Summary
Denna artikel specificerar användningen av en förankrad multiplex polymeras kedjereaktion-baserade bibliotek förberedelse kit följt av nästa generations sekvensering för att bedöma för onkogena gen fusioner i kliniska fasta tumörprover. Både våt-bänk och dataanalys steg beskrivs.
Abstract
Gen fusioner bidrar ofta till den onkogena fenotypen hos många olika typer av cancer. Dessutom, närvaron av vissa fusioner i prover från cancerpatienter ofta direkt påverkar diagnos, prognos, och/eller terapi urval. Som ett resultat har korrekt detektion av gen fusioner blivit en kritisk komponent i klinisk hantering för många sjukdomstyper. Tills nyligen, klinisk gen fusion upptäckt var främst åstadkommas genom användning av engenstester. Den ständigt växande förteckningen över gen fusioner med klinisk betydelse har dock skapat ett behov av att bedöma fusions status för flera gener samtidigt. Nästa generations sekvensering (NGS)-baserad testning har uppfyllt denna efterfrågan genom förmågan att sekvensera nukleinsyra i massivt parallella sätt. Flera NGS-baserade metoder som använder olika strategier för gentarget berikning är nu tillgängliga för användning i klinisk molekylär diagnostik, var och en med sina egna styrkor och svagheter. Denna artikel beskriver användningen av förankrade Multiplex PCR (AMP)-baserade mål berikning och bibliotek förberedelse följt av NGS att bedöma för gen fusioner i kliniska fasta tumörprover. AMP är unik bland amplicon-baserade berikningsmetoder genom att den identifierar gen fusioner oavsett identiteten hos fusions partnern. Detaljerade här är både våt-bänk och dataanalys steg som säkerställer korrekt gen fusion upptäckt från kliniska prover.
Introduction
Fusion av två eller flera gener till en enda transkriptionell enhet kan inträffa som ett resultat av storskaliga kromosomala variationer inklusive borttagningar, dubbleringar, infogningar, inversioner och translokationer. Genom förändrad transkriptionell kontroll och/eller förändrade funktionella egenskaper hos den uttryckta genprodukten kan dessa fusions gener ge onkogena egenskaper till cancerceller1. I många fall är fusions gener kända för att fungera som primära onkogena förare genom att direkt aktivera cellulär proliferation och överlevnads vägar.
Den kliniska relevansen av gen fusioner för cancerpatienter blev först uppenbar med upptäckten av Philadelphia-kromosomen och motsvarande BCR-ABL1 fusions gen vid kronisk myelogen leukemi (KML)2. Den lilla molekyl hämmaren imatinib mesylate utvecklades för att specifikt rikta in sig på denna fusions gen och uppvisade anmärkningsvärd effekt hos BCR-ABL1-positiva KML-patienter3. Terapeutisk inriktning av onkogena gen fusioner har också varit framgångsrik i solida tumörer, med hämning av ALK och ROS1 fusion gener i icke-småcellig lungcancer som fungerar som primära exempel4,5. Nyligen, den NTRK inhibitor larotrectinib var FDA godkänt för NTRK1/2/3 fusion-positiva solida tumörer, oavsett sjukdoms plats6. Utöver terapi val, gen fusion upptäckt har också roller i sjukdomsdiagnos och prognos. Detta är särskilt utbredd i olika sarkom och hematologiska malignitet subtyper som är diagnostiskt definieras av närvaron av specifika fusioner och/eller för vilka förekomst av en fusion direkt informerar prognosen7,8 , 9 , 10 , 11. Detta är bara några exempel på klinisk tillämpning av detektion av gen fusion för cancerpatienter.
På grund av den kritiska roll i kliniskt beslutsfattande, noggrann gen fusion detektion från kliniska prover är av avgörande betydelse. Många tekniker har tillämpats i kliniska laboratorier för fusion eller kromosom rearrangering analys inklusive: cytogenetiska tekniker, omvänd Transkription polymeras kedjereaktion (RT-PCR), fluorescens in situ hybridisering (fisk), immunohistokemi (IHC), och 5 '/3 ' Expression obalans analys (bland annat)12,13,14,15. För närvarande, den snabbt växande lista över angripbara gen fusioner i cancer har resulterat i behovet av att bedöma fusions status av flera gener samtidigt. Följaktligen, vissa traditionella tekniker som bara kan fråga en eller några gener i taget blir ineffektiva metoder, särskilt när man överväger att kliniska tumör prover är ofta mycket ändlig och inte mottagliga för att delas upp bland flera analyser. Nästa generations sekvensering (NGS) är dock en analysplattform som lämpar sig väl för flergenstester, och NGS-baserade analyser har blivit vanliga i laboratorier för klinisk molekylär diagnostik.
För närvarande används NGS analyser för fusion/rearrangering upptäckt varierar med avseende på använt material, kemiska sammansättningar som används för bibliotek beredning och mål berikning, och antalet gener tillfrågade inom en analys. NGS-analyser kan baseras på RNA eller DNA (eller båda) som utvinns ur provet. Även om RNA-baserad analys hämmas av tendensen hos kliniska prover att innehålla kraftigt försämrad RNA, kringgår det behovet av att sekvensera stora och ofta repetitiva introner som är målen för DNA-baserade fusions test men har visat sig vara svåra för NGS dataanalys16. Mål beriknings strategier för RNA-baserade NGS-analyser kan till stor del delas in i hybrid fångst eller amplicon-medierade metoder. Även om båda strategierna framgångsrikt har utnyttjats för fusion Detection, varje innehåller fördelar jämfört med de andra17,18. Hybrid Capture-analyser resulterar i allmänhet i mer komplexa bibliotek och minskad alleliska dropout, medan amplicon-baserade analyser i allmänhet kräver lägre indata och resulterar i mindre off-Target-sekvensering19. Men kanske den primära begränsningen av traditionella amplicon-baserade berikning är behovet av primers till alla kända fusion partners. Detta är problematiskt eftersom många kliniskt viktiga gener är kända för att smälta samman med dussintals olika partners, och även om primer design tillåts för detektering av alla kända partners, nya fusion händelser skulle förbli oupptäckta. En nyligen beskrivna teknik kallas förankrade Multiplex PCR (eller AMP för kort) adresser denna begränsning20. I amp är en halv funktionell ngs-adapter och ligaturer till cDNA-fragment som härleds från ingångsrna. Mål berikningen uppnås genom amplifiering mellan genspecifika primers och en primer till adaptern. Som ett resultat av detta bör alla fusioner till gener av intresse, även om en ny fusion partner berörs, upptäckas (se figur 1). Denna artikel beskriver användningen av ArcherDx FusionPlex solid tumör kit, en NGS-baserad analys som sysselsätter AMP för mål berikning och bibliotek förberedelse, för detektion av onkogen gen fusioner i fasta tumörprover (se kompletterande tabell 1 för fullständiga gen listan). Wet-Bench protokoll och dataanalys steg har noggrant validerats i en klinisk laboratorie förbättring ändringar (CLIA)-certifierade laboratorium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. förberedelse av bibliotek och sekvensering
- Allmänna assay överväganden och pre-assay steg
- Analyskörningar består vanligtvis av sju kliniska prover och en positiv kontroll (även om antalet prover per biblioteks förberedelse körning kan justeras vid behov). Använda en positiv kontroll som innehåller minst flera gen fusioner (att analysens mål) som har bekräftats av en tillverkare och/eller har bekräftats genom en ortogonal metod. En icke-mall kontroll (NTC) måste ingå som ett ytterligare prov i varje analys körs, men endast transporteras genom andra del cDNA syntes och pre-sekvensering kvalitetskontroll (pre-SEQ QC; för att säkerställa ingen cDNA-syntes). Använd provspädningsmedel (10 mM Tris HCl pH 8,0) för NTC.
