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Cancer Research

Oncogenic जीन फ्यूजन जांच लंगर मल्टीप्लेक्स पॉलिमरेज चेन रिएक्शन का उपयोग अगली पीढ़ी अनुक्रमण द्वारा पीछा किया

Published: July 5, 2019 doi: 10.3791/59895
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pathology, University of Colorado - Anschutz Medical Campus

Summary

यह लेख नैदानिक ठोस ट्यूमर के नमूनों में oncogenic जीन संलयन के लिए आकलन करने के लिए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के बाद एक लंगर मल्टीप्लेक्स पॉलिमरेज श्रृंखला प्रतिक्रिया आधारित पुस्तकालय तैयारी किट के उपयोग का विवरण। दोनों गीला बेंच और डेटा विश्लेषण कदम वर्णित हैं.

Abstract

जीन संलयन अक्सर कैंसर के कई अलग अलग प्रकार के oncogenic phenotype करने के लिए योगदान. इसके अतिरिक्त, कैंसर रोगियों से नमूनों में कुछ संलयन की उपस्थिति अक्सर सीधे निदान, पूर्वानुमान, और / नतीजतन, जीन संलयन का सही पता लगाने के कई रोग प्रकार के लिए नैदानिक प्रबंधन का एक महत्वपूर्ण घटक बन गया है. हाल ही में जब तक, नैदानिक जीन संलयन का पता लगाने मुख्य रूप से एकल जीन assays के उपयोग के माध्यम से पूरा किया गया था. तथापि, नैदानिक महत्व वाले जीन संलयनों की बढ़ती सूची ने एक साथ अनेक जीनों की संलयन स्थिति का आकलन करने की आवश्यकता पैदा कर दी है। अगली पीढ़ी अनुक्रमण (NGS) आधारित परीक्षण बड़े पैमाने पर समानांतर फैशन में न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम करने की क्षमता के माध्यम से इस मांग को पूरा किया है. एकाधिक NGS आधारित दृष्टिकोण है कि जीन लक्ष्य संवर्धन के लिए विभिन्न रणनीतियों को रोजगार अब नैदानिक आणविक निदान में उपयोग के लिए उपलब्ध हैं, अपनी शक्तियों और कमजोरियों के साथ प्रत्येक. यह लेख नैदानिक ठोस ट्यूमर नमूनों में जीन संलयन के लिए आकलन करने के लिए एनजीएस द्वारा पीछा करने के बाद लंगर वाले मल्टीप्लेक्स पीसीआर (एएमपी) आधारित लक्ष्य संवर्धन और पुस्तकालय की तैयारी के उपयोग का वर्णन करता है। एएमपी में amplicon आधारित संवर्धन दृष्टिकोण के बीच अद्वितीय है कि यह जीन संलयन की पहचान की परवाह किए बिना जीन संलयन की पहचान करता है. यहाँ विस्तृत दोनों गीला बेंच और डेटा विश्लेषण कदम है कि नैदानिक नमूनों से सटीक जीन संलयन का पता लगाने सुनिश्चित कर रहे हैं.

Introduction

एक एकल प्रतिलिपित्मक इकाई में दो या अधिक जीनों का संलयन हटाने, दोहराव, प्रविष्टि, व्युत्क्रमण, और translocations सहित बड़े पैमाने पर गुणसूत्र विविधताओं के परिणाम के रूप में हो सकता है। व्यक्त जीन उत्पाद के परिवर्तित प्रतिलेखनीय नियंत्रण और/अथवा परिवर्तित कार्यात्मक गुणों के माध्यम से ये संलयन जीन कैंसर कोशिकाओं को कोजनी गुणों को प्रदान कर सकते हैं1. कई मामलों में, संलयन जीन सीधे सेलुलर प्रसार और अस्तित्व के रास्ते को सक्रिय करके प्राथमिक oncogenic ड्राइवरों के रूप में कार्य करने के लिए जाना जाता है।

कैंसर रोगियों के लिए जीन संलयन की नैदानिक प्रासंगिकता पहले फिलाडेल्फिया गुणसूत्र और पुरानी माइलोजेनस ल्यूकेमिया (सीएमएल)2में इसी बीसीआर-ABL1 संलयन जीन की खोज के साथ स्पष्ट हो गया। छोटे अणु अवरोधक imatinib mesylate विशेष रूप से इस संलयन जीन को लक्षित करने के लिए विकसित किया गया था और बीसीआर-ABL1सकारात्मक सीएमएल रोगियों में उल्लेखनीय प्रभावकारिता का प्रदर्शन3. ओकोजेनिक जीन संलयनों का चिकित्सीय लक्ष्य भी ठोस ट्यूमर में सफल रहा है, गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर में ALK और ROS1 संलयन जीन ों के निषेध के साथ प्राथमिक उदाहरण4,5के रूप में सेवा कर रहे हैं। हाल ही में, NTRK अवरोधक larotrectinib एफडीए NTRK1/2/3 संलयन सकारात्मक ठोस ट्यूमर के लिए मंजूरी दे दी थी, रोग साइट6की परवाह किए बिना. चिकित्सा चयन के अलावा, जीन संलयन का पता लगाने भी रोग निदान और रोग का निदान में भूमिका है. यह विशेष रूप से विभिन्न सार्कोमा और हेमेटोलॉजिक द्रोह उपप्रकारों में प्रचलित है जो नैदानिक रूप से विशिष्ट संलयनोंकी उपस्थिति द्वारा परिभाषित किए जाते हैं और/या जिसके लिए संलयन की उपस्थिति सीधे पूर्वानुमान 7,8 को सूचित करती है , 9 , 10 , 11ये कैंसर रोगियों के लिए जीन संलयन का पता लगाने के नैदानिक अनुप्रयोग के कुछ उदाहरण हैं .

नैदानिक निर्णय लेने में महत्वपूर्ण भूमिका के कारण, नैदानिक नमूनों से सटीक जीन संलयन का पता लगाने के महत्वपूर्ण महत्व का है. कई तकनीकों संलयन या गुणसूत्र पुनर्व्यवस्थित विश्लेषण के लिए नैदानिक प्रयोगशालाओं में लागू किया गया है सहित: साइटोजेनेटिक तकनीक, रिवर्स प्रतिलेखन polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया (आरटी-पीसीआर), situ संकरीकरण में फ्लोरोसेंट (FISH), इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी), और 5'/3' अभिव्यक्ति असंतुलन विश्लेषण (दूसरों के बीच)12,13,14,15. वर्तमान में, कैंसर में कार्रवाई योग्य जीन संलयनों की तेजी से विस्तार सूची के परिणामस्वरूप एक साथ कई जीनों की संलयन स्थिति का आकलन करने की आवश्यकता हुई है। नतीजतन, कुछ पारंपरिक तकनीक है कि केवल एक समय में एक या कुछ जीन क्वेरी कर सकते हैं अक्षम दृष्टिकोण होते जा रहे हैं, खासकर जब विचार है कि नैदानिक ट्यूमर के नमूने अक्सर बहुत सीमित हैं और कई परख के बीच विभाजित किया जा रहा करने के लिए अनुकूल नहीं है. अगली पीढ़ी अनुक्रमण (NGS), तथापि, एक विश्लेषण मंच है कि अच्छी तरह से बहु जीन परीक्षण के लिए अनुकूल है, और NGS आधारित परख नैदानिक आणविक नैदानिक प्रयोगशालाओं में आम हो गए हैं.

