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Biochemistry

दोहरी डीएनए शासकों एकल-न्यूक्लिओटाइड संकल्प के साथ रिबोसोम स्थानांतरण के तंत्र का अध्ययन करने के लिए

Published: July 8, 2019 doi: 10.3791/59918
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Chemistry, University of Houston, 2Department of Biology and Biochemistry, University of Houston

Summary

दोहरी डीएनए शासक परख ribosome स्थानांतरण के दौरान MRNA स्थिति निर्धारित करने के लिए विकसित की है, जो गठित डीएनए-एमआरएनए डुप्लेक्स के वियोजन बलों पर निर्भर करता है. एकल न्यूक्लिओटाइड संकल्प और MRNA के दोनों सिरों तक पहुँचने की क्षमता के साथ, यह राइबोसोम स्थानांतरण के लिए मशीनी अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं और अन्य न्यूक्लिक एसिड विस्थापन की जांच.

Abstract

राइबोसोम स्थानांतरण वास्तव में तीन न्यूक्लिओटाइड (nt) द्वारा MRNA पर राइबोसोमल आंदोलन को संदर्भित करता है, जो प्रोटीन संश्लेषण में केंद्रीय कदम है। इसके तंत्र की जांच करने के लिए दो आवश्यक तकनीकी आवश्यकताएं हैं। पहले frameshifting से सामान्य स्थानांतरण को हल कर सकते हैं कि एकल nt संकल्प है, जिसके दौरान ribosome 3 nt के अलावा अन्य द्वारा चलता है. दूसरा स्थानांतरण की पूरी तस्वीर स्पष्ट करने के क्रम में MRNA के प्रवेश और निकास पक्षों दोनों की जांच करने की क्षमता है. हम दोहरी डीएनए शासक परख है कि डीएनए-MRNA डुप्लेक्स के महत्वपूर्ण वियोजन बलों पर आधारित है रिपोर्ट, बल प्रेरित अवशेष चुंबकन स्पेक्ट्रोस्कोपी (FIRMS) द्वारा प्राप्त की.  2-4 pN बल संकल्प के साथ, दोहरी शासक परख विभिन्न स्थानांतरण चरणों भेद करने के लिए पर्याप्त है. जांच DNAs पर एक लंबे linker को लागू करने से, वे ribosome के विपरीत पक्ष पर MRNA तक पहुँच सकते हैं, ताकि MRNA स्थिति दोनों पक्षों के लिए निर्धारित किया जा सकता है. इसलिए, दोहरी शासक परख विशिष्ट रूप से राइबोसोम स्थानांतरण की जांच करने के लिए अनुकूल है, और सामान्य में न्यूक्लिक एसिड गति. हम प्रतिनिधि परिणाम है जो एक looped MRNA रचना संकेत और frameshifting से सामान्य स्थानांतरण हल दिखाते हैं.

Introduction

जैव-अणुक विस्थापन संबंधित जैविक कार्यों के तंत्र का अध्ययन करने में एक मौलिक पैरामीटर है। इसका एक विशेष उदाहरण राइबोसोम स्थानांतरण1,2, जिसके दौरान राइबोसोम सामान्य रूप से दूत आरएनए (एमआरएनए) पर तीन न्यूक्लिओटाइड (एनटीएस) द्वारा गति करता है, और एक, दो, या अन्य संख्याओं के मामले में तीन को छोड़कर फ्रेमस्थानांतरण. इसलिए, एक आणविक मापनी सिस्टम एकल-nt रिज़ॉल्यूशन भिन्न चरण आकार भेद करने के लिए आवश्यक है। एक बड़ी चुनौती दोनों प्रवेश और निकास पक्षों पर राइबोसोम आंदोलन की जांच करने के लिए है। दूसरे शब्दों में, केवल एक दोहरी शासक प्रणाली के साथ हम प्रकट करने में सक्षम हो जाएगा कि क्या MRNA आसानी से राइबोसोम के माध्यम से पिरोया है, या वहाँ मध्यवर्ती कदम है जिसमें दोनों पक्षों के विभिन्न कदम आकार एक kinked या looped MRNA के अंदर रचना के लिए अग्रणी है राइबोसोम.

राइबोसोम (एमआरएनए के 3' अंत) के निकास पक्ष पर विभिन्न चरणों को हल करने की पहली चुनौती को हल करने के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं। द्वैत लूसीफेरे परख परिणामी भिन्न प्रोटीन3,4के अनुपातको मापकर विभिन्न पठन फ्रेमों का निराकरण करती है . यह केवल MRNA के 3' अंत के लिए लागू है और इस प्रकार स्थानांतरण की एक पूरी तस्वीर प्रदान करने के लिए अपर्याप्त. मास स्पेक्ट्रोमेट्री संबंधित कोड के परिणाम के रूप में विभिन्न पेप्टाइड टुकड़े का विश्लेषण कर सकते हैं5rerangements . लेकिन यह इंगित नहीं कर सकता कि कितने nt ribosome MRNA पर चलता है. टो-मुद्रण परख एक और आम विधि है कि एक रिवर्स ट्रांसक्रिप्टस का उपयोग करता है 3'-distal अंत में प्राइम्ड के लिए ribosome6की ओर MRNA टाइप . हालांकि, यह mrna के 5' अंत है कि राइबोसोम में प्रवेश कर रहा है के लिए लागू नहीं है. एकल अणु दृष्टिकोण और फ्लोरोसेंट विधियों7सहित अन्य तकनीकों, एकल-एनटी संकल्प को प्राप्त करने के लिए मुश्किल हैं।

