Summary
L'analisi del doppio righello del DNA viene sviluppata per determinare la posizione dell'mRNA durante la traslocazione del ribosoma, che si basa sulle forze di dissociazione dei duplex DNA-mRNA formati. Con la risoluzione mononucleotide e la capacità di raggiungere entrambe le estremità dell'mRNA, può fornire spunti meccanicistici per la traslocazione del ribosoma e sondare altri spostamenti di acido nucleico.
Abstract
La traslocazione del ribosoma si riferisce al movimento ribosomico sull'mRNA da esattamente tre nucleotidi (nt), che è il passo centrale nella sintesi proteica. Per studiarne il meccanismo, esistono due requisiti tecnici essenziali. Il primo è una risoluzione single-nt che può risolvere la normale traslocazione dal frameshifting, durante il quale il ribosoma si muove di diverso da 3 nt. La seconda è la capacità di sondare i lati di ingresso e uscita dell'mRNA al fine di chiarire l'intero quadro della traslocazione. Riportiamo il doppio saggio del righello del DNA che si basa sulle forze di dissociazione critiche dei duplex DNA-mRNA, ottenuti dalla spettroscopia di magnetizzazione residua indotta dalla forza (FIRMS). Con la risoluzione della forza 2-4 pN, l'esempio a doppio righello è sufficiente a distinguere i diversi passaggi di traslocazione. Implementando un lungo linker sui DNA di sondaggio, possono raggiungere l'mRNA sul lato opposto del ribosoma, in modo che la posizione dell'mRNA possa essere determinata per entrambi i lati. Pertanto, l'analisi del doppio righello è particolarmente adatta a studiare la traslocazione del ribosoma e il movimento dell'acido nucleico in generale. Mostriamo risultati rappresentativi che indicavano una conformazione di mRNA in loop e risolvevano la normale traslocazione dal frameshifting.
Introduction
Lo spostamento biomolecolare è un parametro fondamentale nello studio del meccanismo delle funzioni biologiche correlate. Un esempio particolare è la traslocazione ribosoma1,2, durante la quale il ribosoma si muove esattamente da tre nucleotidi (nt) sull'RNA messaggero (mRNA) normalmente, e da uno, due o altri numeri di nt tranne tre nel caso di frameshifting. Pertanto, è necessario un sistema di righello molecolare a risoluzione a virgola singola per distinguere le diverse dimensioni del passo. Una sfida più grande è quella di sondare il movimento del ribosoma su entrambi i lati di entrata e di uscita. In altre parole, solo con un sistema a doppio righello saremo in grado di rivelare se l'mRNA è filettato senza intoppi attraverso il ribosoma, o ci sono passaggi intermedi in cui i due lati hanno dimensioni di gradino diverse che portano a una conformazione di mRNA piegata o loop all'interno del Ribosoma.
Sono stati sviluppati diversi metodi per affrontare la prima sfida di risolvere diversi passi sul lato di uscita del ribosoma (la fine del 3' dell'mRNA). Il doppio saggio luciferasi risolve i diversi fotogrammi di lettura misurando i rapporti delle diverse proteine risultanti3,4. È applicabile solo per l'estremità 3' dell'mRNA e quindi insufficiente a fornire un quadro completo della traslocazione. La spettrometria di massa può analizzare i diversi frammenti di peptidi come conseguenza dei corrispondenti riarrangiamenti del codice5. Ma non può individuare quanti nt il ribosoma si muove sull'mRNA. Il test di stampa della dito della luce è un altro metodo comune che utilizza una trascrizione inversa innescata all'estremità 3'-distale per trascrivere l'mRNA verso il ribosoma6. Tuttavia, non è applicabile per la fine 5' dell'mRNA che sta entrando nel ribosoma. Altre tecniche, tra cui approcci a singola molecola e metodi di fluorescenza7, sono difficili da raggiungere una risoluzione a due.
