Summary
L'analyse double de règle d'ADN est développée pour déterminer la position d'ARNm pendant la translocation de ribosome, qui s'appuie sur les forces de dissociation des duplex d'ADN-ARNm formés. Avec la résolution d'un nucléotide simple et la capacité d'atteindre les deux extrémités de l'ARNm, il peut fournir des aperçus mécanistes pour la translocation de ribosome et sonder d'autres déplacements d'acide nucléique.
Abstract
La translocation ribosome se réfère au mouvement ribosomal sur l'ARNm par exactement trois nucléotides (nt), qui est l'étape centrale dans la synthèse des protéines. Pour étudier son mécanisme, il y a deux exigences techniques essentielles. La première est la résolution mono-nt qui peut résoudre la translocation normale de frameshifting, au cours de laquelle le ribosome se déplace par d'autres que 3 nt. La deuxième est la capacité de sonder à la fois les côtés d'entrée et de sortie de l'ARNm afin d'élucider l'ensemble de l'image de la translocation. Nous rapportons l'analyse de règle d'ADN double qui est basée sur les forces critiques de dissociation des duplex d'ADN-ARNm, obtenues par spectroscopie de magnétisation résiduelle induite par la force (FIRMS). Avec la résolution de force de 2-4 pN, l'assay de double règle est suffisant pour distinguer différentes étapes de translocation. En mettant en œuvre un long lien sur les ANN sondants, ils peuvent atteindre l'ARNm de l'autre côté du ribosome, de sorte que la position de l'ARNm peut être déterminée pour les deux côtés. Par conséquent, l'exemple de règle double est particulièrement adapté pour étudier la translocation ribosome, et le mouvement de l'acide nucléique en général. Nous montrons des résultats représentatifs qui ont indiqué une conformation d'ARNm en boucle et résolu la translocation normale du changement de cadre.
Introduction
Le déplacement biomoléculaire est un paramètre fondamental dans l'étude du mécanisme des fonctions biologiques connexes. Un exemple particulier est la translocation ribosome1,2, au cours de laquelle le ribosome se déplace par exactement trois nucléotides (nt) sur l'ARN messager (ARNm) normalement, et par un, deux, ou d'autres nombres de nt sauf trois dans le cas de frameshifting. Par conséquent, une résolution mono-nt du système de règle moléculaire est nécessaire pour distinguer les différentes tailles d'étape. Un plus grand défi est de sonder le mouvement ribosome sur les côtés d'entrée et de sortie. En d'autres termes, ce n'est qu'avec un système de double règle que nous serons en mesure de révéler si l'ARNm est fileté en douceur à travers le ribosome, ou il ya des étapes intermédiaires dans lesquelles les deux côtés ont des tailles d'étapes différentes conduisant à une conformation arnde plissée ou en boucle à l'intérieur de la Ribosome.
Plusieurs méthodes ont été développées pour relever le premier défi de résoudre différentes étapes sur le côté de sortie du ribosome (l'extrémité 3' de l'ARNm). Le double bifuséré résout les différents cadres de lecture en mesurant les rapports des différentes protéines résultantes3,4. Il n'est applicable que pour la fin 3' de l'ARNm et donc insuffisant pour fournir une image complète de la translocation. La spectrométrie de masse peut analyser les différents fragments de peptides comme conséquence des réarrangements de code correspondants5. Mais il ne peut pas identifier combien nt le ribosome se déplace sur l'ARNm. L'assay d'impression d'orteil est une autre méthode commune qui emploie une transcriptase inverse amorcée àl'extrémité 3'-distal pour transcrire l'ARNm vers le ribosome 6. Cependant, il n'est pas applicable pour la fin de 5' de l'ARNm qui entre dans le ribosome. D'autres techniques, y compris les approches à molécule unique et les méthodes de fluorescence7, sont difficiles à atteindre une résolution unique.
