Summary
Dual DNA Lineal Assay wird entwickelt, um die mRNA-Position während der ribosomen Translokation zu bestimmen, die auf den Dissoziationskräften der gebildeten DNA-mRNA-Duplexe beruht. Mit einer Single-Nukleotid-Auflösung und der Fähigkeit, beide Enden der mRNA zu erreichen, kann es mechanistische Einblicke für ribosome translokation liefern und andere Nukleinsäureverschiebungen untersuchen.
Abstract
Die Ribosomentranslokation bezieht sich auf die ribosomale Bewegung auf der mRNA durch genau drei Nukleotide (nt), was der zentrale Schritt in der Proteinsynthese ist. Um seinen Mechanismus zu untersuchen, gibt es zwei wesentliche technische Anforderungen. Die erste ist die Single-nt-Auflösung, die die normale Translokation von Frameshifting auflösen kann, während der sich das Ribosom um andere als 3 nt bewegt. Die zweite ist die Fähigkeit, sowohl die Ein- als auch die Ausgangsseite von mRNA zu untersuchen, um das gesamtbildende Translokation zu erläutern. Wir berichten über den dualen DNA-Lineal-Assay, der auf den kritischen Dissoziationskräften von DNA-mRNA-Duplexen basiert, die durch kraftinduzierte Restmagnetisierungsspektroskopie (FIRMS) gewonnen werden. Mit einer Kraftauflösung von 2-4 pN reicht der Dual-Lineal-Assay aus, um verschiedene Translokationsschritte zu unterscheiden. Durch die Implementierung eines langen Linkers auf den prüfenden DNAs können sie die mRNA auf der gegenüberliegenden Seite des Ribosoms erreichen, so dass die mRNA-Position für beide Seiten bestimmt werden kann. Daher ist der Dual-Lineal-Assay einzigartig geeignet, um die ribosomsome Translokation und Nukleinsäurebewegung im Allgemeinen zu untersuchen. Wir zeigen repräsentative Ergebnisse, die auf eine geschleifte mRNA-Konformation hindeuteten und die normale Translokation von Frameshifting auflösten.
Introduction
Biomolekulare Verschiebung ist ein grundlegender Parameter bei der Untersuchung des Mechanismus der zugehörigen biologischen Funktionen. Ein besonderes Beispiel ist die Ribosomtranslokation1,2, bei der sich das Ribosom normalerweise um genau drei Nukleotide (nt) auf der Boten-RNA (mRNA) bewegt, und um eine, zwei oder andere Nt-Zahlen außer drei im Falle von Frameshifting. Daher ist eine einstellige Auflösung des molekularen Linealsystems erforderlich, um die verschiedenen Schrittgrößen zu unterscheiden. Eine größere Herausforderung besteht darin, die Ribosombewegung sowohl auf der Ein- als auch auf der Ausgangsseite zu untersuchen. Mit anderen Worten, nur mit einem Dual-Lineal-System können wir zeigen, ob die mRNA glatt durch das Ribosom gefädelt ist, oder es gibt Zwischenschritte, in denen die beiden Seiten unterschiedliche Schrittgrößen haben, die zu einer geknickten oder geschleiften mRNA-Konformation im Inneren des Ribosom.
Es wurden mehrere Methoden entwickelt, um die erste Herausforderung der Lösung verschiedener Schritte auf der Austrittsseite des Ribosoms (das 3' Ende der mRNA) zu bewältigen. Der duale Luziferase-Assay löst die verschiedenen Leserahmen auf, indem er die Verhältnisse der resultierenden verschiedenen Proteine3,4misst. Sie gilt nur für das 3' Ende der mRNA und reicht daher nicht aus, um ein vollständiges Bild der Translokation zu liefern. Die Massenspektrometrie kann die verschiedenen Peptidfragmente als Folge der entsprechenden Codeumlagerungen analysieren5. Aber es kann nicht genau bestimmen, wie viele nt das Ribosom auf der mRNA bewegt. Der Zehendruck-Assay ist eine weitere gängige Methode, die eine Reverse-Transkriptase verwendet, die am 3'-distalen Ende grundiert ist, um die mRNA in Richtung des Ribosoms6zu transkribieren. Es gilt jedoch nicht für das 5' Ende von mRNA, das in das Ribosom eintritt. Andere Techniken, einschließlich Einzelmolekülansätze und Fluoreszenzmethoden7, sind schwierig, eine Single-nt-Auflösung zu erreichen.