Abbiamo sviluppato il doppio saggio del righello del DNA in grado di determinare in modo univoco sia le posizioni di ingresso che di uscita dell'mRNA scoperto nei complessi di ribosomi-mRNA. I DNA righelli sono oligomeri di DNA che formano duplex di un certo numero di coppie di base (bp) con l'mRNA scoperto dal ribosoma, indipendentemente dalla fine dell'mRNA. I numeri bp poi rivelano con precisione la posizione del ribosoma sull'mRNA durante la traslocazione. I numeri bp dei duplex sono determinati dalle loro forze critiche di dissociazione ottenute dalla spettroscopia di magnetizzazione della magnetizzazione di residua indotta dalla forza (FIRMS)8. Con 2-3 pN di incertezza forza, le forze critiche sono sufficienti per offrire una risoluzione mono-nt. Implementando una molecola del linker sui righelli del DNA, il lato sterically ostacolato dell'mRNA dal ribosoma può essere sondato. Diversi spostamenti di ribosomia possono quindi essere risolti con precisione. Abbiamo rivelato con successo un'unica conformazione loopdiforme di mRNA intrappolata dagli antibiotici durante la traslocazione9, e risolto diversi fotogrammi di lettura che coesistevano su una sequenza di mRNA scivolosa10. Questo articolo descrive i dettagli del saggio a doppio righello, che includono la preparazione dei complessi ribosomi, la funzionalizzazione superficiale dei vetrini di vetro, l'immobilizzazione dei complessi di ribosomi e la loro ibridazione con righello di DNA etichettato magneticamente molecole, rilevamento magnetico e analisi dello spettro di forza da parte di FIRMS.
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Protocol
1. Preparazione dei complessi ribosomi
- Fare 1.000 mL di TAM10 buffer, che consiste di 20 mM tris-HCl (pH 7.5), 10 mM Mg (OAc)2, 30 mM NH4Cl, 70 mM KCl, 5 mM EDTA, 7 mM BME (2-cap mertoetanolo) e 0,05% Tween20.
- Preparare le cinque miscele elencate nella Tabella 1.
NOTA: Il ribosoma era del ceppo MRE60011. EF-Tu: fattore di allungamento terminabile. EF-Ts: fattore di allungamento termo stabile. GTP: guanosina tripofosfato. PEP: fosforo (enol)pyruvate. - Incubare le cinque miscele separatamente a 37 gradi centigradi per 25 minuti prima di realizzare i complessi di ribosomi. Preparare i cinque complessi di ribosomi secondo la tabella 2.
NOTA: Post-traslocazione; Pre:pre-traslocazione. - Aggiungere ciascuno dei cinque complessi di ribosomi su un cuscino di saccarosio di 1,1 M separatamente, con rapporto di volume 1:1. Purificare ciascuno con 450.000 g per 2 h in un ultra-centrifuga. Utilizzare un pipet per rimuovere il supernatante e ripristinare i complessi di ribosomi a -80 gradi centigradi dopo la sospensione del pellet con buffer TAM10.
2. Preparazione di vetrini in vetro rivestito di biotina
- Pulizia preliminare degli scivoli di vetro
- Collocare 12 vetrini di vetro con dimensioni pari a 60,0 x 4,0 x 0,3 mm3 (L e T) in un piatto di vetro corto e largo.
- Riempire il piatto di vetro con acetone e sonicare per 5 min. Quindi lavare i vetrini con acqua ultrapura 5 volte e riempire 3/4 del piatto con acqua.
- Aggiungere 10 M KOH per riempire il piatto e sonicare i vetrini di vetro per 20 min. Lavare i vetrini con acqua 5 volte.
- Aggiungere l'etanolo e il sonicato per 5 min, versare l'etanolo e poi asciugarli separatamente a 300 gradi centigradi per 3 h.
- Rivestimento di ammisorria
- Rimettere i 12 vetrini puliti nella teglia di vetro contenente metanolo. Pulire una fiaschetta PEGylation con metanolo sonicando per 5 min, quindi riempirlo con 25 mL di metanolo, 1,25 mL di acqua, 0,125 mL HAc, 0,25 mL 3-aminopropyltriethoxysilane (AMEO).
- Sostituire immediatamente il metanolo nella teglia di vetro con la soluzione AMEO preparata. Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
- Sciacquare gli scivoli con acqua più volte, quindi asciugarli con la purga dell'azoto. Mettere i vetrini secchi in piatti di vetro pulito.