वर्तमान में उपयोग किए गए संलयन/पुनर्व्यवस्था का पता लगाने के लिए एनजीएस परख का उपयोग इनपुट सामग्री के संबंध में भिन्न होता है, पुस्तकालय तैयारी और लक्ष्य संवर्धन के लिए नियोजित रसायनज्ञ, और एक परख के भीतर पूछे जाने वाले जीनों की संख्या। NGS परख आरएनए या डीएनए (या दोनों) नमूने से निकाले पर आधारित हो सकता है. हालांकि आरएनए आधारित विश्लेषण अत्यधिक अवक्रमित आरएनए को रोकने के लिए नैदानिक नमूनों की प्रवृत्ति से बाधित है, यह डीएनए आधारित संलयन परीक्षण के लक्ष्य हैं कि बड़े और अक्सर दोहराव introns अनुक्रम की जरूरत को दरकिनार लेकिन NGS के लिए मुश्किल साबित हो गया है डेटा विश्लेषण16| आरएनए आधारित एनजीएस परख के लिए लक्ष्य संवर्धन रणनीतियों को काफी हद तक हाइब्रिड कैप्चर या एम्प्लिकॉन-मध्यस्थ दृष्टिकोणों में विभाजित किया जा सकता है। जबकि दोनों रणनीतियों को संलयन का पता लगाने के लिए सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है , प्रत्येक अन्य17,18से अधिक लाभ शामिल हैं . हाइब्रिड कब्जा परख आम तौर पर अधिक जटिल पुस्तकालयों में परिणाम और एलीलिक ड्रॉपआउट कम है, जबकि amplicon आधारित परख आम तौर पर कम इनपुट की आवश्यकता होती है और कम ऑफ-लक्ष्य अनुक्रमण19में परिणाम. हालांकि, शायद पारंपरिक amplicon आधारित संवर्धन की प्राथमिक सीमा सभी ज्ञात संलयन भागीदारों के लिए प्राइमर के लिए की जरूरत है. यह समस्याग्रस्त है क्योंकि कई चिकित्सकीय महत्वपूर्ण जीन विभिन्न भागीदारों के दर्जनों के साथ फ्यूज करने के लिए जाना जाता है, और यहां तक कि अगर प्राइमर डिजाइन सभी ज्ञात भागीदारों का पता लगाने के लिए अनुमति दी, उपन्यास संलयन घटनाओं का पता नहीं चल रहेगा. हाल ही में वर्णित एक तकनीक जिसे एंकर्ड मल्टीप्लेक्स पीसीआर (या कम के लिए एएमपी) कहा जाता है, इस सीमाको 20को संबोधित करती है। एएमपी में, एक 'आधा कार्यात्मक' NGS एडाप्टर cDNA टुकड़े कि इनपुट आरएनए से प्राप्त कर रहे हैं करने के लिए ligated है. लक्ष्य संवर्धन जीन विशिष्ट प्राइमर और एडाप्टर के लिए एक प्राइमर के बीच प्रवर्धन द्वारा हासिल की है. परिणामस्वरूप, रुचि के जीनों के लिए सभी संलयन, भले ही एक उपन्यास संलयन साथी शामिल है, का पता लगाया जाना चाहिए (चित्र 1देखें)। यह लेख ArcherDx FusionPlex ठोस ट्यूमर किट, एक NGS आधारित परख है कि लक्ष्य संवर्धन और पुस्तकालय की तैयारी के लिए एएमपी को रोजगार के उपयोग का वर्णन करता है, ठोस ट्यूमर के नमूनों में oncogenic जीन संलयन का पता लगाने के लिए (देखें अनुपूरक तालिका 1 के लिए पूर्ण जीन सूची). गीला बेंच प्रोटोकॉल और डेटा विश्लेषण कदम कड़ाई से एक नैदानिक प्रयोगशाला सुधार संशोधन (CLIA) प्रमाणित प्रयोगशाला में मान्य किया गया है.