Nous avons développé le double test de règle d'ADN qui peut déterminer de façon unique les positions d'entrée et de sortie de l'ARNm découvert dans les complexes ribosome-mRNA. Les ADN souverains sont des oligomères de l'ADN qui forment des duplex de certains nombres de paires de base (bp) avec l'ARNm découvert par le ribosome, quelle que soit l'extrémité de l'ARNm. Les nombres de bp révèlent alors précisément la position de ribosome sur l'ARNm pendant la translocation. Les nombres de bp des duplex sont déterminés par leurs forces critiques de dissociation obtenues à partir de la spectroscopie de magnétisation résiduelle induite par la force (FIRMS)8. Avec l'incertitude de la force de 2-3 pN, les forces critiques sont suffisantes pour offrir la résolution simple-nt. En mettant en œuvre une molécule de liaison sur les règles d'ADN, le côté stérilement entravé de l'ARNm par le ribosome peut être sondé. Différents déplacements ribosomal peuvent ainsi être résolus avec précision. Nous avons avec succès révélé une conformation unique en boucle de l'ARNm piégé par les antibiotiques au cours de la translocation9, et résolu différents cadres de lecture qui coexistaient sur une séquence d'ARNm glissante10. Cet article décrit les détails de l'essai de règle double, qui incluent la préparation des complexes de ribosome, la fonctionnalisation de surface des glissières en verre, l'immobilisation des complexes de ribosome et leur hybridation avec la règle magnétiqued d'ADN molécules, la détection magnétique et l'analyse du spectre de force par firms.
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Protocol
1. Préparation des complexes de ribosome
- Faire 1 000 mL de tampon TAM10, qui se compose de 20 mM tris-HCl (pH 7,5), 10mM Mg (OAc)2, 30 mN 4 Cl, 70 mM KCl, 5 mM EDTA, 7 mM BME (2-mercaptoethanol), et 0,05% Tween20.
- Préparer les cinq mélanges énumérés dans le tableau 1.
REMARQUE: Le ribosome était de la souche MRE60011. EF-Tu: facteur d'allongement thermo instable. EF-Ts: facteur d'allongement thermo stable. GTP: triphosphate de guanosine. PEP: phospho(enol)pyruvate. - Incuber les cinq mélanges séparément à 37 oC pendant 25 min avant de faire les complexes de ribosome. Préparer les cinq complexes ribosome selon le tableau 2.
REMARQUE: Post: post-translocation; Pré: pré-translocation. - Ajouter chacun des cinq complexes de ribosome sur un coussin de saccharose de 1,1 M séparément, avec un rapport de volume 1:1. Purifie chacun avec 450 000 g pour 2 h dans une ultra-centrifugeuse. Utilisez une pipet pour enlever le supernatant et restaurer les complexes de ribosome à -80 oC après la suspension de la pastille avec tampon TAM10.
2. Préparation de lames en verre recouvertes de biotine
- Nettoyage préliminaire des lames de verre
- Placer 12 lames de verre d'une largeur de 60,0 à 4,0 mm 3 (L et W et T) dans un plat en verre court et large.
- Remplir le plat en verre d'acétone et sonicate pendant 5 min. Ensuite, lavez les toboggans avec de l'eau ultrapure 5 fois et remplissez les 3/4 du plat avec de l'eau.
- Ajouter 10 M KOH pour remplir le plat et sonicate les lames de verre pendant 20 min. Laver les toboggans avec de l'eau 5 fois.
- Ajouter l'éthanol et le sonicate pendant 5 min, verser l'éthanol et les sécher séparément à 300 oC pendant 3 h.
- Enduit d'aminosilane
- Placez les 12 lames nettoyées dans le plat en verre contenant du méthanol. Nettoyez un flacon de PEGylation avec du méthanol en soniquant pendant 5 min, puis remplissez-le de 25 ml de méthanol, 1,25 ml d'eau, 0,125 mL HAc, 0,25 mL 3-aminopropyltriethoxysilane (AMEO).
- Remplacez immédiatement le méthanol dans le plat en verre par la solution AMEO préparée. Incuber à température ambiante pendant 30 min.
- Rincer les glissières à l'eau plusieurs fois, puis les sécher par purge d'azote. Placer les lames séchées dans des plats en verre propre.
