Summary
提示されたプロトコルは、マウスにおける付録(caecalパッチ)の顔外科的除去を記述し、続いて炎症性腸疾患関連結腸直腸癌の誘導を示す。このマウス虫垂切除モデルは、ヒト胃腸疾患の病因における虫垂の生物学的役割の調査を可能にする。
Abstract
ヒト虫垂は最近、大腸癌、炎症性腸疾患、パーキンソン病などの様々な複雑な疾患の病因に重要な生物学的役割を果たすことを目的としています。虫垂の機能を研究するために、腸疾患関連のマウス虫垂切除モデルが確立され、そのステップバイステッププロトコルがここに記載されている。本報告では、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)とアゾキシメタン(AOM)の組み合わせを用いた慢性大腸炎関連大腸癌の化学誘導に続いて、マウスにおけるcaecalパッチ除去のための顔状プロトコルを導入する。IgA特異的細胞およびIgA濃度は、偽群と比較して雄C57BL/6マウスにおけるcaecalパッチの除去時に有意に減少した。同時に2%のDSSおよびAOMを投与すると、有意な体重減少なしにシャムおよび虫垂切除群の両方で約80%のマウス生存をもたらした。組織学的結果は、結腸炎症および腺癌の異なる程度を確認した。このモデルは、腸内細菌叢恒常性および腸内因性腫瘍の病因を維持する上での付録の機能的役割の研究、ならびに薬物標的治療の潜在的な開発に使用することができる。
Introduction
臨床虫垂切除術は、主に炎症(例えば、虫垂炎)1、2、3に起因する虫垂の除去を伴う標準的な外科的処置である。しかし、ヒト虫垂の生物学的機能は論争の余地のある4,5,6のままである。付録は、大腸の盲腸から突出した痕跡の残骸とみなされています。最近まで、進化論的、免疫学的、形態学的、および微生物学的研究は、虫垂が異なる機能を有する可能性があることを示唆している。これらの役割には、免疫グロビンの産生(例えば、IgAおよびIgG)、腸関連リンパ組織内の適応免疫応答に重要な様々なB細胞およびT細胞(GALT)、および共生微生物叢を有する大腸の補充が含まれる。6,7,8,9,10歳,11歳,12.
前虫垂切除術または急性虫垂炎患者の臨床疫学的研究はまた、炎症性腸疾患(IBD)、大腸癌、および非胃腸などのヒト疾患の病因における潜在的な役割を明らかにした障害(例えば、パーキンソン病および心血管疾患)13、14、15、16、17、18.例えば、75,979人の虫垂切除患者を対象にしたアジアの大規模集団コホート研究では、虫垂切除術とその後の大腸癌の発症との間に有意な関連が示された。死亡率14,19.したがって、ヒトに似た適切な動物虫垂切除モデルを確立することは、疾患病因における虫垂の生物学的機能および分子機構を調べるのに役立つだろう。
多くの哺乳類は、霊長類、ラゴモルフ(例えば、ウサギ)、いくつかのげっ歯類、および群れ20を含む虫垂または虫垂のような器官を有する。小型で一般的に使用される実験動物の場合、ウサギはヒト21、22に似た形態学的に形質的に虫垂を有するが、ウサギのGALTはヒトに比べて非常に大きい。リンパ組織はまた、小腸と大腸21の両方に位置するペイヤーのパッチで見つけることができます。さらに、ウサギは、ヒトとは異なるリンパ球状構造、T細胞分布、および免疫グロブリン密度をヒトから示し、その付録の研究を不適切にする21。
マウスは、ヒト病態生理学を研究し、様々な既存および新規のセラプス23、24、25をテストするために最も一般的に使用される動物モデルである。マウスの盲液の頂点にある単一の白い大リンパ球クラスターは、caecalパッチとして知られており、ヒト虫垂26、27、28と同様の機能を果たすと考えられている。しかし、マウスのcaecumからcaecalパッチを分離することは実質的に困難です。これまでのところ、マウスモデルで虫垂炎を誘発するための一般的な外科的処置は、腹壁を通して比較的大きな切開(例えば、1〜2センチメートル)を伴い、全盲(補足表1)29、 30,31,32,33,34,35,36.