हम दोहरी डीएनए शासक परख है कि विशिष्ट दोनों प्रवेश द्वार और ribosome-mRNA परिसरों में खुला MRNA के बाहर निकलने की स्थिति निर्धारित कर सकते हैं विकसित किया है.  शासक DNAs डीएनए oligomers कि basepairs की कुछ संख्या के डुप्लेक्स फार्म (बीपी) mrna ribosome द्वारा खुला के साथ कर रहे हैं, जो MRNA के अंत की परवाह किए बिना. बीपी संख्या तो ठीक स्थानांतरण के दौरान MRNA पर राइबोसोम स्थिति प्रकट करते हैं. द्वैधों की बीपी संख्या बल-प्रेरित अवशेष चुंबकन स्पेक्ट्रोस्कोपी (फर्म्स)8से प्राप्त उनके महत्वपूर्ण वियोजन बलों द्वारा निर्धारित की जाती है। 2-3 पीएन बल अनिश्चितता के साथ, महत्वपूर्ण बल एकल संकल्प की पेशकश करने के लिए पर्याप्त हैं। डीएनए शासकों पर एक linker अणु को लागू करने से, ribosome द्वारा MRNA के बाँझ पक्ष में बाधा की जांच की जा सकती है. इस प्रकार विभिन्न राइबोसोमल विस्थापनों का सही समाधान किया जा सकता है। हमने 9 स्थानांतरण के दौरान एंटीबायोटिक दवाओं द्वारा फंसीएमआरएनए की एक अनूठी लूप्ड रचना का सफलतापूर्वक खुलासा किया है और विभिन्न रीडिंग फ्रेमों का समाधान किया है जो फिसलन वाले एमआरएनए अनुक्रम10पर मौजूद थे . इस अनुच्छेद में दोहरी शासक परख के विवरण का वर्णन किया गया है, जिसमें राइबोसोम परिसरों की तैयारी, कांच स्लाइडों की सतह कार्यात्मककरण, राइबोसोम परिसरों का अचलीकरण और चुंबकीय रूप से लेबल डीएनए शासक के साथ उनके संकरण शामिल हैं। अणुओं, चुंबकीय का पता लगाने, और फर्मों द्वारा बल स्पेक्ट्रम विश्लेषण.

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Protocol

1. राइबोसोम परिसरों की तैयारी

  1. TAM10 बफर के 1,000 एमएल, जो 20 एम एम tris-HCl (पीएच 7.5), 10एमएम मिलीग्राम (OAc) 2, 30 एमएम एनएच4सीएल, 70 एमएम KCl, 5 एमएम EDTA, 7 एम एम बी एम (2-mercaptoethanol), और 0.05% Tween20 के होते हैं बनाओ।
  2. सारणी 1में सूचीबद्ध पाँच मिश्रण तैयार कीइए।
    नोट: राइबोसोम MRE600 तनाव11से था. EF-Tu: दीर्घीकरण कारक ताप अस्थिर। EF-Ts: दीर्घीकरण कारक थर्मो स्थिर। जी.टी.पी.: ग्वानोसाइन ट्राइफॉस्फेट। पीईपी: फॉस्फो (इनोल)पिरुवेटेट।
  3. राइबोसोम परिसरों को बनाने से पहले पांच मिश्रणों को 25 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर अलग से इनक्यूबेट करें। सारणी 2के अनुसार पांच राइबोसोम संकुल तैयार की जा यीं।
    नोट: पोस्ट: पोस्ट स्थानांतरण; पूर्व: पूर्व स्थानांतरण.
  4. मात्रा अनुपात 1:1 के साथ, एक 1.1 एम sucrose कुशन पर पांच राइबोसोम परिसरों में से प्रत्येक को अलग से जोड़ें। एक अल्ट्रा-सेंट्रीफ्यूज में 2 एच के लिए 450,000 डिग्री ग्राम के साथ प्रत्येक को शुद्ध करें। TAM10 बफर के साथ गोली के निलंबन के बाद -80 डिग्री सेल्सियस पर ribosome परिसरों को बहाल करने के लिए supernatant को दूर करने के लिए एक पाइप का प्रयोग करें।

2. बायोटिन लेपित कांच स्लाइड की तैयारी

  1. कांच स्लाइड की प्रारंभिक सफाई
    1. एक छोटे और चौड़े काँच के डिश में 12 कांच स्लाइडों को 60ण्0 द 4ण्0 द 0ण्3 उउ3 (ल र् ड ड र् त् त्) के आयामों के साथ रखिए।
    2. एसीटोन और sonicate के साथ ग्लास डिश को 5 मिनट के लिए भरें। फिर 5 बार अल्ट्राप्यूर पानी से स्लाइड को धोएं और 3/4 पकवान को पानी से भरें।
    3. डिश को भरने के लिए 10 एम KOH जोड़ें और 20 मिनट के लिए कांच स्लाइड sonicate. स्लाइड को पानी से 5 बार धोएं।
    4. 5 मिनट के लिए इथेनॉल और sonicate जोड़ें, इथेनॉल बाहर डालना और फिर 3 डिग्री सेल्सियस के लिए 300 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें अलग से सूखी।
  2. अमीनोसिलेन कोटिंग
    1. 12 साफ स्लाइड वापस मेथनॉल युक्त ग्लास डिश में रखें। 5 मिनट के लिए sonicating द्वारा मेथनॉल के साथ एक PEGylation फ्लास्क साफ करें, फिर इसे 25 एमएल मेथनॉल, 1.25 एमएल पानी, 0.125 एमएल एचएसी, 0.25 एमएल 3-एमिनोप्रोपाइलट्रिथॉक्सीलेन (एएमईओ) के साथ भरें।
    2. तुरंत तैयार AMEO समाधान के साथ कांच पकवान में मेथनॉल की जगह। 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
    3. कई बार पानी के साथ स्लाइड कुल्ला, तो उन्हें नाइट्रोजन शुद्ध द्वारा सूखी. सूखे स्लाइड को साफ कांच के व्यंजन में रखें।
  3. PEGlation
    1. NaHCO3 समाधान (8.4 mg/mL) और PEGylation बफर (37.5 मिलीग्राम खूंटी, 6 मिलीग्राम biotinylated खूंटी, 150 $L NaHCO3 समाधान) तैयार करें। 1 मिनट के लिए 6,000 आरपीएम पर कताई द्वारा उन्हें अच्छी तरह से मिलाएं।
    2. प्रत्येक स्लाइड पर खूंटी समाधान के 25 डिग्री सेल्सियस रखें। शीर्ष पर अन्य स्लाइड के साथ कवर. सुनिश्चित करें कि दो स्लाइड्स के बीच कोई बुलबुले नहीं हैं.  स्लाइड्स को एक खाली पाइप टिप बॉक्स में रखें. सुनिश्चित करें कि बॉक्स leveled है और यह के बारे में 3 एच के लिए एक अंधेरे दराज में जगह है.
    3. स्लाइड को पानी से धो लें और फिर से सूख लें। अप करने के लिए 2 सप्ताह के लिए वैक्यूम के तहत कमरे के तापमान पर सूखे स्लाइड स्टोर.