- PEGlation (EN)
- Préparer la solution NaHCO3 (8,4 mg/mL) et le tampon DE PÉGylation (37,5 mg PEG, 6 mg de PEG biotinylated, 150 'L NaHCO3 solution). Bien mélanger en tournant à 6 000 tr/min pendant 1 min.
- Placez 25 ll de solution PEG sur chaque diapositive. Couvrez-le avec l'autre diapositive sur le dessus. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles entre les deux diapositives. Placez les diapositives dans une boîte à épissaume vide. Assurez-vous que la boîte est nivelée et placez-la dans un tiroir sombre pendant environ 3 h.
- Rincer les toboggans à l'eau et les sécher à nouveau. Conserver les lames séchées à température ambiante sous vide jusqu'à 2 semaines.
3. Préparation de l'échantillon avant les mesures magnétiques et de force
- Machine un échantillon en plastique bien avec des dimensions de 4 ' 3 '2 mm3 (L 'W 'D). Coller un morceau de verre recouvert de biotine (environ 5 mm de long, coupé à partir des toboggans de 60 mm de long préparés dans la section 2) sur la surface inférieure à l'aide d'époxy.
- Ajouter 20 oL de 0,25 mg/mL de solution aqueuse de streptavidindanse dans le puits d'échantillon et couver à température ambiante pendant 40 min. Ensuite, rincez bien l'échantillon deux fois avec le tampon TAM10.
- Immobiliser les complexes ribosome.
- Sans antibiotiques : Utilisez une pipette pour enlever le tampon du puits de l'échantillon, puis ajoutez 20 l de complexe de ribosome de 0,1 M (MF-Pre ou MF-Post) dans le puits de l'échantillon. Le complexe de ribosome se liera avec le streptavidin sur la surface par l'intermédiaire de la biotine de 5'-extrémité sur l'ARNm. Incuber à 37 oC pendant 1 h, puis rincer une fois avec le tampon TAM10.
- Pour l'expérience utilisant à la fois de la néomycine et de l'acide fusidique : incuber le complexe MF-Pre avec de la néomycine à 37 oC pendant 10 min; incubez ef-G avec de l'acide fusidique à 37 oC pendant 20 min. Les concentrations sont les suivantes : complexe de ribosome de 0,1 M, 2 M EF-G, 4 mM DE GTP, 4 mM PEP, 0,02 mg/mL de pyruvate kinase, 0,2 mM de néomycine et 0,25 mm d'acide fusidique.
- Effectuez les autres expériences antibiotiques de la même façon. Les concentrations sont les suivantes: 0,2 mM de viomycine, 0,4 mM d'hygromycine B, et 0,25 mM d'acide fusidique.
- Pour l'étude de changement de cadre, répétez les étapes ci-dessus pour les complexes MFNF-Pre et MFNF-Post impliquant le motif glissant U6A. Utilisez des antibiotiques acide fusidique plus néomycine, et l'acide fusidique seul, respectivement.
- Retirez le tampon du puits de l'échantillon, puis ajoutez 20 l de 1 brin d'ADN biotinylated biotinylated et incuber à température ambiante pendant la nuit. Rincer le duplex ADN-ARNm formé une fois avec le tampon TAM10.
- Retirez bien le tampon du puits de l'échantillon. Ajouter ensuite 20 l de perles magnétiques enduites de streptavidin de 0,5 mg/mL dans le puits de l'échantillon et couver à température ambiante pendant 2 h.
- Insérez soigneusement l'échantillon bien dans un support et placez-le dans une centrifugeuse. Retirer les particules magnétiques libres de la surface en centrifugeant à 84 x g pendant 5 min.
4. Mesures magnétiques et de force
- Allumer le laser
- Allumez le laser à l'aide de la clé. Appuyez ensuite sur le bouton d'alimentation.
- Ajustez la sensibilité de l'amplificateur de verrouillage 1 (LIA1) à 500 mV et attendez environ 2 h pour réchauffer et stabiliser le magnétomètre atomique.
- Mise en place du magnétomètre atomique
- Exécutez le logiciel de contrôle d'instrument et configurez les paramètres de mesure. Certains paramètres peuvent varier légèrement dans chaque mesure.