本明細書において、消化管疾患に関連する虫垂切除モデルを生成するために、この報告は、マウスにおけるCaecalパッチ除去のための顔の外科的プロトコルを提示する。これに続いて、ヒトに見られるものと同様の大腸炎関連結腸直腸癌の誘導に対するゲノキサクサク物質AOMおよびプロ炎症剤DSSの併用投与が続く。IBDは、腸癌37、38の危険因子であることが示されている。AOM/DSS誘発性慢性大腸癌の組み合わせは十分に確立されており、読者はノイフェルトら、およびThakerら詳細な手順39,40を参照することができます。この再現性と迅速なマウス虫垂切除モデルは、特にIBDおよび大腸癌の発症および進行において、虫垂変調性腸炎症および結腸微生物叢を研究するために使用することができる。
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Protocol
すべての動物の手順は、西安Jiaotong大学の機関動物ケアと使用委員会によって承認されました(いいえ。XJTULAC2019-1023)。
1. マウス虫垂切除術
- 手術前1週間の認定特病原体フリー(SPF)環境における8〜10週齢のC57BL/6オスマウスを収容する。
- 次の滅菌手術器具を準備する:マイクロハサミ1組、マイクロ鉗子1組、殺菌非吸収縫合糸の2つのサイズ(4-0および8-0)、針ホルダー付き電気凝固ペン、75%の医療アルコール、ヨウ素ベースのスクラブ(例えば、エントイオジン)、および無菌綿棒のパッケージ。
- 手術中に腹部のフラッシュと水分補給のための事前に温められた0.9%の生理食生食水で10 mL注射器を充填します。
- 100mg/kgの用量で1%のペントバルビタールナトリウムで非断食マウスを食経内(i.p.)に麻酔する。ペダル反射に対する応答の欠如によって麻酔の深さを確認してください。
注:マウスの完全な鎮静効果を確保するために、単一の麻酔用量が投与される。短い手順の状況下では、50 mg/kgのペントバルビタールi.p.で十分な場合があります。 - 電気剃毛で腹部の髪をそっと剃ります。
- 低体温症を防ぐために、加熱パッドの上にマウスを置きます。
- 手術中の姿勢の動きを防ぐために、4本の医療用粘着テープを四肢に置くことで、プラットフォーム上でマウスを固定します。
- 腹部全体にそっと触れて、バンプ感を見つけます。
注:ほとんどの場合、バンプの感触は常にcaecumの正確な位置を示します。腸の残りの部分への可能な損傷を避けるために、腹部切開前の盲腸のこの事前位置決めが重要です。 - 無菌ドレープで覆い、ヨウ素ベースの溶液と75%のアルコールの交互の外科スクラブを適用することにより、腹部の剃った領域を消毒する。プロセスを2x繰り返します。
- 腹部の中線で0.5〜1.0センチメートルの範囲の縦方向の切開を行います。
- caecumの所定の位置に従って、caecumに達し、穏やかに外装(〜1センチメートル)を有し、caecalパッチを識別する。生理的pHの無菌、前温められた生理食生の溶液を使用して腸を水和する。
注:マウスのcaecalパッチは、カカムの一部であり、表面に白い卵胞の存在によって特徴付けられます。 - 術後の出血および感染の潜在的な合併症を防ぐために、8-0を使用して盲腸の間膜血管をライゲートする縫合。無菌生理食液でカカムを水和します。
- 4-0縫合糸を使用して、近位結腸の盲点の頂点付近に開ループを使用して切除領域をマークします。
注:開いたループでcaecumをマークすると、カットからのCaecal含有量の漏れを防ぎます。 - マイクロハサミを使用してマークされた切除の下のCAecalパッチを切り取り、医療用綿棒で残留するcaecal含有量を一掃します。その後、ヨウ素ベースのスクラブでカエカムの切り株を消毒する。
- 8-0を使用して、実行中の縫合糸で切り株を閉じます縫合。
- 前に帝いたしの切り株で切除をマークするために使用した4-0スレッドループを慎重に取り外します。
- ヨウ素ベースのスクラブで縫合位置を殺菌します。再び生理生理で外科部位を水分補給する。
- 8-0を使用して実行中の縫合糸で筋肉層を閉じます縫合糸。
- 4-0縫合糸で中断した縫合糸を使用してスキンレイヤーを閉じます。
