Summary
Dual DNA linjal analysen er utviklet for å bestemme mRNA posisjon under ribosom translokasjon, som er avhengig av dissosiasjon kreftene til dannet DNA-mRNA duplexes. Med nukleotid oppløsning og mulighet til å nå begge endene av mRNA, kan den gi mekanistisk innsikt for ribosom translokasjon og granske andre nukleinsyre yre forskyvninger.
Abstract
Den ribosom translokasjon refererer til ribosomal bevegelse på mRNA av nøyaktig tre nukleotider (NT), som er det sentrale trinnet i proteinsyntese. For å undersøke mekanismen er det to vesentlige tekniske krav. For det første er enkelt-NT resolution det kanne løse normal translokasjon fra frameshifting, i løpet av hvilke det ribosom beveger av annet enn 3 NT. Den andre er evnen til å granske både inngangs-og utgangssidene til mRNA for å belyse hele bildet av translokasjon. Vi rapporterer den doble DNA linjal analysen som er basert på de kritiske dissosiasjon kreftene til DNA-mRNA duplexes, fremstilt ved Force-indusert rest magnetization spektroskopi (bedrifter). Med 2-4 pN styrke oppløsning, er den doble linjalen analysen tilstrekkelig til å skille ulike translokasjon trinn. Ved å implementere en lang linker på undersøkelser DNAs, kan de nå mRNA på motsatt side av ribosom, slik at mRNA posisjon kan bestemmes for begge sider. Derfor er den doble linjalen analysen unikt egnet til å undersøke ribosom translokasjon, og nukleinsyre syre bevegelse generelt. Vi viser representative resultater som indikerte en repeterende mRNA konformasjon og løst normal translokasjon fra frameshifting.
Introduction
Biomolecular forskyvning er en fundamental parameter i å studere mekanismen av relaterte biologiske funksjoner. Et spesielt eksempel er ribosom translokasjon1,2, der ribosom beveger seg med nøyaktig tre nukleotider (NT) på Messenger RNA (mRNA) normalt, og etter en, to eller andre tall av NT unntatt tre i tilfelle av frameshifting. Derfor kreves et molekyl linjal system med én NT-oppløsning for å skille mellom de ulike trinn størrelsene. En større utfordring er å granske den ribosom bevegelsen på både inngangs-og utgangssidene. Med andre ord, bare med et dobbelt linjal system vil vi være i stand til å avdekke om mRNA er jevnt gjenget gjennom ribosom, eller det er mellomliggende trinn der de to sidene har forskjellige trinn størrelser som fører til en kinked eller løkker mRNA konformasjon inne i ribosom.
Flere metoder er utviklet for å møte den første utfordringen med å løse ulike trinn på utgangssiden av ribosom (3 ' enden av mRNA). Den doble luciferase analysen løser de ulike lese rammene ved å måle forholdet mellom de resulterende forskjellige proteinene3,4. Det gjelder kun for de 3 ' slutten av mRNA og dermed utilstrekkelig for å gi et fullstendig bilde av translokasjon. Mass massespektrometri kan analysere ulike peptid fragmenter som konsekvensen av den tilsvarende koden rearrangements5. Men det kan ikke finne ut hvor mange NT den ribosom trekk på mRNA. The toe-utskrift analysen er en annen vanlig metode som bruker en omvendt transkriptase primet på 3 '-Trykk enden å transkribere den mRNA mot ribosom6. Det er imidlertid ikke aktuelt for 5 ' slutten av mRNA som går inn i ribosom. Andre teknikker, inkludert enkelt molekyl tilnærminger og fluorescens metoder7, er vanskelig å oppnå én-NT oppløsning.