Wir haben den Dual-DNA-Lineal-Assay entwickelt, der sowohl die Ein- als auch die Ausgangsposition der freigelegten mRNA in Ribosome-mRNA-Komplexen eindeutig bestimmen kann. Die Lineal-DNAs sind DNA-Oligomere, die Duplexe einer bestimmten Anzahl von Basepairs (bp) bilden, wobei die mRNA vom Ribosom aufgedeckt wird, unabhängig davon, welches Ende der mRNA. Die bp-Zahlen zeigen dann genau die ribosomische Position auf der mRNA während der Translokation. Die bp-Nummern der Duplexe werden durch ihre kritischen Dissoziationskräfte bestimmt, die aus der kraftinduzierten Restmagnetisierungsspektroskopie (FIRMS)8gewonnen werden. Bei 2-3 pN-Kraftunsicherheit reichen die kritischen Kräfte aus, um eine Single-nt-Auflösung zu bieten. Durch die Implementierung eines Linkermoleküls auf den DNA-Linealen kann die sterisch behinderte Seite der mRNA durch das Ribosom untersucht werden. So lassen sich unterschiedliche ribosomale Verschiebungen genau auflösen. Wir haben erfolgreich eine einzigartige Schleifenkonformation von mRNA aufgedeckt, die von Antibiotika während der Translokation9eingeschlossen wurde, und verschiedene Leserahmen aufgelöst, die auf einer rutschigen mRNA-Sequenz10koexistierten. Dieser Artikel beschreibt die Details des Dual-Lineals-Assays, zu denen die Vorbereitung der Ribosom-Komplexe, die Oberflächenfunktionalisierung der Glasgeuken, die Immobilisierung der Ribosom-Komplexe und deren Hybridisierung mit magnetisch beschrifteten DNA-Linealen gehören. Moleküle, magnetische Detektion und Kraftspektrumanalyse durch FIRMS.
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Protocol
1. Vorbereitung der Ribosom-Komplexe
- Machen Sie 1.000 ml TAM10 Puffer, der aus 20 mM tris-HCl (pH 7.5), 10 mM Mg (OAc)2, 30 mM NH4Cl, 70 mM KCl, 5 mM EDTA, 7 mM BME (2-Mercaptoethanol) und 0,05% Tween20 besteht.
- Bereiten Sie die fünf in Tabelle 1aufgeführten Mischungen vor.
HINWEIS: Das Ribosom stammt e.b. vom MRE600-Stamm11. EF-Tu: Dehnungsfaktor thermo instabil. EF-Ts: Dehnungsfaktor thermostabil. GTP: Guanosintriphosphat. PEP: Phospho(enol)pyruvat. - Die fünf Mischungen bei 37 °C für 25 min separat inkubieren, bevor die Ribosom-Komplexe entstehen. Bereiten Sie die fünf Ribosom-Komplexe gemäß Tabelle 2vor.
HINWEIS: Post: Post-Translocation; Pre: Vortranslokation. - Fügen Sie jeden der fünf Ribosom-Komplexe separat auf ein 1,1 M Saccharosekissen mit einem Volumenverhältnis von 1:1 ein. Reinigen Sie jeweils mit 450.000 g für 2 h in einer Ultrazentrifuge. Verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu entfernen und die Ribosom-Komplexe bei -80 °C nach Wiederaufhängung des Pellets mit TAM10-Puffer wiederherzustellen.
2. Herstellung von biotinbeschichteten Glasgletten
- Vorreinigung der Glasrutschen
- Legen Sie 12 Glasschieber mit den Abmessungen 60,0 x 4,0 x 0,3 mm3 (L x W x T) in eine kurze und breite Glasschale.
- Füllen Sie die Glasschale mit Aceton und beschallen Sie für 5 min. Dann waschen Sie die Rutschen mit Reinstwasser 5 Mal und füllen Sie 3/4 der Schale mit Wasser.
- Fügen Sie 10 M KOH hinzu, um die Schale zu füllen und die Glasgletten für 20 min zu beschallen. Waschen Sie die Dias 5 Mal mit Wasser.
- Ethanol hinzufügen und 5 min beschallen, das Ethanol ausgießen und dann bei 300 °C für 3 h separat trocknen.
- Aminosilan-Beschichtung
- Die 12 gereinigten Rutschen wieder in die Glasschale mit Methanol legen. Reinigen Sie einen PEGylationskolben mit Methanol, indem Sie ihn 5 min beschallen, dann mit 25 ml Methanol, 1,25 ml Wasser, 0,125 ml HAc, 0,25 ml 3-Aminopropyltriethoxysilan (AMEO) füllen.
- Ersetzen Sie das Methanol in der Glasschale sofort durch die vorbereitete AMEO-Lösung. Bei Raumtemperatur 30 min inkubieren.
- Spülen Sie die Rutschen mehrmals mit Wasser ab und trocknen Sie sie dann durch Stickstoffspülung. Legen Sie die getrockneten Dias in saubere Glasschalen.
