Summary
Denne protokol viser samtidig påvisning af reaktive iltarter (ROS), levende celler og døde celler i levende primære kulturer fra museoklære overfladeceller. 2',7'-Dichlorfluoresceindiacetate, propidiumiodid og Hoechst farvning anvendes til at vurdere henholdsvis ROS, døde celler og levende celler efterfulgt af billeddannelse og analyse.
Abstract
Okulær overflade udsættes for regelmæssig slitage på grund af forskellige miljømæssige faktorer. Udsættelse for UV-C-stråling udgør en sundhedsrisiko på arbejdspladsen. Her demonstrerer vi eksponeringen af primære stamceller fra museoklær overflade til UV-C-stråling. Reaktiv iltarter (ROS) dannelse er udlæsningen af omfanget af oxidativ stress / skade. I en eksperimentel in vitro indstilling, er det også vigtigt at vurdere procentdelen af døde celler genereret på grund af oxidativstress. I denne artikel vil vi demonstrere 2',7'-Dichlorfluoresceindiacetate (DCFDA) farvning af UV-C eksponeret mus primære okulære overflade stamceller og deres kvantificering baseret på fluorescerende billeder af DCFDA farvning. DCFDA farvning svarer direkte til ROS generation. Vi demonstrerer også kvantificeringen af døde og levende celler ved samtidig farvning med propidiumiodid (PI) og Hoechst 3332 henholdsvis og procentdelen af DCFDA (ROS positive) og PI positive celler.
Introduction
Den okulære overflade (OS) er en funktionel enhed, der hovedsagelig består af det ydre lag og kirtelepithelia af hornhinden, lachrymal kirtel, meibomiankirtel, konjunktiva, en del af øjenlåget margener og innervations at transduce signaler1. Den gennemsigtige kuppel formet hornhinde lag fokuserer lys på nethinden. Denne avaskulære væv er sammensat af cellulære komponenter såsom epitelceller, keratorer, og endotelceller og acellulære komponenter såsom kollagen og glycosaminoglycans2. Området er drænet af tårer, der også leverer de fleste af de næringsstoffer. Den anatomiske position af OS tvinger det til at være i direkte kontakt med det ydre miljø, ofte udsætter det for forskellige barske komponenter såsom stærkt lys, mikrober, støvpartikler og kemikalier. Denne faktor prædisponerer OS til fysiske skader og gør det tilbøjelige til forskellige sygdomme.
Oxidativ stress er forårsaget på grund af uligevægt mellem produktionen af reaktive ilt arter (ROS) og endogene antioxidant forsvar mekanismer3. ROS er klassificeret i reaktive molekyler og frie radikaler, som begge er afledt af molekylær ilt (O2)gennem mitokondriel oxidativ fosforylering4. Den tidligere gruppe består af ikke-radikale arter som hydrogenperoxid (H2O2), singlet oxygen (1O2), og sidstnævnte omfatter arter som superoxidanioner (O2-) og hydroxylradikaler (•OH), blandt andre. Disse molekyler er biprodukter af normale cellulære processer og deres roller har været involveret i vigtige fysiologiske funktioner såsom signal transduktion, genekspression, og vært forsvar5. En forbedret produktion af ROS er kendt for at blive genereret som reaktion på faktorer som patogen invasion, xenobiotika, og eksponering for ultraviolet (UV) stråling4. Denne overproduktion af ROS resulterer i oxidativstress, der fører til skader på molekyler som nukleinsyrer, proteiner og lipider6.