- PEGlation
- Preparare la soluzione NaHCO3 (8,4 mg/mL) e il buffer PEGylation (37,5 mg PEG, 6 mg di PEG biotinylated, 150 soluzione NaHCO3). Mescolare bene ruotando a 6.000 giri/mm per 1 min.
- Posizionare 25 gradi di soluzione PEG su ogni vetrino. Coprirlo con l'altra diapositiva in cima. Assicurarsi che non vi siano bolle tra le due diapositive. Posizionare le diapositive in una casella di punta pipetta vuota. Assicurarsi che la scatola è livellata e posizionarla in un cassetto scuro per circa 3 h.
- Sciacquare gli scivoli con acqua e asciugare di nuovo. Conservare i vetrini essiccati a temperatura ambiente sotto vuoto per un massimo di 2 settimane.
3. Preparazione del campione prima delle misurazioni magnetiche e della forza
- Lavorare bene un campione di plastica con le dimensioni 4 x 3 x 2 mm3 (L , W e D). Incollare un pezzo di vetro rivestito di biotina (circa 5 mm di lunghezza, tagliato dai vetrini lunghi 60 mm preparati nella sezione 2) sulla superficie inferiore utilizzando la resina epossidica.
- Aggiungere nel pozzo del campione una soluzione aquesa di 20 -L di 0,25 mg/mL streptavidin e incubare a temperatura ambiente per 40 min. Quindi risciacquare il campione due volte con TAM10 tampone.
- Immobilizzare i complessi ribosomi.
- Senza antibiotici: utilizzare una pipetta per rimuovere bene il buffer dal campione, quindi aggiungere nel pozzo il complesso di ribosomi 0,1 M (MF-Pre o MF-Post). Il complesso di ribosomi si legherà con la streptavidina sulla superficie attraverso la biotina 5'-end sull'mRNA. Incubare a 37 gradi centigradi per 1 ora e poi risciacquare una volta con tam10 tampone.
- Per l'esperimento utilizzando sia neomicina che acido fusidico: incubare il complesso MF-Pre con neomicina a 37 s per 10 min; incubare EF-G con acido fusidico a 37 gradi centigradi per 20 min. Le concentrazioni sono le seguenti: 0,1 complesso ribosomiare, 2 M EF-G, 4 mM GTP, 4 mM PEP, 0,02 mg/mL di pigiami chinasi, neomicina di 0,2 mM e acido fusidico di 0,25 mM.
- Eseguire gli altri esperimenti antibiotici in modo simile. Le concentrazioni sono le seguenti: 0,2 mM di viomicina, 0,4 m di igromicina B e 0,25 mM di acido fusidico.
- Per lo studio del frameshifting, ripetere i passaggi precedenti per i complessi MFNF-Pre e MFNF-Post che coinvolgono il motivo scivoloso U6A. Utilizzare antibiotici acido fusidico più neomicina, e acido fusidico da solo, rispettivamente.
- Rimuovere il buffer dal pozzo campione, quindi aggiungere 20 . Risciacquare il duplex DNA-mRNA formato una volta con buffer TAM10.
- Rimuovere il buffer dal pozzo campione. Aggiungere quindi nel pozzo del campione 20 luna di 0,5 mg/mL di perline magnetiche rivestite con streptavidin e incubare a temperatura ambiente per 2 h.
- Inserire con attenzione il campione in un supporto e metterlo in una centrifuga. Rimuovere le particelle magnetiche libere dalla superficie centrifugando a 84 x g per 5 min.
4. Misurazioni magnetiche e di forza
- Accensione del laser
- Accendere il laser utilizzando la chiave. Quindi premere il pulsante di accensione.
- Regolare la sensibilità dell'amplificatore di bloccaggio 1 (LIA1) a 500 mV e attendere circa 2 h per riscaldare e stabilizzare il magnetometro atomico.
- Impostazione del magnetometro atomico
- Eseguire il software di controllo dello strumento e impostare i parametri di misurazione. Alcuni parametri possono variare leggermente in ogni misura.