- Utför total nukleinsyra (TNA) extraktion av formalin-fast paraffin-inbäddade (FFPE) vävnad.
- Kvantifiera RNA-komponenten i TNA med hjälp av en fluorometrisk analys.
Anmärkning: förhindra RNA-nedbrytning i proverna genom att begränsa frys-Tina cykler, hålla tinade nukleinsyra vid låg temperatur (kyld block, is, eller alternativ), och förhindra RNase förorening (bär handskar, med hjälp av en RNase dekontaminator spray).
- Slumpmässig priming
Anmärkning: den önskade ingången för analysen är 200 ng RNA (baserat på den fluorometriska kvantifiationen av TNA). Lägre ingångar kan användas om 200 ng inte kan uppnås. Om exemplet misslyckas efter sekvensering QC, kan upprepa med högre indata resultera i godtagbara QC-mått.- Späd TNA i 10 mM Tris HCl pH 8,0 för att uppnå önskad RNA-koncentration. För varje prov ska 20 μL av utspädningen överföras till de slumpmässiga reagenskensrören (placerade i förkyld aluminiumblock) och blandas genom pipettering upp och ned 6 − 8 gånger. Snurra kort och överför hela volymen till en 96 väl PCR-platta och försegla med RT-film.
- Skär plattan i termocyklern block, täck med kompression pad, och Stäng locket. Inkubera vid 65 ° c i 5 min (uppvärmt lock).
- Ta bort plattan från termocyklern och placera på isen i 2 min.
- Första programområde cDNA-syntesen
- Överför hela volymen av den slumpmässiga grundnings produkten till de första strand reagensmedels rören (placerade i förkyld aluminiumblock). Blanda genom att Pipettera upp och ner 6 − 8 gånger. Snurra en kort stund, överför hela volymen till en 96 väl PCR-platta och försegla med RT-film.
- Skär plattan i termocyklern block, täck med kompression pad, och Stäng locket. Kör termocyklern program: 25 ° c 10 min, 42 ° c 30 min, 80 ° c 20 min, 4 ° c Håll (uppvärmd lock).
- Andra programområde cDNA-syntesen
- I en ny uppsättning PCR-bandrör, skapa en 1:10 utspädning av den första del produkten genom att tillsätta 1 μL första strand produkt till 9 μL nukleasfritt vatten. Ställ in utspädning åt sidan för att användas i pre-SEQ QC-analysen.
- Tillsätt 21 μL nukleasfritt vatten till den kvarvarande första strand produkten. Överför 40 μL av den första del produkten och nukleasfritt vatten till det andra strand reagensmedels röret (placerat i förkyld aluminiumblock). Blanda genom att Pipettera upp och ner 6 − 8 gånger. Snurra ner, överför hela volymen till en 96 väl PCR-platta och försegla med RT-film.
- Skär plattan i termocyklern block, täck med kompression pad, och Stäng locket. Kör termocyklern program: 16 ° c 60 min, 75 ° c 20 min, 4 ° c Håll (uppvärmd lock).
Anmärkning: Detta är en acceptabel stopp punkt. Plattan kan förvaras vid-20 ° c.
- Pre-SEQ QC
Anmärkning: denna kvalitetskontroll (QC)-analys används främst för verifiering av ingen cDNA-syntes från NTC. Men data kan också vara informativ i analysen felsökning. Till exempel, om ett prov har en bra pre-SEQ QC värde men dålig assay Metrics (se nedan) då det kan vara en indikation på ett problem i analysen köra, vilket kräver en upprepning.- Kör varje prov och NTC i två exemplar. Också omfatta i pre-SEQ QC köra en reaktion NTC, som är Nuclease gratis vatten (även köras i två exemplar). Till varje tillämplig brunn på en optisk 96 väl plattan Tillsätt 5 μL av analysen Master Mix, 1 μL av 10X VCP primer, och 4 μL av 1:10 utspädning av första delprodukt som skapades i steg 1.4.1.
- Försegla plattan med RT-film, snurra ner och lasta i ett kvantitativt PCR-instrument (qPCR). Kör programmet: pre-amp: 1 cykel 95 ° c 20 s, amp: 35 cykler 95 ° c 3 s (4,4 ° c/s ramp Rate) − 60 ° c 30 s (2,2 ° c/s ramp Rate).
- Bekräfta avsaknaden av ett värde för cykel tröskel (CT) för både analysen NTC och reaktions-NTC.