Naturligt sollys, den mest dominerende kilde til UV-stråling, er sammensat af UV-A (400-320 nm), UV-B (320-290 nm), og UV-C (290-200 nm)7. Der er rapporteret om en omvendt sammenhæng mellem bølgelængden og spektrale energier. Selv om naturlig UV-C-stråling absorberes af atmosfæren, udsender kunstige kilder såsom kviksølvlamper og svejseinstrumenter og udgør derfor en erhvervsrisiko. Symptomer på eksponering for øjne omfatter fotokeratitis og fotokeratoconjunctivitis8. Produktion af ROS er en af de vigtigste mekanismer til at påføre UV-induceret cellulære skader9. I den aktuelle undersøgelse påviser vi påvisning af ROS ved hjælp af 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA) farvningsmetode i de primære okulære overfladeceller/stamceller, der udsættes for UV-C. Den grønne fluorescens blev fanget ved hjælp af fluorescerende mikroskopi. Cellerne var kontrafarvede med to farvestoffer, Hoechst 33342 og rød propidiumiodid, for at plette henholdsvis levende og døde celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsøget blev udført på primære okulære celler / stamceller stammer fra den schweiziske albino museøje. Brugen af dyr til høst af øjnene til dette eksperiment blev godkendt af Den Institutionelle Etiske Komité for Dyrs Dyr, Yenepoya (anses for at være universitet) (IEAC-godkendelsesnummer, 6a/19.10.2016).
1. Præparater af reagenser
BEMÆRK: Afledning af primære celler/stamceller fra museoklær overflade ligger uden for denne protokols anvendelsesområde. Derfor demonstrerer vi UV-C eksponeringsdoser, reagensforberedelse til vurdering af ROS, levende og døde celler og deres kvantificering. Der henvises til tabel 1 for de respektive mængder af reagenserne (10 % føtal kvægserum, DCFDA, Hoechst- og propidiumiodidbestandløsninger, der skal tilsættes for at opnå den endelige farvningsopløsning).
- Forbered en lageropløsning på 10 mM DCFDA ved at opløse 25 mg DCFDA-pulver i 5,13 ml DMSO. Aliquot 250 μL hver i ravfarvede 1,5 ml rør og opbevares ved -20 °C.
- Der fremstilles en lageropløsning på 10 mg/ml (16,23 mM opløsning) Hoechst 33342 ved at opløse hele indholdet af 25 mg hætteglasset i 2,5 ml deioniseret vand. Lav aliquoter af 100 μL i ravfarvede mikrocentrifugerør, og opbevares ved 2-6 °C i op til 6 måneder. Til længerevarende opbevaring opbevares ved -20 °C.
- Der fremstilles en lageropløsning på 1 mg/ml propidiumidid i deioniseret vand, aliquot 1 ml hver i ravfarvede 1,5 ml rør og opbevares ved 4 °C.
2. Celleforning og UV-C strålebehandling
- Før plating, adskille musen primære okulære overfladeceller isoleret i vores laboratorium (ikke offentliggjorte resultater; sådanne celler er en blanding af hornhinde epitel, stromale celler og keratytter) ved hjælp af en blid celle dissociation agent(Tabel over materialer).
- Plade 0,2 x 106 mus primære okulære overfladeceller i 35 mm 0,2% kælder membran matrix belagt celle kultur retter i 2,5 ml af komplette medier. Inkubernatten ved 37 °C i en 5% CO2 og befugtet kuvøse.
BEMÆRK: Komplette medier til dyrkning af primære celler fra museoklær overflade består af DMEM høj glukose, der indeholder 20% FBS, 1% Pen-strep, 1% Glutamax, 1% ikke-essentiel aminosyre (NEAA), 1% natriumpyruvat og 0,1% β-mercaptoethanol. - Før cellerne udsættes for forskellige doser UV-C, skal den maksimale mediemængde kasseres, og der må kun være et tyndt medielag (~500 μL) at forblive i kontakt med cellerne, lige nok til at dække dem.
- Tag opvasken, en ad gangen til UV-C kilde / kammer (det nederste kammer af en hybridisering ovn / UV cross linker; Tabel over materialer). Placer skålen i kammeret og fjern låget af skålen. Skålens åbne lågposition sikrer, at cellerne får den maksimale UV-C-dosis under UV-C-eksponeringen.
- Cellerne udsættes for forskellige kvaliteter/doser UV-C: 1 J/m2, 100J/m2,1.000 J/m2 og 10.000 J/m2.
- Efter UV-C eksponering, udskift låget af hver af retterne straks og fjerne dem fra UV-C kildekammer.