NOTA: Il magnetometro atomico comprende un laser (descritto sopra), un amplificatore di blocco SR830 (noto come LIA1), un amplificatore di bloccaggio SR530 (denominato LIA2), DS345 (noto come FG1) e generatori di funzioni ATF20B (denominati FG2), un generatore di funzioni ad alta risoluzione motore e un computer. Tutti questi dovrebbero essere attivati in questa fase del protocollo. - Impostare la modalità di spostamento del motore su Rumore e la posizione predefinita su 0. Premere Blocca sul pannello anteriore, regolare la sensibilità di LIA1 torna a 200 mV.
- Regolare la corrente e la tensione del laser e trovare il picco di risonanza corretto e il livello di segnale-rumore. Premere Sweep sul pannello anteriore. Si noti che il rapporto ampiezza/larghezza deve essere superiore a 0,5 e il valore di fase deve essere inferiore a 5 gradi. In caso contrario, eseguire nuovamente il passaggio di sweep.
- Collegare l'uscita di LIA2 al feedback del laser per bloccarne la frequenza. Questo amplificatore misura la rotazione ottica di una cella ausiliaria di cesio per mantenere la frequenza laser in risonanza12. Lo stato rimane fino alla fine della misurazione.
- Generatore di funzioni plug-in FG2 per inserire un'onda quadra (500 mVpp, 100 mHz) come segnale di riferimento. L'onda quadra corrisponde a 100 pT e viene utilizzata per convertire l'uscita corrente dell'amplificatore in segnale magnetico. Scollegare il generatore di funzioni.
- Impostare la modalità di movimento del motore su Bidirezionale e posizione predefinita su 260 mm. Controllare lo stato del regolatore di temperatura per garantire la temperatura corretta del sensore atomico.
- Controllare la stabilità dell'intero sistema misurando due volte i segnali del supporto campione vuoto. Valutare la stabilità e il livello di rumore dopo aver sottratto le due tracce. Il livello di rumore tipico e la fluttuazione dovrebbe essere di 2 pT a 30 ms tempo di integrazione.
- Eseguire il software di controllo dello strumento e impostare i parametri di misurazione. Alcuni parametri possono variare leggermente in ogni misura.
- Magnetizzazione del campione
- Posizionare delicatamente il campione sulla stazione di magnetizzazione e lasciarlo rimanere per 2 min.
NOTA: La stazione di magnetizzazione è costituita da un magnete permanente (0,5 T) e da un distanziale di plastica. - Rimettere il campione nel supporto del campione. Utilizzare una forza centrifuga di 335,4 x per rimuovere le particelle magnetiche non legate in modo specifico.
- Posizionare delicatamente il campione sulla stazione di magnetizzazione e lasciarlo rimanere per 2 min.
- Misure magnetiche dopo l'applicazione delle forze
- Utilizzare una pinzetta per caricare il campione sul motore. Fare clic su Blocca sul pannello anteriore per eseguire il programma. Nel frattempo, utilizzare le pinzette per caricare l'altro campione nel supporto e posizionarlo nella centrifuga. Si noti che il lato in vetro rivestito deve affrontare il centro della centrifuga.
NOTA: Viene utilizzata la tecnica della spettroscopia di magnetizzazione residua indotta dalla forza (FIRMS), che utilizza un magnetometro atomico per misurare il segnale magnetico del campione dopo aver applicato la forza meccanica sulle interazioni molecolari nel campione. Qui, le interazioni molecolari sono tra le molecole righello del DNA e l'mRNA nel complesso ribosoma. La forza aumenta gradualmente aumentando la velocità centrifuga. Dopo aver applicato ogni forza, il motore traduce il campione nel sensore atomico e quindi si sposta indietro. Quindi, si ottengono due profili di campo magnetico, uno durante la scansione in avanti e l'altro durante la scansione all'indietro13. Usiamo solo quest'ultimo per estrarre l'altezza di picco grazie al suo migliore rapporto segnale-rumore. L'altezza di picco nella corrente (nA) viene convertita in ampiezza del segnale magnetico (pT) in base all'onda quadra di calibrazione. - Ogni misura dura circa 5 min. Quando il motore torna a 0, fare clic su Salva sul pannello anteriore. Utilizzare con attenzione le pinzette per prelevare campioni da motore e centrifuga. Utilizzare la velocità iniziale corrispondente a 335,4 g (2000 rpm, rivoluzione al minuto per la centrifuga elencata nella Tabella dei materiali).