Vi har utviklet den doble DNA linjal analysen som kan unikt bestemme både inngangen og exit posisjoner av avdekket mRNA i ribosom-mRNA komplekser. Herskeren DNAs er DNA-oligomers som danner duplexes av visse antall basepairs (BP) med mRNA avdekket av ribosom, uavhengig av hvilken ende av mRNA. BP tallene så nøyaktig avslører ribosom posisjon på mRNA under translokasjon. BP tallene for duplexes bestemmes av deres kritiske dissosiasjon styrker innhentet fra Force-indusert rest magnetization spektroskopi (bedrifter)8. Med 2-3 pN Force usikkerhet, de kritiske kreftene er tilstrekkelige til å tilby én-NT oppløsning. Ved å implementere en linker molekyl på DNA herskere, sterically hindret siden av mRNA av ribosom kan være analysert. Ulike ribosomal forskyvninger kan dermed bli nøyaktig løst. Vi har med hell avslørt en unik repeterende konformasjon av mRNA fanget av antibiotika under translokasjon9, og løst ulike lese RAM mer som coexisted på en glatt mRNA sekvens10. Denne artikkelen beskriver detaljene i dual Ruler analysen, som inkluderer utarbeidelse av ribosom komplekser, overflate funksjonalisering av glass lysbilder, immobilisering av ribosom komplekser og deres hybridisering med magnetisk merket DNA hersker molekyler, magnetisk deteksjon, og styrke spektrum analyse av bedrifter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. utarbeidelse av ribosom komplekser
- Lag 1 000 mL TAM10 buffer, som består av 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM mg (OAc)2, 30 mm NH4CL, 70 mM KCL, 5 mM EDTA, 7 mm BME (2-mercaptoethanol), og 0,05% Tween20.
- Forbered de fem blandinger som er listet opp i tabell 1.
Merk: ribosom var fra MRE600-stammen11. EF-Tu: forlengelse faktor Thermo ustabil. EF-TS: forlengelse faktor Thermo stabil. GTP: guanosin trifosfat. PEP: fosfat (ENOL) pyruvat. - Ruge de fem mikser separat ved 37 ° c i 25 min før du gjør ribosom komplekser. Forbered de fem ribosom komplekser som per tabell 2.
Merk: post: post-translokasjon; Pre: pre-translokasjon. - Legg hver av de fem ribosom komplekser på en 1,1 M sukrose pute separat, med volumforhold 1:1. Rens hver med 450 000 × g for 2 t i en ultra-sentrifuger. Bruk en Pipet for å fjerne supernatanten og gjenopprette ribosom komplekser ved-80 ° c etter blanding av pellet med TAM10 buffer.
2. utarbeidelse av biotin-belagt glass lysbilder
- Foreløpig rengjøring av glass lysbilder
- Plasser 12 glass lysbilder med dimensjoner på 60,0 × 4,0 × 0,3 mm3 (L × W × T) i en kort og bred glass parabolen.
- Fyll glass parabolen med aceton og sonikere i 5 min. Vask deretter lysbildene med ultrarent vann 5 ganger og fyll 3/4 av fatet med vann.
- Tilsett 10 M KOH å fylle fatet og sonikere glass lysbildene i 20 min. vask lysbildene med vann 5 ganger.
- Tilsett etanol og sonikere i 5 min, hell ut etanol og tørk dem separat ved 300 ° c for 3 t.
- Aminosilanbehandlede belegg
- Plasser de 12 rene lysbildene tilbake i glass fatet som inneholder metanol. Rengjør en PEGylation kolbe med metanol ved sonikere i 5 min, og fyll den med 25 mL metanol, 1,25 mL vann, 0,125 mL HAc, 0,25 mL 3-aminopropyltrietoksysilan (AMEO).
- Umiddelbart erstatte metanol i glass parabolen med forberedt AMEO løsning. Ruge ved romtemperatur i 30 min.
- Skyll lysbildene med vann flere ganger, tørk dem av nitrogen PURGE. Plasser tørket lysbilder i rene glass retter.
- PEGlation
- Klargjør NaHCO3 -oppløsning (8,4 mg/ml) og PEGylation-buffer (37,5 mg Peg, 6 mg biotinylated PEG, 150 μL NaHCO3 -løsning). Bland dem godt ved å spinne på 6 000 RPM i 1 min.
- Plasser 25 μL av PEG-løsning på hvert lysbilde. Dekk den med det andre lysbildet oppå. Kontroller at det ikke er noen bobler mellom de to lysbildene. Plasser lysbildene i en tom Pipet tupp boks. Pass på at boksen er jevnet og legg den i en mørk skuff i ca 3 h.
- Skyll lysbildene med vann og tørk igjen. Oppbevar de tørkede lysbildene ved romtemperatur under vakuum i opptil 2 uker.