REMARQUE : Le magnétomètre atomique comprend un laser (décrit ci-dessus), un amplificateur de verrouillage SR830 (appelé LIA1), un amplificateur de verrouillage SR530 (appelé LIA2), DS345 (appelé FG1) et ATF20B (appelé FG2) générateurs de fonction, une haute résolution moteur et un ordinateur. Tous ces éléments devraient être activés à cette étape du protocole. - Configurez le mode de déplacement du moteur vers le bruit et la position par défaut à 0. Appuyez sur le verrou sur le panneau avant, ajuster la sensibilité de LA LIA1 à 200 mV.
- Ajustez le courant et la tension du laser et trouvez le pic de résonance approprié et le niveau de signal au bruit. Appuyez sur Balayez sur le panneau avant. Notez que le rapport amplitude/largeur doit être supérieur à 0,5 et que la valeur de la phase doit être inférieure à 5 degrés. Si ce n'est pas le cas, refaites l'étape de balayage.
- Branchez la sortie de LIA2 à la rétroaction du laser pour verrouiller sa fréquence. Cet amplificateur mesure la rotation optique d'une cellule auxiliaire de césium pour maintenir la fréquence de laser sur la résonance12. L'état reste jusqu'à la fin de la mesure.
- Générateur de fonction de branchement FG2 pour entrer une onde carrée (500 mVpp, 100 mHz) comme signal de référence. L'onde carrée correspond à 100 pT et est utilisée pour convertir la sortie actuelle de l'amplificateur en signal magnétique. Débranchez le générateur de fonction.
- Configurez le mode de déplacement du moteur en position bidirectionnelle et par défaut à 260 mm. Vérifiez l'état du contrôleur de température pour assurer la température appropriée (37 oC) du capteur atomique.
- Vérifiez la stabilité de l'ensemble du système en mesurant les signaux du titulaire de l'échantillon vide deux fois. Évaluer la stabilité et le niveau de bruit après avoir soustrait les deux traces. Le niveau de bruit et la fluctuation typiques doivent être de 2 pT à 30 ms de temps d'intégration.
- Exécutez le logiciel de contrôle d'instrument et configurez les paramètres de mesure. Certains paramètres peuvent varier légèrement dans chaque mesure.
- Magnétisation de l'échantillon
- Placez délicatement l'échantillon sur la station de magnétisation et laissez-le rester pendant 2 min.
REMARQUE : La station de magnétisation se compose d'un aimant permanent (0,5 T) et d'un espaceur en plastique. - Remettre l'échantillon dans le porte-échantillon. Utilisez une force centrifuge de 335,4 g pour éliminer les particules magnétiques non spécifiquement liées.
- Placez délicatement l'échantillon sur la station de magnétisation et laissez-le rester pendant 2 min.
- Mesures magnétiques après l'application des forces
- Utilisez une pince à épiler pour charger l'échantillon sur le moteur. Cliquez sur Verrouiller sur le panneau avant pour exécuter le programme. Pendant ce temps, utilisez une pince à épiler pour charger l'autre échantillon dans le support et placez-le dans la centrifugeuse. Notez que le côté en verre enduit doit faire face au centre de la centrifugeuse.
REMARQUE : La technique de la spectroscopie de magnétisation résiduelle induite par la force (FIRMS) est utilisée, qui utilise un magnétomètre atomique pour mesurer le signal magnétique de l'échantillon après avoir appliqué une force mécanique sur les interactions moléculaires dans l'échantillon. Ici, les interactions moléculaires sont entre les molécules de règle d'ADN et l'ARNm dans le complexe de ribosome. La force est augmentée dans le sens des étapes en augmentant la vitesse centrifuge. Après avoir appliqué chaque force, le moteur traduit l'échantillon au capteur atomique, puis se déplace en arrière. Par conséquent, deux profils de champ magnétique sont obtenus, l'un pendant l'analyse vers l'avant et l'autre pendant l'analyse vers l'arrière13. Nous n'utilisons ce dernier que pour extraire la hauteur de pointe en raison de son meilleur rapport signal-bruit. La hauteur maximale du courant (nA) est convertie en amplitude du signal magnétique (pT) basée sur l'onde carrée d'étalonnage. - Chaque mesure dure environ 5 min. Lorsque le moteur revient à 0, cliquez sur Enregistrer sur le panneau avant. Utilisez soigneusement une pince à épiler pour prélever des échantillons de moteur et de centrifugeuse. Utiliser la vitesse initiale correspondant à 335,4 g (2000 tr/min, révolution par minute pour la centrifugeuse figurant dans le Tableau des matériaux).