- Scambiare i due campioni e applicare una forza più forte aumentando la velocità centrifuga di 100 giri/min o dimensioni di passo simili. Elaborare alternativamente per aumentare gradualmente la forza; uno spettro di forza completo si ottiene dopo 10-12 punti dati.
- Utilizzare una pinzetta per caricare il campione sul motore. Fare clic su Blocca sul pannello anteriore per eseguire il programma. Nel frattempo, utilizzare le pinzette per caricare l'altro campione nel supporto e posizionarlo nella centrifuga. Si noti che il lato in vetro rivestito deve affrontare il centro della centrifuga.
- Completamento dell'esperimento
- Quando tutti gli esperimenti pianificati sono terminati, spegnere l'apparecchiatura, procedendo nell'ordine opposto come è stata attivata.
- Rimuovere i campioni dal supporto e immergerli in etanolo per la pulizia e l'uso futuro. Pulire il supporto del campione con acetone in caso di contaminazione magnetica delle perline.
- Analisi dei dati
- Aprire lo script di analisi Python e immettere tutti i dati sperimentali. Fare clic su Carica quadrato per inserire l'onda quadra come riferimento. Quindi fare clic su Carica linea di base per inserire il segnale magnetico residuo come sfondo.
- Definire la diminuzione complessiva del segnale magnetico come B0. Normalizzare ogni segnale magnetico diminuire da B a B0 ed esprimerlo in percentuale. Tracciare la percentuale (B/B0) rispetto alla forza centrifuga per ottenere lo spettro FIRMS.
NOTA: La forza centrifuga F è calcolata dalla massa galleggiante delle perle magnetiche m (4,6 x 10kg), dalla velocità centrifuga w e dal raggio della centrifuga r (7,5 cm qui) tramite l'equazione F 2 Il nome del sistema r.La risoluzione di forza tipica è 2-4 pN e l'intervallo di forza è 15-95 pN in questo lavoro.
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Representative Results
La figura 1 mostra lo schema di rilevamento e le fotografie dei componenti principali. Il rilevamento magnetico è ottenuto da un magnetometro atomico utilizzando lo schema di scansione (Figura 1A)13. Il campione viene posto su un'asta montata su un motore lineare. Il motore trasporta il campione al sensore atomico all'interno di uno scudo magnetico, quindi di nuovo al sito originale per lo scarico. Il magnetometro atomico rileva il segnale magnetico durante la scansione del campione e ha prodotto una traccia del segnale, con il segnale massimo quando il campione è il più vicino al sensore. Figura 1 B mostra la foto dello strumento complessivo. Le figure 1C,D mostrano le foto della stazione di magnetizzazione e della centrifuga utilizzata rispettivamente per l'applicazione della forza.
Principio del doppio assaggio del righello del DNA è mostrato in Figura 2. Il complesso di ribosomi è immobilizzato sulla superficie attraverso l'estremità 5' dell'mRNA. Due righelli del DNA sono progettati per sondare l'esatta posizione del ribosoma, uno per ogni lato dell'mRNA. L'attuale schema di immobilizzazione rende il lato 3' facilmente accessibile per i righelli del DNA di sonda. Pertanto, gli oligomeri di DNA coniugati con perline magnetiche possono formare duplex con l'mRNA scoperto. Il lato 5', tuttavia, è sterically ostacolato dal ribosoma e dalla superficie. È quindi necessaria una molecola del linker affinché il DNA raggiunga l'mRNA scoperto su questo lato. Variando la lunghezza del linker, abbiamo determinato che quando il linker è più lungo di 50 T, siamo in grado di rilevare un forte segnale magnetico che indica la corretta formazione di duplex DNA-mRNA (Figura 2B). La correlazione tra la forza di dissociazione e la lunghezza duplex si ottiene variando il numero di nt sul DNA complementari all'mRNA. Le figure 2C,D mostrano la correlazione rispettivamente per i lati 3' e 5'- . Poiché la differenza di forza tra duplex di lunghezze consecutive è in genere 12-20 pN e la risoluzione della forza è in genere 2-4 pN, otteniamo regolarmente una risoluzione a virgola singola per la lunghezza dei duplex DNA-mRNA in base alle loro forze di dissociazione.