3. prøve forberedelser før magnetisk og kraftmåling
- Machine en plast prøve godt med dimensjoner 4 × 3 × 2 mm3 (L × W × D). Lim et stykke biotin-belagt glass (ca 5 mm lang, kuttet fra 60 mm lange lysbilder fremstilt i del 2) på den nederste overflaten ved hjelp av epoxy.
- Tilsett 20 μL av 0,25 mg/mL streptavidin vandig oppløsning i prøve brønnen og ruge ved romtemperatur i 40 min. Skyll deretter prøven godt to ganger med TAM10 buffer.
- Nakkens ribosom komplekser.
- Uten antibiotika: Bruk en pipette til å fjerne bufferen fra prøve brønnen, og tilsett deretter 20 μL av 0,1 μM ribosom kompleks (MF-pre eller MF-post) i prøve brønnen. Det ribosom komplekset vil binde med streptavidin på overflaten via 5 '-end biotin på mRNA. Ruge ved 37 ° c for 1 time og skyll en gang med TAM10 buffer.
- For eksperimentet ved bruk av både Neomycin og Fusidic syre: ruge MF-pre-komplekset med Neomycin ved 37 ° c i 10 min; ruge EF-G med Fusidic syre ved 37 ° c i 20 min. Konsentrasjonene er som følger: 0,1 μM ribosom kompleks, 2 μM EF-G, 4 mM GTP, 4 mM PEP, 0,02 mg/mL pyruvat kinase, 0,2 mM Neomycin, og 0,25 mM Fusidic syre.
- Utføre de andre antibiotika eksperimenter på samme måte. Konsentrasjonene er som følger: 0,2 mM viomycin, 0,4 mM hygromycin B og 0,25 mM Fusidic syre.
- For frameshifting studere, gjentagelse det over skritt for det MFNF-pre og MFNF-stolpe komplekser innvolvere det glatte motiv U6A. Bruk antibiotika Fusidic syre pluss Neomycin, og Fusidic syre alene, henholdsvis.
- Fjern bufferen fra prøve brønnen, legg deretter til 20 μL av 1 μM biotinylated og ruge ved romtemperatur over natten. Skyll den formede DNA-mRNA dupleks en gang med TAM10 buffer.
- Fjern bufferen fra prøve brønnen. Tilsett deretter 20 μL av 0,5 mg/mL streptavidin magnetiske perler i prøve brønnen og ruge ved romtemperatur i 2 timer.
- Sett prøve brønnen forsiktig inn i en holder og sett den i en sentrifuge. Fjern de frie magnetiske partikler fra overflaten ved sentrifugering ved 84 x g i 5 min.
4. magnetiske og kraft målinger
- Slå på laseren
- Slå på laseren med tasten. Trykk deretter på strømknappen.
- Juster følsomheten til lock-in forsterker 1 (LIA1) til 500 mV og vent i ca 2 t for å varme opp og stabilisere Atom-Magnetometer.
- Sette opp Atom Magnetometer
- Kjør instrument Kontrollprogramvaren og sett opp måle parametrene. Noen parametere kan variere noe i hver måling.
Merk: Atomic Magnetometer omfatter en laser (beskrevet ovenfor), en SR830 lock-in forsterker (referert til som LIA1), en SR530 lock-in forsterker (referert til som LIA2), DS345 (referert til som FG1) og ATF20B (referert til som FG2) funksjonsgeneratorer, en høyoppløselig motor og en datamaskin. Alle disse bør være slått på på dette trinnet i protokollen. - Sett opp motor flyttemodus til støy og standard posisjon til 0. Trykk Lås på frontpanelet, Juster FØLSOMHETEN til LIA1 tilbake til 200 mv.
- Juster strøm og spenning på laseren og Finn riktig resonans topp og signal-til-støy-nivå. Trykk på feie på frontpanelet. Legg merke til amplitude/bredde forholdet bør være over 0,5 og fase verdien bør være mindre enn 5 grader. Hvis ikke, re-gjøre feie trinn.
- Plug-in utgang på LIA2 til tilbakemelding av laseren for å låse sin frekvens. Denne forsterkeren måler den optiske rotasjonen til en ekstra cesium celle for å opprettholde laser frekvensen på resonans12. Staten gjenstår til slutten av målingen.