Anmärkning: om det inte finns någon CT observerad i analysen NTC kommer den inte längre att föras vidare i analysen. Observation av ett Ct-värde i reaktionen NTC kräver en upprepning av pre-SEQ QC-analysen. Observation av en CT i analysen NTC föreslår prov kontamination någon gång före i analysen, vilket kräver att hela analysen (alla prover) startas över. Pre-SEQ QC CT-värdet för ett adekvat kvalitetsprov bör vara under 30 (lägre CT-värden korrelerar med mer produkt och därmed högre kvalitet RNA). Värden över 30 är inte absoluta indikatorer på misslyckande och dessa prov bör fortsätta i analysen. Alla uppgifter som härrör från sådana prover bör dock granskas noggrant, särskilt i fall där ingen fusion kallas.
- reparation och pärla rening
- Överför 40 μL av den andra del produkten till reparations reagensbandröret (placerat i förkyld aluminiumblock). Blanda genom att Pipettera upp och ner 6 − 8 gånger, snurra ner och placera i termocyklern block (hålla det uppvärmda locket öppet) och kör termocyklern programmet: 25 ° c 30 min, 4 ° c Hold.
- Ta bort renings kulor från 4 ° c och låt jämvikt till rumstemperatur. Gör upp tillräckligt med 70% etanol för att hålla hela biblioteket beredning. Vortex pärlor väl före användning och Pipettera 100 μL i lämpligt antal brunnar i en U-bottenplattan.
Anmärkning: för varje 8 prover som körs, 20 mL 70% etanol kommer att behövas. - Tillsätt hela volymen av reparations produkten till pärlorna. Pipet upp och ner 6 − 8 gånger för att blanda och inkubera i rumstemperatur i 5 min, följt av en 5 minuters inkubering på magneten.
- Ta bort och Kassera supernatanten och utför 2 200 μL 70% etanol tvättar med 30-s inkuberingar. Efter den sista tvätten ta bort alla 70% etanol och låt lufttorka i 5 min.
- Ta bort från magneten och återsuspendera pärlorna i 22 μL 10 mM Tris HCl pH 8,0. Inkubera från magneten i 3 minuter följt av en 2-minuters inkubering på magneten. Fortsätt omedelbart till ligationssteg 1.
- Ligationssteg 1 och pärlrening
- Överför 20 μL från änd reparation pärla renings plattan (noga med att inte störa pärla pellet) i ligering steg 1 band rör (placeras i pre-kyld aluminiumblock). Blanda genom att Pipettera upp och ner 6 − 8 gånger, snurra ner och överför hela volymen till en 96 väl PCR-platta.
- Skär plattan i termocyklern block, täck med kompression pad och Stäng locket. Kör termocyklern program: 37 ° c 15 min, 4 ° c Håll (uppvärmd lock).
- Ta bort renings kulor från 4 ° c och låt jämvikt till rumstemperatur. Vortex pärlor väl före användning och Pipettera 50 μL i lämpligt antal brunnar i en U-bottenplattan.
- Tillsätt hela volymen av ligationssteg 1 produkt till pärlorna. Pipet upp och ner 6 − 8 gånger för att blanda och inkubera i rumstemperatur i 5 min, följt av en 5 minuters inkubering på magneten.
- Ta bort och Kassera supernatanten och utför 2 200 μL 70% etanol tvättar med 30-s inkuberingar. Efter den sista tvätten ta bort alla 70% etanol och låt lufttorka i 5 min.
- Ta bort från magneten och återsuspendera pärlor i 42 μL av 10 mM Tris HCl pH 8,0. Inkubera från magneten i 3 minuter följt av en 2-minuters inkubering på magneten. Fortsätt omedelbart till ligationssteg 2.
- Ligering steg 2 och pärla rening
- Ta bort molekylär streckkod (MBC) adapter Strip rör reagenser från 4 ° c lagring. Korrekt numrering av MBC-adapterremsan är av avgörande betydelse eftersom exempelspecifika index läggs till i detta skede. Placera rören horisontellt med gångjärnen på bak och Använd en permanent markör för att märka rören 1, 2, 3... från vänster till höger. Det är också viktigt att registrera exempelspecifika index för sekvenserings ändamål (de måste anges i Sequencer-kalkylblad).
- Överför 40 μL från ligationssteg 1 pärla renings plattan (noga med att inte störa pärla pellet) till MBC adapter band rören (placerade i pre-kylda aluminiumblock). Blanda genom att Pipettera upp och ner 6 − 8 gånger.
- Snurra och överför hela volymen till ligationssteg 2 reagensbandrör (även placerade i förkyld aluminiumblock). Blanda genom att Pipettera upp och ner 6 − 8 gånger, snurra ner och placera i termocyklern block. Med det uppvärmda locket av kör termocyklern programet: 22 ° c 5 min, 4 ° c håll.
Anmärkning: Detta är en säker stopp punkt och prover kan förvaras vid-20 ° c. - Ta bort ligationsrensning pärlor från 4 ° c lagring och låt jämvikt till rumstemperatur. Förbered 1 mL färsk 5 mM NaOH.
- Vortex ligationsrengöring pärlor och tillsätt 50 μL till en ny uppsättning av PCR-bandrör. Inkubera på magneten i 1 min. Efter 1-min inkubation ta bort och Kassera supernatanten. Ta bort bandrör från magnet och återsuspendera i 50 μL av ligationsaneringbufferten genom att Pipettera upp och ner 6 − 8 gånger.
- Överföra hela volymen av ligering steg 2 produkten i ligering rensning pärla band rören. Blanda proverna med vortexa och inkubera i rumstemperatur i 5 min. Återigen, blanda prover genom vortexa och inkubera i rumstemperatur för ytterligare 5 min. Efter den andra 5-min inkubering, Blanda proverna med vortexing, snurra kort och inkubera på magneten i 1 min.
- Ta bort och Kassera supernatanten. Tillsätt 200 μL ligationsaneringbuffert och Vortex för att Återsuspendera. Utför en snabb dragning och placera på magneten i 1 min. utföra en andra tvätt med hjälp av ligering rensning buffert igen.
- Efter de två tvättar med ligering rensning buffert utföra en identisk tvätta med ultrarent vatten. Efter ultrarent vatten tvätta re-suspendera pärlorna i 20 μl av 5 mm NaOH och överför till en 96 väl PCR plattan. Placera plattan i termocyklern block med en kompression pad och kör termocyklern programmet: 75 ° c 10 min, 4 ° c Håll (uppvärmd lock).
- Snurra på PCR-plattan när proverna har svalnat till 4 ° c. Placera plattan på magneten i minst 3 minuter och fortsätt omedelbart till första PCR.