La figura 3 presenta i risultati della normale traslocazione in assenza e presenza di vari antibiotici. La traslocazione va da MF-Pre a MF-Post (Figura 3A). L'insetto indica che MF-Pre trasporta tRNAfMet e MF-tRNAPhe rispettivamente nei siti P e A. MF-Post trasporta tRNAfMet e MF-tRNAPhe rispettivamente nei siti E e P, con un sito A vacante. Figura 3 B mostra che senza antibiotici, il ribosoma si muove di 3 nt su entrambi i lati (spostandosi verso la fine 3'-fine). Ciò è dovuto ai seguenti motivi: (i) I duplex DNA-mRNA sul lato 5' presentano forze di legame 12 bp e 15 bp rispettivamente in MF-Pre e MF-Post. (ii) I duplex all'estremità 3' presentano una variazione invertita da 15 a 12 bp (Figura 3C). Tuttavia, quando sono presenti sia l'acido fusidico che la neomicina, gli spettri di forza mostrano che il ribosoma si muove solo di 1 nt sul lato 5' ma 2 nt sul lato 3' (Figura 3D,E). Questo risultato indica che il ribosoma traslocato attraverso un meccanismo stepwise, risultante da una conformazione di mRNA in loop che ha un nt extra all'interno del ribosoma, che non è stato rivelato sperimentalmente prima. Questo è coerente con la simulazione teorica riportata14. In alternativa, il ribosoma può essere allungato per coprire 28 nt di mRNA, invece dei soliti 27 nt15. Dopo aver lavato via gli antibiotici, si verifica una normale traslocazione, come dimostrano i movimenti di 3 nt da entrambi i lati 5 e 3 (traccia viola nella Figura 3D, E). La conformazione in loop non si forma quando si utilizza solo l'acido fusidico. Gli spettri di forza sono coerenti con il movimento del ribosoma di 3 nt su entrambi i lati, simile alla situazione della normale traslocazione (Figura 3F,G). L'asdetto a doppio righello rivela anche che la viomicina ha completamente inibito la traslocazione, come mostrato da 0 nt movimento su entrambi i lati (Figura 3H,I).
Abbiamo anche studiato se questa conformazione in loop può formarsi su motivi di spostamento del telaio "-1". Qui, la traslocazione dai complessi MFNF-Pre e MFNF-Post si svolge sul motivo 'U6A', che è stato trovato parte del motivo '-1' in frameshifting in HIV16. Le cifre 4A,B mostrano che nell'MFNF-Post, il duplex DNA-mRNA è abbreviato di 2 o 3 nt all'estremità 3'; la lunghezza duplex aumenta di 2 o 3 nt alle estremità 5. I risultati suggeriscono la coesistenza di una normale traslocazione e del frameshifting "-1", con il primo correlato con il movimento 3-nt e il secondo correlando con il movimento 2-nt. L'asdetto a doppio righello è in grado di risolvere chiaramente le due popolazioni. Con sia neomicina che con l'acido fusidico, osserviamo che il ribosoma si muove di 2 nt all'estremità 3'ma solo di 1 nt all'estremità 5 (Figura 4C,D). Pertanto, la conformazione dell'mRNA in loop avviene anche sulla sequenza scivolosa. Quando per l'MFNF-Pre (Figura 4E,F)è presente solo l'acido fusidico , il risultato è lo stesso di quello per MFNF-Post nei pannelli A e B (tracce blu), indicando che l'acido fusidico da solo non è sufficiente per sospendere la traslocazione o il frameshift. Pertanto, conferma che sia l'acido fusidico che la neomicina sono necessari per gli spostamenti disuguali per i due lati dell'mRNA.