- Plug-in funksjon generator FG2 å legge inn en firkantbølge (500 mVpp, 100 mHz) som referanse signal. Plassen bølgen tilsvarer 100 pT og brukes til å konvertere den gjeldende produksjonen av forsterkeren til magnetisk signal. Koble fra funksjons generatoren.
- Sett opp motor flyttemodus til toveis og standard posisjon til 260 mm. Kontroller status for temperatur kontrolleren for å sikre riktig temperatur (~ 37 ° c) av Atom sensoren.
- Kontroller stabiliteten til hele systemet ved å måle signalene til den tomme prøve holderen to ganger. Evaluer stabiliteten og støynivået etter at du har trukket fra de to sporene. Typisk støynivå og svingninger bør være ± 2 pT ved 30 MS integrasjons tid.
- Kjør instrument Kontrollprogramvaren og sett opp måle parametrene. Noen parametere kan variere noe i hver måling.
- Magnetizing prøven
- Plasser prøven forsiktig på magnetization stasjon og la den forbli i 2 min.
Merk: den magnetization stasjonen består av en permanent magnet (~ 0,5 T) og en plast spacer. - Sett prøven tilbake i prøveholderen. Bruk 335,4 × g sentrifugalkraft for å fjerne nonspecifically bundne magnet partikler.
- Plasser prøven forsiktig på magnetization stasjon og la den forbli i 2 min.
- Magnetiske målinger etter påføring av krefter
- Bruk pinsett til å laste prøven på motoren. Klikk Lås på frontpanelet for å kjøre programmet. I mellomtiden bruker pinsett til å laste den andre prøven i holderen og legg den i sentrifuge. Merk at belagt glass side skal møte midten av sentrifuger.
Merk: teknikken for Force-indusert rest magnetization spektroskopi (bedrifter) brukes, som bruker en Atomic Magnetometer å måle magnetisk signal av prøven etter påføring mekanisk kraft på den molekylære interaksjoner i prøven. Her er de molekylære interaksjoner mellom DNA linjal molekyler og mRNA i ribosom komplekset. Styrken økes trinnvis ved å øke sentrifugal hastigheten. Etter å ha brukt hver kraft, oversetter motoren prøven til Atom sensoren og flytter deretter tilbake. Derfor er to magnetiske felt profiler innhentet, en under fremover skanning og den andre under bakover skanning13. Vi bruker bare sistnevnte til å trekke toppen høyde på grunn av sin bedre signal-til-støy-forhold. Topp høyde i gjeldende (nA) omdannes til magnetisk signal amplitude (pT) basert på kalibrerings kvadrat bølgen. - Hver måling varer ca 5 min. Når motoren kommer tilbake til 0, klikker du på Lagre på frontpanelet. Bruk pinsett forsiktig for å ta prøver fra motor og sentrifuge. Bruk starthastighet tilsvarende 335,4 × g (2000 RPM, revolusjon per minutt for sentrifuger oppført i tabellen av materialer).
- Utveksle de to prøvene og bruke en sterkere kraft ved å øke sentrifugal hastigheten med 100 RPM eller lignende trinn størrelse. Prosess vekselvis å gradvis øke styrken; et komplett kraft spektrum oppnås etter 10-12 datapunkter.
- Bruk pinsett til å laste prøven på motoren. Klikk Lås på frontpanelet for å kjøre programmet. I mellomtiden bruker pinsett til å laste den andre prøven i holderen og legg den i sentrifuge. Merk at belagt glass side skal møte midten av sentrifuger.
- Fullføre eksperimentet
- Når alle planlagte eksperimenter er ferdige, slår du av utstyret og fortsetter i motsatt rekkefølge som det var slått på.
- Fjern prøvene fra holderen og dypp dem i etanol for rengjøring og fremtidig bruk. Rydd opp prøve holderen med aceton i tilfelle av magnetiske perler forurensning.
- Data analyse
- Åpne Python analyse script og innspill alle eksperimentelle data. Klikk Load Square for å legge inn firkant bølgen som referanse. Deretter klikker du Last inn Baseline til input gjenværende magnetisk signal som bakgrunn.