3. चुंबकीय और बल माप से पहले नमूना तैयारी

  1. मशीन एक प्लास्टिक का नमूना अच्छी तरह से आयामों के साथ 4 $ 3 ] 2 मिमी3 (एल जेड डब्ल्यू ] डी) के साथ। बायोटिन लेपित कांच का एक टुकड़ा गोंद (लगभग 5 मिमी लंबी, खंड में तैयार 60 मिमी लंबी स्लाइड से कटौती 2) epoxy का उपयोग कर नीचे की सतह पर।
  2. नमूना में 0.25 मिलीग्राम/एमएल स्ट्रेप्टविडिन जलीय समाधान का 20 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और 40 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। फिर TAM10 बफर के साथ नमूना अच्छी तरह से दो बार कुल्ला.
  3. राइबोसोम परिसरों को स्थिर करें।
    1. एंटीबायोटिक दवाओं के बिना: अच्छी तरह से नमूना से बफर को हटाने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें, फिर नमूना में अच्छी तरह से 0.1 डिग्री एम राइबोसोम जटिल (एमएफ-पूर्व या एमएफ-पोस्ट) के 20 डिग्री एल जोड़ें। राइबोसोम परिसर MRNA पर 5'अंत biotin के माध्यम से सतह पर streptavidin के साथ बाध्य करेगा. 1 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट और फिर TAM10 बफर के साथ एक बार कुल्ला।
    2. दोनों neomycin और fusidic एसिड का उपयोग कर प्रयोग के लिए: 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर neomycin के साथ MF-पूर्व परिसर इनक्यूबेट; 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर फ्यूसिडिक एसिड के साथ EF-G इनक्यूबेट करें। सांद्रता इस प्रकार है: 0.1 डिग्री एम राइबोसोम संकुल, 2 डिग्री एम ईएफ-जी, 4 एमएम जीटीपी, 4 एमएम पीईपी, 0.02 मिलीग्राम/एमएल पाइरुटेट काइनेज़, 0.2 एमएम नेओमाइसिन, और 0.25 एम फ्यूसिडिक एसिड।
    3. इसी तरह अन्य एंटीबायोटिक प्रयोगों को बाहर ले. सांद्रता इस प्रकार है: 0.2 m viomycin, 0.4 m hygromycin B, और 0.25 m fusidic एसिड.
    4. frameshifting अध्ययन के लिए, MFNF-पूर्व और MFNF-पोस्ट परिसरों फिसलन आकृति यू6ए का उपयोग एंटीबायोटिक दवाओं fusidic एसिड प्लस neomycin, और अकेले fusidic एसिड, क्रमशः शामिल के लिए ऊपर कदम दोहराने.
  4. अच्छी तरह से नमूना से बफर निकालें, तो जोड़ें 20 $L के 1 डिग्री एम biotinylated जांच डीएनए किनारा और कमरे के तापमान पर रात भर incubate. गठित डीएनए-mRNA डुप्लेक्स एक बार TAM10 बफर के साथ कुल्ला।
  5. नमूना से अच्छी तरह से बफ़र निकालें. फिर नमूना में 0.5 मिलीग्राम/एमएल स्ट्रेप्टाविडिन-कोटेड चुंबकीय मोती के 20 डिग्री एल को अच्छी तरह से जोड़ें और 2 ज के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  6. ध्यान से एक धारक में अच्छी तरह से नमूना डालने और यह एक centrifuge में जगह है. 5 मिनट के लिए 84 x g पर centrifuging द्वारा सतह से मुक्त चुंबकीय कणों निकालें।