- PEGlation
- Bereiten Sie NaHCO3 Lösung (8,4 mg/ml) und PEGylationspuffer (37,5 mg PEG, 6 mg biotinylierte PEG, 150 l NaHCO3 Lösung). Mischen Sie sie gut, indem Sie bei 6.000 U/min für 1 min drehen.
- Legen Sie 25 L der PEG-Lösung auf jeden Schlitten. Bedecken Sie es mit der anderen Folie oben. Stellen Sie sicher, dass sich zwischen den beiden Folien keine Blasen befinden. Platzieren Sie die Dias in einem leeren Pipetten-Spitzenkasten. Stellen Sie sicher, dass die Box nivelliert ist und legen Sie sie in eine dunkle Schublade für ca. 3 h.
- Spülen Sie die Rutschen mit Wasser und trocknen Sie wieder. Bewahren Sie die getrockneten Dias bei Raumtemperatur unter Vakuum bis zu 2 Wochen auf.
3. Probenvorbereitung vor Magnet- und Kraftmessungen
- Maschine eine Kunststoffprobe gut mit den Abmessungen 4 x 3 x 2 mm3 (L x W x D). Mit Epoxid kleben Sie ein Stück biotinbeschichtetes Glas (ca. 5 mm lang, aus den 60 mm langen Dias in Abschnitt 2) auf die Bodenoberfläche schneiden.
- Fügen Sie 20 l 0,25 mg/ml Streptavidin wässrige Lösung gut in die Probe geben und bei Raumtemperatur für 40 min inkubieren. Dann spülen Sie die Probe gut zweimal mit TAM10 Puffer.
- Immobilisieren Sie die Ribosom-Komplexe.
- Ohne Antibiotika: Verwenden Sie eine Pipette, um Puffer aus der Probe gut zu entfernen, und fügen Sie dann 20 L von 0,1 M Ribosom-Komplex (MF-Pre oder MF-Post) in die Probe gut. Der Ribosom-Komplex bindet mit dem Streptavidin an der Oberfläche über das 5'-Ende-Biotin auf der mRNA. Bei 37 °C für 1 h inkubieren und dann einmal mit TAM10 Puffer ausspülen.
- Für das Experiment mit Neomycin und Fusidinsäure: inkubieren Sie den MF-Pre-Komplex mit Neomycin bei 37 °C für 10 min; EF-G mit Fusidinsäure bei 37 °C für 20 min inkubieren. Die Konzentrationen sind wie folgt: 0,1 m Ribosom-Komplex, 2 M EF-G, 4 mM GTP, 4 mM PEP, 0,02 mg/ml Pyruvatkinase, 0,2 mM Neomycin und 0,25 mM Fusidinsäure.
- Führen Sie die anderen Antibiotika-Experimente ähnlich durch. Die Konzentrationen sind wie folgt: 0,2 mM Viomycin, 0,4 mM Hygromycin B und 0,25 mM Fusidinsäure.
- Für Frameshifting-Studie, wiederholen Sie die oben genannten Schritte für die MFNF-Pre und MFNF-Post-Komplexe mit dem rutschigen Motiv U6A. Verwenden Sie Antibiotika Fusidinsäure plus Neomycin, und Fusidinsäure jeweils
- Puffer aus der Probe gut entfernen, dann 20 L von 1 'M biotinylierten DNA-Strang hinzufügen und bei Raumtemperatur über Nacht inkubieren. Spülen Sie das gebildete DNA-mRNA-Duplex einmal mit TAM10 Puffer.
- Entfernen Sie den Puffer aus dem Sample-Brunnen. Dann 20 l von 0,5 mg/ml streptavidin-beschichteten Magnetperlen gut in die Probe geben und bei Raumtemperatur für 2 h inkubieren.
- Die Probe vorsichtig gut in einen Halter einlegen und in eine Zentrifuge legen. Entfernen Sie die freien magnetischen Partikel von der Oberfläche durch Zentrifugieren bei 84 x g für 5 min.
4. Magnet- und Kraftmessungen
- Einschalten des Lasers
- Schalten Sie den Laser mit der Taste ein. Drücken Sie dann die Ein-/Aus-Taste.
- Stellen Sie die Empfindlichkeit des Einsperrverstärkers 1 (LIA1) auf 500 mV ein und warten Sie etwa 2 h, um das Atommagnetometer aufzuwärmen und zu stabilisieren.
- Einrichten des Atommagnetometers
- Führen Sie die Gerätesteuerungssoftware aus und richten Sie die Messparameter ein. Einige Parameter können in jeder Messung leicht variieren.