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Protocol

1. पुस्तकालय की तैयारी और अनुक्रमण

  1. सामान्य परख विचार और पूर्व assay कदम
    1. परख चलाता है आम तौर पर सात नैदानिक नमूने और एक सकारात्मक नियंत्रण से मिलकर बनता है (हालांकि पुस्तकालय की तैयारी रन प्रति नमूनों की संख्या आवश्यक के रूप में समायोजित किया जा सकता है). एक सकारात्मक नियंत्रण है कि कम से कम कई जीन संलयन शामिल का प्रयोग करें (कि परख लक्ष्य) है कि एक निर्माता द्वारा पुष्टि की गई है और / एक गैर-टेम्पलेट नियंत्रण (NTC) हर परख रन में एक अतिरिक्त नमूना के रूप में शामिल किया जाना चाहिए, लेकिन केवल दूसरे किनारा cDNA संश्लेषण और पूर्व अनुक्रमण गुणवत्ता नियंत्रण के माध्यम से किया जाता है (पूर्व-सेक QC; कोई cDNA संश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए). एनटीसी के लिए नमूना diluent (10 m Tris HCl पीएच 8.0) का उपयोग करें।
    2. कुल न्यूक्लिक एसिड (TNA) formalin-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (FFPE) ऊतक की निकासी प्रदर्शन.
    3. एक फ्लोरोमेट्रिक परख का उपयोग कर TNA के आरएनए घटक मात्रा.
      नोट: फ्रीज-थॉव चक्र को सीमित करके नमूनों में आरएनए गिरावट को रोकें, कम तापमान पर thawed न्यूक्लिक एसिड रखते हुए (ठंडा ब्लॉक, बर्फ, या वैकल्पिक), और RNase संदूषण को रोकने (वस्त्र पहने, एक RNase decontaminator स्प्रे का उपयोग कर).
  2. यादृच्छिक प्राइमिंग
    नोट: परख के लिए वांछित इनपुट है 200 एनजी आरएनए (टीएनए के फ्लोरोमेट्रिक परिमाणपरणता पर आधारित).। कम आदानों का इस्तेमाल किया जा सकता है अगर 200 एनजी हासिल नहीं किया जा सकता है। यदि नमूना पोस्ट-सेक्सिंग QC विफल हो जाता है, तो उच्च इनपुट के साथ दोहराने से स्वीकार्य QC मीट्रिक हो सकती है.
    1. 10 एमएम ट्रास एचसीएल पीएच 8.0 में डिल्यूट टीएनए वांछित आरएनए एकाग्रता प्राप्त करने के लिए। प्रत्येक नमूने के लिए, यादृच्छिक प्राइमिंग अभिकर्मक पट्टी ट्यूबों में कमजोर पड़ने के 20 डिग्री सेल्सियस हस्तांतरण (पूर्व ठंडा एल्यूमीनियम ब्लॉक में रखा) और ऊपर और नीचे 6 "8 बार pipeting द्वारा मिश्रण. संक्षेप में नीचे स्पिन और एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट और आरटी फिल्म के साथ सील करने के लिए पूरे मात्रा हस्तांतरण।
    2. थर्मोसाइकिलर ब्लॉक में प्लेट डालें, संपीड़न पैड के साथ कवर करें, और ढक्कन बंद करें। 5 मिनट (गर्म ढक्कन) के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    3. थर्मोसाइकिलर से प्लेट निकालें और 2 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।
  3. पहले किनारा cDNA संश्लेषण
    1. पहले किनारा अभिकर्मक पट्टी ट्यूबों में यादृच्छिक प्राइमिंग उत्पाद की पूरी मात्रा स्थानांतरण (पूर्व ठंडा एल्यूमीनियम ब्लॉक में रखा). ऊपर और नीचे 6 "8 बार पाइपिंग द्वारा मिक्स. संक्षेप में नीचे स्पिन, एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट और आरटी फिल्म के साथ सील करने के लिए पूरे मात्रा हस्तांतरण।
    2. थर्मोसाइकिलर ब्लॉक में प्लेट डालें, संपीड़न पैड के साथ कवर करें, और ढक्कन बंद करें। थर्मोसाइकिलर प्रोग्राम चलाएं: 25 डिग्री सेल्सियस 10 मिनट, 42 डिग्री सेल्सियस 30 मिनट, 80 डिग्री सेल्सियस 20 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस होल्ड (गर्म ढक्कन)।
  4. दूसरा किनारा cDNA संश्लेषण
    1. पीसीआर पट्टी ट्यूबों के एक नए सेट में, एक 1:10 पहले किनारा उत्पाद के कमजोर पड़ने 9 $L nuclease मुक्त पानी के लिए पहले किनारा उत्पाद के 1 $L जोड़कर बनाएँ. कमजोर पड़ने को एक तरफ सेट करें पूर्व-सेक क्यूसी परख में इस्तेमाल किया जा करने के लिए।
    2. शेष पहले किनारा उत्पाद के लिए nuclease मुक्त पानी के 21 डिग्री एल जोड़ें. स्थानांतरण पहले किनारा उत्पाद और nuclease मुक्त पानी के 40 $L दूसरे किनारा अभिकर्मक पट्टी ट्यूब (पूर्व ठंडा एल्यूमीनियम ब्लॉक में रखा) के लिए. ऊपर और नीचे 6 "8 बार पाइपिंग द्वारा मिक्स. नीचे स्पिन, एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट और आरटी फिल्म के साथ सील करने के लिए पूरे मात्रा हस्तांतरण।
    3. थर्मोसाइकिलर ब्लॉक में प्लेट डालें, संपीड़न पैड के साथ कवर करें, और ढक्कन बंद करें। thermocycler कार्यक्रम चलाएँ: 16 डिग्री सेल्सियस 60 मिनट, 75 डिग्री सेल्सियस 20 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस पकड़ (गर्म ढक्कन).
      नोट: यह एक स्वीकार्य रोक बिंदु है। प्लेट को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  5. प्री-सेक क्यूसी
    नोट: यह गुणवत्ता नियंत्रण (QC) परख मुख्य रूप से NTC से कोई cDNA संश्लेषण के सत्यापन के लिए प्रयोग किया जाता है. हालांकि, डेटा भी परख समस्या निवारण में जानकारीपूर्ण हो सकता है। उदाहरण के लिए, अगर किसी नमूने का पूर्व-सेक QC मान अच्छा है, लेकिन खराब परख मीट्रिक (नीचे देखें) तो यह परख रन में किसी समस्या का संकेत हो सकता है, जिसे दोहराने की आवश्यकता हो.
    1. प्रत्येक नमूना और डुप्लिकेट में NTC चलाएँ। इसके अलावा पूर्व सेक QC में शामिल एक प्रतिक्रिया एनटीसी, जो nuclease मुक्त पानी है चलाने के लिए (भी डुप्लिकेट में चलाते हैं). एक ऑप्टिकल 96 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक लागू करने के लिए परख मास्टर मिश्रण के 5 डिग्री एल, 10x VCP प्राइमर के 1 $L, और 1:10 पहले किनारा उत्पाद है कि चरण 1.4.1 में बनाया गया था की 1:10 कमजोर पड़ने के 4 $L जोड़ें.
    2. आरटी फिल्म के साथ थाली सील, नीचे स्पिन, और एक मात्रात्मक पीसीआर (QPCR) साधन में लोड. कार्यक्रम चलाने के लिए: पूर्व amp: 1 चक्र 95 डिग्री सेल्सियस 20 s, amp: 35 चक्र 95 डिग्री सेल्सियस 3 s (4.4 डिग्री सेल्सियस /
    3. परख NTC और प्रतिक्रिया NTC दोनों के लिए एक चक्र थ्रेशोल्ड (Ct) मान की कमी की पुष्टि करें।
      नोट: यदि कोई Ct परख NTC में मनाया जाता है यह अब परख में आगे ले जाया जाएगा. प्रतिक्रिया एनटीसी में एक Ct मूल्य के अवलोकन पूर्व सेक QC परख की एक दोहराने की आवश्यकता है. परख एनटीसी में एक Ct के अवलोकन परख में पहले कुछ बिंदु पर नमूना संदूषण पता चलता है, इस प्रकार की आवश्यकता है कि पूरे परख (सभी नमूने) पर शुरू कर दिया. एक पर्याप्त गुणवत्ता नमूने के लिए पूर्व सेक QC Ct मूल्य 30 से नीचे होना चाहिए (कम Ct मूल्यों अधिक उत्पाद और इस तरह उच्च गुणवत्ता आरएनए के साथ सहसंबंधित). 30 से ऊपर के मान विफलता के पूर्ण संकेतक नहीं हैं और इन नमूने परख में जारी रखा जाना चाहिए. तथापि, ऐसे नमूनों से प्राप्त सभी आंकड़ों की सावधानीपूर्वक समीक्षा की जानी चाहिए, विशेष रूप से ऐसे मामलों में जिनके लिए कोई संलयन नहीं कहा जाता है।
  6. मरम्मत और मनका शुद्धि समाप्त करें
    1. अंत की मरम्मत अभिकर्मक पट्टी ट्यूब में दूसरे किनारा उत्पाद के 40 डिग्री एल स्थानांतरण (पूर्व ठंडा एल्यूमीनियम ब्लॉक में रखा). ऊपर और नीचे 6 डिग्री 8 बार पाइपिंग द्वारा मिक्स, नीचे स्पिन और thermocycler ब्लॉक में जगह (गर्म ढक्कन खुला रखने) और thermocycler कार्यक्रम चलाने: 25 डिग्री सेल्सियस 30 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस पकड़.