- Första PCR-och pärlrening
- Ta bort de första PCR-reagensbandrören från förvaring i 4 ° c och placera dem i ett förkyld aluminiumblock. Ta också bort GSP1 primers från-20 ° c och låt jämvikt till rumstemperatur.
- Tillsätt 2 μL av GSP1 primers till varje brunn av de första PCR-reagensbandrören. Överför 18 μl av Rengöringsprodukten ligering 2 till de första PCR-reagensremrören och blanda genom att Pipettera upp och ned 6 − 8 gånger.
- Snurra och överför till en 96 väl PCR-platta. Placera plattan i termocyklern block med en kompressions dyna och kör termocyklern program: 95 ° c 3 min, 15 cykler 95 ° c 30 s − 65 ° c 5 min (100% ramp Rate), 72 ° c 3 min, 4 ° c Håll (uppvärmd lock).
Anmärkning: Detta är en säker stopp punkt och prover kan förvaras vid 4 ° c över natten eller vid-20 ° c för långtidsförvaring. - Ta bort renings kulor från 4 ° c och låt jämvikt till rumstemperatur. Virvel pärlor väl före användning och Pipettera 24 μL i lämpligt antal brunnar i en U-bottenplattan.
- Överför 20 μL av den första PCR-produkten till 24 μL av pärlorna. Pipet upp och ner 6 − 8 gånger för att blanda och inkubera i rumstemperatur i 5 min, följt av en 2-min inkubering på magneten.
- Ta bort och Kassera supernatanten och utför 2 200 μL 70% etanol tvättar med 30-s inkuberingar. Efter den sista tvätten ta bort alla 70% etanol och låt lufttorka i 2 min.
- Avlägsna från magneten och återsuspendera pärlorna i 24 μL 10 mM Tris HCl pH 8,0. Inkubera från magneten i 3 minuter följt av en 2-minuters inkubering på magneten. Fortsätt omedelbart till andra PCR.
- Andra PCR-och pärlrening
- Ta bort de andra PCR-reagensbandrören från 4 ° c och placera dem i ett förkyld aluminiumblock. Korrekt numrering av de andra PCR-bandrören är av avgörande betydelse eftersom provspecifika index läggs till i detta skede. Placera rören horisontellt med gångjärnen på bak och Använd en permanent markör för att märka rören 1, 2, 3... från vänster till höger. Ta också bort GSP2 primers från-20 ° c och låt jämvikt till rumstemperatur.
Anmärkning: det är också viktigt att registrera exempelspecifika index för sekvenserings ändamål (de måste anges i Sequencer-kalkylblad). - Tillsätt 2 μL av GSP2 primers till varje brunn av andra PCR-reagensbandrör. Överför 18 μL av den första PCR-rensnings produkten till andra PCR-reagensbandrör och blanda genom att Pipettera upp och ned 6 − 8 gånger.
- Snurra och överför till en 96 väl PCR-platta. Placera plattan i termocyklern block med en kompressions dyna och kör termocyklern program: 95 ° c 3 min, 18 cykler 95 ° c 30 s − 65 ° c 5 min (100% ramp Rate), 72 ° c 3 min, 4 ° c Håll (uppvärmd lock).
Anmärkning: Detta är en säker stopp punkt och prover kan förvaras vid 4 ° c över natten eller vid-20 ° c för långtidsförvaring. - Ta bort renings kulor från 4 ° c och låt jämvikt till rumstemperatur. Virvel pärlor väl före användning och Pipettera 24 μL i lämpligt antal brunnar i en U-bottenplattan.
- Överför 20 μL av den andra PCR-produkten till pärlorna. Pipet upp och ner 6 − 8 gånger för att blanda och inkubera i rumstemperatur i 5 min, följt av en 2-min inkubering på magneten.
- Ta bort och Kassera supernatanten och utför 2 200 μL 70% etanol tvättar med 30-s inkuberingar. Efter den sista tvätten ta bort alla 70% etanol och låt lufttorka i 2 min.
- Avlägsna från magneten och återsuspendera pärlorna i 24 μL 10 mM Tris HCl pH 8,0. Inkubera från magneten i 3 minuter följt av en 2-minuters inkubering på magneten. Överför 20 μL av den andra PCR-rensnings produkten till en ny 96 well PCR-platta.
Obs: Detta är en säker stopp punkt och bibliotek kan lagras vid-20 ° c för långtidslagring eller omedelbart gå vidare till biblioteket kvantifiering.
- Ta bort de andra PCR-reagensbandrören från 4 ° c och placera dem i ett förkyld aluminiumblock. Korrekt numrering av de andra PCR-bandrören är av avgörande betydelse eftersom provspecifika index läggs till i detta skede. Placera rören horisontellt med gångjärnen på bak och Använd en permanent markör för att märka rören 1, 2, 3... från vänster till höger. Ta också bort GSP2 primers från-20 ° c och låt jämvikt till rumstemperatur.
- Kvantifiering av bibliotek
- Ta bort bibliotekets kvantifiering Master Mix och standarder från-20 ° c lagring och låt jämvikt till rumstemperatur.
- Utför 1:5 utspädning av alla bibliotek (andra PCR-produkten) med 10 mM Tris HCl pH 8,0 följt av en seriell utspädning av 1:199, 1:199 och 20:80 med 10 mM Tris HCl pH 8,0 0,05% polysorbat. De två sista utspädningar på 1:200000 respektive 1:1000000 kommer att köras i tre exemplar.
- Tillsätt 6 μL Mastermix till varje brunn på en optisk 96-platta följt av 4 μL lämplig utspädning eller standard. Snurra ner plattan och lasta den på qPCR-instrumentet. Använd följande cykel förhållanden: 1 cykel 95 ° c 5 min, 35 cykler 95 ° c 30 s (4,4 ° c/s ramp Rate) − 60 ° c 45 s (2,2 ° c/s ramp Rate).
- Efter att bibliotekets kvantifiering är slutförd och bibliotekets koncentrationer bestäms (genom medelvärdes båda testade utspädningar), normalisera alla bibliotek till 2 nM med 10 mM Tris HCl pH 8,0. Gör bibliotekspoolen genom att kombinera 10 μL av varje normaliserat bibliotek i en 1,5 mL Micro centrifug tub.