- ヨウ素ベースのスクラブで外科的カット2倍を消毒し、75%の医療アルコールを使用してヨウ素を除去します。
- マウスをそっと裏返し、皮下(s.c.)に0.1mg/kgの体重をブプレノルフィンと0.4mLの生理食生食生理食生理食生を注入し、意識に戻るまでマウスをヒートパッドに残します。
- マウスを滅菌ケージに戻し、手術後3日間の痛みの兆候を注意深く監視して回復を確保します。
注:0.05 mg/kgブプレノルフィンの術後の適用は、個々のマウスの痛みの軽減のために必要とされうる。大腸炎関連大腸癌のさらなる誘導のために、手術後7日間の回復をマウスに許可する。
2. AOMおよびDSSによる慢性大腸炎関連大腸癌の誘導
注:虫垂切除後7日間この手順を実行します。
- 10mg/mLの濃度で0.9%無菌生理生理の2.5mLで25mgのAOMを溶解することにより、AOMストック溶液を調出す。
注: AOM は光に敏感です。- アリコット2.5mLの準備されたAOMストック溶液を5 mLのガラス管にアルミ箔で包み、使用するたびに-20°Cで保存します。
- AOMのアリコート1アリコを1回解凍し、0.9%の無菌生理塩水(比1:10)で1mg/mLの濃度に希釈する。
注意: AOM は非常に発がん性があります。したがって、ヒュームフードで全体の準備手順を実行します。
- オートクレーブ水の200 mLにDSS粉末の4gを溶解し、2%(w/v)DSS溶液を調出します。
注:DSSの濃度は、マウスのひずみ、性別、および誘導サイクルによって異なる場合があります。3%DSSは、他のマウス株に用いてもよい。 - 新たに調製したAOM/DSSをマウスに同時に投与する。この操作を行うには、次の手順に従います。
- 各マウスに0.01 mL/gの新たに調製されたAOM作業液を食後に注入し、オートクレーブ水を2%のDSS溶液で5日間のアドリボタムに置き換えます。
注:各ケージには5匹のマウスが含まれています。DSS飲料ボトルを定期的にチェックして、治療期間中に沈殿物が発生しないことを確認してください。 - 重量と密接に毎日各マウスを監視します。
注:投与中に、最初の体重またはハドル、スクイント、低体温症、および不十分な活動の徴候と比較して、最大20%の体重減少を有するマウスを安楽死させる。
- 各マウスに0.01 mL/gの新たに調製されたAOM作業液を食後に注入し、オートクレーブ水を2%のDSS溶液で5日間のアドリボタムに置き換えます。
- 21日目まで、AOM/DSS投与後6日目にオートクレーブ水の新鮮なボトルを提供する(図1B)。
注:これは21日間で構成される1つの完全なサイクルです。 - さらに2サイクルの手順2.3~2.4を繰り返し、70日目にマウスを犠牲にする。
3. 大腸炎症および腫瘍の評価(AOM投与後70日)
- 安楽死室における10%の充填率でCO2吸入によりマウスを犠牲にし、続いて子宮頸部脱臼を行う。
- 結腸全体をイレオ疝痛接点の上からアナスに収穫します。
- 大腸を縦方向に開いて内膜側を露出させる。大腸全体を10cmの長さに切り、ヘマトキシリンとエオシン(H&E)染色のために72時間ホルマリン10%ホルマリンで大腸組織を固定します。
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Representative Results
マウス虫垂切除モデルの確立
この慢性大腸炎関連大腸癌のこのマウス虫垂切除モデルは、図1に示すように順次外科的および誘導ステップに従うことによって生成することができる。caecumの最も頻繁な位置は、腹部の中央線に続く左右の腸毛フォッサにあります(図2)。触診法を用いて腹部切開前のカエカムの事前ローカリゼーションの成功率は、ほぼ70%である(補足情報、表S2)。虫垂切除術は、主に6つの重要なステップで構成されています(図3)。虫垂切除手術の間、長さ0.5〜1.0cmの中線切開は外科的外傷を最小限に抑えるために重要である(図3A)。精巣内漏出の場合、単純なライゲーションの代わりに実行縫合糸を使用して、糸帯血管を結び付け、カエンカムの切り株を閉じる必要がある(図3B,C,D,E)。
虫垂切除マウスにおけるバイオマーカーとしてのIgAの評価