- Definer det samlede magnetiske signalet reduseres som B0. Normalisere hvert magnetisk signal redusere b til B0 og uttrykke det som en prosentandel. Plot prosenten (B/B0) versus sentrifugalkraften for å få bedriftene spekteret.
Merk: sentrifugalkraften f er beregnet fra spenstig massen av de magnetiske perlene m (4,6 × 10− 15 kg), sentrifugal hastighet w, og radius av sentrifuge r (7,5 cm her) via ligning F = mw 2 andre priser r. den typiske kraften oppløsningen er 2-4 PN og kraft rekkevidde er 15-95 pN i dette arbeidet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser registreringsskjemaet og fotografier av hovedkomponentene. Magnetisk deteksjon oppnås ved en Atomic Magnetometer ved hjelp av skanning ordningen (figur 1A)13. Prøven er plassert på en stang montert på en lineær motor. Motoren transporterer prøven til Atom-sensoren i et magnetisk skjold, deretter tilbake til det opprinnelige stedet for lossing. Atom Magnetometer oppdager det magnetiske signalet under prøve skanningen og produserte et signal spor, med det maksimale signalet når prøven er nærmest sensoren. Figur 1 B viser bildet av det samlede instrumentet. Tall 1C, D Vis bilder av magnetization stasjonen og sentrifuger brukes til kraft anvendelse, henholdsvis.
Prinsippet om den doble DNA linjal analysen er vist i figur 2. Det ribosom komplekset er immobilisert på overflaten via 5 ' enden av mRNA. To DNA-herskere er utformet for å undersøke den nøyaktige posisjonen til ribosom, en for hver side av mRNA. Den nåværende immobilisering ordningen gjør 3 ' side lett tilgjengelig for undersøkelser DNA herskere. Derfor, DNA oligomers bøyd med magnetiske perler kan danne duplexes med avdekket mRNA. Den 5 ' side, derimot, er sterically hindret av ribosom og overflaten. En linker molekyl er dermed nødvendig for at DNA å nå avdekket mRNA på denne siden. Ved å variere linker lengde, har vi fastslått at når linker er lengre enn 50 T, kan vi oppdage et sterkt magnetisk signal som indikerer vellykket dannelse av DNA-mRNA duplexes (figur 2B). Korrelasjon av dissosiasjon kraft til dupleks lengde oppnås ved å variere antall NT på DNA som er komplementære til mRNA. Tall 2C,D viser sammenhengen for henholdsvis 3 '-og 5 '-sidene. Fordi styrken forskjellen mellom duplexes av påfølgende lengder er vanligvis 12-20 pN og styrken oppløsning er vanligvis 2-4 pN, vi rutinemessig oppnå enkelt-NT-oppløsning for lengden av DNA-mRNA duplexes basert på deres dissosiasjon styrker.
Figur 3 presenterer resultatene av normal translokasjon i fravær og tilstedeværelsen av ulike antibiotika. Translokasjon er fra MF-pre til MF-post (Figur 3A). Innfelt indikerer at MF-pre bærer ledige tRNAfMet og MF-tRNAPhe på P-og A-områder, henholdsvis. MF-post bærer tRNAfMet og MF-tRNAPhe på henholdsvis E-og P-sidene, med en ledig a-site. Figur 3 B viser at uten antibiotika, den ribosom trekk av 3 NT på begge sider (beveger seg mot 3 '-end). Dette er på grunn av følgende årsaker: (i) DNA-mRNA duplexes på 5 ' side utstillingen 12 BP og 15 BP bindende styrker i MF-pre og MF-post, henholdsvis. (II) duplexes på 3-enden viser en reversert endring fra 15 til 12 BP (Figur 3C). Imidlertid, når begge to Fusidic syren og Neomycin er gave, det Force Spectra viser det det ribosom beveger bare av 1 NT for det 5 ' side bortsett fra 2 NT for det 3 ' side (skikkelsen 3D, E). Dette resultatet indikerer at ribosom translocated via en trinnvis mekanisme, noe som resulterer en løkker mRNA konformasjon som har en ekstra NT inne i ribosom, som ikke har blitt eksperimentelt avslørt før. Dette er konsistent med rapportert teoretisk simulering14. Alternativt kan ribosom strekkes for å dekke 28 NT av mRNA, i stedet for den vanlige 27 NT15. Etter å vaske bort antibiotika, normal translokasjon oppstår, som dokumentert av 3 NT bevegelser fra både 5 gepatotoksičnost og 3 gepatotoksičnost sider (lilla spor i Figur 3D, E). Den repeterende konformasjon ikke dannes når bare Fusidic syre brukes. Kraften Spectra er forenlig med ribosom bevegelse av 3 NT på begge sider, i likhet med situasjonen for normal translokasjon (Figur 3F, G). Den doble linjalen analysen avslører også at viomycin fullstendig hemmet translokasjon, som vist ved 0 NT bevegelse på begge sider (Figur 3H, I).