- Sekvensering av bibliotek
- Ta bort Sequencer reagens patron från-20 ° c lagring och plats i avjoniserat (DI) vatten upp till fyllningslinjen i minst 1 h. Ta också bort Sequencer reagens kit från 4 ° c och låt jämvikt till rumstemperatur i minst 1 h. Det maximala antalet bibliotek som kan sekvenseras på den här sekvenserings plattformen är 8 (varav en måste vara den positiva kontrollen).
- Gör den denaturerade amplikon Library (dal) pool genom att kombinera 10 μl av bibliotekspoolen med 10 μl av 0,2 N NaOH och inkubera i 5 min vid rumstemperatur. Efter 5-min inkubering tillsätt 10 μL 200 mM Tris HCl pH 7,0, följt av 970 μL av HT1 hybridiseringsbuffert.
- Gör det slutliga laddnings röret genom att kombinera 300 μL av HT1 μl av 20 pM PhiX och 675 μL av DAL bassängen. Virvel och snurra ner Last röret. Lägg till hela volymen av Last röret till provet väl av Sequencer reagens patron och Last kassett i Sequencer kör 2 x 151 BP läser med 2 x 8 index läsningar.
2. analys av data
- Sekvensering av datahantering och analys
- Hämta sekvenserings mått från NGS-instrumentet.
- Se till att sekvenserings data hamnar i nedanstående intervall (specifikt för det paket som används i det här exemplet). Kluster täthet (densitet [K/mm2]): 945 – 1600 K; % av läser passerar filter (kluster PF [%]): > 90%; kvalitetsresultat (% ≥ Q30): > 85%; PhiX-justering (justerad%): 1.5 − 6.0%; PhiX felfrekvens (felfrekvens [%]): < 1,0%; läser att passera filtrerar (läser PF [M]): > 22 miljoner.
Observera: sekvensering körs inte uppfyller dessa mått kan upprepas. - Granska procent av läsningar som tillskrivs varje prov (dvs. varje exempelspecifikt index). För en typisk körning där PhiX Spike-in var ~ 5% och 8 prover sekvenserade, varje prov bör helst redogöra för cirka 11,9% av läsningar. Det acceptabla intervallet för varje prov är 5 − 25%. Om några exempel inte ryms inom det här intervallet upprepar du biblioteks kvantifiering och sekvensering.
- Inlämning av rå sekvensdata till analysalgoritmen
Anmärkning: version 4.1.1.7 av ArcherDx analys beskrivs här. I det här exemplet distribueras analysprogramvara som en "virtuell dator" körs på en intern server. En centralprocessor (CPU) och 12 GB RAM-minne krävs för varje prov som ska analyseras samtidigt (vanligtvis 8 prover bearbetas samtidigt kräver 8 CPU och 96 GB RAM). Behandlingen tar normalt 3 − 8 h.- Använd standard analysinställningar i analyssystemet, med undantag för MIN_AVERAGE_UNIQUE_RNA_START_SITES_PER_GSP2_CONTROLS (detta ändras från 10 till 20) och READ_DEPTH_NORMALIZATION (detta är inställt på 0 för att förhindra nedsampling).
- Om du vill starta ett analysjobb klickar du på utför analys i användargränssnittet, skickar ett namn för jobbet och väljer sedan de nödvändiga fastq-filerna (se till att både läsningar [R1 och R2] är markerade för varje prov).
- Välj RNA fusion för RNA analystyper, Illumina (Parade) för plattform, och fusionplex solid tumör panel för mål region. Klicka sedan på Skicka analys.
- Tolkning av analysdata
- Öppna användargränssnittet för analyssystemet och välj önskat jobb. Välj positivt kontroll exempel. Säkerställ att alla förväntade fusioner och onkogena isoformer har upptäckts och är listade på fliken starka bevis .
Anmärkning: om någon av de spårade fusioner i positiv kontroll inte upptäcks för en given körning av analysen, kan det vara en indikation på ett problem i den körningen, vilket kräver en upprepning (från början av analysen). - Undersök Läs statistiken för varje kliniskt prov i körningen genom att klicka på fliken Läs statistik . Varje prov bör representeras av minst 1 000 000 totala fragment. Om mindre än 1 000 000, re-sekvens biblioteket med överväganden för re-kvantifiering för att säkerställa den initiala kvantifiering var inte aberrantly hög.
Obs: bra kvalitet prover kommer i allmänhet att visas på mål% > 85%, och RNA molekylära soptunnor bör > 20000 och utgör > 30% av läsningar. Underlåtenhet att uppfylla dessa mått utlöser dock inte automatiskt exempel fel. - Inspektera de genomsnittliga unika start platserna per GSP2 kontroll värde.
Anmärkning: detta värde är ett mått på sekvensering komplexitet från primers till fyra Housekeeping gener. Detta mått är en kritisk avgörande faktor för RNA-kvalitet i provet (om sekvensering av gener som förväntas uttryckas i provet är dålig, då är förtroendet för förmågan att detektera en uttryckt gen fusion låg). Cutoff för detta mått är 20. Om ett exempel visar ett värde som är mindre än 20, måste resultatet för provet rapporteras som oinformativt om ingen hög konfidensfusion hittas. Status för det här måttet kan också bestämmas på sammanfattningssidan för körningen (status visas som fusion QC: pass eller fusion QC: antal unika RNA GSP2 Control start platser låg beroende på om värdet är större än eller mindre än 20). En hög förtroende fusion i ett prov som inte klarar detta QC-mått kan fortfarande rapporteras om det är fast beslutna att vara verkliga (se nedan). I allmänhet högre QC poäng med hjälp av detta mått korrelerar med lägre PreSeq CT poäng, som förväntat (figur 2).
- Öppna användargränssnittet för analyssystemet och välj önskat jobb. Välj positivt kontroll exempel. Säkerställ att alla förväntade fusioner och onkogena isoformer har upptäckts och är listade på fliken starka bevis .
- Tolkning av fusions samtal
- Noggrant granska varje kallas fusion under starka bevis fliken (de flesta starka bevis fusioner kallas av systemet är Artifakt). Också Skanna den svaga bevis fusion bin, även om förekomsten av en icke-artifaktfusion i denna bin är en ytterst sällsynt händelse. Om du vill bedöma giltigheten för en fusion först anteckna läsningar (#/%) och Start platser mått.