4. चुंबकीय और बल माप

  1. लेजर पर टर्निंग
    1. कुंजी का उपयोग कर लेजर चालू करें। फिर पावर बटन दबाएँ.
    2. लॉक-इन एम्पलीफायर की संवेदनशीलता को समायोजित करें 1 (LIA1) करने के लिए 500 mV और के बारे में के लिए प्रतीक्षा 2 ज गर्म और परमाणु magnetometer को स्थिर करने के लिए.
  2. परमाणु मैग्नेटोमीटर की स्थापना
    1. साधन नियंत्रण सॉफ्टवेयर चलाने के लिए और माप मापदंडों की स्थापना की। कुछ पैरामीटर प्रत्येक माप में थोड़ा भिन्न हो सकते हैं.
      नोट: परमाणु magnetometer एक लेजर शामिल (ऊपर वर्णित), एक SR830 लॉक-इन एम्पलीफायर (LIA1 के रूप में संदर्भित), एक SR530 लॉक-इन एम्पलीफायर (LIA2 के रूप में संदर्भित), DS345 (FG1 के रूप में संदर्भित) और ATF20B (FG2 के रूप में संदर्भित) समारोह जनरेटर, एक उच्च संकल्प मोटर और एक कंप्यूटर. इन सभी प्रोटोकॉल के इस कदम पर चालू किया जाना चाहिए.
    2. 0करने के लिए शोर और डिफ़ॉल्ट स्थिति के लिए मोटर चलती मोड सेट करें। सामने पैनल पर प्रेस लॉक, LIA1 की संवेदनशीलता को समायोजित करने के लिए वापस 200 एमवी.
    3. लेजर की वर्तमान और वोल्टेज को समायोजित करें और उचित अनुनाद शिखर और संकेत-से-शोर स्तर पाते हैं। सामने पैनल पर स्वीप प्रेस. नोट आयाम/चौड़ाई अनुपात 0.5 से ऊपर होना चाहिए और चरण मान 5 डिग्री से कम होना चाहिए। यदि नहीं, तो स्वीप चरण को पुन: करें.
    4. प्लग में अपनी आवृत्ति को लॉक करने के लिए लेजर की प्रतिक्रिया करने के लिए LIA2 के उत्पादन में। यह प्रवर्धक अनुनाद12पर लेजर आवृत्ति को बनाए रखने के लिए सहायक सीजियम सेल के ऑप्टिकल रोटेशन को मापता है . राज्य माप के अंत तक रहता है.
    5. प्लग में समारोह जनरेटर FG2 एक वर्ग लहर इनपुट करने के लिए (500 mVpp, 100 mHz) संदर्भ संकेत के रूप में. वर्ग तरंग 100 पीटी से मेल खाती है और चुंबकीय संकेत करने के लिए एम्पलीफायर के वर्तमान उत्पादन में परिवर्तित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। फ़ंक्शन जनरेटर अनप्लग करें.
    6. दो तरह से मोटर चलती मोड सेट और 260 मिमी करने के लिए डिफ़ॉल्ट स्थिति. परमाणु सेंसर के उचित तापमान ($37 डिग्री सेल्सियस) सुनिश्चित करने के लिए तापमान नियंत्रक की स्थिति की जाँच करें।
    7. दो बार खाली नमूना धारक के संकेतों को मापने के द्वारा पूरी प्रणाली की स्थिरता की जाँच करें. दो अंश घटाने के बाद स्थिरता और शोर स्तर का मूल्यांकन करें। ठेठ शोर स्तर और उतार-चढ़ाव 30 एमएस एकीकरण समय पर $ 2 पीटी होना चाहिए।
  3. नमूना चुंबकन
    1. चुंबकन स्टेशन पर धीरे से नमूना जगह है और यह 2 मिनट के लिए रहने दें।
      नोट: चुंबकन स्टेशन एक स्थायी चुंबक के होते हैं ($0.5 टी) और एक प्लास्टिक स्पेसर.
    2. नमूना धारक में वापस नमूना रखो. गैर-विशिष्ट रूप से बाध्य चुंबकीय कणों को हटाने के लिए 335.4 ग्राम केन्द्रापसारक बल का प्रयोग करें।
  4. बलों को लागू करने के बाद चुंबकीय माप
    1. मोटर पर नमूना लोड करने के लिए चने का उपयोग करें। प्रोग्राम को चलाने के लिए सामने पैनल पर लॉक करें क्लिक करें. इस बीच, धारक में अन्य नमूना लोड करने के लिए छनयकने का उपयोग करें और इसे अपकेंद्रण में रखें। ध्यान दें कि लेपित कांच की ओर अपकेंद्रण के केंद्र का सामना करना चाहिए।
      नोट: बल प्रेरित अवशेष चुंबकन स्पेक्ट्रोस्कोपी की तकनीक का उपयोग किया जाता है, जो नमूने में आणविक बातचीत पर यांत्रिक बल लागू करने के बाद नमूना के चुंबकीय संकेत को मापने के लिए एक परमाणु magnetometer का उपयोग करता है. यहाँ, आण्विक अन्योन्यक्रिया डीएनए शासक अणुओं और राइबोसोम परिसर में MRNA के बीच हैं. केन्द्रापसारक गति को बढ़ाकर बल को चरणवार बढ़ाया जाता है। प्रत्येक बल लागू करने के बाद, मोटर परमाणु सेंसर करने के लिए नमूना अनुवाद और फिर वापस ले जाता है. अतः दो चुंबकीय क्षेत्र प्रोफाइल प्राप्त किए जाते हैं, एक अग्र स्कैन के दौरान और दूसरा पश्च स्कैन13के दौरान। हम केवल अपने बेहतर संकेत करने के लिए शोर अनुपात के कारण चोटी ऊंचाई निकालने के लिए बाद का उपयोग करें। वर्तमान में शिखर ऊंचाई (nA) अंशांकन वर्ग लहर के आधार पर चुंबकीय संकेत आयाम (pT) में बदल जाता है.
    2. हर माप लगभग 5 मिनट तक रहता है। जब मोटर 0 पर वापस आती है, तो सामने के पैनल पर सहेजें क्लिक करें. मोटर और अपकेंद्रित्र से नमूने लेने के लिए ध्यान से चितर्ई का उपयोग करें। 335.4 डिग्री ग्राम (2000 आरपीएम, सामग्री तालिका में सूचीबद्ध अपकेंद्रित्र के लिए प्रति मिनट क्रांति) के संगत प्रारंभिक चाल का प्रयोगकीजिए।
    3. दो नमूनों का आदान-प्रदान करें और केन्द्रापसारक गति को 100 आरपीएम या इसी तरह के चरण आकार में वृद्धि करके एक मजबूत बल लागू करें। धीरे-धीरे बल को बढ़ाने के लिए बारी-बारी से प्रक्रिया; 10-12 डेटा बिंदुओं के बाद एक पूर्ण बल स्पेक्ट्रम प्राप्त किया जाता है।
  5. प्रयोग समाप्त
    1. जब सभी नियोजित प्रयोग समाप्त हो जाते हैं, तो उपकरण को बंद कर दें, विपरीत क्रम में आगे बढ़ें क्योंकि इसे चालू किया गया था.
    2. धारक से नमूने निकालें और उन्हें सफाई और भविष्य के उपयोग के लिए इथेनॉल में विसर्जित कर दिया। चुंबकीय मोती संदूषण के मामले में एसीटोन के साथ नमूना धारक को साफ करें।
  6. डेटा विश्लेषण
    1. Python विश्लेषण स्क्रिप्ट और इनपुट सभी प्रयोगात्मक डेटा खोलें. संदर्भ के रूप में वर्ग लहर इनपुट करने के लिए लोड वर्ग क्लिक करें. फिर पृष्ठभूमि के रूप में इनपुट अवशिष्ट चुंबकीय संकेत करने के लिए लोड आधार रेखा क्लिक करें।
    2. समग्र चुंबकीय संकेत में कमी को ठ0के रूप में परिभाषित कीजिए। प्रत्येक चुंबकीय संकेत कम बी0 करने के लिए सामान्य और एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त करते हैं। FIRMS स्पेक्ट्रम प्राप्त करने के लिए प्रतिशत (B/B0) बनाम केन्द्रापसारक बल प्लॉट करें।
      नोट: केन्द्रापसारक बल च की गणना चुंबकीय मोती उ (4ण्6 र् 10दृ15 शह), केन्द्रापसारक चाल ड, तथा केन्द्रापसारक त (7ण्5 बउ यहाँ) की त्रिज्या समीकरण च ख् ड ड के उत्फुल्ल द्रव्यमान से की जाती है। २ त,विशिष्ट बल विभेदन 2-4 च् छ तथा बल श्रेणी इस कार्य में 15-95 च.