ANMERKUNG: Das Atommagnetometer besteht aus einem Laser (siehe oben), einem SR830-Sperrverstärker (als LIA1), einem SR530-Sperrverstärker (als LIA2 bezeichnet), DS345 (bezeichnet als FG1) und ATF20B (als FG2 bezeichnet), Motor und einem Computer. All diese Sollten in diesem Schritt des Protokolls aktiviert werden. - Richten Sie den Motorbewegungsmodus auf Rauschen und die Standardposition auf 0ein. Drücken Sie Lock auf der Frontplatte, stellen Sie die Empfindlichkeit von LIA1 wieder auf 200 mV ein.
- Stellen Sie strom und spannungsfrei den Laser ein und finden Sie die richtige Resonanzspitze und den Signal-Rausch-Pegel. Drücken Sie Sweep auf der Frontplatte. Beachten Sie, dass das Amplituden-Breite-Verhältnis über 0,5 und der Phasenwert kleiner als 5 Grad sein sollte. Wenn dies nicht der Fall ist, wiederholen Sie den Sweep-Schritt.
- Schließen Sie den Ausgang von LIA2 an das Feedback des Lasers an, um seine Frequenz zu sperren. Dieser Verstärker misst die optische Rotation einer Hilfs-Cäsiumzelle, um die Laserfrequenz auf Resonanz12beizubehalten. Der Zustand bleibt bis zum Ende der Messung.
- Plug-in-Funktionsgenerator FG2 zur Eingabe einer Rechteckwelle (500 mVpp, 100 mHz) als Referenzsignal. Die rechteckige Welle entspricht 100 pT und wird verwendet, um den Stromausgang des Verstärkers in magnetisches Signal umzuwandeln. Trennen Sie den Funktionsgenerator.
- Richten Sie den Motorbewegungsmodus auf Zwei-Wege- und Standardposition auf 260 mm ein. Überprüfen Sie den Status des Temperaturreglers, um die richtige Temperatur (ca. 37 °C) des Atomsensors zu gewährleisten.
- Überprüfen Sie die Stabilität des gesamten Systems, indem Sie die Signale des leeren Probenhalters zweimal messen. Bewerten Sie Stabilität und Geräuschpegel, nachdem Sie die beiden Spuren subtrahiert haben. Typischer Geräuschpegel und Fluktuation sollten bei 30 ms Integrationszeit 2 pT betragen.
- Führen Sie die Gerätesteuerungssoftware aus und richten Sie die Messparameter ein. Einige Parameter können in jeder Messung leicht variieren.
- Magnetisierung der Probe
- Legen Sie die Probe vorsichtig auf die Magnetisierungsstation und lassen Sie sie 2 min bleiben.
HINWEIS: Die Magnetisierungsstation besteht aus einem Permanentmagneten (0,5 T) und einem Kunststoffabstandhalter. - Legen Sie die Probe wieder in den Probenhalter. Verwenden Sie 335,4 g Zentrifugalkraft, um die nicht spezifisch gebundenen magnetischen Partikel zu entfernen.
- Legen Sie die Probe vorsichtig auf die Magnetisierungsstation und lassen Sie sie 2 min bleiben.
- Magnetische Messungen nach Demanwendung von Kräften
- Verwenden Sie eine Pinzette, um die Probe auf den Motor zu laden. Klicken Sie auf der Vorderseite auf Sperren, um das Programm auszuführen. In der Zwischenzeit verwenden Pinzette, um die andere Probe in den Halter zu laden und legen Sie es in der Zentrifuge. Beachten Sie, dass die beschichtete Glasseite der Mitte der Zentrifuge gegenüberstehen sollte.
HINWEIS: Es wird die Technik der kraftinduzierten Restmagnetisierungsspektroskopie (FIRMS) verwendet, die ein atomares Magnetometer verwendet, um das magnetische Signal der Probe zu messen, nachdem mechanische Kraft auf die molekularen Wechselwirkungen in der Probe angewendet wurde. Hier liegen die molekularen Wechselwirkungen zwischen den DNA-Linealmolekülen und der mRNA im Ribosom-Komplex. Die Kraft wird schrittweise erhöht, indem die Fliehkrafterhöht wird. Nach dem Anwenden jeder Kraft übersetzt der Motor die Probe in den Atomsensor und bewegt sich dann zurück. Somit werden zwei Magnetfeldprofile erhalten, eines während des Vorwärtsscans und das andere beim Rückwärtsscan13. Letzteres verwenden wir nur, um die Spitzenhöhe aufgrund seines besseren Signal-Rausch-Verhältnisses zu extrahieren. Die Spitzenhöhe im Strom (nA) wird basierend auf der Kalibrierquadratwelle in magnetische Signalamplitude (pT) umgewandelt. - Jede Messung dauert ca. 5 min. Wenn der Motor auf 0 zurückkommt, klicken Sie auf der Vorderseite auf Speichern. Verwenden Sie sorgfältig Pinzette, um Proben von Motor und Zentrifuge zu nehmen. Verwenden Sie die Anfangsgeschwindigkeit von 335,4 g (2000 U/min, Umdrehung pro Minute für die zentrifuge, die in der Materialtabelleaufgeführt ist).