- Échangez les deux échantillons et appliquez une force plus forte en augmentant la vitesse centrifuge de 100 tr/min ou taille d'étape similaire. Traiter alternativement pour augmenter graduellement la force; un spectre de force complet est obtenu après 10-12 points de données.
- Utilisez une pince à épiler pour charger l'échantillon sur le moteur. Cliquez sur Verrouiller sur le panneau avant pour exécuter le programme. Pendant ce temps, utilisez une pince à épiler pour charger l'autre échantillon dans le support et placez-le dans la centrifugeuse. Notez que le côté en verre enduit doit faire face au centre de la centrifugeuse.
- Terminer l'expérience
- Lorsque toutes les expériences prévues sont terminées, éteignez l'équipement, en procédant dans l'ordre opposé comme il a été allumé.
- Retirer les échantillons du support et les immerger dans de l'éthanol pour le nettoyage et l'utilisation future. Nettoyez le porte-échantillon avec de l'acétone en cas de contamination par les perles magnétiques.
- Analyse des données
- Ouvrez le script d'analyse Python et entrez toutes les données expérimentales. Cliquez sur Charger carré pour entrer l'onde carrée comme référence. Cliquez ensuite sur La ligne de base de la charge pour entrer le signal magnétique résiduel en arrière-plan.
- Définir la diminution globale du signal magnétique comme B0. Normalisez chaque diminution de signal magnétique B à B0 et exprimez-le en pourcentage. Tracer le pourcentage (B/B0) par rapport à la force centrifuge pour obtenir le spectre FIRMS.
REMARQUE : La force centrifuge F est calculée à partir de la masse flottante des perles magnétiques m (4,6 x 10kg), de la vitesse centrifuge w, et du rayon de la centrifugeuse r (7,5 cm ici) par l'équation F 2 (en) r. La résolution de force typique est 2-4 pN et la portée de force est 15-95 pN dans ce travail.
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Representative Results
La figure 1 montre le schéma de détection et les photographies des principaux composants. La détection magnétique est réalisée par un magnétomètre atomique utilisant le schéma de balayage (Figure 1A)13. L'échantillon est placé sur une tige montée sur un moteur linéaire. Le moteur transporte l'échantillon au capteur atomique à l'intérieur d'un bouclier magnétique, puis de retour au site d'origine pour le déchargement. Le magnétomètre atomique détecte le signal magnétique pendant l'analyse de l'échantillon et a produit une trace de signal, avec le signal maximum lorsque l'échantillon est le plus proche du capteur. Figure 1 B montre la photo de l'instrument global. Les figures 1C,D montrent les photos de la station de magnétisation et de la centrifugeuse utilisée pour l'application de la force, respectivement.
Le principe de l'analyse de la règle de double ADN est indiqué dans la figure 2. Le complexe de ribosome est immobilisé à la surface par l'extrémité 5' de l'ARNm. Deux règles d'ADN sont conçues pour sonder la position exacte du ribosome, une pour chaque côté de l'ARNm. Le schéma d'immobilisation actuel rend le côté 3' facilement accessible pour les règles d'ADN sondant. Par conséquent, les oligomères d'ADN conjugués avec des perles magnétiques peuvent former des duplex avec l'ARNm découvert. Le côté 5', cependant, est stérilement entravé par le ribosome et la surface. Une molécule de liaison est donc nécessaire pour que l'ADN atteigne l'ARNm découvert de ce côté. En variant la longueur du linker, nous avons déterminé que lorsque le lien est plus long que 50 T, nous pouvons détecter un signal magnétique fort qui indique la formation réussie de duplex d'ADN-ARNm (Figure 2B). La corrélation de la force de dissociation à la longueur duplex est obtenue en variant le nombre de nt sur l'ADN qui sont complémentaires à l'ARNm. Les figures 2C,D montrent la corrélation pour les côtés 3'- et 5'- respectivement. Puisque la différence de force entre les duplex des longueurs consécutives est typiquement 12-20 pN et la résolution de force est typiquement 2-4 pN, nous atteignons systématiquement la résolution simple-nt pour la longueur des duplex d'ADN-ARNd basé sur leurs forces de dissociation.