- Bring hver af retterne til laminar luftstrømmen hætte og top op hver af retterne med 2 ml friske komplette medier.
- Inkuber cellerne i 3 timer i en 37 °C CO 2-inkubator. Tre timers inkubation efter UV-C eksponering er optimal til at visualisere og kvantificere de tidlige virkninger.
3. Forberedelse af strømførende medier
- Forbered farvningsmediet friskt i løbet af de sidste 15 min af 3 timers celleinkubationen efter UV-C-eksponering.
- Forvarm 10 ml af farvningsmediet, der indeholder 10% FBS-DMEM suppleret med 1% Pen-Strep til 37 °C.
- Der tilsættes 5 μL 10 mM DCFDA; 5 μL 10 mg/ml Hoechst opløsning og 200 μL 1 mg/ml propidiumiditd. De endelige koncentrationer af HENHOLDSVIS DCFDA, Hoechst og PI er 5 μM, 5 μg/ml og 20 μg/ml i 10 ml farvningsmedier.
4. DCFDA farvning af UV-C eksponeret mus primære okulære celler
- Efter 3 h inkubation af UV-C eksponeret mus primære okulære celler ved forskellige doser, aspirere medierne fra de 35 mm retter.
- Genopfyld med 2 ml frisklavet DCFDA farvning medier til hver af retterne forsigtigt fra siderne.
- Inkuber cellerne med farvningsmediet i 15 minutter i mørke i en 37 °C CO 2-inkubator til strømførende cellefarvning.
5. Visning af DCFDA (ROS), Hoechst og PI farvede celler
- Efter afslutningen af inkubationen skal farvningsmediet kasseres.
- Tilføj friske hele medier til cellerne og observere cellerne under en omvendt fluorescerende mikroskop / celle imager (Tabel over materialer). Fotografer de ønskede felter: lysfelt, blå fluorescens, rød fluorescens, grøn fluorescens.
BEMÆRK: De blå fluorescerende farvede celler er kernerne, den grønne fluorescens er for ROS-producerende celler, og den røde fluorescens indikerer PI-positive døde celler.
6. Kvantificering af farvede celler (Hoechst-Blue, PI-Dead og Green-ROS) ved hjælp af billeddannelsesteknikker
- Eksporter de billeder, der er taget under det omvendte fluorescerende mikroskop/cellebilledbillede, til ImageJ til kvantificering.
- Åbn hvert af billederne én ad gangen ved hjælp af hver kanal (dvs. blå (Nuclei/Hoechst), grøn (ROS), rød (Død/PI positiv)) sekventialt for at tælle. Start fra den ueksponerede kontrol og træk fortløbende til 1, 100, 1.000 og 10.000 J/m-2.
- Tæl cellerne ved hjælp af celleoptællingsværktøjet, der er markeret som et kryds i softwaremenuen for hvert af felterne [blå positivt (Hoechst positive; nuclei), rød positiv (PI positive; døde celler), grøn positiv (ROS)] i hvert af de billeder, der svarer til hvert af de Behandlinger.
- Tæl ved at klikke på hvert af de specifikke signaler i hvert af felterne. For eksempel vil klikke på den blå / Hoechst farvede kerner give det samlede antal kerner i et givet felt.
- Resultatprocenten af celledød beregnes som procentdelen af celledød med UV-skader (antal PI-positive celler x 100 divideret med antallet af Hoechst-positive celler) og procentdelen af ROS-produktionen ved UV-skader (antal DCFDA-positive celler x 100 divideret med antallet af Hoechst-positive celler).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DCFDA er et farveløst farvestof, der er en kemisk reduceret form for fluorescein, der anvendes som indikator for påvisning af ROS i celler. Dette farvestof bliver fanget inde i celler og er let oxideret til fluorescerende dichlorodihydrofluorescein (DCF), som udsender en grøn fluorescens. Denne fluorescens kan påvises ved hjælp af fluorescerende mikroskopi. Cellerne kan visualiseres og korreleres med ROS-akkumulering som følger: (i) levende celler uden ROS udsender høj blå fluorescens; ii) levende celler med ROS-akkumulering udsender høj blå fluorescens med lav grøn fluorescens og (iii) døde celler med ROS-akkumulering udsender lav blå fluorescens med høj rød og høj grøn fluorescens.