    2. 4 डिग्री सेल्सियस से शुद्धि मोती निकालें और कमरे के तापमान के लिए तुल्य ताक करने के लिए अनुमति देते हैं। पूरी लाइब्रेरी की तैयारी के दौरान पिछले करने के लिए पर्याप्त 70% इथेनॉल बनाओ। एक यू-नीचे प्लेट के कुओं की उचित संख्या में उपयोग और पाइप 100 जेडएल से पहले भंवर मोती।
      नोट: हर 8 नमूने है कि चला रहे हैं के लिए, 70% इथेनॉल के 20 एमएल की जरूरत होगी.
    3. मोती के लिए अंत मरम्मत उत्पाद की पूरी मात्रा जोड़ें. पाइप अप और नीचे 6 "8 बार मिश्रण और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर incubate, चुंबक पर एक 5 मिनट ऊष्मायन के बाद.
    4. निकालें और supernatant त्यागें और 30-s ऊष्मायन के साथ दो 200 $L 70% इथेनॉल washes प्रदर्शन करते हैं। अंतिम धोने के बाद सभी 70% इथेनॉल को हटा दें और हवा को 5 मिनट के लिए सूखा दें।
    5. चुंबक से निकालें और 10 एमएम ट्रास एचसीएल पीएच 8.0 के 22 डिग्री एल में मोती फिर से निलंबित करें। चुंबक को 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और इसके बाद चुंबक पर 2-मिनट ऊष्मायन होगा। लिगिंग चरण 1 के लिए तुरंत आगे बढ़ें।
  7. लिगेशन चरण 1 और मनका शुद्धि
    1. स्थानांतरण 20 $L अंत मरम्मत मनका शोधन प्लेट से (ध्यान लेने के लिए मनका गोली परेशान नहीं) लिगिंग चरण 1 पट्टी ट्यूबों में (पूर्व ठंडा एल्यूमीनियम ब्लॉक में रखा). ऊपर और नीचे 6 "8 बार pipeting द्वारा मिक्स, नीचे स्पिन और एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट में पूरे मात्रा हस्तांतरण.
    2. थर्मोसाइकिलर ब्लॉक में प्लेट डालें, संपीड़न पैड और क्लोज ढक्कन के साथ कवर करें। thermocycler कार्यक्रम चलाएँ: 37 डिग्री सेल्सियस 15 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस पकड़ (गर्म ढक्कन).
    3. 4 डिग्री सेल्सियस से शुद्धि मोती निकालें और कमरे के तापमान के लिए तुल्य ताक करने के लिए अनुमति देते हैं। भंवर मोती अच्छी तरह से उपयोग करने से पहले और एक यू-नीचे प्लेट के कुओं की उचित संख्या में पाइप 50 जेडएल।
    4. मोती के लिए ligation चरण 1 उत्पाद की पूरी मात्रा जोड़ें। पाइप अप और नीचे 6 "8 बार मिश्रण और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर incubate, चुंबक पर एक 5 मिनट ऊष्मायन के बाद.
    5. निकालें और supernatant त्यागें और 30-s ऊष्मायन के साथ दो 200 $L 70% इथेनॉल washes प्रदर्शन करते हैं। अंतिम धोने के बाद सभी 70% इथेनॉल को हटा दें और हवा को 5 मिनट के लिए सूखा दें।
    6. चुंबक से निकालें और 10 एमएम ट्रास एचसीएल पीएच 8.0 के 42 डिग्री एल में मोती फिर से निलंबित करें। चुंबक को 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और इसके बाद चुंबक पर 2-मिनट ऊष्मायन होगा। लिगिंग चरण 2 के लिए तुरंत आगे बढ़ें।
  8. लिगेशन चरण 2 और मनका शुद्धि
    1. आणविक बारकोड (MBC) एडाप्टर पट्टी ट्यूब अभिकर्मकों को 4 डिग्री सेल्सियस भंडारण से निकालें। MBC एडाप्टर पट्टी की उचित संख्यान गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है के रूप में नमूना-विशिष्ट अनुक्रमित इस बिंदु पर जोड़े जाते हैं. पीठ पर टिका के साथ क्षैतिज ट्यूबों की स्थिति और ट्यूबों लेबल करने के लिए एक स्थायी मार्कर का उपयोग करें 1, 2, 3... बाएं से दाएं। अनुक्रमण उद्देश्यों के लिए नमूना-विशिष्ट अनुक्रमणिकाओं को रिकॉर्ड करने के लिए भी महत्वपूर्ण है (वे अनुक्रमक कार्यपत्रक में दर्ज किए जाने चाहिए).।
    2. लिगेशन चरण 1 मनका शुद्धि प्लेट से 40 डिग्री सेल्सियस स्थानांतरण (मनका गोली परेशान करने के लिए ध्यान नहीं ले रही है) MBC एडाप्टर पट्टी ट्यूबों के लिए (पूर्व ठंडा एल्यूमीनियम ब्लॉक में रखा). ऊपर और नीचे 6 "8 बार पाइपिंग द्वारा मिक्स.
    3. नीचे स्पिन और लिगिंग चरण 2 अभिकर्मक पट्टी ट्यूबों के लिए पूरे मात्रा हस्तांतरण (भी पूर्व ठंडा एल्यूमीनियम ब्लॉक में रखा). ऊपर और नीचे 6 "8 बार पाइपिंग द्वारा मिक्स, नीचे स्पिन और thermocycler ब्लॉक में जगह है. गर्म ढक्कन बंद thermocycler कार्यक्रम चलाने के साथ: 22 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस पकड़।
      नोट: यह एक सुरक्षित रोक बिंदु है और नमूने -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस भंडारण से लिगेशन सफाई मोती निकालें और कमरे के तापमान के लिए बराबर करने के लिए अनुमति देते हैं। ताजा 5 एमएम NaOH के 1 एमएल तैयार करें।
    5. Ligation सफाई मोती भंवर और पीसीआर पट्टी ट्यूबों का एक नया सेट करने के लिए 50 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। 1 मिनट के लिए चुंबक पर इनक्यूबेट। 1-मिनट ऊष्मायन के बाद निकालें और supernatant त्याग दें. चुंबक से पट्टी ट्यूब निकालें और 6 डिग्री 8 बार ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा लिगेशन सफाई बफर के 50 डिग्री एल में फिर से निलंबित।
    6. लिगेशन चरण 2 उत्पाद की संपूर्ण मात्रा को लिगेशन क्लीनअप मनका स्ट्रिप ट्यूबों में स्थानांतरित करें। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर भंवर और इनक्यूबेट द्वारा नमूनों को मिलाएं। फिर, एक और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर भंवर और इनक्यूबेट द्वारा मिश्रण नमूने. दूसरे 5-मिनट ऊष्मायन के बाद, भ्रमिल द्वारा नमूनों को मिश्रण करें, संक्षेप में स्पिन करें और चुंबक पर 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    7. निकालें और supernatant त्यागें. लिगेशन क्लीनअप बफर और भंवर के 200 $L को फिर से निलंबित करने के लिए जोड़ें। एक त्वरित स्पिन करें और चुंबक पर 1 मिनट के लिए जगह बनाएं। लिगेशन क्लीनअप बफर का उपयोग करके एक दूसरा वॉश फिर से करें।
    8. लिगेशन सफाई बफर के साथ दो washes के बाद अल्ट्रापुरे पानी का उपयोग कर एक समान धोने प्रदर्शन करते हैं। अल्ट्रापुरे पानी धोने के बाद 5 एम एम NaOH के 20 डिग्री एल में मोती फिर से निलंबित कर दिया और एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट में स्थानांतरण। प्लेट को एक संपीड़न पैड के साथ थर्मोसाइकिलर ब्लॉक में रखें और थर्मोसाइकिलर प्रोग्राम चलाएं: 75 डिग्री सेल्सियस 10 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस होल्ड (गर्म ढक्कन)।
    9. नमूनों को ठंडा करने के बाद पीसीआर प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस तक घुमाएं। चुंबक पर प्लेट को कम से कम 3 मिनट के लिए रखें और तुरंत पहले पीसीआर पर जाएं।
  9. पहले पीसीआर और मनका शुद्धि
    1. एक पूर्व ठंडा एल्यूमीनियम ब्लॉक में 4 डिग्री सेल्सियस भंडारण और जगह से पहले पीसीआर अभिकर्मक पट्टी ट्यूब निकालें। इसके अलावा, -20 डिग्री सेल्सियस से GSP1 प्राइमर को हटा दें और कमरे के तापमान को बराबर करने की अनुमति दें।
    2. पहली पीसीआर अभिकर्मक पट्टी ट्यूबों के प्रत्येक कुएं में GSP1 प्राइमर के 2 $L जोड़ें। पहले पीसीआर अभिकर्मक पट्टी ट्यूबों के लिए लिगेशन 2 सफाई उत्पाद के 18 डिग्री एल स्थानांतरण और ऊपर और नीचे 6 डिग्री 8 बार पाइपिंग द्वारा मिश्रण।