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Representative Results

चित्र 1 प्रमुख घटकों की पहचान योजना और तस्वीरों को दर्शाता है। चुंबकीय संसूचन को स्कैनिंग योजना का प्रयोग करते हुए परमाणु चुंबकमापी द्वारा प्राप्त किया जाता है (चित्र 1क)13. नमूना एक रैखिक मोटर पर घुड़सवार एक छड़ी पर रखा गया है. मोटर एक चुंबकीय ढाल के अंदर परमाणु सेंसर करने के लिए नमूना परिवहन, तो वापस उतारने के लिए मूल साइट पर. परमाणु magnetometer नमूना स्कैन के दौरान चुंबकीय संकेत का पता लगाता है और एक संकेत का पता लगाने का उत्पादन किया, अधिकतम संकेत के साथ जब नमूना सेंसर करने के लिए निकटतम है. चित्र 1 बी समग्र साधन की तस्वीर से पता चलता है. चित्र 1C,D चुंबकन स्टेशन के फोटो और क्रमशः बल अनुप्रयोग के लिए प्रयुक्त अपकेंद्रण को दर्शाता है।

दोहरी डीएनए शासक परख का सिद्धांत चित्र 2में दिखाया गया है। राइबोसोम परिसर MRNA के 5' अंत के माध्यम से सतह पर स्थिर है। दो डीएनए शासकों ribosome की सही स्थिति की जांच करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं, MRNA के प्रत्येक पक्ष के लिए एक. वर्तमान अचलीकरण योजना की जांच डीएनए शासकों के लिए 3' पक्ष को आसानी से सुलभ बनाती है। इसलिए, चुंबकीय मोती के साथ संयुग्मी डीएनए ओलिगोमर्स खुला MRNA के साथ डुप्लेक्स बना सकते हैं। 5' पक्ष, तथापि, बाँझ ribosome और सतह से बाधित है. इस प्रकार डीएनए के लिए एक लिंकर अणु की आवश्यकता होती है ताकि इस ओर खुला एमआरएनए तक पहुंच सके। लिंकर लंबाई को अलग करके हमने यह निर्धारित किया है कि जब लिंकर 50 टी से अधिक लंबा होता है, तो हम एक मजबूत चुंबकीय संकेत का पता लगा सकते हैं जो डीएनए-एमआरएनए डुप्लेक्स के सफल गठन को इंगित करता है (चित्र2ठ)। वियोजन बल से द्वैध लंबाई तक सहसंबंध, एम.एन.ए.एन.ए. के पूरक डीएनए पर एन टी की संख्या को अलग-अलग करके प्राप्त किया जाता है। चित्र 2C,D क्रमशः 3'- और 5'- पक्षों के लिए सहसंबंध दिखाता है। क्योंकि लगातार लंबाई के डुप्लेक्स के बीच बल अंतर आम तौर पर 12-20 pN है और बल संकल्प आमतौर पर 2-4 pN है, हम नियमित रूप से उनके वियोजन बलों पर आधारित डीएनए-mRNA डुप्लेक्स की लंबाई के लिए एकल-nt संकल्प प्राप्त.

चित्र 3 विभिन्न एंटीबायोटिक दवाओं की अनुपस्थिति और उपस्थिति में सामान्य स्थानांतरण के परिणाम प्रस्तुत करता है। स्थानांतरण एमएफ-प्री से एमएफ-पोस्ट तक है (चित्र 3ए)। इनसेट इंगित करता है कि एमएफ-पूर्व क्रमशः पी- और ए-साइटों पर रिक्त tRNAfMet और MF-tRNAPhe किया जाता है। MF-Post में एक रिक्त ए-साइट के साथ क्रमशः ई-और पी-साइट्स पर tRNAfMet और MF-tRNAPhe किया जाता है। चित्र 3 बी से पता चलता है कि एंटीबायोटिक दवाओं के बिना, ribosome दोनों पक्षों पर 3 nt द्वारा चलता है (3'-अंत की ओर बढ़ रहा है). यह निम्नलिखित कारणों से है: (i) 5' पक्ष में डीएनए-एमआरएनए डुप्लेक्स क्रमशः एमएफ-प्री और एमएफ-पोस्ट में 12 बीपी और 15 बीपी बंधन बलों का प्रदर्शन करते हैं। (पप) 3 के अंत में डुप्लेक्स 15 से 12 बीपी (चित्र3ग) से उत्क्रमित परिवर्तन दर्शाते हैं। तथापि, जब फ्यूसिडिक अम्ल तथा नियोमाइसिन दोनों उपस्थित होते हैं, तो बल स्पेक्ट्रम यह दर्शाता है कि राइबोसोम केवल 1 nt द्वारा 5' पक्ष में परंतु 3 की ओर 2 nt (चित्र 3D,E) पर चलता है। यह परिणाम इंगित करता है कि राइबोसोम एक चरणबद्ध तंत्र के माध्यम से स्थानांतरित, एक looped MRNA रचना है कि राइबोसोम के अंदर एक अतिरिक्त nt है जिसके परिणामस्वरूप, प्रयोगात्मक पहले से पता चला नहीं किया गया है. यह रिपोर्ट की गई सैद्धांतिक सिमुलेशन14के अनुरूप है। वैकल्पिक रूप से, राइबोसोम को सामान्य 27 एन टी15के बजाय, MRNA के 28 nt को कवर करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। एंटीबायोटिक दवाओं को धोने के बाद, सामान्य स्थानांतरण होता है, जैसा कि दोनों 5 और 3 पक्षों से 3 nt आंदोलनों द्वारा सबूत के रूप में (चित्र 3डी, ईमें पूर्ण ट्रेस)। केवल फ्यूसिडिक एसिड का उपयोग किया जाता है जब looped रचना फार्म नहीं है. बल स्पेक्ट्रम दोनों पक्षों पर 3 nt के राइबोसोम आंदोलन के साथ संगत कर रहे हैं, सामान्य स्थानांतरण के लिए स्थिति के समान (चित्र 3च,जी). दोहरी शासक परख भी पता चलता है कि viomycin पूरी तरह से संक्रमण बाधित, के रूप में दोनों पक्षों पर 0 nt आंदोलन द्वारा दिखाया गया है (चित्र 3एच,मैं).