- Tauschen Sie die beiden Proben aus und wenden Sie eine stärkere Kraft an, indem Sie die Zentrifugalgeschwindigkeit um 100 U/min oder eine ähnliche Schrittgröße erhöhen. Prozess abwechselnd, um die Kraft schrittweise zu erhöhen; nach 10-12 Datenpunkten wird ein komplettes Kraftspektrum erreicht.
- Verwenden Sie eine Pinzette, um die Probe auf den Motor zu laden. Klicken Sie auf der Vorderseite auf Sperren, um das Programm auszuführen. In der Zwischenzeit verwenden Pinzette, um die andere Probe in den Halter zu laden und legen Sie es in der Zentrifuge. Beachten Sie, dass die beschichtete Glasseite der Mitte der Zentrifuge gegenüberstehen sollte.
- Abschließen des Experiments
- Wenn alle geplanten Experimente abgeschlossen sind, schalten Sie die Ausrüstung aus und gehen Sie in umgekehrter Reihenfolge vor, als sie eingeschaltet wurde.
- Entfernen Sie die Proben aus dem Halter und tauchen Sie sie zur Reinigung und zukünftigen Verwendung in Ethanol ein. Reinigen Sie den Probenhalter bei magnetischer Perlenkontamination mit Aceton.
- Datenanalyse
- Öffnen Sie das Python-Analyseskript, und geben Sie alle experimentellen Daten ein. Klicken Sie auf Quadrat laden, um die Rechteckwelle als Referenz einzugeben. Klicken Sie dann auf Basislinie laden, um ein magnetisches Restsignal als Hintergrund einzugeben.
- Definieren Sie die allgemeine magnetische Signalabnahme als B0. Normalisieren Sie jede magnetische Signalabnahme B bis B0 und drücken Sie sie als Prozentsatz aus. Plotten Sie den Prozentsatz (B/B0) im Vergleich zu der Zentrifugalkraft, um das FIRMS-Spektrum zu erhalten.
ANMERKUNG: Die Zentrifugalkraft F wird aus der Schwimmmasse der Magnetperlen m (4,6 x 10x 15 kg), der Zentrifugalgeschwindigkeit w und dem Radius der Zentrifuge r (7,5 cm hier) über Gleichung F = mw 2 r. Die typische Kraftauflösung beträgt 2-4 pN und der Kraftbereich beträgt 15-95 pN in dieser Arbeit.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt das Erkennungsschema und die Fotos der hauptwichtigsten Komponenten. Die magnetische Detektion wird durch ein atomares Magnetometer mit dem Scanschema erreicht (Abbildung 1A)13. Die Probe wird auf einer Stange platziert, die auf einem Linearmotor montiert ist. Der Motor transportiert die Probe zum Atomsensor innerhalb eines magnetischen Schildes und dann zurück zum ursprünglichen Ort zum Entladen. Das Atommagnetometer erkennt das magnetische Signal während des Probenscans und erzeugt eine Signalspur, mit dem maximalen Signal, wenn die Probe dem Sensor am nächsten ist. Abbildung 1 B zeigt das Foto des Gesamtinstruments. Abbildungen 1C,D zeigen die Fotos der Magnetisierungsstation bzw. der Zentrifuge, die für die Kraftanwendung verwendet werden.
Das Prinzip des Dual-DNA-Lineal-Assays ist in Abbildung 2dargestellt. Der Ribosom-Komplex wird über das 5'-Ende der mRNA auf der Oberfläche immobilisiert. Zwei DNA-Lineale sind so konzipiert, dass sie die genaue Position des Ribosoms untersuchen, eines für jede Seite der mRNA. Das aktuelle Immobilisierungsschema macht die 3'-Seite für die prüfenden DNA-Herrscher leicht zugänglich. Daher können DNA-Oligomere, die mit magnetischen Perlen konjugiert werden, Duplexe mit der ungedeckten mRNA bilden. Die 5'-Seite wird jedoch durch das Ribosom und die Oberfläche sterisch behindert. Ein Linkermolekül wird daher benötigt, damit die DNA die ungedeckte mRNA auf dieser Seite erreicht. Durch Variation der Linkerlänge haben wir festgestellt, dass wir, wenn der Linker länger als 50 T ist, ein starkes magnetisches Signal erkennen können, das auf eine erfolgreiche Bildung von DNA-mRNA-Duplexen hinweist (Abbildung 2B). Die Korrelation von Dissoziationskraft zu Duplexlänge wird erreicht, indem die Anzahl der nt auf der DNA variiert wird, die die mRNA ergänzen. Die Abbildungen 2C, D zeigen die Korrelation für die 3'- bzw. 5'- Seiten. Da der Kraftunterschied zwischen Duplexen aufeinanderfolgender Längen in der Regel 12-20 pN beträgt und die Kraftauflösung typischerweise 2-4 pN beträgt, erreichen wir routinemäßig eine Single-nt-Auflösung für die Länge von DNA-mRNA-Duplexen basierend auf ihren Dissoziationskräften.