Vi har også undersøkt om denne løkker konformasjon kan danne på "-1" frameshifting motiver. Her, translokasjon fra MFNF-pre og MFNF-post komplekser finner sted på ' U6A ' motiv, som har blitt funnet å være en del av '-1 ' frameshifting MOTIV i HIV16. Tall 4a, B viser at i MFNF-post, DNA-mRNA dupleks er forkortet med enten 2 eller 3 NT på 3 '-end; dupleks lengden øker med enten 2 eller 3 NT ved 5 gepatotoksičnost-ender. Resultatene tyder på sameksistens av både normal translokasjon og "-1" frameshifting, med den tidligere samkjøre med 3-NT-bevegelsen og sistnevnte samkjøre med 2-NT-bevegelsen. Den doble linjalen analysen er i stand til å klart løse de to populasjoner. Med både Neomycin og Fusidic syre, observerer vi at ribosom beveger seg med 2 NT på 3 '-end, men bare 1 NT på 5 gepatotoksičnost-end, henholdsvis (Figur 4C, D). Derfor er det løkker mRNA konformasjon også foregår på glatt sekvens. Når bare Fusidic yre er til stede for MFNF-pre (Figur 4E, F), er resultatet det samme som for MFNF-post i panel A og B (blå spor), noe som indikerer at Fusidic syre alene er ikke tilstrekkelig til å stanse translokasjon eller frameshift. Derfor bekrefter det at både Fusidic syre og Neomycin er nødvendig for de ulike forskyvninger for de to sidene av mRNA.
Figur 1 : Instrumenter for den bedrifter-baserte dual DNA linjal analysen. (A) skjematisk av magnet deteksjon. 1: prøve og montere; 2: motor; 3: Atomic sensor og magnetisk skjold. (B) bilde av Atomic Magnetometer og sample håndtering system. Tallene indikerer de faktiske tilsvarende komponenter som vises i skjematisk. Merk magnet skjoldet er inne i papp boksen for bedre termisk stabilitet. (C) magnetization stasjon. (D) sentrifuger som brukes til kraft påføring. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Dual linjal analysen med én-NT-oppløsning for å studere ribosom translokasjon. (A) skjematisk av dual linjal analysen, der to DNA-herskere er utformet for å henholdsvis sonde de 5 gepatotoksičnost-og 3 gepatotoksičnost-endene. Den røde linjen indikerer polyT linker. (B) optimalisering av lengde på linker for Ruler-in. (C) bedrifter resultater for å bestemme dissosiasjon kreftene til duplexes mellom linjal-ins og mRNA. (D) dissosiasjon krefter duplexes mellom linjal-outs og mRNA. Feil linjen er definert som forholdet mellom instrumentets støy og det samlede magnetiske signalet reduseres (B0), med typisk verdi på ± 3-5%. Figur er gjengitt med tillatelse9. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Verifiserer translokasjon trinn under påvirkning av ulike antibiotika. (A) undersøkelser ORDNINGEN for MF-pre og MF-post komplekser. Innfelt indikerer skjematisk ribosomer i pre og post, som tilsvarer den solide og Dash-lined ovaler, henholdsvis. (B, C) BEDRIFTER resultater uten antibiotika. (D, E) Resultater med både Fusidic syre og Neomycin. (F, G) Resultater med Fusidic syre bare. (H, I) Resultater med viomycin bare. Venstre panel: ved hjelp av linjal-in for å granske 5-siden; høyre panel: ved hjelp av linjal-ut for å granske 3-siden. Feilfeltene beregnes på samme måte som i forrige figur. Figur er gjengitt med tillatelse9. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Bedrifter resultater av å bruke to herskere å granske frameshifting. (A, B) MFNF-pre og MFNF-post uten antibiotika. (C, D) Resultater med både Fusidic syre og Neomycin. (E, F) Resultater med bare Fusidic syre. Venstre panel: ved hjelp av Ruler-in for å granske 5 gepatotoksičnost IDen; høyre panel: Bruk linjal-ut for å granske 3 gepatotoksičnost-siden. Feilfeltene beregnes på samme måte som i forrige figur. Figur er gjengitt med tillatelse9. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I vår dual linjal analysen, magnetiske perler spille to viktige roller. Først tjener de som kraft transdusere fordi Sentrifugalkraften er proporsjonal med deres spenstig masse. Sekund, perlene er signal bærere oppdages av en Atomic Magnetometer, som for tiden er den mest nøyaktige magnetisk sensor. Kombinere mekanisk manipulasjon og magnetisk deteksjon, er det bedrifter teknikken i stand til å løse et stort antall molekylære interaksjoner basert på deres kritiske dissosiasjon styrker, som er grunnlaget for DNA herskere. Den doble linjal analysen er unikt egnet til å granske begge sider av mRNA under translokasjon. Fordi det er en fysisk tilnærming som bare er avhengig av dannelsen av duplexes, er det ikke begrenset av mRNA sider eller andre biologiske begrenser. Dette er en fordel sammenlignet med andre teknikker som er basert på biokjemiske reaksjoner. Vi har vist at ved å bruke en lang kobling molekyl, kan herskerne nå målrettede bindende området for å bestemme mRNA posisjon. Nærmere bestemt, for ribosom, den linker lengden er 50 T, som tilsvarer 17 NM i lengde. Denne lengden er svært nær størrelsen på ribosom17. Konsentrasjonen av antibiotika er typiske verdier fra litteraturen. Det er også mulig å bruke vår metode for å avdekke utbruddet verdier for sine funksjoner.
Det er to kritiske aspekter for dual linjal analysen. Den ene er den delikate funksjonalisert overflaten for molekylær immobilisering og påfølgende biologiske reaksjoner. Hver lasting og vasking trinn bør utføres med minimal forstyrrelse til overflaten, slik at molekylene immobilisert på overflaten vil forbli intakt. For DNA-mRNA hybridisering prosessen er det nødvendig med tilstrekkelig tid for å sikre fullføringen av prosessen. Det er også anbefalt å bruke TAM10 buffer med ekstra 1 M NaCl å opprettholde et homøostatisk system. Den andre kritiske aspektet er magnetization av perlene. Siden overdreven perler brukes, er det rikelig med gratis perler ikke immobilisert på overflaten. Derfor, når magnetizing prøven, bør den belagte overflaten nærmer seg og la magneten vertikalt. Enhver mindre sving av prøven kan muligens føre til riper skade på overflaten.
Våre Dual DNA linjal analysen er foreløpig den eneste metoden som objektivt kan sonde både inngangs-og utgangssidene av mRNA i ribosom komplekser med ett-NT-oppløsning. Novel mekanistisk informasjon om ribosom translokasjon er innhentet. Metoden er vanligvis aktuelt for molekylær forskyvning av nukleinsyre syrer, som er allment oppstått i molekylærbiologi.