हम यह भी जांच की है कि क्या इस looped रचना पर फार्म कर सकते हैं "-1" frameshifting रूपांकनों. यहाँ, MFNF-पूर्व और MFNF-पोस्ट परिसरों से स्थानांतरण 'यू6ए' आकृति है, जो एचआईवी16में '-1' frameshifting आकृति का हिस्सा पाया गया है पर जगह लेता है. आंकड़े 4A,B बताते हैं कि MFNF-पोस्ट में, डीएनए-mRNA डुप्लेक्स या तो 2 या 3 nt द्वारा 3'end पर छोटा है; डुप्लेक्स लंबाई 5$एंड्स पर या तो 2 या 3 nt बढ़ जाती है। परिणाम दोनों सामान्य स्थानांतरण और "-1" frameshifting के सह-अस्तित्व का सुझाव है, पूर्व 3-nt आंदोलन और बाद 2-nt आंदोलन के साथ संबंधित के साथ संबंधित के साथ. दोहरी शासक परख स्पष्ट रूप से दो आबादी को हल करने में सक्षम है. नियोमाइसिन और फ्यूसिडिक अम्ल दोनों के साथ, हम देखते हैं कि राइबोसोम 3 के अंत में 2 nt द्वारा चलता रहता है, लेकिन केवल 1 nt 5$-end पर, क्रमशः (चित्र4ब्,डी)। इसलिए, looped MRNA रचना भी फिसलन अनुक्रम पर जगह लेता है. जब केवल फ्यूसिडिक एसिड MFNF-पूर्व के लिए मौजूद है (चित्र 4E,F), परिणाम पैनल ए और बी (नीले निशान) में MFNF-पोस्ट के लिए के रूप में ही है, यह दर्शाता है कि फ्यूजीटिक एसिड अकेले स्थानांतरण या frameshift को रोकने के लिए पर्याप्त नहीं है. इसलिए, यह पुष्टि करता है कि एम आर ए ए के दोनों पक्षों के लिए असमान विस्थापनों के लिए फ्यूसिडिक एसिड और नियोमाइसिन दोनों की आवश्यकता होती है।

Figure 1
चित्र 1 : फर्म आधारित दोहरी डीएनए शासक परख के लिए उपकरण. (ए) चुंबकीय पता लगाने की योजना। 1: नमूना और उसके माउंट; 2: मोटर; 3: परमाणु सेंसर और चुंबकीय ढाल। (ठ) परमाणु मैग्नेटोमीटर और नमूना हैंडलिंग प्रणाली का फोटो। संख्याएँ योजनाबद्ध में दिखाए गए वास्तविक संगत घटकों को इंगित करती हैं. नोट चुंबकीय ढाल बेहतर थर्मल स्थिरता के लिए कार्डबोर्ड बॉक्स के अंदर है. (सी) चुंबकन स्टेशन. (डी) बल अनुप्रयोग के लिए उपयोग किया जाने वाले सेंट्रीफ्यूज। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : रिबोसोम स्थानांतरण का अध्ययन करने के लिए एकल-एनटी संकल्प के साथ दोहरी शासक परख। (ए) दोहरी शासक परख की रूपरेखा, जिसमें दो डीएनए शासकों को क्रमशः 5 और 3 के अंत की जांच करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। लाल रेखा polyT linker इंगित करता है। (ख) शासक-इन के लिए लिंकर लंबाई का अनुकूलन (C ) फर्मों का परिणाम शासक-इन्स और एमआरएनए के बीच द्वैधों के वियोजन बलों का निर्धारण करना है।  (घ) शासक-आउट्स और एमआरएनए के बीच द्वैधों के विघटन बल। त्रुटि पट्टी साधन शोर और समग्र चुंबकीय संकेत कमी केबीच अनुपात के रूप में परिभाषित किया गया है (बी 0), $ 3-5% के विशिष्ट मूल्य के साथ. चित्रा को अनुमति9के साथ पुनरुत्पादित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : विभिन्न एंटीबायोटिक दवाओं के प्रभाव में स्थानांतरण चरणों की जांच. ((ए ) एमएफ-प्री और एमएफ-पोस्ट परिसरों के लिए जांच योजना। इनसेट पूर्व और पोस्ट में योजनाबद्ध राइबोसोम को इंगित करता है, जो क्रमशः ठोस और डैश-लाइन वाले अंडाकार के अनुरूप होता है। (बी, सी) कोई एंटीबायोटिक दवाओं के साथ परिणाम फर्मों. (डी, ई) दोनों fusidic एसिड और neomycin के साथ परिणाम. (एफ , जी) केवल फ्यूसिडिक एसिड के साथ परिणाम. (एच, मैं) केवल viomycin के साथ परिणाम. बाएँ पैनल: शासक का उपयोग कर 5' पक्ष की जांच करने के लिए; सही पैनल: 3' पक्ष की जांच करने के लिए शासक-आउट का उपयोग कर। त्रुटि पट्टियों की गणना उसी तरह की जाती है, जैसी पिछले आंकड़े में थी. चित्रा को अनुमति9के साथ पुनरुत्पादित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : frameshifting की जांच करने के लिए दोहरी शासकों का उपयोग करने के परिणाम. (ए, बी) एंटीबायोटिक दवाओं के बिना MFNF-पूर्व और MFNF-पोस्ट. (सी, डी) दोनों fusidic एसिड और neomycin के साथ परिणाम. (ई, एफ) केवल fusidic एसिड के साथ परिणाम. बाएँ पैनल: शासक का उपयोग कर 5 पक्ष की जांच करने के लिए; दाएँ पैनल: 3 पक्ष की जांच करने के लिए शासक-आउट का उपयोग कर। त्रुटि पट्टियों की गणना उसी तरह की जाती है, जैसी पिछले आंकड़े में थी. चित्रा को अनुमति9के साथ पुनरुत्पादित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