La figure 3 présente les résultats de la translocation normale en l'absence et la présence de divers antibiotiques. La translocation est de MF-Pre à MF-Post (figure 3A). L'enset indique que MF-Pre porte vacant tRNAfMet et MF-tRNAPhe aux p- et A-sites, respectivement. MF-Post transporte tRNAfMet et MF-tRNAPhe sur les sites E- et P, respectivement, avec un site A vacant. Figure 3 B montre que sans antibiotiques, le ribosome se déplace par 3 nt des deux côtés (se déplaçant vers le 3'-end). C'est pour les raisons suivantes: (i) Les duplex DE l'ARNm d'ADN à la pièce 5' côté 12 bp et 15 bp forces de liaison dans MF-Pre et MF-Post, respectivement. (ii) Les duplex à l'extrémité 3' montrent un changement inversé de 15 à 12 bp (figure 3C). Cependant, lorsque l'acide fusidique et la néomycine sont présents, les spectres de force montrent que le ribosome ne se déplace que par 1 nt sur le côté 5' mais 2 nt sur le côté 3' (Figure 3D,E). Ce résultat indique que le ribosome s'est translogué par l'intermédiaire d'un mécanisme stepwise, résultant d'une conformation d'ARNm en boucle qui a un nt supplémentaire à l'intérieur du ribosome, qui n'a pas été expérimentalement révélé avant. Ceci est compatible avec la simulation théorique rapportée14. Alternativement, le ribosome peut être étiré pour couvrir 28 nt de l'ARNm, au lieu de l'habituel 27 nt15. Après avoir lavé les antibiotiques, la translocation normale se produit, comme en témoignent les mouvements de 3 nt des deux côtés de 5 et 3 (trace violette dans la figure 3D, E). La conformation en boucle ne se forme pas lorsque seul l'acide fusidique est utilisé. Les spectres de force sont compatibles avec le mouvement ribosome de 3 nt des deux côtés, semblable à la situation pour la translocation normale (Figure 3F,G). Le double jeu de règle révèle également que la viomycine a complètement inhibé la translocation, comme le montre le mouvement 0 nt des deux côtés (Figure 3H,I).
Nous avons également cherché à savoir si cette conformation en boucle peut se former sur des motifs de changement d'image "-1". Ici, la translocation des complexes MFNF-Pre et MFNF-Post se déroule sur le motif « U6A », qui s'est avéré faire partie du motif de changement d'image «-1 » dans le VIH16. Les figures 4A,B montrent que dans le MFNF-Post, le duplex de l'ARNM d'ADN est raccourci par 2 ou 3 nt à la 3'-extrémité; la longueur duplex augmente de 2 ou 3 nt aux extrémités de 5. Les résultats suggèrent la coexistence de la translocation normale et du changement d'image «-1 », le premier se corrélant avec le mouvement 3-nt et le second corrélé avec le mouvement de 2-nt. Le double gouvernement est capable de résoudre clairement les deux populations. Avec à la fois la néomycine et l'acide fusidique, nous observons que le ribosome se déplace par 2 nt à la 3'-extrémité, mais seulement 1 nt à la 5'extrémité, respectivement (Figure 4C,D). Par conséquent, la conformation d'ARNm en boucle a également lieu sur la séquence glissante. Lorsque seul l'acide fusidique est présent pour le MFNF-Pre (Figure 4E,F), le résultat est le même que celui de MFNF-Post dans les panneaux A et B (traces bleues), ce qui indique que l'acide fusidique seul n'est pas suffisant pour mettre en pause la translocation ou le changement de cadre. Par conséquent, il confirme que l'acide fusidique et la néomycine sont nécessaires pour les déplacements inégaux pour les deux côtés de l'ARNm.