虫垂切除術を確認するために、マウスの大腸と胎児含有量を採取し、IgA特異的血漿細胞および分泌性IgA(sIgA)濃度のレベルを決定するために手術後に採取した。虫垂切除マウスは、シャム群と比較してB220-IgA+特異的血漿細胞の割合が有意に減少した(図4A,B)。また、手術前の初期状態と比較して、シャムマウスは手術後14日間にわたってfecal sIgA濃度を維持し、虫垂切除群は14日目に有意なslgA減少を示した(図4C)。
虫垂切除マウスにおける大腸炎関連大腸癌の検証
虫垂切除群のほとんどのマウスが重篤な合併症と有意な体重減少を示した3%のDSSと比較して(図5A)、AOMと組み合わせた2%のDSSは、シャムおよび虫垂切除群の両方で生存率の80%を提供し、合理的な体重変化(図5E)。治療の3サイクルの終わりに、全長の大腸は病理学的評価のために収穫された。目視検査およびH&E染色は、2%AOM/DSSで治療したマウスにおいて、結腸炎症および異なる程度の腺癌(ウェル、中等度、および不十分な分化腺癌)を有する結腸腫瘍を示した(図6)。
図1:慢性大腸炎関連大腸癌のマウス虫垂切除モデルの確立の概略図。
(A) 虫垂切除術の主な外科的ステップ(最初の3つは重要である)のフローチャート。(B) 大腸癌の誘導虫垂切除の7日後、AOMおよびDSSを同時に投与した。マウスの重みは様々な時間(赤い三角形)で記録した。70日目にマウスを犠牲にし、腸組織を採取してさらなる評価を行った。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:腹部切開前のマウスにおけるcaecalパッチ位置の事前決定。
(A) 盲点の位置を見つける可能性の要約。マウスの(B)右下、(C)中央、および(D)左下腹部における盲点の3つの最も一般的な位置の解剖図。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:マウス虫垂切除術の重要なステップ。
(A) 小さな切開は0.5〜1.0 cmを配置しました。(B) caecumの前置き後に、caecalパッチの正確な部分を引き出す。(C) 盲腸に付随する腸間膜血管のライゲーション。(D)4-0縫合糸でカカムの切断領域をマーキングする。(E) 8-0 を使用して縫合糸を実行して切り株を閉じる縫合。(F) 8-0 を使用して縫合を中断して筋肉層を閉じる縫合。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:虫垂切除後のIgA特異的血漿細胞およびfecal sIgA濃度の定量化。
(A)手術後1日及び14日目のシャムおよび虫垂切除マウスの全大腸中に抗IgAおよびB220で染色された細胞の代表的なドットプロット。ラミナプロプリア中のリンパ球を調製し、FITC抗マウスIgA、PEアンチマウスCD45R/B220をフローサイトメトリー用に染色した。プロット内の数値は、それぞれの領域のセルのパーセンテージを示します。(B) シャムおよび虫垂切除群におけるIgA特異的血漿細胞の定量的決定データは平均 ± SD を表します。n = 5-8 マウス;*p < 0.05、 **p < 0.01、および ***p < 0.001。(C) 手術前後のfecal sIgA濃度Fecalの内容物は指定された時点で収集され、SIgAのレベルはELISAによって試験された。各色のドットは、14 日間にわたって同じマウスを表します。統計分析は、p< 0.05 が統計的に有意と見なされる、ペアでないt-test を使用して行われました。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:虫垂切除後のAOM/DSS組み合わせにより誘導される慢性大腸炎関連結腸直腸癌マウスモデルの動物生存状況
(A) 偽および虫垂切除群における大腸炎誘導に3%DSSを用いて得られた生存曲線。肛他脱出の重篤な合併症(B)および壁画膿瘍は、動物の終点を示した(C)。(D) シャムおよび虫垂切除群における大腸炎誘導に対して2%DSSを用いて得られた生存曲線;(E) 70日以上のマウスの平均体重変化。このデータは平均±SD、n=6マウスを表す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:2%DSSおよび10mg/kg AOMの併用治療により誘発された慢性大腸炎関連結腸直腸腫瘍の画像。