Kontrolceller og celler, der blev eksponeret for 1 J/m2 UV-C, udviste ikke DCFDA/ROS og PI-positive celler. UV-C-ueksponeret kontrol viste kun nuklear farvning som angivet ved Hoechst-farvningen (figur 1). Der blev imidlertid ikke set nogen PI- eller DCFDA-positive celler i UV-C-ueksponerede kontrolceller (figur 1).
Celler udsat for 100 J/m2 UV-C udstillet lav ROS og PI positive celler. Primære celler fra museokulær overflade ved udsættelse for UV-C ved en dosis på 100 J/m2 viste ca. 5% co-farvning af DCFDA og PI, hvilket indikerer dannelsen af ROS og celledød i 5% af cellerne (figur 1).
Celler udsat for 1.000 J/m2 UV-C udstillet 60% -70% ROS og PI positive celler. Primære celler fra okulær musoverflade ved udsættelse for UV-C ved en dosis på 1.000 J/m2 viste ca. 70 % co-farvning af DCFDA og PI, hvilket indikerer dannelsen af ROS og celledød i 70 % af cellerne (figur 1).
Celler udsat for 10.000 J/m2 UV-C udstillet 100% ROS positive celler og ~ 100% celledød. Den højeste UV-C-dosis (10.000 J/m2),når de udsættes for de okulære primære celler med musen, resulterede i 100 % celledød (PI-positive celler) og ROS-dannelse (FARVNING af DCFDA), hvilket indikerer den højeste dødelighed af denne særlige UV-C-dosis (Figur 1).
Celler behandlet med 1 J/m2 UV-C-stråling viste ingen ophobning af ROS, og procentdelen af levende celler i denne dosis var sammenlignelig med kontrolcellerne. Celler viste en betydelig mængde celledød og ROS-akkumulering ved 100 J/m2. Den højeste mængde ROS-akkumulering og celledød blev observeret i celler behandlet med 10.000 J/m2 UV-C-stråling.
De kvantificerede resultater (procentdel af generering af fortjeneste af fortjeneste og procentdel af celledød pr. formler i henhold til punkt 6.3) blev afbildet i form af en søjlegraf (figur 2). X-aksen repræsenterer UV-C-doserne, mens Y-aksen repræsenterer procentdelen af celler. Den grønne bjælke repræsenterer procentdelen af ROS, og de røde bjælker repræsenterer celledød ved forskellige doser af UV-C-stråling (Figur 2). Procentdelen af ros og døde celler var i størrelsesordenen 0%, 0%, 10%, 70% og 100% ved UV-C doser: ueksponeret kontrol, 1 J / m2, 100 J / m2, 1.000 J / m2 og 10.000 J / m2, henholdsvis (figur 2).
Figur 1: Sammensatte levende cellebilleder af de primære celler i museokulær overflade, der udsættes for forskellige doser AF UV-C (Ueksponeret kontrol, 1, 100, 1.000, 10.000 J/m2). Disse billeder blev taget under forskellige filtre: bright-field (for celle morfologi), blå (Hoechst nukleare plet), grøn (ROS generation) og rød (propidium iodid farvede døde celler). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Søjlediagrammer, der viser de kvantificeringsresultater, der er opnået efter beregning af procentdelen af generering af ros og procentdel af døde celler ved eksponering af primære museoklære overfladeceller i forskellige doser UV-C-stråling. X-aksen repræsenterer UV-C-doserne, mens Y-aksen repræsenterer procentdelen af celler. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Komponent | Volumen |
| 10% føtal kvægserum indeholdende DMEM | 9790 μL |
| DCFDA lagerløsning | 5 μL |
| Hoechst 33342 lagerløsning | 5 μL |
| Propidium iodid lagerløsning | 200 μL |
Tabel 1: Reagenser, der er nødvendige for fremstilling af farvningsopløsning.