Figure 1 : Instruments pour l'analyse de la règle de l'ADN double basée sur LES FIRMS. (A) Schéma de la détection magnétique. 1: échantillon et sa monture; 2: moteur; 3: capteur atomique et bouclier magnétique. (B) Photo du magnétomètre atomique et du système de manipulation d'échantillons. Les nombres indiquent les composants correspondants réels indiqués dans le schéma. Notez que le bouclier magnétique est à l'intérieur de la boîte en carton pour une meilleure stabilité thermique. (C) Station de magnétisation. (D) Centrifuge utilisé pour l'application de la force. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Double test de règle avec résolution mono-nt pour étudier la translocation ribosome. (A) Schéma de l'analyse de règle double, dans laquelle deux règles d'ADN sont conçues pour sonder respectivement les 5 et 3- extrémités. La ligne rouge indique le lien polyT. (B) Optimisation de la longueur du linker pour Ruler-In. (C) RÉSULTATS FIRMS pour déterminer les forces de dissociation des duplex entre Ruler-Ins et ARNm. (D) Forces de dissociation des duplex entre Ruler-Outs et ARNm. La barre d'erreur est définie comme le rapport entrele bruit de l'instrument et la diminution globale du signal magnétique (B 0), avec une valeur typique de 3 à 5 %. Figure a été reproduite avec la permission9. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Le sondage de translocation est sous l'influence de divers antibiotiques. (A) Schéma de sondage pour les complexes MF-Pre et MF-Post. L'enset indique les ribosomes schématiques dans Pre et Post, qui correspondent aux ovales solides et bordés de tirets, respectivement. (B, C) RÉSULTATS FIRMS sans antibiotiques. (D, E) Résultats avec l'acide fusidique et la néomycine. (F, G) Résultats avec l'acide fusidique seulement. (H, Je) Résultats avec la viomycine seulement. Panneaux gauches : utilisation de Ruler-In pour sonder le côté 5' ; panneaux droits : en utilisant Ruler-Out pour sonder le côté 3' Les barres d'erreur sont calculées de la même manière que celles du chiffre précédent. Figure a été reproduite avec la permission9. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : RÉSULTATS FIRMS de l'utilisation de deux règles pour sonder frameshifting. (A, B) MFNF-Pre et MFNF-Post sans antibiotiques. (C, D) Résultats avec l'acide fusidique et la néomycine. (E, F) Résultats avec seulement l'acide fusidique. Panneaux de gauche : en utilisant Ruler-In pour sonder le côté 5' ; panneaux de droite : en utilisant Ruler-Out pour sonder le côté 3. Les barres d'erreur sont calculées de la même manière que celles du chiffre précédent. Figure a été reproduite avec la permission9. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Dans notre double test de règle, les perles magnétiques jouent deux rôles essentiels. Premièrement, ils servent de transducteurs de force parce que la force centrifuge est proportionnelle à leur masse flottante. Deuxièmement, les perles sont des porteurs de signaux détectés par un magnétomètre atomique, qui est actuellement le capteur magnétique le plus précis. Combinant manipulation mécanique et détection magnétique, la technique FIRMS est capable de résoudre un grand nombre d'interactions moléculaires basées sur leurs forces de dissociation critiques, qui est la base des règles de l'ADN. Le double jeu d'enfant est particulièrement adapté pour sonder les deux côtés de l'ARNm pendant la translocation. Parce qu'il s'agit d'une approche physique qui ne repose que sur la formation des duplex, elle n'est pas limitée par les côtés de l'ARNm ou d'autres contraintes biologiques. Il s'agit d'un avantage par rapport à d'autres techniques qui sont basées sur des réactions biochimiques. Nous avons montré qu'en utilisant une molécule de liaison à long terme, les règles peuvent atteindre le site de liaison ciblé pour déterminer la position de l'ARNm. Plus précisément, pour le ribosome, la longueur du linker est de 50 T, ce qui correspond à 17 nm de longueur. Cette longueur est très proche de la taille du ribosome17. Les concentrations des antibiotiques sont des valeurs typiques de la littérature. Il est également possible d'utiliser notre méthode pour révéler les valeurs d'enclence de leurs fonctions.