    3. नीचे स्पिन और एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट के लिए स्थानांतरण. प्लेट को एक संपीड़न पैड के साथ थर्मोसाइकिलर ब्लॉक में रखें और थर्मोसाइकिलर प्रोग्राम चलाएं: 95 डिग्री सेल्सियस 3 मिनट, 15 चक्र 95 डिग्री सेल्सियस 30 s $ 65 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट (100% रैंप दर), 72 डिग्री सेल्सियस 3 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस पकड़ (गर्म ढक्कन)।
      नोट: यह एक सुरक्षित रोक बिंदु है और नमूने 4 डिग्री सेल्सियस रात में या लंबी अवधि के भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस से शुद्धि मोती निकालें और कमरे के तापमान के लिए तुल्य ताक करने के लिए अनुमति देते हैं। भंवर मोती अच्छी तरह से उपयोग करने से पहले और एक यू-नीचे प्लेट के कुओं की उचित संख्या में 24 डिग्री सेल्सियस पाइप.
    5. मोती के 24 डिग्री एल करने के लिए पहले पीसीआर उत्पाद के 20 डिग्री एल स्थानांतरण। पाइप अप और नीचे 6 "8 बार मिश्रण और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर incubate, चुंबक पर एक 2-मिनट ऊष्मायन के बाद.
    6. निकालें और supernatant त्यागें और 30-s ऊष्मायन के साथ दो 200 $L 70% इथेनॉल washes प्रदर्शन करते हैं। अंतिम धोने के बाद सभी 70% इथेनॉल को हटा दें और हवा 2 मिनट के लिए सूखी.
    7. चुंबक से निकालें और 10 एमएम Tris HCl पीएच 8.0 के 24 डिग्री एल में मोती फिर से निलंबित. चुंबक को 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और इसके बाद चुंबक पर 2-मिनट ऊष्मायन होगा। दूसरे पीसीआर के लिए तुरंत आगे बढ़ें।
  10. दूसरा पीसीआर और मनका शुद्धि
    1. 4 डिग्री सेल्सियस से दूसरा पीसीआर अभिकर्मक पट्टी ट्यूब निकालें और एक पूर्व ठंडा एल्यूमीनियम ब्लॉक में जगह है। नमूना-विशिष्ट अनुक्रमित इस बिंदु पर जोड़ रहे हैं के रूप में दूसरी पीसीआर पट्टी ट्यूबों की उचित संख्या महत्वपूर्ण है. पीठ पर टिका के साथ क्षैतिज ट्यूबों की स्थिति और ट्यूबों लेबल करने के लिए एक स्थायी मार्कर का उपयोग करें 1, 2, 3... बाएं से दाएं। इसके अलावा, -20 डिग्री सेल्सियस से GSP2 प्राइमर को हटा दें और कमरे के तापमान को बराबर करने की अनुमति दें।
      नोट: यह अनुक्रमण उद्देश्यों के लिए नमूना-विशिष्ट अनुक्रमणिका ओंकार रिकॉर्ड करने के लिए भी महत्वपूर्ण है (वे अनुक्रमक कार्यपत्रक में दर्ज किया जाना चाहिए)।
    2. जोड़ें 2 $L GSP2 प्राइमर के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए दूसरी पीसीआर अभिकर्मक पट्टी ट्यूबों. स्थानांतरण 18 $L दूसरी पीसीआर अभिकर्मक पट्टी ट्यूबों के लिए पहली पीसीआर सफाई उत्पाद के और ऊपर और नीचे 6 डिग्री 8 बार pipetting द्वारा मिश्रण।
    3. नीचे स्पिन और एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट के लिए स्थानांतरण. एक संपीड़न पैड के साथ थर्मोसाइकिलर ब्लॉक में प्लेट रखें और थर्मोसाइकिलर कार्यक्रम चलाएं: 95 डिग्री सेल्सियस 3 मिनट, 18 चक्र 95 डिग्री सेल्सियस 30 एस $ 65 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट (100% रैंप दर), 72 डिग्री सेल्सियस 3 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस पकड़ (गर्म ढक्कन)।
      नोट: यह एक सुरक्षित रोक बिंदु है और नमूने 4 डिग्री सेल्सियस रात में या लंबी अवधि के भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस से शुद्धि मोती निकालें और कमरे के तापमान के लिए तुल्य ताक करने के लिए अनुमति देते हैं। भंवर मोती अच्छी तरह से उपयोग करने से पहले और एक यू-नीचे प्लेट के कुओं की उचित संख्या में 24 डिग्री सेल्सियस पाइप.
    5. मोती के लिए दूसरे पीसीआर उत्पाद के 20 $L स्थानांतरण। पाइप अप और नीचे 6 "8 बार मिश्रण और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर incubate, चुंबक पर एक 2-मिनट ऊष्मायन के बाद.
    6. निकालें और supernatant त्यागें और 30-s ऊष्मायन के साथ दो 200 $L 70% इथेनॉल washes प्रदर्शन करते हैं। अंतिम धोने के बाद सभी 70% इथेनॉल को हटा दें और हवा 2 मिनट के लिए सूखी.
    7. चुंबक से निकालें और 10 एमएम Tris HCl पीएच 8.0 के 24 डिग्री एल में मोती फिर से निलंबित. चुंबक को 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और इसके बाद चुंबक पर 2-मिनट ऊष्मायन होगा। एक नया 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट के लिए दूसरी पीसीआर सफाई उत्पाद के 20 $L स्थानांतरण।
      नोट: यह एक सुरक्षित रोक बिंदु है और पुस्तकालयों लंबी अवधि के भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है या पुस्तकालय परिमाणीकरण के लिए तुरंत आगे बढ़ना।
  11. पुस्तकालय परिमाणीकरण
    1. -20 डिग्री सेल्सियस भंडारण से पुस्तकालय परिमाणीकरण मास्टर मिश्रण और मानकों को निकालें और कमरे के तापमान के बराबर करने के लिए अनुमति देते हैं।
    2. 1:199, 1:199, और 20:80 10 एमएम Tris HCl पीएच 8.0 0 00 5% polysorbate का उपयोग कर सभी पुस्तकालयों (दूसरा पीसीआर उत्पाद) के 1:5 कमजोर पड़ने प्रदर्शन। अंतिम दो कमजोर पड़ने 1:200,000 और 1:1,000,000 क्रमशः trilicate में चलाया जाएगा.
    3. एक ऑप्टिकल 96 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से मास्टर मिश्रण के 6 डिग्री एल जोड़ें उपयुक्त कमजोर पड़ने या मानक के 4 डिग्री एल के बाद. प्लेट नीचे स्पिन और यह QPCR साधन पर लोड. निम्नलिखित साइकिल की स्थिति का उपयोग करें: 1 चक्र 95 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट, 35 चक्र 95 डिग्री सेल्सियस 30 s (4.4 डिग्री सेल्सियस /
    4. पुस्तकालय परिमाणीकरण पूरा हो गया है और पुस्तकालय सांद्रता (दोनों परीक्षण कमजोर पड़ने औसत के माध्यम से) निर्धारित कर रहे हैं के बाद, 10 एमएम Tris HCl पीएच 8.0 का उपयोग कर 2 एनएम करने के लिए सभी पुस्तकालयों सामान्य। प्रत्येक सामान्यीकृत पुस्तकालय के 10 डिग्री सेल्सियस को एक 1.5 एमएल माइक्रो अपकेंद्रित्र ट्यूब में संयोजित करके पुस्तकालय पूल बनाएं।
  12. पुस्तकालयों का अनुक्रमण
    1. कम से कम 1 एच के लिए भरने लाइन तक -20 डिग्री सेल्सियस भंडारण और deionized (डीआई) पानी में जगह से अनुक्रमक अभिकर्मक कारतूस निकालें। इसके अलावा, 4 डिग्री सेल्सियस से अनुक्रमक अभिकर्मक किट को हटा दें और कम से कम 1 ज के लिए कमरे के तापमान को बराबर करने की अनुमति दें। इस अनुक्रमण प्लेटफ़ॉर्म पर अनुक्रम किया जा सकता है कि पुस्तकालयों की अधिकतम संख्या 8 है (जिसमें से एक सकारात्मक नियंत्रण होना चाहिए).
    2. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 0.2 एन NaOH और इनक्यूबेट के 10 $L के साथ पुस्तकालय पूल के 10 डिग्री सेल्सियस के संयोजन के द्वारा विकृत amplicon पुस्तकालय (DAL) पूल बनाओ। 5-मिनट ऊष्मायन के बाद 200 एमएम ट्रास एचसीएल पीएच 7.0 के 10 डिग्री एल को जोड़ें, इसके बाद एचटी 1 हाइब्रिडाइजेशन बफर के 970 डिग्री सेल्सियस।
    3. एचटी1 के 300 डिग्री एल, 20 पी एम फीक्स के 25 डिग्री एल और डीएल पूल के 675 डिग्री एल के संयोजन से अंतिम लोड ट्यूब बनाओ। भंवर और लोड ट्यूब नीचे स्पिन. 2 x 151 बीपी चल रहे seuencer अभिकर्मक कारतूस और लोड कारतूस के नमूना अच्छी तरह से करने के लिए लोड ट्यूब की पूरी मात्रा जोड़ें 2 x 8 सूचकांक पढ़ता है के साथ पढ़ता है.