Abbildung 3 zeigt die Ergebnisse einer normalen Translokation bei Abwesenheit und Vorhandensein verschiedener Antibiotika. Die Umverteilung erfolgt von MF-Pre zu MF-Post (Abbildung 3A). Der Einbau weist darauf hin, dass MF-Pre an den P- bzw. A-Standorten freie tRNAfMet und MF-tRNAPhe trägt. MF-Post trägt tRNAfMet und MF-tRNAPhe an den E- bzw. P-Standorten mit einem freien A-Standort. Abbildung 3 B zeigt, dass sich das Ribosom ohne Antibiotika auf beiden Seiten um 3 nt bewegt (in Richtung 3'-Ende). Dies hat folgende Gründe: (i) Die DNA-mRNA-Duplexe an der 5'-Seite weisen 12 bp bzw. 15 bp Bindungskräfte in MF-Pre bzw. MF-Post aus. ii) Duplexe am Ende der 3 zeigen eine umgekehrte Änderung von 15 auf 12 bp (Abbildung3C). Wenn jedoch sowohl Fusidinsäure als auch Neomycin vorhanden sind, zeigen die Kraftspektren, dass sich das Ribosom nur um 1 nt an der 5'-Seite, aber 2 nt an der 3'-Seite bewegt (Abbildung3D,E). Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass das Ribosom über einen stufenweisen Mechanismus translokalisiert wurde, was zu einer geschleiften mRNA-Konformation führt, die eine zusätzliche nt im Inneren des Ribosoms aufweist, die zuvor nicht experimentell offenbart wurde. Dies entspricht der gemeldeten theoretischen Simulation14. Alternativ kann das Ribosom auf 28 nt mRNA statt der üblichen 27 nt15gedehnt werden. Nach dem Abwaschen der Antibiotika erfolgt eine normale Translokation, wie 3 nt Bewegungen von den Seiten 5' und 3' belegen (lila Spur in Abbildung 3D, E). Die Schleifenkonformation bildet sich nicht, wenn nur Fusidinsäure verwendet wird. Die Kraftspektren stimmen mit der Ribosombewegung von 3 nt auf beiden Seiten überein, ähnlich der Situation bei normaler Translokation (Abbildung 3F,G). Der Dual-Lineal-Assay zeigt auch, dass Viomycin die Translokation völlig hemmte, wie die 0 nt Bewegung auf beiden Seiten zeigt (Abbildung 3H,I).
Wir haben auch untersucht, ob sich diese Schleifenkonformation auf "-1" Frameshifting-Motiven bilden kann. Hier erfolgt die Translokation von MFNF-Pre- und MFNF-Post-Komplexen auf dem Motiv "U6A", das teil stellischer Rahmenverschiebungsmotiv in HIV16ist. Abbildungen 4A,B zeigen, dass im MFNF-Post das DNA-mRNA-Duplex am 3'-Ende um 2 oder 3 nt verkürzt wird; die Duplexlänge erhöht sich an den 5-Enden um 2 oder 3 nt. Die Ergebnisse deuten auf die Koexistenz von normaler Translokation und "-1" Frameshifting hin, wobei erstere mit der 3-nt-Bewegung korreliert und letztere mit der 2-nt-Bewegung korreliert. Der Doppelherrscher-Assay ist in der Lage, die beiden Populationen klar zu lösen. Bei Neomycin und Fusidinsäure beobachten wir, dass sich das Ribosom am 3'-Ende um 2 nt bewegt, aber nur 1 nt am 5'-Ende (Abbildung4C,D). Daher erfolgt die geschleifte mRNA-Konformation auch auf der rutschigen Sequenz. Wenn für die MFNF-Pre (Abbildung4E,F)nur Fusidinsäure vorhanden ist, ist das Ergebnis das gleiche wie bei MFNF-Post in den Paneelen A und B (blaue Spuren), was darauf hindeutet, dass Fusidinsäure allein nicht ausreicht, um Translokation oder Frameshift zu unterbrechen. Daher bestätigt es, dass sowohl Fusidinsäure als auch Neomycin für die ungleichen Verschiebungen für die beiden Seiten von mRNA erforderlich sind.