I allmänhet ökar förtroendet för en kallad fusion högre dessa mått är. Fusioner som stöds av mindre än 5 startplatser och med mindre än 10% av läsningar från stödjande primer bör betraktas som mycket misstänksam som artifakto. - Anteckna ikonerna som visas i kolumnen filter .
Obs: flera av dessa ikoner varnar användaren av en potentiell källa till ett artifakto samtal. Frekvent bland dessa (och främst återfinns i den svaga bevis bin av kallade fusioner) är fall där partnerna är kända paralogs eller Visa likhet med varandra i sekvens (indikerar sannolikt mis-priming eller felaktig anpassning). En annan vanlig källa till artifakto fusion samtal inträffar när läsningar som stöder fusion innehåller en hög felfrekvens som tyder på dålig mappning till referens arvsmassan, och detta är förknippat med en distinkt ikon. Transkriptionella genomläsning-händelser identifieras via en annan ikon. Dessa är vanliga och ignoreras i allmänhet. Flera andra ikoner används också i användargränssnittet, men en fullständig beskrivning av alla är utanför tillämpningsområdet för denna artikel. Vanliga artefakter som i allmänhet kan ignoreras utan ytterligare utredning inkluderar: ADCK4-tall, SYN2-PPARG, DGKG-ETV5, ETV6-AXL, ETV1-ERG, ETV4-ETV1, FGFR3-PDGFRB, eGFR-NTRK1, RAF1-ret, ALK-TFEB, NOTCH1-ret, RELA-ret, NTRK3-ALK, BRAF-ADAMTS8, och FCGR2C-mast. - Visualisera stödjande läsningar för varje potentiell fusion genom att klicka på visualisera länken i användargränssnittet, som tar användaren till en webbaserad jbrowse vy av trängsel av enskilda fusion-stödjande läsningar. Bekräfta att läsningarna i allmänhet är fria från obalans (även om vissa ljud kan förväntas), att en betydande andel (helst > 30 baser) av läsningar anpassas till Fusion partner, och att sekvenser omedelbart intill brytpunkten mellan gener och primer bindnings platser är fria från infogningar eller borttagningar. Bekräfta att justerad sekvens innehåller 3 ' del av primer bindande sekvenser för primers som stöder fusion läsningar (om 3 ' portioner inte ingår, det kan vara en indikation på mis-priming).
- Om kodning sekvenser av båda gener är inblandade i fusion, se till att 3 ' partner förblir i bildruta. Klicka på länken översättning i gränssnittet (som ger en sann eller falsk status för varje referens sekvens kombination) och även manuellt bekräfta att fusionen är i ram genom inspektion av de kallade brytpunkter i en Genoms webbläsare. De kallade brytpunkterna kan bestämmas genom att hålla muspekaren över de röda prickarna i fusions schematiska.
Anmärkning: eftersom de flesta (men inte alla) genomiska brytpunkter för legitima fusioner förekommer i intronic regioner och resultera i skarvning tillsammans med hela exoner, fusioner där exon gränser utgör brytpunkterna för båda parter i allmänhet ses med en högre grad av förtroende. Men eftersom det finns många publicerade exempel på Mid-exonic brytpunkter i fusioner, bör detta inte användas som absoluta kriterier i tolkningen av en fusion. - För varje fusion manuellt se till att sekvenser intill brytpunkten inte är homologa till nästa förväntade sammanhängande baser för varje partner. Inspektera alla möjliga sammanhängande exonerna i en genomwebbläsare.
Anmärkning: en vanlig källa till Artifakt fusion är feljustering eller mis-priming på grund av homologi mellan två gen partners, och detta är inte alltid kallas av systemet via ikonerna som beskrivs ovan.
- Noggrant granska varje kallas fusion under starka bevis fliken (de flesta starka bevis fusioner kallas av systemet är Artifakt). Också Skanna den svaga bevis fusion bin, även om förekomsten av en icke-artifaktfusion i denna bin är en ytterst sällsynt händelse. Om du vill bedöma giltigheten för en fusion först anteckna läsningar (#/%) och Start platser mått.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Visas i figur 3, figur 4 och figur 5 är skärmdumpar från analys användargränssnittet som visar resultaten från ett lungadenocarcinom prov. I figur 3visas exempel sammanfattningen (överst) som listar de s.k. starka bevis fusioner samt QC-status (inringad i rött). Den ADCK4- ANT fusion (av vilken 3 isoformer är katalogiserat) är omedelbart ignorerat emedan den er en ihärdig transkriptionell reglering genomläsning händelsen (antecknat vid den bruten cirkel ikonen närmast den listningarna). Botten av figur 3 är en skärmdump av Läs statistiksidan. Särskilt informativa mätvärden är inringade i grönt. Det kritiska QC-måttet som avgör hur provet ska passera/misslyckas markeras med rött (det här är det mått som avgör status för godkänd/underkänd i sammanfattningen ovan). Om värdet är lägre än 20, anses ett negativt fusions resultat "oinformativt". Figur 4 och figur 5 är skärmdumpar av fusion scheman (överst) och jbrowse visningar av fusion stödjande läsningar (botten) för de två fusioner som motiverade ytterligare utredning. Den KIF5B-ret fusion (figur 4) visar ett stort antal stödjande läsningar, en hög% av läsningar från primer stödja fusion, och ett stort antal startplatser. Dessutom, flera sammanhängande exoner av fusion partner (KIF5B) ingår i anpassningen, var fusionen verifieras att vara i ram, och läsningar som stöder fusion är i allmänhet fria från obalans. Av dessa skäl anses fusionen vara reell och rapportabel. LOC101927681-PDGFRB fusion (figur 5) visar lägre stödjande mått. Dessutom är portion av läser kartlägga till partnern förhållandevis kort och innehåller en kick fel klassar, som föreslår starkt snedställning och ett artifakskt fusion appell. Slutligen ingår intronic sekvens av Pdgfrb , ytterligare tyder på en artefakt (de flesta, men inte alla, legitima fusioner består enbart av sekvens som mappas till kodning regioner av båda gener). Av dessa skäl, denna fusion anses vara en artefakt och inte rapporterbara.