2. डेटा विश्लेषण

  1. डेटा हैंडलिंग और विश्लेषण को अनुक्रमित करना
    1. NGS साधन से अनुक्रमण मैट्रिक्स डाउनलोड करें.
    2. सुनिश्चित करें कि अनुक्रमण डेटा नीचे श्रेणियों में आता है (इस उदाहरण में उपयोग किए गए किट के लिए विशिष्ट). क्लस्टर घनत्व (घनत्व [K/mm2]: 945-1600 K; % का पासिंग फ़िल्टर (clusters PF [%]): और 90%; गुणवत्ता स्कोर (% $Q30): और 85%; PhiX संरेखण (संरेखित %): 1.5 "6.0%; PhiX त्रुटि दर (त्रुटि दर [%]): (lt;1.0%; पासिंग फिल्टर पढ़ता है (पीएफ [M] पढ़ता है): और 22 मिलियन.
      नोट: इन मीट्रिक्स को पूरा नहीं करने वाले अनुक्रमण रन दोहराने के अधीन हैं.
    3. प्रत्येक नमूने के लिए एरियट किए गए पढ़ें के % की समीक्षा करें (यानी, प्रत्येक नमूना-विशिष्ट अनुक्रमणिका). एक ठेठ चलाने के लिए जिसमें PhiX स्पाइक-इन $5% था और 8 नमूने अनुक्रम थे, प्रत्येक नमूना आदर्श रूप से पढ़ता के लगभग 11.9% के लिए खाते चाहिए. प्रत्येक नमूने के लिए स्वीकार्य श्रेणी 5 "25% है। किसी भी नमूने इस श्रेणी के भीतर फिट नहीं है, तो दोहराने पुस्तकालय परिमाणीकरण और अनुक्रमण.
  2. विश्लेषण एल्गोरिथ्म के लिए कच्चे अनुक्रम डेटा का सबमिशन
    नोट: संस्करण 4.1.1.7 ArcherDx विश्लेषण के यहाँ वर्णित है. इस उदाहरण में, विश्लेषण सॉफ़्टवेयर एक 'वर्चुअल मशीन' किसी आंतरिक सर्वर पर चलाने के रूप में लागू किया गया है। एक केंद्रीय संसाधन इकाई (सीपीयू) और 12 GB रैंडम एक्सेस मेमोरी (RAM) का विश्लेषण करने के लिए प्रत्येक नमूने के लिए आवश्यक हैं (आमतौर पर 8 नमूने समवर्ती 8 CPU और 96 GB RAM की आवश्यकता होती संसाधित किए जाते हैं)। प्रसंस्करण आम तौर पर लेता है 3 "8 एच.
    1. विश्लेषण प्रणाली के भीतर डिफ़ॉल्ट विश्लेषण सेटिंग्स का उपयोग करें, के अपवाद के साथ MIN[AVERAGE]UNIQUE]RNA]START]SITES[PER]GSP2]CONTROLS (यह 10 से 20 में बदल गया है) और READ$DEPTH]NORMALATION (यह डाउन-सैम्पलिंग को रोकने के लिए 0 पर सेट किया गया है)।
    2. एक विश्लेषण कार्य प्रारंभ करने के लिए, उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस में विश्लेषण प्रदर्शन पर क्लिक करें, कार्य के लिए कोई नाम सबमिट करें, और उसके बाद आवश्यक FASTQ फ़ाइलों का चयन करें (दोनों पढ़ता है [R1 और R2] प्रत्येक नमूने के लिए चयनित हैं कि यह सुनिश्चित करते हुए)।
    3. आरएनए विश्लेषण प्रकार के लिए आरएनए फ्यूजन का चयन करें, मंच के लिए Illumina (युग्मित), और लक्ष्य क्षेत्र के लिए FusionPlex ठोस ट्यूमर पैनल. फिर सबमिट विश्लेषणपर क्लिक करें .
  3. परख डेटा व्याख्या
    1. विश्लेषण प्रणाली के उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस खोलें और इच्छित कार्य का चयन करें। धनात्मक नियंत्रण नमूने का चयन करें. सुनिश्चित करें कि सभी अपेक्षित संलयन और oncogenic isoforms का पता लगाया गया है और मजबूत साक्ष्य टैब में सूचीबद्ध हैं.
      नोट: यदि सकारात्मक नियंत्रण में ट्रैक किए गए संलयनों में से किसी परख के एक दिए गए रन के लिए पता नहीं कर रहे हैं, यह है कि चलाने में एक समस्या का संकेत हो सकता है, जो एक दोहराने की जरूरत है (परख की शुरुआत से).
    2. प्रत्येक नैदानिक नमूने के लिए पठन आँकड़े की जांच करें चालू में पढ़ें सांख्यिकी टैब पर क्लिक करके. प्रत्येक नमूना कम से कम 1 लाख कुल टुकड़े द्वारा प्रतिनिधित्व किया जाना चाहिए. यदि कम से कम 1 मिलियन, फिर से परिमाणीकरण के लिए विचार के साथ पुस्तकालय फिर से अनुक्रम प्रारंभिक परिमाणन aberantly उच्च नहीं था सुनिश्चित करने के लिए.
      नोट: अच्छी गुणवत्ता के नमूने आम तौर पर लक्ष्य % पर प्रदर्शित करेगा % और 85%, और आरएनए आणविक डिब्बे होना चाहिए और शामिल करें [gt;30% पढ़ता है. हालांकि, इन मीट्रिक को पूरा करने में विफलता स्वचालित रूप से नमूना विफलता ट्रिगर नहीं करता है।
    3. GSP2 नियंत्रण मान प्रति औसत अनन्य प्रारंभ साइट्स का निरीक्षण करें।
      नोट: यह मान प्राइमर से चार गृह व्यवस्था जीन के लिए अनुक्रमण जटिलता का एक उपाय है. इस मीट्रिक नमूने में आरएनए गुणवत्ता का एक महत्वपूर्ण निर्धारक है (यदि जीन के अनुक्रमण के नमूने में व्यक्त किया जा करने की उम्मीद गरीब है, तो एक व्यक्त जीन संलयन का पता लगाने की क्षमता में विश्वास कम है). इस मेट्रिक की कटऑफ 20 है। किसी भी नमूना 20 से कम एक मान प्रदर्शित करता है, तो कोई उच्च विश्वास संलयन पाया जाता है, तो नमूना के लिए परिणाम uninformative के रूप में रिपोर्ट किया जाना चाहिए. इस मीट्रिक की स्थिति भी चलाने के सारांश पृष्ठ में निर्धारित किया जा सकता है (स्थिति फ्यूजन QC के रूप में सूचीबद्ध किया जाएगा: पास या फ्यूजन QC: अद्वितीय आरएनए GSP2 नियंत्रण प्रारंभ साइट्स की संख्या कम कि क्या मान से अधिक है या कम से कम 20) के आधार पर. एक नमूना है कि इस QC मीट्रिक पारित नहीं किया था में एक उच्च विश्वास संलयन अभी भी अगर यह असली होने के लिए निर्धारित किया जाता है रिपोर्ट किया जा सकता है (नीचे देखें). सामान्यतया, इस मीट्रिक का उपयोग करके उच्च QC स्कोरकम प्रेसेक Ct स्कोर के साथ सहसंबंधित होते हैं, जैसा कि अपेक्षित है (चित्र 2)।
  4. फ्यूजन कॉल व्याख्या
    1. ध्यान से मजबूत साक्ष्य टैब के तहत हर बुलाया संलयन जांच (प्रणाली द्वारा बुलाया मजबूत सबूत संलयन के बहुमत artifactual हैं). इसके अलावा कमजोर सबूत संलयन बिन स्कैन, हालांकि इस बिन में एक गैर-कृत्रिम संलयन की उपस्थिति एक अत्यंत दुर्लभ घटना है. संलयन की वैधता का आकलन करने के लिए, पहले रीड्स ($/%) और प्रारंभ साइट्स मैट्रिक्स पर ध्यान दें.
      नोट: आम तौर पर, एक बुलाया संलयन में विश्वास बढ़ जाती है उच्च इन मैट्रिक्स हैं. फ्यूजन कि कम से कम 5 शुरू साइटों द्वारा समर्थित हैं और समर्थन प्राइमर से पढ़ता के कम से कम 10% artifactual जा रहा है के रूप में अत्यधिक संदिग्ध माना जाना चाहिए.
    2. फ़िल्टर स्तंभ में प्रदर्शित चिह्नों का नोट बनाएँ.
      नोट: इन चिह्नों के कई एक artifactual कॉल के एक संभावित स्रोत के उपयोगकर्ता चेतावनी. इन के बीच अक्सर (और मुख्य रूप से बुलाया संलयन के कमजोर सबूत बिन में पाया) उदाहरण हैं जहां भागीदारों paralogs जाना जाता है या अनुक्रम में एक दूसरे के लिए समानता दिखाने (होने की संभावना गलत प्राइमिंग या गलत संरेखण का संकेत). artifactual संलयन कॉल का एक अन्य आम स्रोत तब होता है जब संलयन का समर्थन पढ़ता है एक उच्च त्रुटि दर है कि संदर्भ जीनोम के लिए गरीब मानचित्रण का संकेत है होते हैं, और यह एक अलग आइकन के साथ जुड़ा हुआ है. Transcriptional पठन-पाठन ईवेंट किसी अन्य चिह्न के माध्यम से पहचाने जाते हैं. ये आम हैं और आम तौर पर नजरअंदाज कर रहे हैं. कई अन्य चिह्न भी उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस में उपयोग किया जाता है, लेकिन सभी का एक पूरा विवरण इस आलेख के क्षेत्र से बाहर है। आम तौर पर आगे की जांच के बिना नजरअंदाज किया जा सकता है कि आम कलाकृतियों में शामिल हैं: ADCK4-NUMBL, SYN2-PPARG, DGKG-ETV5, ETV6-AXL, ETV1-ERG, ETV4-ETV1, FGFR3-PDGFRB, EGFR-NTRK1, RAF1-RET, AL-RET, RET, NTRT, और FCGR2C-MAST.
    3. उपयोगकर्ता को व्यक्तिगत संलयन-समर्थन वाले reads के pileups के एक वेब-आधारित JBrowse दृश्य के लिए उपयोगकर्ता लेता है जो उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस में Visualize लिंक पर क्लिक करके प्रत्येक संभावित संलयन के लिए समर्थन पढ़ता विज़ुअलाइज़ करें। पुष्टि करें कि पढ़ता आम तौर पर बेमेल से मुक्त कर रहे हैं (हालांकि कुछ शोर की उम्मीद की जा रही है), कि एक महत्वपूर्ण अनुपात (आदर्श gt; 30 कुर्सियां) पढ़ता के संलयन साथी के लिए संरेखित करें, और कि अनुक्रम तुरंत जीन के बीच विराम बिंदु के निकट और प्राइमर बाइंडिंग साइट्स सम्मिलन या विलोपन से मुक्त हैं. पुष्टि करें कि गठबंधन अनुक्रम प्राइमर के लिए प्राइमर बाध्यकारी दृश्यों के 3 भाग शामिल है कि संलयन का समर्थन पढ़ता है (यदि 3' भाग शामिल नहीं हैं, यह गलत-प्राइमिंग का एक संकेत हो सकता है).
    4. यदि दोनों जीनों के कोडन अनुक्रम संलयन में शामिल हैं, तो सुनिश्चित करें कि 3' साथी फ्रेम में रहता है। इंटरफ़ेस में अनुवाद लिंक पर क्लिक करें (जो प्रत्येक संदर्भ अनुक्रम संयोजन के लिए एक सही या गलत स्थिति दे देंगे) और भी मैन्युअल रूप से पुष्टि करें कि संलयन एक में बुलाया विराम बिंदु के निरीक्षण के माध्यम से फ्रेम में है जीनोम ब्राउज़र. कॉल विराम बिंदु संलयन योजनाबद्ध में लाल डॉट्स पर माउस मँडरा द्वारा निर्धारित किया जा सकता है.
      नोट: के बाद से सबसे (लेकिन सभी नहीं) वैध संलयन के लिए जीनोमिक विराम बिंदु intronic क्षेत्रों में होते हैं और पूरे exons के साथ splicing में परिणाम, संलयन जिसमें exon सीमाओं दोनों भागीदारों के लिए विराम बिंदु शामिल आम तौर पर एक उच्च डिग्री के साथ देखा जाता है विश्वास की. हालांकि, के बाद से वहाँ संलयन में मध्य-exonic विराम बिंदु के कई प्रकाशित उदाहरण हैं, यह एक संलयन की व्याख्या में पूर्ण मानदंडों के रूप में इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए.
    5. प्रत्येक संलयन के लिए, मैन्युअल रूप से सुनिश्चित करें कि विराम बिंदु के निकट दृश्यों प्रत्येक साथी के लिए अगले अपेक्षित निरंतर आधार के लिए समजात नहीं हैं। एक जीनोम ब्राउज़र में सभी संभव आसन्न exons निरीक्षण.
      नोट: दो जीन भागीदारों के बीच होमोलोजी के कारण कृत्रिम संलयन का एक सामान्य स्रोत गलत संरेखण या गलत-प्राइमिंग है, और यह हमेशा ऊपर वर्णित माउस के माध्यम से सिस्टम द्वारा नहीं कहा जाता है।