Figura 1 : strumenti per il doppio indice del righello del DNA basato su FIRMS. (A) Schematica del rilevamento magnetico. 1: campione e suo montaggio; 2: motore; 3: sensore atomico e scudo magnetico. (B) Foto del magnetometro atomico e del sistema di movimentazione dei campioni. I numeri indicano i componenti corrispondenti effettivi mostrati nello schema. Si noti che lo scudo magnetico si trova all'interno della scatola di cartone per una migliore stabilità termica. (C) Stazione di magnetizzazione. (D) Centrifuga utilizzata per l'applicazione della forza. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : doppio saggio righello con risoluzione mono-nt per studiare la traslocazione del ribosoma. (A) Schematico del saggio a doppio righello, in cui due righelli del DNA sono progettati per sondare rispettivamente le estremità da 5 e 3. La linea rossa indica il linker polit. (B) Ottimizzazione della lunghezza del linker per i risultati di Ruler-In. (C) PER determinare le forze di dissociazione dei duplex tra Ruler-In e mRNA. (D) Forze di dissociazione dei duplex tra Ruler-Outs e mRNA. La barra di errore è definita come il rapporto tra il rumore dello strumento e la diminuzione complessiva del segnale magnetico (B0), con un valore tipico di 3-5%. La figura è stata riprodotta con il permesso9. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : sondare le misure di traslocazione sotto l'influenza di vari antibiotici. (A) Sistema di sondaggio per i complessi MF-Pre e MF-Post. L'insetto indica i ribosomi schematici in Pre e Post, che corrispondono rispettivamente agli ovali solidi e a trattini. (B, C) RISULTATI REE senza antibiotici. (D, E) Risultati con acido fusidico e neomicina. (F, G) Risultati solo con acido fusidico. (H, I) Risultati solo con viomycina. Pannelli a sinistra: usare righello in per sondare il lato 5'; pannelli a destra: utilizzando Ruler-Out per sondare il lato 3'. Le barre di errore vengono calcolate allo stesso modo di quelle della figura precedente. La figura è stata riprodotta con il permesso9. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : risultati DELL'utilizzo di doppi righelli per sondare il cambio del fotogramma. (A, B) MFNF-Pre e MFNF-Post senza antibiotici. (C, D) Risultati con acido fusidico e neomicina. (E, F) Risultati con solo acido fusidico. Pannelli a sinistra: utilizzo di righello-in per sondare il lato di 5 gradi; pannelli a destra: utilizzando righello-out per sondare il lato a 3. Le barre di errore vengono calcolate allo stesso modo di quelle della figura precedente. La figura è stata riprodotta con il permesso9. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Nel nostro assaggio doppio righello, le perline magnetiche svolgono due ruoli essenziali. In primo luogo, servono come trasduttori di forza perché la forza centrifuga è proporzionale alla loro massa galleggiante. In secondo luogo, le perline sono vettori di segnale rilevati da un magnetometro atomico, che è attualmente il sensore magnetico più preciso. Combinando la manipolazione meccanica e il rilevamento magnetico, la tecnica FIRMS è in grado di risolvere un gran numero di interazioni molecolari basate sulle loro forze critiche di dissociazione, che è la base dei righelli del DNA. L'analisi del doppio righello è particolarmente adatto a sondare entrambi i lati dell'mRNA durante la traslocazione. Poiché si tratta di un approccio fisico che si basa solo sulla formazione dei duplex, non è limitato dai lati mRNA o da altri vincoli biologici. Questo è un vantaggio rispetto ad altre tecniche che si basano su reazioni biochimiche. Abbiamo dimostrato che utilizzando una molecola del linker lunga, i righelli possono raggiungere il sito di legame mirato per determinare la posizione dell'mRNA. In particolare, per il ribosoma, la lunghezza del linker è 50 T, che corrisponde a 17 nm di lunghezza. Questa lunghezza è molto vicino alla dimensione del ribosoma17. Le concentrazioni degli antibiotici sono valori tipici della letteratura. È anche possibile utilizzare il nostro metodo per rivelare i valori di insorgenza per le loro funzioni.