(A)目視検査および(B)動物操作顕微鏡下の腫瘍を有する解剖された結腸の写真。(C)大腸炎症、(D)十分に分化した腺癌、(E)適度に分化した腺癌、および(F)高度に分化した腺癌を示す大腸組織のH&E染色画像。黒い矢印は粘膜潰瘍を示し、黒い矢印は腺癌を示し、白い矢印は腺間の好中球浸潤を示す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足表1:一般的に使用されるマウス株における虫垂炎誘導に用いられる外科的方法の文献要約。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表2:腹腔内のマウスにおけるカカムの位置。切開後の露出した器官は、開腹術後の前置き位置に直接見つかった器官を示す。caecumの位置は、腹部領域/腸に対するカカム位置に対する盲液位置を示す。露出は、精液が腹部の筋肉層の下にあり、腸の他の部分の上にあったことを示す。埋め込みは、カエンカムが腸で覆われたことを示す。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
大腸炎関連大腸癌のマウス虫垂切除モデルは、マウスの生存率が高い外科的ステップを用いて得られた。ほとんどの場合、精液は腹壁の下に置かれたので(補足表1、補足表2、図2)、腹腔内目抜きなしでその位置を判断することは困難であった。この外科的プロトコルでは、バンプに触れる簡単なステップが導入され、盲液の再局所化の精度を高めるためのガイダンスとして盲液位置の定量的評価も提供された(図2)。Caecalパッチを除去する解剖学的特徴の利用は、腸の意図しない部分の破壊を最小限に抑え、それによって虫垂切除および腹腔の感染の潜在的な合併症の率を減少させる。
このモデルには、3 つの重要な手順が含まれる。まず、腹腔移植前の目視検査および触診は、盲検の一般的な位置を決定するのに役立つ。caecumが腹部の左腸骨領域に存在する可能性が最も高いにもかかわらず、caecumの頂点から突出するcaecalパッチはしばしば解離的(すなわち、動き回るか、または埋め込まれる)であり、中腹膜の下に見られる可能性が高い(図2)第二に、腹部の中央線における小さな切開およびCAecalパッチの正確な曝露が好ましい。これは、腹部の中央線に細い斑点があり、この位置に切断すると腹部筋肉層の潜在的な傷害を減少させる可能性があるためである。さらに、マウスに有害である虫垂切除術時のボルヴルを避けるために、ケーカルパッチの正確な暴露は、腸の意図しない障害を最小限に抑え、ボルヴル発生のリスクを低減する。さらに、腹腔の最小限の暴露は、腸が汚染されていない、暖かく、湿ったままであることを保証することができます。さもなければ、過度の暴露は組織の著しい熱損失および乾燥を引き起こす可能性がある41。
第三に、単純なライゲーションの代わりに縫合糸を実行するCAEcal切り株の消毒および閉鎖は、切り株の潜在的な出血および消毒を防ぐために必要である。マウスの大腸におけるIgA特異的血漿細胞およびfecal sIgAのレベルは虫垂切除によって有意に減少し、少なくとも初期期間33において、CaecalパッチがIgAの産生の主な部位であることを示唆している。大腸では、sIgAは、共生細菌叢の正常な植民地化を安定させ、病原性微生物42を打ち消すことによって粘膜健康防御者として機能する。虫垂の除去はIgAの産生を減少させ、粘膜恒常性を破壊する可能性がある。