हमारे दोहरे शासक परख में, चुंबकीय मोती दो आवश्यक भूमिका निभाते हैं. सबसे पहले, वे बल ट्रांसड्यूसर के रूप में सेवा क्योंकि केन्द्रापसारक बल उनके उत्फुल्ल द्रव्यमान के लिए आनुपातिक है. दूसरा, मोती संकेत वाहक एक परमाणु magnetometer, जो वर्तमान में सबसे सटीक चुंबकीय सेंसर है द्वारा पता चला रहे हैं. यांत्रिक हेरफेर और चुंबकीय पता लगाने के संयोजन, फर्म्स तकनीक उनके महत्वपूर्ण वियोजन बलों, जो डीएनए शासकों का आधार है के आधार पर आणविक बातचीत की एक बड़ी संख्या को हल करने में सक्षम है. दोहरी शासक परख विशिष्ट स्थानांतरण के दौरान MRNA के दोनों पक्षों की जांच करने के लिए अनुकूल है. क्योंकि यह एक भौतिक दृष्टिकोण है कि केवल डुप्लेक्स के गठन पर निर्भर करता है, यह MRNA पक्षों या अन्य जैविक विवश द्वारा सीमित नहीं है. यह अन्य तकनीकों है कि जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं पर आधारित हैं की तुलना में एक लाभ है. हमने दिखाया है कि एक लंबे लिंकर अणु का उपयोग करके, शासक ोंको लक्षित बाइंडिंग स्थल तक पहुंचकर एमआरएनए स्थिति का निर्धारण कर सकते हैं। विशेष रूप से, राइबोसोम के लिए, लिंकर लंबाई 50 टी है, जो लंबाई में 17 एनएम से मेल खाती है। यह लंबाई राइबोसोम17के आकार के बहुत करीब है। एंटीबायोटिक दवाओं की सांद्रता साहित्य से विशिष्ट मूल्य हैं. यह भी अपने कार्यों के लिए शुरुआत मूल्यों प्रकट करने के लिए हमारी विधि का उपयोग करने के लिए संभव है.

दोहरी शासक परख के लिए दो महत्वपूर्ण पहलू हैं. एक आणविक स्थिरीकरण और बाद में जैविक प्रतिक्रियाओं के लिए नाजुक कार्यात्मक सतह है। हर लोडिंग और धोने के कदम सतह के लिए न्यूनतम अशांति के साथ प्रदर्शन किया जाना चाहिए, ताकि सतह पर स्थिर अणुओं बरकरार रहेगा. डीएनए-एमआरएनए संकरीकरण प्रक्रिया के लिए, प्रक्रिया के पूरा होने को सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त समय आवश्यक है। यह भी एक homeostatic प्रणाली को बनाए रखने के लिए अतिरिक्त 1 एम NaCl के साथ TAM10 बफर का उपयोग करने की सलाह दी है. अन्य महत्वपूर्ण पहलू मोतियों का चुंबकन है। अत्यधिक मोती उपयोग किया जाता है के बाद से, वहाँ मुक्त मोती के बहुत सारे सतह पर स्थिर नहीं कर रहे हैं। इसलिए, जब नमूना magnetizing, लेपित सतह दृष्टिकोण और चुंबक खड़ी छोड़ देना चाहिए. नमूने के किसी भी मामूली स्विंग संभवतः सतह पर खरोंच नुकसान का कारण बन सकता है.

हमारे दोहरे डीएनए शासक परख वर्तमान में केवल एक ही तरीका है कि निष्पक्ष दोनों प्रवेश द्वार और एक संकल्प के साथ ribosome परिसरों में MRNA के बाहर निकलने के पक्षों की जांच कर सकते हैं. राइबोसम स्थानांतरण के बारे में उपन्यास यंत्री जानकारी प्राप्त की गई है। विधि आम तौर पर न्यूक्लिक एसिड है, जो व्यापक रूप से आणविक जीव विज्ञान में सामना करना पड़ता है के आणविक विस्थापन के लिए लागू है.

भविष्य के विकास और अनुप्रयोगों के लिए, हमने दिखाया है कि केन्द्रापसारक बल को बदलने के लिए ध्वनिक विकिरण बल का उपयोग करने से बल संकल्प में और सुधार होगा, उप-एनटी शासन18तक पहुंच जाएगा। हम भी पता लगाने की क्षमता में सुधार करने के लिए परमाणु magnetometers का उपयोग कर multiplexed पता लगाने की जांच कर रहे हैं. इन सुधारों के साथ, हम इस काम में विस्तृत हमारी विधि जैविक अनुसंधान में व्यापक अनुप्रयोगों मिल जाएगा उम्मीद है.