| Problem | Sandsynlige årsager | Fejlfinding | Kommentarer |
| Ingen eller meget lidt ROS eller PI positive celler farves, når cellerne blev behandlet med høj til højeste UV-dosis | i. Brug af en gammel farvningsopløsning. | i. Brug frisklavet farvningsopløsning. | i. Tidligere forberedt farvningsopløsning fører til forkert farvning af cellerne. |
| ii. Overconfluent kultur parabol resulterer i bjærgning af UVC skader af cellerne. | ii. Plade kun 0,2 millioner celler i hver 35 mm cellekultur parabol og aldrig tillade cellerne at vokse i mere end 12 timer, før udsætter dem for UVC doser. | ii. Overconfluent celler kan redde UVC skader, og dermed ingen eller lidt ROS og PI positive celler vil blive visualiseret. |
Tabel 2: Fejlfinding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den DCFDA farvning metode, der er beskrevet her gør det muligt visualisering af ROS i mus primære okulære levende celler behandlet med UV-C-stråling. En fordel ved denne farvning metode er, at det også giver forskerne mulighed for at studere de umiddelbare virkninger af UV-C (3 timer efter UVC eksponering) på de levende celler og deres samtidige optælling for den procentdel af ROS positive, samt, døde celler. Da farvningsmetoden anvendes på levende celler, kan cellerne desuden inkuberes yderligere i de samme medier i længere tid (flere dage) til undersøgelse af forsinkede virkninger af UV-C-stråling. Derfor gør denne farvningsmetode det muligt at visualisere ROS-generationen (grøn) og samtidig skelne mellem levende, apoptotiske og døde cellepopulationer i levende celler under et omvendt fluorescensmikroskop. Men under visse omstændigheder, på trods af forventningen om at opnå ROS positive og PI positive celler, visualiseringen kan mislykkes. I sådanne tilfælde foreslås fejlfinding(tabel 2).
Denne protokol skal udføres nøjagtigt for at opnå optimale resultater. Optimale resultater indikerer en korrelation mellem det grønne fluorescerende signal, der udsendes/ROS, der genereres som en nøjagtig udlæsning af den specifikke UV-C-dosis, der er induceret DNA-skade. Med andre ord, for at udføre dette trin, mængden af medier, der er i kontakt med cellerne under UV-C eksponering bør ikke være så meget, således at UV-C dosis undlader at fremkalde den nødvendige skade. Derfor er det vigtigt at holde en minimal volumen af medier, siger 500 μL pr 35 mm fad, lige nok til at dække cellerne under UV-C eksponering på alle de angivne doser. For det andet bør mediemængden ikke være så lille, at cellerne tørrer ud under UV-C-eksponering. Endelig, umiddelbart efter eksponeringen af cellerne til UV-C, cellerne bør fyldes op med friske medier til det optimale volumen (f.eks 2 ml), for yderligere at undgå eventuelle skader og ROS generation.
En begrænsning af denne teknik er den type ROS genereret. Andre yderligere analyser skal udføres for at detektere den specifikke ROS type som reaktion på UV-C dosisintervaller. Sådanne analyser omfatter vurdering af de intracellulære hydroxylradikal (•OH), intracellulære superoxidradikaler, intracellulære reaktive nitrogenarter, mitokondrielle hydroxylradikaler, mitokondrielle superoxider og brintoverilte i levende celler ved hjælp af kommercielt tilgængelige kits. En anden begrænsning af denne teknik er detekterbarheden af den procentvise rosgenerering ved doser under 10 J/m2 og derover 10.000 J/m2. Tilsyneladende var der ingen ROS-positive celler synlige, da de primære celler/stamceller fra museoklær overflade blev udsat for UV-C-doser mindre end 10 J/m2. Tværtimod, 100% ROS positive celler var synlige, når cellerne blev udsat for UV-C dosis over 10.000 J / m2. Derfor kan andre analyser (f.eks. enzymanalyse, måling af oxidative stressmarkører såsom 8-hydroxydeoxyguanosin (8-OHdG) (DNA-skadesmarkør) og vestlig blotanalyse af DNA-skadeproteiner ved forskellige doser være nyttige til at forstå omfanget/typen af cellulære/molekylære skader på forskellige niveauer. En tredje begrænsning af denne teknik er korrelationen mellem UV-C doser til ROS genereret på tværs af forskellige celletyper. Dette skal valideres.