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Representative Results

चित्र 3में दिखाया गया है, चित्र 4 और चित्र 5 विश्लेषण उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस से स्क्रीनशॉट एक फेफड़ों एडेनोकार्सीनोमा नमूने से परिणामों का प्रदर्शन कर रहे हैं. चित्र 3में, नमूना सारांश (ऊपर) दिखाया गया है जो कहा जाता है मजबूत सबूत संलयन, साथ ही QC स्थिति (लाल रंग में वृत्त) सूचीबद्ध करता है। ADCK4-NUMBL संलयन (जिसमें से 3 isoforms सूचीबद्ध हैं) तुरंत नजरअंदाज कर दिया है क्योंकि यह एक लगातार ट्रांसक्रिप्शनल रीडथ्रू घटना है (सूची के बगल में टूटे सर्कल माउस द्वारा नोट). चित्र 3 का निचला भाग सांख्यिकी पृष्ठ का स्क्रीनशॉट है. विशेष रूप से जानकारीपूर्ण मैट्रिक्स हरे रंग में वृत्त रहे हैं. नमूना की पास/विफलता प्रकृति निर्धारित करने वाली महत्वपूर्ण QC मीट्रिक लाल रंग में हाइलाइट की जाती है (यह वह मीट्रिक है जो ऊपर सारांश में पास/विफलता स्थिति निर्धारित करती है). यदि यह मान 20 से नीचे है, तो एक नकारात्मक संलयन परिणाम को 'असूचनात्मक' माना जाता है। चित्र ााला 4 और चित्र ाााू 5, संलयन स्केमेटिक्स (ऊपर) के स्क्रीनशॉट और संलयन सबे के JBrowse विचार हैं, जो आगे की जाँच के लिए दो संलयनों के लिए (नीचे) पढ़ते हैं. KIF5B-RET संलयन (चित्रा 4) समर्थन पढ़ता है की एक उच्च संख्या को दर्शाता है, संलयन का समर्थन प्राइमर से पढ़ता है की एक उच्च %, और शुरू साइटों की एक उच्च संख्या. इसके अतिरिक्त, संलयन साथी के कई आसन्न exons (KIF5B) संरेखण में शामिल किए गए हैं, संलयन फ्रेम में होने के लिए सत्यापित किया गया था, और संलयन का समर्थन पढ़ता आम तौर पर बेमेल से मुक्त कर रहे हैं. इन कारणों के लिए, संलयन वास्तविक और reportable समझा जाता है. LOC101927681-PDGFRB संलयन (चित्र 5) कम समर्थन मैट्रिक्स को दर्शाता है. इसके अलावा, साथी के लिए मानचित्रण पढ़ता के हिस्से अपेक्षाकृत कम कर रहे हैं और एक उच्च त्रुटि दर है, जो दृढ़ता से misalignment और एक artifactual संलयन कॉल पता चलता है होते हैं. अंत में, PDGFRB के intronic अनुक्रम शामिल है, आगे एक कलाकृति का सुझाव (सबसे, लेकिन सभी नहीं, वैध संलयन अनुक्रम है कि दोनों जीन के क्षेत्रों कोडिंग के लिए नक्शे की पूरी तरह शामिल हैं). इन कारणों के लिए, इस संलयन एक कलाकृति और reportable नहीं समझा जाता है.

Figure 1
चित्र 1: AMP दृष्टिकोण का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. लक्ष्य संवर्धन के लिए पारंपरिक amplicon-मध्यस्थ दृष्टिकोण तथ्य यह है कि प्राइमर सभी संलयन भागीदारों के लिए आवश्यक हैं द्वारा सीमित कर रहे हैं. इस प्रकार, उपन्यास संलयन भागीदारों का पता नहीं लगाया जाएगा. एएमपी में, विरोधी प्राइमर एडाप्टर के लिए विशिष्ट है, इस प्रकार उपन्यास भागीदारों का पता लगाया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: PreSeQ QC स्कोर और बाद अनुक्रम QC के बीच सहसंबंध. PreSeQ Ct और GSP2 नियंत्रण मान प्रति औसत अद्वितीय प्रारंभ साइट्स 100 नमूनों की एक श्रृंखला के लिए सहसंबद्ध थे। आम तौर पर, जैसा कि उम्मीद थी, कम PreSeQ स्कोर उच्च SS/GSP2 मूल्यों के साथ सहसंबंधित (दोनों अच्छी गुणवत्ता आरएनए के संकेतक हैं). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: उदाहरण नमूना सारांश और पढ़ें आँकड़ों के दृश्य. शीर्ष: सूचीबद्ध मजबूत सबूत संलयन के साथ यूजर इंटरफेस में एक नमूना सारांश का दृश्य. नीचे: उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस में पढ़ा आँकड़े पृष्ठ का दृश्य. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: एक वैध संलयन कॉल का उदाहरण. शीर्ष: उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस में संलयन योजनाबद्ध का दृश्य. नीचे: व्यक्ति के JBrowse दृश्य संलयन का समर्थन पढ़ता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: एक कृत्रिम संलयन कॉल का उदाहरण। शीर्ष: उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस में संलयन योजनाबद्ध का दृश्य. नीचे: व्यक्ति के JBrowse दृश्य संलयन का समर्थन पढ़ता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

AKT3 EWSR1 NOTCH1 PRKCA
अलके FGFR1 NOTCH2 PRKCB
ARHGAP26 एफजीएफआर2 एनआरजी 1 आरएएफ 1
AXL FGFR3 NTRK1 रेला
BRAF एफजीआर NTRK2 Ret
बीआरडी3 आई.एस.आर. NTRK3 ROS1
बीआरडी4 एमएएमएल2 NUMBL आरएसपीओ 2
ईजीएफआर MAST1 NUTM1 आरएसपीओ3
ईआरजी MAST2 पीडीजीएफआरए TERT
ईएसआर1 मिले पीडी जीएफआरबी TFE3
ईटीवी1 एमएसएमबी PIK3CA TFEB
ईटीवी4 कस्तूरी PKN1 थाडा
ईटीवी5 MYB पी.पी.आर.जी. TMPRSS2
ईटीवी6
परख विभिन्न exons के लिए जीन-विशिष्ट प्राइमर शामिल (और कुछ introns) ऊपर 53 जीन में.