Abbildung 1 : Instrumente für den AUF FIRMS basierenden Dual-DNA-Lineal-Test. (A) Schemader der magnetischen Detektion. 1: Probe und seine Halterung; 2: Motor; 3: Atomsensor und magnetischer Schutzschild. (B) Foto des Atommagnetometers und des Probenhandhabungssystems. Die Zahlen geben die tatsächlichen entsprechenden Komponenten an, die im Schaltplan angezeigt werden. Beachten Sie, dass sich der magnetische Schutzschild im Karton befindet, um die thermische Stabilität zu verbessern. (C) Magnetisierungsstation. (D) Zentrifuge, die für die Kraftanwendung verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Dual Lineal-Assay mit Single-nt-Auflösung zum Studium der ribosomigen Translokation. (A) Schematic des Dual-Lineals-Assays, bei dem zwei DNA-Lineale entworfen sind, um die 5-- und 3-Enden jeweils zu untersuchen. Die rote Linie zeigt den PolyT-Linker an. (B) Optimierung der Linkerlänge für Lineal-In. (C) FIRMS Ergebnisse, um die Dissoziationskräfte der Duplexe zwischen Lineal-Ins und mRNA zu bestimmen. (D) Dissoziationskräfte der Duplexe zwischen Lineal-Outs und mRNA. Der Fehlerbalken ist definiert als das Verhältnis zwischen dem Geräterauschen und der gesamten magnetischen Signalabnahme (B0) mit einem typischen Wert von 3-5%. Die Abbildung wurde mit der Berechtigung9reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 : Sondierung von Translokationsschritten unter dem Einfluss verschiedener Antibiotika. (A) Sondierungsschema für die MF-Pre- und MF-Post-Komplexe. Inset gibt die schematischen Ribosomen in Pre und Post an, die den festen bzw. dash gefütterten Ovalen entsprechen. (B, C) FIRMS Ergebnisse ohne Antibiotika. (D, E) Ergebnisse mit Fusidinsäure und Neomycin. (F, G) Ergebnisse nur mit Fusidinsäure. (H, I) Ergebnisse nur mit Viomycin. Linke Paneele: Verwenden von Lineal-In, um die 5'-Seite zu untersuchen; rechte Paneele: mit Lineal-Out, um die 3' Seite zu sondieren. Die Fehlerbalken werden auf die gleiche Weise berechnet wie in der vorherigen Abbildung. Die Abbildung wurde mit der Berechtigung9reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4 : FIRMS Ergebnisse der Verwendung von Dual-Linealen, um Frameshifting zu sonden. (A, B) MFNF-Pre und MFNF-Post ohne Antibiotika. (C, D) Ergebnisse mit Fusidinsäure und Neomycin. (E, F) Ergebnisse mit nur Fusidinsäure. Linke Paneele: mit Lineal-In, um die 5-Seite zu untersuchen; rechte Paneele: mit Lineal-Out, um die 3-Seite zu untersuchen. Die Fehlerbalken werden auf die gleiche Weise berechnet wie in der vorherigen Abbildung. Die Abbildung wurde mit der Berechtigung9reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
In unserem Doppelherrscher-Assay spielen die magnetischen Perlen zwei wesentliche Rollen. Erstens dienen sie als Kraftgeber, weil die Fliehkraft proportional zu ihrer Auftriebsmasse ist. Zweitens sind die Perlen Signalträger, die von einem Atommagnetometer erfasst werden, das derzeit der genaueste Magnetsensor ist. Durch die Kombination von mechanischer Manipulation und magnetischer Detektion ist die FIRMS-Technik in der Lage, eine große Anzahl molekularer Wechselwirkungen auf der Grundlage ihrer kritischen Dissoziationskräfte aufzulösen, die die Grundlage der DNA-Lineale bilden. Der Dual-Lineal-Assay ist einzigartig geeignet, um beide Seiten der mRNA während der Translokation zu untersuchen. Da es sich um einen physikalischen Ansatz handelt, der nur auf der Bildung der Duplexe beruht, ist er nicht durch die mRNA-Seiten oder andere biologische Einschränkungen begrenzt. Dies ist ein Vorteil im Vergleich zu anderen Techniken, die auf biochemischen Reaktionen basieren. Wir haben gezeigt, dass die Lineale mit Hilfe eines langen Linkermoleküls die zielgerichtete Bindungsstelle erreichen können, um die mRNA-Position zu bestimmen. Speziell für das Ribosom beträgt die Linkerlänge 50 T, was einer Länge von 17 nm entspricht. Diese Länge ist sehr nah an der Größe des Ribosoms17. Die Konzentrationen der Antibiotika sind typische Werte aus der Literatur. Es ist auch möglich, unsere Methode zu verwenden, um die Einbesetwerte für ihre Funktionen anzuzeigen.