I øjeblikket, DCFDA kits er tilgængelige kommercielt for ROS afsløring enten ved hjælp af mikroskopi eller flow cytometri10,11. Sådanne kits er imidlertid dyre og kan ikke ydes af forskningslaboratorier i lande med begrænset ressourcer. Derfor er denne protokol meget nyttig med en effektivitet i lighed med de kommercielt solgte metoder. For det andet har vi indarbejdet propidium iodid døde celle plet sammen med DCFDA / ROS generation. Derfor kan levende celleovervågning af ROS-positive og døde celler udføres samtidigt ved hjælp af denne metode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere modtaget støtte fra Bio-Rad Laboratories India Private Limited for at sponsorere artiklen.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender støtte fra Yenepoya Research Centre, Yenepoya (anses for at være universitet) for infrastrukturfaciliteter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA) | Sigma | D6883 | 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species. |
| Cell culture dish (35 mm) | Eppendorf | SA 003700112 | Sterile dishes for culturing the cells. |
| DMEM High Glucose | HiMedia | AT007 | Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose. |
| Fetal Bovine Serum, EU Origin | HiMedia | RM99955 | One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements. |
| GlutMax | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth. |
| HL-2000 Hybrilinker | UVP | Hybridization oven/UV cross linker | |
| Hoechst 33342 | Sigma | B2261 | Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive. |
| Matrigel | Corning | Basement membrane matrix | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100X) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Used as a supplement to increase the cell growth and viability. |
| Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture. |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170 | Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells. |
| TryplE Express | Thermo Fisher Scientific | Gentle cell dissociation agent | |
| ZOE Fluorescent Cell Imager | Bio-rad |
References
- Gipson, I. K. The ocular surface: the challenge to enable and protect vision: the Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).
- Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmoogy. 66 (2), 190-194 (2018).
- Betteridge, D. J.
- Ray, P. D., Huang, B. W., Tsuji, Y. Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling. Cell Signaling. 24 (5), 981-990 (2012).
- Nita, M., Grzybowski, A. The Role of the Reactive Oxygen Species and Oxidative Stress in the Pathomechanism of the Age-Related Ocular Diseases and Other Pathologies of the Anterior and Posterior Eye Segments in Adults. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3164734 (2016).
- Covarrubias, L., Hernandez-Garcia, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregon, S. Function of reactive oxygen species during animal development: passive or active. Developmental Biology. 320 (1), 1-11 (2008).
- Behar-Cohen, F., et al. Ultraviolet damage to the eye revisited: eye-sun protection factor (E-SPF(R)), a new ultraviolet protection label for eyewear. Clinical Ophthalmology. 8, 87-104 (2014).
- Izadi, M., Jonaidi-Jafari, N., Pourazizi, M., Alemzadeh-Ansari, M. H., Hoseinpourfard, M. J. Photokeratitis induced by ultraviolet radiation in travelers: A major health problem. Journal of Postgraduate Medicine. 64 (1), 40-46 (2018).
- de Jager, T. L., Cockrell, A. E., Du Plessis, S. S. Ultraviolet Light Induced Generation of Reactive Oxygen Species. Advances in Experimental Medicine and Biology. 996, 15-23 (2017).
- Degl'Innocenti, D., et al. Oxadiazon affects the expression and activity of aldehyde dehydrogenase and acylphosphatase in human striatal precursor cells: A possible role in neurotoxicity. Toxicology. 411, 110-121 (2019).
- Li, Z., et al. APC-Cdh1 Regulates Neuronal Apoptosis Through Modulating Glycolysis and Pentose-Phosphate Pathway After Oxygen-Glucose Deprivation and Reperfusion. Cellular and Molecular Neurobiology. 39, 123-135 (2019).