For fremtidig utvikling og applikasjoner, har vi vist at bruk av akustisk stråling kraft for å erstatte sentrifugalkraften vil ytterligere forbedre styrken oppløsning, nå sub-NT regime18. Vi undersøker også multiplekset deteksjon ved hjelp av Atomic magnetometers for å forbedre deteksjons effektiviteten. Med disse forbedringene, forventer vi vår metode detaljert i dette arbeidet vil finne omfattende anvendelser i biologisk forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke rapportert om potensiell interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet er støttet av det amerikanske National Institutes of Health (R01GM111452, Y.W., S.X.). Y. W. erkjenner støtte fra Welch Foundation (E-1721).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Styrene Strip | City of Industry | MS-861 | |
| Glass slides | Evaporated Coatings | 60.0 × 4.0 × 0.3 mm3 | |
| Acetic acid | Millipore Sigma | A6283-500ML | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane | UCT specialties | 21400088 | |
| mPEG-SVA | Laysan Bio | 154-82 | |
| Biotin-PEG-SVA | Laysan Bio | 152-84 | |
| Sodium bicarbonate | Millipore Sigma | S5761-500G | |
| Epoxy glue | Devcon | 31345 | |
| Streptavidin | ThermoFisher | 434301 | |
| Fusidic Acid | Millipore Sigma | F0756-1G | |
| Neomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1458009 | |
| Viomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1715000 | |
| Hygromycin | invitrogen | 10687-010 | |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941-100G | |
| Magnesium acetate | Millipore Sigma | M5661-50G | |
| Ammonium chloride | Millipore Sigma | A9434-500G | |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | P9333-500G | |
| EDTA | GIBCO | 774750 | |
| 2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-500ML | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-250ML | |
| GTP | Millipore Sigma | G8877-100MG | |
| PEP | Millipore Sigma | P7127-100MG | |
| Pyruvate Kinase | Millipore Sigma | P1506-5KU | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S7903-5KG | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | ThermoFisher | 11205D | |
| mRNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 133899727 | 5′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468630 | 3?- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5? |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 164845370 | 3?-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468628 | 3?-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 163472705 | 3?-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678130 | 3?-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678131 | 3?-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678132 | 3?-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5? |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678133 | 3?-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| Centrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Micro Ultracentrifuge | Hitachi | CS150FNX | |
| Vortex mixer | VWR | VM-3000 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR530 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR830 | |
| Laser | Newport | TLB-6918-D | |
| Function generator | Stanford Research Systems | DS345 | |
| Photo detectors | Thorlabs | DET36A |
References
- Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA. Quarterly Review of Biophysics. 50, 12 (2017).
- Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F. How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation. Science. 345, 1188-1191 (2014).
- Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals. RNA. 4, 479-486 (1998).
- Fang, Y., Treffers, E. E., Li, Y., Tas, A., Sun, Z., van der Meer, Y., de Ru, A. H., van Veelen, P. A., Atkins, J. F., Snijder, E. J., Firth, A. E. Efficient -2 frameshifting by mammalian ribosomes to synthesize an additional arterivirus protein. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 2920-2928 (2012).
- Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways. Cell. 160, 870-881 (2015).
- Shirokikh, N. E., Alkalaeva, E. Z., Vassilenko, K. S., Afonina, Z. A., Alekhina, O. M., Kisselev, L. L., Spirin, A. S. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Research. 38, 15 (2010).
- Chen, J., et al. Dynamic pathways of -1 translational frameshifting. Nature. 512, 328-332 (2014).
- De Silva, L., Yao, L., Wang, Y., Xu, S. Well-defined and sequence-specific noncovalent binding forces of DNA. Journal of Physical Chemistry B. 117, 7554-7558 (2013).
- Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers reveal an "mRNA looping" intermediate state during ribosome translocation. RNA Biology. 15, 1392-1398 (2018).
- Tsai, T. W., Yang, H., Yin, H., Xu, S., Wang, Y. High-efficiency "-1" and "-2" ribosomal frameshiftings revealed by force spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12, 1629-1635 (2017).
- Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99, 3002-3009 (2010).
- Garcia, N. C., Yu, D., Yao, L., Xu, S. Optical atomic magnetometer at body temperature for magnetic particle imaging and nuclear magnetic resonance. Optics Letters. 35, 661-663 (2010).
- Yao, L., Xu, S. Long-range, high-resolution magnetic imaging of nanoparticles. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5679-5682 (2009).
- Kurkcuoglu, O., Doruker, P., Sen, T. Z., Kloczkowski, A., Jernigan, R. L. The ribosome structure controls and directs mRNA entry, translocation and exit dynamics. Physical Biology. 5, 046005 (2008).
- Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475, 118-121 (2011).
- Jacks, T., et al. Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression. Nature. 331, 280-283 (1988).
- Schuwirth, B. S., et al. Structures of the bacterial ribosome at 3.5 Å resolution. Science. 310, 827-834 (2005).
- Jia, H., Wang, Y., Xu, S. Super-resolution force spectroscopy reveals ribosomal motion at sub-nucleotide steps. Chemical Communications. 54, 5883-5886 (2018).