Figur 1: schematisk representation av amp-metoden. Traditionella amplicon-medierade metoder för mål berikning begränsas av det faktum att primers behövs för alla fusion partners. Således kommer nya fusion partners inte att upptäckas. I AMP är den motsatta primern specifik för adaptern, vilket innebär att nya partners upptäcks. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: korrelation mellan PreSeq QC-Poäng och efter sekvensering QC. PreSeq CT och genomsnittliga unika startplatser per GSP2 kontrollvärden var korrelerade för en serie 100 exempel. Generellt sett är låg PreSeq score korrelerar med högre SS/GSP2 värden (båda är indikatorer på god kvalitet RNA). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: exempel Sammanfattning och Läs statistikvyer. Överst: Visa en sammanfattning av provet i användargränssnittet med starka bevis fusioner som anges. Nederst: Visa sidan Läs statistik i användargränssnittet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: exempel på en legitim fusion samtal. Överst: Visa av fusion schematiskt i användargränssnittet. Nederst: JBrowse vy över enskilda läsningar som stöder fusionen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: exempel på ett Artifakt fusions samtal. Överst: Visa av fusion schematiskt i användargränssnittet. Nederst: JBrowse vy över enskilda läsningar som stöder fusionen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| AKT3 | EWSR1 | NOTCH1 | PRKCA |
| Alk | FGFR1 | NOTCH2 | PRKCB |
| ARHGAP26 | FGFR2 | NRG1 | RAF1 |
| Axl | FGFR3 | NTRK1 | RELA |
| BRAF | Fgr | NTRK2 | Ret |
| BRD3 | INSR | NTRK3 | ROS1 |
| BRD4 | MAML2 | L | RSPO2 |
| EGFR | MAST1 | NUTM1 | RSPO3 |
| Erg | MAST2 | PDGFRA | Tert |
| ESR1 | Träffade | PDGFRB | TFE3 |
| ETV1 | MSMB | PIK3CA | TFEB |
| ETV4 | Mysk | PKN1 | THADA |
| ETV5 | MYB | PPARG | TMPRSS2 |
| ETV6 | |||
| Analysen innehåller genspecifika primers till olika exoner (och några introner) i ovanstående 53 gener. | |||
Tilläggstabell 1: förteckning över gener för vilka genspecifika primers ingår i analysen (till olika exoner och introner).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förankrade Multiplex PCR-baserade mål berikning och bibliotek förberedelse följt av nästa generations sekvensering är väl lämpad för multiplexade Gene fusion bedömning i kliniska tumörprover. Genom att fokusera på RNA-indata i stället för genomiskt DNA undviks behovet av att sekvensera stora och repetitiva introner. Eftersom detta tillvägagångssätt förstärker gen fusioner oavsett identiteten hos fusions partnern upptäcks nya fusioner. Detta är en kritisk fördel i den kliniska sfären, och det har förekommit många exempel på genomförbara nya gen fusioner identifierade genom amp rapporteras i litteraturen21,22,23,24, 25.
Eftersom analysen är RNA-baserad, är det viktigt att bevara RNA-kvalitet i prover under bearbetningen. Det är också viktigt att avgöra vilka prover producerade RNA-sekvensering som är för dålig för att lita på negativa fusions resultat. Detta uppnås genom bedömning av sekvenserings data från primers till fyra städ gener. Om sekvensering av dessa gener är dålig, då negativa fusions resultat bedöms vara oinformativ. Dessutom, med tanke på komplexiteten och mångfalden av våt-bänk steg i analysen, det är viktigt att inkludera en fusion-positiv kontroll i varje test körning. På så sätt, äventyras analyskörningar blir uppenbara genom analys av förväntade fusions händelser i kontrollen.
Som med alla amplicon-baserade metoder, AMP är mycket beroende av individuell primer prestanda. Vid bedömning av flera exoner av flera gener, är det oundvikligt att vissa primers inte kommer att fungera lika bra som andra. Därför är det viktigt för användare att veta var analysen underpresterar på grund av primer ineffektivitet. Dessutom kräver NGS-baserade analyser komplexa bioinformatiska dataanalys. Om de algoritmer som används inte är genomtänkt utformade, falskt negativa och falskt positiva resultat är sannolika. Det är mycket viktigt att alla gen fusioner som anropas av analysalgoritmer inspekteras manuellt av användaren.
Med en ständigt växande lista över angriparbara gen fusioner som bör bedömas i kliniska tumörprover, användning av multiplexade analyser som AMP kommer att fortsätta att öka i kliniska laboratorier. Framtida tillämpningar av tekniken kommer sannolikt att fokusera på att kombinera fusion och mutation bedömning inom en enda analys. Oavsett den molekylära analysen tillvägagångssätt, användare måste alltid vara medvetna om assay begränsningar och bör alltid fastställa kvalitetskontroll mått för att vägleda data tolkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
D.L.A. har fått konsultarvoden från Bayer Oncology, Genentech, AbbVie och Bristol Myers Squibb. K. D. D har fått sponsrade resor från ArcherDx.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av den molekylära patologi delade resursen vid University of Colorado (National Cancer Institute Cancer Center support Grant No. P30-CA046934) och Colorado Center för personlig medicin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mM Tris HCl pH 8.0 | IDT | 11-05-01-13 | Used for TNA dilution |
| 1M Tris pH 7.0 | Thermo Fisher | AM9850G | Used in library pooling |
| 25 mL Reagent Reservoir with divider | USA Scientific | 9173-2000 | For use with multi-channel pipetters and large reagent volumes |
| 96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-natural | USA Scientific | 1402-9700 | Plate used for thermocycler steps |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | Used in purification after several assay steps |
| Agencourt Formapure Kit | Beckman Coulter | A33343 | Used in TNA extraction |
| Archer FusionPlex Solid Tumor kit | ArcherDX | AB0005 | This kit contains most of the reagents necessary to perform library preperation for Illumina sequencing (kits for Ion Torrent sequencing are also available) |
| Cold block, 96-well | Light Labs | A7079 | Used for keeping samples chilled at various steps |
| Ethanol | Decon Labs | DSP-MD.43 | Used for bead washes |
| Library Quantification for Illumina Internal Control Standard | Kapa Biosystems | KK4906 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Primers and ROX Low qPCR mix | Kapa Biosystems | KK4973 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Standards | Kapa Biosystems | KK4903 | Used for library quantitation |
| Magnet Plate, 96-well (N38 grade) | Alpaqua | A32782 | Used in bead purificiation steps |