過度の大腸炎誘導の高い死亡率および臨床徴候(すなわち、重度の血便、肛とらえ、腹部膿瘍43、44)は、3%DSSで処置したマウスで観察された(図5)。しかし、3サイクル後の2%DSS誘導は、これらの合併症のいずれも引き起こらず、生存率は80%以上維持された。これは、GALTの完全性の欠如は、ある程度、AOMとDSSの組み合わせに対するマウスの耐性を低下させる可能性があるため、DSSとAOMの組み合わせの併用を検証する必要があることを示している。臨床ベースのエビデンスからの観察研究は、虫垂がIBDおよび大腸癌14、45、46の発症と強く関連していることを示唆している。しかし、慢性腸疾患の病因における虫垂の生物学的機能および基礎機構は依然として不明である。虫垂はGALTの重要な部分として機能し、腸内細菌叢の貯蔵所として健康または病気の状態を調節する17、18、31として機能するように見える。この反復性と費用対効果の高いマウス虫垂切除モデルの確立は、微生物叢恒常性、癌予防、および免疫療法の文脈におけるIBDおよび大腸癌における虫垂の役割を研究するために使用することができる。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
本研究は、中央大学基礎研究基金(G2018KY0302)、大学基礎研究開発基金(KT00062)、中国国立自然科学財団(81870380)、臨床研究賞の一部を支援しています。中国の西安Jiaotong大学の最初の提携病院(NO.XJTU1AF-CRF-2015-029)。著者らは、マウス虫垂切除モデルの初期の探査段階における彼の技術的な提案と、大腸炎および大腸腫瘍のH&E染色結果の評価に関する病理学者Xi Liu博士に感謝している。Y.L.は手術のデモンストレーションを行い、データ分析を行い、原稿の草稿を書きました。J.L.、G.L.、Z.P.、Y.M.は、外科的準備、組織コレクション、およびビデオ制作に参加しました。M.Z.はフローサイトメトリーとELISAを行った。Q.W. と H.X. は、臨床的に関連するマウス モデルを生成する技術サポートを提供しました。R.X.Z.は研究を設計し、研究を監督し、原稿を書き、校正した。J.S.は原稿を見直した。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Azoxymethane(AOM) | Sigma-Aldrich,Inc. | A5486 | |
| Dextran Sulfate Sodium Salt(DSS) | MP Biomedicals,Inc. | 160110 | |
| Entoiodine | Shanghai likon high technology disinfection co. LTD | 310102 | |
| digital caliper | Ningbo yuanneng trading co. LTD | 4859263 | |
| 4-0 Silk Sutures | Yuanlikang co. LTD | 20172650032 | |
| 8-0 Prolene Sutures | Yuanlikang co. LTD | 20172650032 | |
| Electric coagulation pen | Chuang mei medical equipment co. LTD | 28221777292 | |
| disposable syringe 1ml | Shengguang medical products co. LTD | 3262-2014 | |
| disposable syringe 10ml | Shengguang medical products co. LTD | 3262-2014 | |
| 75% Medicinal alcohol | Shandong anjie high-tech disinfection technology co. LTD | 371402AAJ008 | |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma-Aldrich,Inc. | 57-33-0 | |
| Physiological Saline | Shandong qidu pharmaceutical co. LTD | H37020766 | |
| Absorbent Cotton Swab | Henan ruike medical co., LTD | RK051 | |
| Surgical Instruments-Ophthalmic | Jinzhong Shanghai co.LTD | WA3050 |
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