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Disclosures

लेखकों द्वारा हितों के कोई संभावित संघर्ष की सूचना नहीं दी गई थी।

Acknowledgments

यह काम अमेरिका के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (R01GM111452, Y.W., S.X.) द्वारा समर्थित है. Y. W. वेल्च फाउंडेशन (E-1721) से समर्थन स्वीकार करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Styrene Strip City of Industry MS-861
Glass slides Evaporated Coatings 60.0 × 4.0 × 0.3 mm3
Acetic acid Millipore Sigma A6283-500ML
3-Aminopropyltriethoxysilane UCT specialties 21400088
mPEG-SVA Laysan Bio 154-82
Biotin-PEG-SVA Laysan Bio 152-84
Sodium bicarbonate Millipore Sigma S5761-500G
Epoxy glue Devcon 31345
Streptavidin ThermoFisher 434301
Fusidic Acid Millipore Sigma F0756-1G
Neomycin Sulfate Millipore Sigma 1458009
Viomycin Sulfate Millipore Sigma 1715000
Hygromycin invitrogen 10687-010
Tris-HCl Millipore Sigma T5941-100G
Magnesium acetate Millipore Sigma M5661-50G
Ammonium chloride Millipore Sigma A9434-500G
Potassium chloride Millipore Sigma P9333-500G
EDTA GIBCO 774750
2-mercaptoethanol Millipore Sigma M6250-500ML
Tween20 Millipore Sigma P1379-250ML
GTP Millipore Sigma G8877-100MG
PEP Millipore Sigma P7127-100MG
Pyruvate Kinase Millipore Sigma P1506-5KU
Sucrose  Millipore Sigma S7903-5KG
Dynabeads M-280 Streptavidin ThermoFisher 11205D
mRNA Oligo Integrated DNA Technologies 133899727 5′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′ 
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 157468630 3?- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5? 
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 164845370 3?-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5’ 
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 157468628 3?-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5’ 
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 163472705 3?-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5’ 
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 138678130 3?-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 138678131 3?-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ 
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 138678132 3?-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5? 
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 138678133 3?-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ 
Centrifuge Eppendorf 5427R
Micro Ultracentrifuge Hitachi CS150FNX
Vortex mixer VWR VM-3000
Lock-in Amplifier Stanford Research Systems SR530
Lock-in Amplifier Stanford Research Systems SR830
Laser Newport TLB-6918-D
Function generator Stanford Research Systems DS345
Photo detectors Thorlabs DET36A

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References

  1. Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA. Quarterly Review of Biophysics. 50, 12 (2017).
  2. Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F. How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation. Science. 345, 1188-1191 (2014).
  3. Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals. RNA. 4, 479-486 (1998).
  4. Fang, Y., Treffers, E. E., Li, Y., Tas, A., Sun, Z., van der Meer, Y., de Ru, A. H., van Veelen, P. A., Atkins, J. F., Snijder, E. J., Firth, A. E. Efficient -2 frameshifting by mammalian ribosomes to synthesize an additional arterivirus protein. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 2920-2928 (2012).
  5. Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways. Cell. 160, 870-881 (2015).
  6. Shirokikh, N. E., Alkalaeva, E. Z., Vassilenko, K. S., Afonina, Z. A., Alekhina, O. M., Kisselev, L. L., Spirin, A. S. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Research. 38, 15 (2010).
  7. Chen, J., et al. Dynamic pathways of -1 translational frameshifting. Nature. 512, 328-332 (2014).
  8. De Silva, L., Yao, L., Wang, Y., Xu, S. Well-defined and sequence-specific noncovalent binding forces of DNA. Journal of Physical Chemistry B. 117, 7554-7558 (2013).
  9. Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers reveal an "mRNA looping" intermediate state during ribosome translocation. RNA Biology. 15, 1392-1398 (2018).
  10. Tsai, T. W., Yang, H., Yin, H., Xu, S., Wang, Y. High-efficiency "-1" and "-2" ribosomal frameshiftings revealed by force spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12, 1629-1635 (2017).
  11. Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99, 3002-3009 (2010).
  12. Garcia, N. C., Yu, D., Yao, L., Xu, S. Optical atomic magnetometer at body temperature for magnetic particle imaging and nuclear magnetic resonance. Optics Letters. 35, 661-663 (2010).
  13. Yao, L., Xu, S. Long-range, high-resolution magnetic imaging of nanoparticles. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5679-5682 (2009).
  14. Kurkcuoglu, O., Doruker, P., Sen, T. Z., Kloczkowski, A., Jernigan, R. L. The ribosome structure controls and directs mRNA entry, translocation and exit dynamics. Physical Biology. 5, 046005 (2008).
  15. Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475, 118-121 (2011).
  16. Jacks, T., et al. Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression. Nature. 331, 280-283 (1988).
  17. Schuwirth, B. S., et al. Structures of the bacterial ribosome at 3.5 Å resolution. Science. 310, 827-834 (2005).
  18. Jia, H., Wang, Y., Xu, S. Super-resolution force spectroscopy reveals ribosomal motion at sub-nucleotide steps. Chemical Communications. 54, 5883-5886 (2018).

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जैव रसायन अंक 149 डीएनए शासकों राइबोसोम स्थानांतरण frameshifting बल स्पेक्ट्रोस्कोपी चुंबकीय लेबलिंग बल प्रेरित अवशेष चुंबकन स्पेक्ट्रोस्कोपी mRNA पाशन एंटीबायोटिक दवाओं परमाणु चुंबक मिति
दोहरी डीएनए शासकों एकल-न्यूक्लिओटाइड संकल्प के साथ रिबोसोम स्थानांतरण के तंत्र का अध्ययन करने के लिए
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Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA… More

Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution. J. Vis. Exp. (149), e59918, doi:10.3791/59918 (2019).

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