| MBC Adapters Set B | ArcherDX | AK0016-48 | Adapters that contain sample-specific indexes to enable multiplex sequencing |
| Micro Centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | Used for spinning down PCR tubes |
| MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well Plate | Thermo-Fisher | 4483485 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| Microamp Optical Film Compression Pad | Applied Biosystems | 4312639 | Used for library quantitation |
| Mini Plate Spinner | Labnet | MPS-1000 | Used for collecing liquid at bottom of plate wells |
| MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle) | Illumina | MS-102-3003 | Contains components necessary for a MiSeq sequencing run |
| MiSeqDx System | Illumina | NGS Sequencing Instrument | |
| Model 9700 Thermocycler | Applied Biosystems | Used for several steps during assay | |
| nuclease free water | Ambion | 9938 | Used as general diluent |
| Optical ABI 96-well PCR plate covers | Thermo-Fisher | 4311971 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| PCR Workstation Model 600 | Air Clean Systems | BZ10119636 | Wet-bench assay steps performed in this 'dead air box' |
| Proteinase K | Qiagen | 1019499 | Used in TNA extraction |
| QuantStudio 5 | Applied Biosystems | LSA28139 | qPCR instrument used for PreSeq and library quantitation |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32855 | Use for determing RNA concentration in TNA samples |
| RNase Away | Fisher | 12-402-178 | Used for general RNase decontamination of work areas |
| Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v2 | SeraCare | 0710-0129 | Used as the assay positive control |
| Sodium Hydroxide | Fisher | BP359-212 | Used in clean-up steps and for sequencing setup |
| SYBR Green Supermix | Bio Rad | 172-5120 | Component of PreSeq QC Assay |
| TempAssure PCR 8-tube Strips | USA Scientific | 1402-2700 | Used for reagent and sample mixing etc. |
| Template RT PCR film | USA Scientific | 2921-7800 | Used for covering 96-well plates |
| U-Bottom 96-well Microplate | LSP | MP8117-R | Used during bead purification |
References
- Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 233-245 (2007).
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247 (4944), 824-830 (1990).
- Druker, B. J., et al. Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome. New England Journal of Medicine. 344 (14), 1038-1042 (2001).
- Solomon, B. J., et al. First-line crizotinib versus chemotherapy in ALK-positive lung cancer. New England Journal of Medicine. 371 (23), 2167-2177 (2014).
- Shaw, A. T., et al. Crizotinib in ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 371 (21), 1963-1971 (2014).
- Drilon, A., et al. Efficacy of Larotrectinib in TRK Fusion-Positive Cancers in Adults and Children. New England Journal of Medicine. 378 (8), 731-739 (2018).
- Kawai, A., et al. SYT-SSX gene fusion as a determinant of morphology and prognosis in synovial sarcoma. New England Journal of Medicine. 338 (3), 153-160 (1998).
- de Alava, E., et al. EWS-FLI1 fusion transcript structure is an independent determinant of prognosis in Ewing's sarcoma. Journal of Clinical Oncology. 16 (4), 1248-1255 (1998).
- Pierron, G., et al. A new subtype of bone sarcoma defined by BCOR-CCNB3 gene fusion. Nature Genetics. 44 (4), 461-466 (2012).
- Papaemmanuil, E., et al. Genomic Classification and Prognosis in Acute Myeloid Leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
- Arber, D. A., et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute. Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).
- Sanders, H. R., et al. Exon scanning by reverse transcriptase-polymerase chain reaction for detection of known and novel EML4-ALK fusion variants in non-small cell lung cancer. Cancer Genetics. 204 (1), 45-52 (2011).
- Camidge, D. R., et al. Optimizing the Detection of Lung Cancer Patients Harboring Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) Gene Rearrangements Potentially Suitable for ALK Inhibitor Treatment. Clinical Cancer Research. 16 (22), 5581-5590 (2010).
- Mino-Kenudson, M., et al. A novel, highly sensitive antibody allows for the routine detection of ALK-rearranged lung adenocarcinomas by standard immunohistochemistry. Clinical Cancer Research. 16 (5), 1561-1571 (2010).
- Suehara, Y., et al. Identification of KIF5B-RET and GOPC-ROS1 fusions in lung adenocarcinomas through a comprehensive mRNA-based screen for tyrosine kinase fusions. Clinical Cancer Research. 18 (24), 6599-6608 (2012).
- Davies, K. D., et al. Comparison of Molecular Testing Modalities for Detection of ROS1 Rearrangements in a Cohort of Positive Patient Samples. Journal of Thoracic Oncology. 13 (10), 1474-1482 (2018).
- Reeser, J. W., et al. Validation of a Targeted RNA Sequencing Assay for Kinase Fusion Detection in Solid Tumors. Journal of Molecular Diagnostics. 19 (5), 682-696 (2017).
- Beadling, C., et al. A Multiplexed Amplicon Approach for Detecting Gene Fusions by Next-Generation Sequencing. Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 165-175 (2016).
- Mamanova, L., et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nature Methods. 7 (2), 111-118 (2010).
- Zheng, Z., et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing. Nature Medicine. 20 (12), 1479-1484 (2014).
- Davies, K. D., et al. Dramatic Response to Crizotinib in a Patient with Lung Cancer Positive for an HLA-DRB1-MET Gene Fusion. JCO Precision Oncology. 2017 (1), (2017).
- Vendrell, J. A., et al. Detection of known and novel ALK fusion transcripts in lung cancer patients using next-generation sequencing approaches. Scientific Reports. 7 (1), 12510 (2017).
- Agaram, N. P., Zhang, L., Cotzia, P., Antonescu, C. R. Expanding the Spectrum of Genetic Alterations in Pseudomyogenic Hemangioendothelioma With Recurrent Novel ACTB-FOSB Gene Fusions. American Journal of Surgical Pathology. 42 (12), 1653-1661 (2018).
- Skalova, A., et al. Molecular Profiling of Mammary Analog Secretory Carcinoma Revealed a Subset of Tumors Harboring a Novel ETV6-RET Translocation: Report of 10 Cases. American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 234-246 (2018).
- Guseva, N. V., et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing reveals recurrent and novel USP6 fusions and upregulation of USP6 expression in aneurysmal bone cyst. Genes Chromosomes and Cancer. 56 (4), 266-277 (2017).