Il y a deux aspects critiques pour l'analyse de la double règle. La première est la délicate surface fonctionnalisée pour l'immobilisation moléculaire et les réactions biologiques subséquentes. Chaque étape de chargement et de lavage doit être effectuée avec un minimum de perturbation à la surface, de sorte que les molécules immobilisées à la surface restent intactes. Pour le processus d'hybridation ADN-ARNm, il faut suffisamment de temps pour assurer l'achèvement du processus. Il est également conseillé d'utiliser TAM10 tampon avec 1 M NaCl supplémentaire pour maintenir un système homéostatique. L'autre aspect critique est la magnétisation des perles. Puisque des perles excessives sont employées, il y a beaucoup de perles libres non immobilisées sur la surface. Par conséquent, lors de la magnétisation de l'échantillon, la surface enduite doit s'approcher et quitter l'aimant verticalement. Toute oscillation mineure de l'échantillon peut éventuellement causer des dommages à gratter sur la surface.
Notre double analyse de règle d'ADN est actuellement la seule méthode qui peut objectivement sonder les côtés d'entrée et de sortie de l'ARNm dans les complexes de ribosome avec la résolution simple-nt. De nouvelles informations mécanistes concernant la translocation des ribosomes ont été obtenues. La méthode est généralement applicable pour le déplacement moléculaire des acides nucléiques, qui est largement rencontré en biologie moléculaire.
Pour le développement et les applications futurs, nous avons montré que l'utilisation de la force de rayonnement acoustique pour remplacer la force centrifuge améliorera encore la résolution de la force, atteignant le régime de sous-nt18. Nous étudions également la détection multiplexée à l'aide de magnétomètres atomiques pour améliorer l'efficacité de détection. Avec ces améliorations, nous nous attendons à ce que notre méthode détaillée dans ce travail trouve de larges applications dans la recherche biologique.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêts potentiel n'a été signalé par les auteurs.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu par les National Institutes of Health des États-Unis (R01GM111452, Y.W., S.X.). Y. W. reconnaît le soutien de la Fondation Welch (E-1721).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Styrene Strip | City of Industry | MS-861 | |
| Glass slides | Evaporated Coatings | 60.0 × 4.0 × 0.3 mm3 | |
| Acetic acid | Millipore Sigma | A6283-500ML | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane | UCT specialties | 21400088 | |
| mPEG-SVA | Laysan Bio | 154-82 | |
| Biotin-PEG-SVA | Laysan Bio | 152-84 | |
| Sodium bicarbonate | Millipore Sigma | S5761-500G | |
| Epoxy glue | Devcon | 31345 | |
| Streptavidin | ThermoFisher | 434301 | |
| Fusidic Acid | Millipore Sigma | F0756-1G | |
| Neomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1458009 | |
| Viomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1715000 | |
| Hygromycin | invitrogen | 10687-010 | |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941-100G | |
| Magnesium acetate | Millipore Sigma | M5661-50G | |
| Ammonium chloride | Millipore Sigma | A9434-500G | |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | P9333-500G | |
| EDTA | GIBCO | 774750 | |
| 2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-500ML | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-250ML | |
| GTP | Millipore Sigma | G8877-100MG | |
| PEP | Millipore Sigma | P7127-100MG | |
| Pyruvate Kinase | Millipore Sigma | P1506-5KU | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S7903-5KG | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | ThermoFisher | 11205D | |
| mRNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 133899727 | 5′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468630 | 3?- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5? |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 164845370 | 3?-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468628 | 3?-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 163472705 | 3?-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678130 | 3?-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678131 | 3?-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678132 | 3?-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5? |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678133 | 3?-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| Centrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Micro Ultracentrifuge | Hitachi | CS150FNX | |
| Vortex mixer | VWR | VM-3000 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR530 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR830 | |
| Laser | Newport | TLB-6918-D | |
| Function generator | Stanford Research Systems | DS345 | |
| Photo detectors | Thorlabs | DET36A |
References
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