Ci sono due aspetti critici per l'analisi del doppio righello. Una è la delicata superficie funzionalizzata per l'immobilizzazione molecolare e le successive reazioni biologiche. Ogni passo di carico e lavaggio deve essere eseguito con il minimo disturbo alla superficie, in modo che le molecole immobilizzate sulla superficie rimangano intatte. Per il processo di ibridazione DNA-mRNA, è necessario tempo sufficiente per garantire il completamento del processo. Si consiglia inoltre di utilizzare TAM10 buffer con extra 1 M NaCl per mantenere un sistema omeostatico. L'altro aspetto critico è la magnetizzazione delle perline. Dal momento che vengono utilizzate perline eccessive, ci sono un sacco di perline libere non immobilizzate sulla superficie. Pertanto, quando si magnetizza il campione, la superficie rivestita dovrebbe avvicinarsi e lasciare il magnete verticalmente. Qualsiasi minore oscillazione del campione può causare danni graffi sulla superficie.
Il nostro doppio saggio righello di DNA è attualmente l'unico metodo in grado di sondare oggettivamente sia i lati di ingresso che di uscita dell'mRNA nei complessi di ribosomi con risoluzione a singolo punto. Sono state ottenute nuove informazioni meccanicistiche sulla traslocazione dei ribosomi. Il metodo è generalmente applicabile per lo spostamento molecolare degli acidi nucleici, che è ampiamente incontrato nella biologia molecolare.
Per lo sviluppo e le applicazioni future, abbiamo dimostrato che l'uso della forza di radiazione acustica per sostituire la forza centrifuga migliorerà ulteriormente la risoluzione della forza, raggiungendo il regime di sub-nt18. Stiamo anche studiando il rilevamento multiplexed utilizzando magnetometri atomici per migliorare l'efficienza di rilevamento. Con questi miglioramenti, ci aspettiamo che il nostro metodo dettagliato in questo lavoro troverà ampie applicazioni nella ricerca biologica.
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Disclosures
Gli autori non hanno segnalato un potenziale conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo lavoro è supportato dagli Stati Uniti National Institutes of Health (R01GM11452, Y.W., S.X.). Y. W. riconosce il sostegno della Welch Foundation (E-1721).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Styrene Strip | City of Industry | MS-861 | |
| Glass slides | Evaporated Coatings | 60.0 × 4.0 × 0.3 mm3 | |
| Acetic acid | Millipore Sigma | A6283-500ML | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane | UCT specialties | 21400088 | |
| mPEG-SVA | Laysan Bio | 154-82 | |
| Biotin-PEG-SVA | Laysan Bio | 152-84 | |
| Sodium bicarbonate | Millipore Sigma | S5761-500G | |
| Epoxy glue | Devcon | 31345 | |
| Streptavidin | ThermoFisher | 434301 | |
| Fusidic Acid | Millipore Sigma | F0756-1G | |
| Neomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1458009 | |
| Viomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1715000 | |
| Hygromycin | invitrogen | 10687-010 | |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941-100G | |
| Magnesium acetate | Millipore Sigma | M5661-50G | |
| Ammonium chloride | Millipore Sigma | A9434-500G | |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | P9333-500G | |
| EDTA | GIBCO | 774750 | |
| 2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-500ML | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-250ML | |
| GTP | Millipore Sigma | G8877-100MG | |
| PEP | Millipore Sigma | P7127-100MG | |
| Pyruvate Kinase | Millipore Sigma | P1506-5KU | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S7903-5KG | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | ThermoFisher | 11205D | |
| mRNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 133899727 | 5′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468630 | 3?- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5? |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 164845370 | 3?-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468628 | 3?-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 163472705 | 3?-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678130 | 3?-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678131 | 3?-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678132 | 3?-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5? |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678133 | 3?-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| Centrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Micro Ultracentrifuge | Hitachi | CS150FNX | |
| Vortex mixer | VWR | VM-3000 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR530 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR830 | |
| Laser | Newport | TLB-6918-D | |
| Function generator | Stanford Research Systems | DS345 | |
| Photo detectors | Thorlabs | DET36A |
References
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