अनुपूरक सारणी 1: जीनों की सूची जिनके लिए जीन-विशिष्ट प्राइमर को परख (विभिन्न एक्सऑन और इनट्रॉन्स) में शामिल किया जाता है।

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Discussion

लंगर वाले मल्टीप्लेक्स पीसीआर-आधारित लक्ष्य संवर्धन और पुस्तकालय की तैयारी अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के बाद नैदानिक ट्यूमर के नमूनों में मल्टीप्लेक्स जीन संलयन मूल्यांकन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। जीनोमिक डीएनए के बजाय आरएनए इनपुट पर ध्यान केंद्रित करके, बड़े और दोहराए introns अनुक्रम की जरूरत से बचा जाता है. इसके अतिरिक्त, चूंकि यह दृष्टिकोण संलयन साथी की पहचान की परवाह किए बिना जीन संलयनों को बढ़ाता है, उपन्यास संलयनों का पता लगाया जाता है। यह नैदानिक दायरे में एक महत्वपूर्ण लाभ है , और वहाँ एएमपी के माध्यम से पहचान की कार्रवाई योग्य उपन्यास जीन संलयन के कई उदाहरण हैं साहित्य21,22,23,24में सूचना दी, 25.

चूंकि परख आरएनए आधारित है, यह प्रसंस्करण के दौरान नमूनों में आरएनए गुणवत्ता को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। यह भी निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है जो नमूने आरएनए अनुक्रमण का उत्पादन किया है कि नकारात्मक संलयन परिणामों पर भरोसा करने के लिए बहुत गरीब है. यह प्राइमर से चार हाउसकीपिंग जीन के अनुक्रमण डेटा के आकलन से हासिल किया जाता है। यदि इन जीनों का अनुक्रमण खराब है, तो नकारात्मक संलयन परिणामों को असूचनात्मक माना जाता है। इसके अलावा, परख में जटिलता और गीला बेंच कदम की भीड़ को देखते हुए, यह हर परख रन में एक संलयन सकारात्मक नियंत्रण शामिल करने के लिए महत्वपूर्ण है. ऐसा करने से, समझौता परख रन नियंत्रण में अपेक्षित संलयन घटनाओं के विश्लेषण के माध्यम से स्पष्ट हो जाते हैं.

सभी amplicon आधारित दृष्टिकोण के साथ के रूप में, एएमपी व्यक्तिगत प्राइमर प्रदर्शन पर अत्यधिक निर्भर है. जब कई जीन के कई exons का आकलन, यह अनिवार्य है कि कुछ प्राइमर के रूप में अच्छी तरह से दूसरों के रूप में प्रदर्शन नहीं होगा. इसलिए, यह उपयोगकर्ताओं के लिए महत्वपूर्ण है पता है, जहां परख प्राइमर अक्षमता के कारण underperforms. इसके अतिरिक्त, NGS आधारित परख जटिल bioinformatic डेटा विश्लेषण की आवश्यकता है. यदि कार्यरत एल्गोरिदम सोच समझकर डिजाइन नहीं किए गए हैं, तो गलत-नकारात्मक और गलत-सकारात्मक परिणाम होने की संभावना है। यह बहुत महत्वपूर्ण है कि विश्लेषण एल्गोरिदम द्वारा बुलाया सभी जीन संलयन मैन्युअल रूप से उपयोगकर्ता द्वारा निरीक्षण किया जाना है.

कार्रवाई योग्य जीन संलयन ों कि नैदानिक ट्यूमर नमूनों में मूल्यांकन किया जाना चाहिए की एक बढ़ती सूची के साथ, एएमपी की तरह बहुसंकेतित परख का उपयोग नैदानिक प्रयोगशालाओं में वृद्धि जारी रहेगा. तकनीक के भविष्य के अनुप्रयोगों की संभावना एक परख के भीतर संलयन और उत्परिवर्तन मूल्यांकन के संयोजन पर ध्यान दिया जाएगा. आणविक परख दृष्टिकोण के बावजूद, उपयोगकर्ताओं को हमेशा परख सीमाओं के बारे में पता होना चाहिए और हमेशा गुणवत्ता नियंत्रण मैट्रिक्स स्थापित करने के लिए डेटा व्याख्या मार्गदर्शन करना चाहिए.

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Disclosures

D.L.A. Bayer कैंसर विज्ञान, Genentech, AbbVie, और ब्रिस्टल मायर्स स्क्विब से परामर्श शुल्क प्राप्त हुआ है. के.डी.डी. ArcherDx से प्रायोजित यात्रा प्राप्त की है.

Acknowledgments

यह काम कोलोराडो विश्वविद्यालय के आणविक पैथोलॉजी साझा संसाधन द्वारा समर्थित किया गया था (राष्ट्रीय कैंसर संस्थान कैंसर केंद्र सहायता अनुदान नहीं. P30-CA046934) और निजीकृत चिकित्सा के लिए कोलोराडो केंद्र द्वारा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mM Tris HCl pH 8.0 IDT 11-05-01-13 Used for TNA dilution
1M Tris pH 7.0 Thermo Fisher AM9850G Used in library pooling
25 mL Reagent Reservoir with divider USA Scientific 9173-2000 For use with multi-channel pipetters and large reagent volumes
96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-natural USA Scientific 1402-9700 Plate used for thermocycler steps
Agencourt AMPure XP Beads Beckman Coulter A63881 Used in purification after several assay steps
Agencourt Formapure Kit Beckman Coulter A33343 Used in TNA extraction
Archer FusionPlex Solid Tumor kit ArcherDX AB0005 This kit contains most of the reagents necessary to perform library preperation for Illumina sequencing (kits for Ion Torrent sequencing are also available)
Cold block, 96-well Light Labs A7079 Used for keeping samples chilled at various steps
Ethanol Decon Labs DSP-MD.43 Used for bead washes
Library Quantification for Illumina Internal Control Standard Kapa Biosystems KK4906 Used for library quantitation
Library Quantification Primers and ROX Low qPCR mix Kapa Biosystems KK4973 Used for library quantitation
Library Quantification Standards Kapa Biosystems KK4903 Used for library quantitation
Magnet Plate, 96-well (N38 grade) Alpaqua A32782 Used in bead purificiation steps
MBC Adapters Set B ArcherDX AK0016-48 Adapters that contain sample-specific indexes to enable multiplex sequencing
Micro Centrifuge USA Scientific 2641-0016 Used for spinning down PCR tubes
MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well Plate Thermo-Fisher 4483485 Used for Pre-Seq QClibrary quantitation
Microamp Optical Film Compression Pad Applied Biosystems 4312639 Used for library quantitation
Mini Plate Spinner Labnet MPS-1000 Used for collecing liquid at bottom of plate wells
MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle) Illumina MS-102-3003 Contains components necessary for a MiSeq sequencing run
MiSeqDx System Illumina NGS Sequencing Instrument
Model 9700 Thermocycler Applied Biosystems Used for several steps during assay
nuclease free water Ambion 9938 Used as general diluent
Optical ABI 96-well PCR plate covers Thermo-Fisher 4311971 Used for Pre-Seq QClibrary quantitation
PCR Workstation Model 600 Air Clean Systems BZ10119636 Wet-bench assay steps performed in this 'dead air box'
Proteinase K Qiagen 1019499 Used in TNA extraction
QuantStudio 5 Applied Biosystems LSA28139 qPCR instrument used for PreSeq and library quantitation
Qubit RNA HS Assay Kit Life Technologies Q32855 Use for determing RNA concentration in TNA samples
RNase Away Fisher 12-402-178 Used for general RNase decontamination of work areas
Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v2 SeraCare 0710-0129 Used as the assay positive control
Sodium Hydroxide Fisher BP359-212 Used in clean-up steps and for sequencing setup
SYBR Green Supermix Bio Rad 172-5120 Component of PreSeq QC Assay
TempAssure PCR 8-tube Strips USA Scientific 1402-2700 Used for reagent and sample mixing etc.
Template RT PCR film USA Scientific 2921-7800 Used for covering 96-well plates
U-Bottom 96-well Microplate LSP MP8117-R Used during bead purification

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References

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Seager, M., Aisner, D. L., Davies, K. D. Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (149), e59895, doi:10.3791/59895 (2019).

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