Es gibt zwei kritische Aspekte für den Dual-Ruler-Assay. Eine davon ist die empfindliche funktionalisierte Oberfläche für molekulare Immobilisierung und nachfolgende biologische Reaktionen. Jeder Lade- und Waschschritt sollte mit minimaler Störung der Oberfläche durchgeführt werden, damit die auf der Oberfläche immobilisierten Moleküle intakt bleiben. Für den DNA-mRNA-Hybridisierungsprozess ist ausreichend Zeit erforderlich, um den Abschluss des Prozesses zu gewährleisten. Es wird auch empfohlen, TAM10 Puffer mit zusätzlichen 1 M NaCl zu verwenden, um ein homeostatisches System zu pflegen. Der andere kritische Aspekt ist die Magnetisierung der Perlen. Da übermäßige Perlen verwendet werden, gibt es viele freie Perlen nicht immobilisiert auf der Oberfläche. Daher sollte sich die beschichtete Oberfläche bei der Magnetisierung der Probe nähern und den Magneten vertikal verlassen. Jeder kleinere Schwenk der Probe kann möglicherweise Kratzschäden an der Oberfläche verursachen.
Unser Dual-DNA-Lineal-Assay ist derzeit die einzige Methode, die sowohl die Ein- als auch die Ausgangsseite von mRNA in den ribosomigen Komplexen mit Single-nt-Auflösung objektiv untersuchen kann. Neue mechanistische Informationen über ribosome Translokation wurden erhalten. Die Methode ist allgemein anwendbar für die molekulare Verschiebung von Nukleinsäuren, die in der Molekularbiologie weit verbreitet ist.
Für zukünftige Entwicklungen und Anwendungen haben wir gezeigt, dass die Verwendung von akustischer Strahlungskraft, um die Fliehkraft zu ersetzen, die Kraftauflösung weiter verbessern und das Subnt-Regime18erreichen wird. Wir untersuchen auch die Multiplex-Erkennung mit atomaren Magnetometern, um die Erkennungseffizienz zu verbessern. Mit diesen Verbesserungen erwarten wir, dass unsere in dieser Arbeit beschriebene Methode breite Anwendungen in der biologischen Forschung finden wird.
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Disclosures
Autoren berichteten über keinen möglichen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird von den US National Institutes of Health (R01GM111452, Y.W., S.X.) unterstützt. Y. W. würdigt die Unterstützung durch die Welch-Stiftung (E-1721).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Styrene Strip | City of Industry | MS-861 | |
| Glass slides | Evaporated Coatings | 60.0 × 4.0 × 0.3 mm3 | |
| Acetic acid | Millipore Sigma | A6283-500ML | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane | UCT specialties | 21400088 | |
| mPEG-SVA | Laysan Bio | 154-82 | |
| Biotin-PEG-SVA | Laysan Bio | 152-84 | |
| Sodium bicarbonate | Millipore Sigma | S5761-500G | |
| Epoxy glue | Devcon | 31345 | |
| Streptavidin | ThermoFisher | 434301 | |
| Fusidic Acid | Millipore Sigma | F0756-1G | |
| Neomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1458009 | |
| Viomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1715000 | |
| Hygromycin | invitrogen | 10687-010 | |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941-100G | |
| Magnesium acetate | Millipore Sigma | M5661-50G | |
| Ammonium chloride | Millipore Sigma | A9434-500G | |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | P9333-500G | |
| EDTA | GIBCO | 774750 | |
| 2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-500ML | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-250ML | |
| GTP | Millipore Sigma | G8877-100MG | |
| PEP | Millipore Sigma | P7127-100MG | |
| Pyruvate Kinase | Millipore Sigma | P1506-5KU | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S7903-5KG | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | ThermoFisher | 11205D | |
| mRNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 133899727 | 5′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468630 | 3?- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5? |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 164845370 | 3?-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468628 | 3?-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 163472705 | 3?-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678130 | 3?-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678131 | 3?-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678132 | 3?-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5? |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678133 | 3?-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| Centrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Micro Ultracentrifuge | Hitachi | CS150FNX | |
| Vortex mixer | VWR | VM-3000 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR530 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR830 | |
| Laser | Newport | TLB-6918-D | |
| Function generator | Stanford Research Systems | DS345 | |
| Photo detectors | Thorlabs | DET36A |
References
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