Summary
Denne protokollen demonstrerer samtidig påvisning av reaktive oksygenarter (ROS), levende celler og døde celler i levende primære kulturer fra musen okulære overflateceller. 2',7'-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium jodid, og Hoechst farging brukes til å vurdere ROS, døde celler, og levende celler, henholdsvis, etterfulgt av bildebehandling og analyse.
Abstract
Okulær overflate er utsatt for vanlig slitasje på grunn av ulike miljøfaktorer. Eksponering for UV-C-stråling utgjør en helsefare på arbeidsplassen. Her viser vi eksponeringen av primære stamceller fra musenokulær overflate til UV-C-stråling. Reaktiv oksygenart (ROS) dannelse er avlesningen av omfanget av oksidativt stress/ skade. I en eksperimentell in vitro-innstilling er det også viktig å vurdere prosentandelen av døde celler som genereres på grunn av oksidativt stress. I denne artikkelen vil vi demonstrere 2',7'-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) farging av UV-C eksponert mus primære okulær overflate stamceller og deres kvantifisering basert på fluorescerende bilder av DCFDA farging. DCFDA farging direkte tilsvarer ROS generasjon. Vi viser også kvantifisering av døde og levende celler ved samtidig farging med propidiumjodid (PI) og Hoechst 3332 henholdsvis og prosentandelen av DCFDA (ROS positive) og PI positive celler.
Introduction
Okulær overflate (OS) er en funksjonell enhet hovedsakelig består av det ytre laget og kjertelepitelen av hornhinnen, lachrymal kjertel, meibomian kjertel, conjunctiva, en del av øyelokkmarginer og innerveringer som transduce signaler1. Det gjennomsiktige kuppelformede hornhinnen legger fokus på netthinnen. Dette avaskulære vevet består av cellulære komponenter som epitelceller, keratocytter og endotelceller og acellulære komponenter som kollagen og glykosaminoglykaner2. Området er drenert av tårer som også forsyner de fleste næringsstoffene. Os anatomiske posisjon tvinger det til å være i direkte kontakt med det ytre miljøet, og utsetter det ofte for ulike harde komponenter som sterkt lys, mikrober, støvpartikler og kjemikalier. Denne faktoren predisponerer operativsystemet for fysiske skader og gjør det utsatt for ulike sykdommer.
Oksidativt stress skyldes disequilibrium mellom produksjon av reaktive oksygenarter (ROS) og endogene antioksidantforsvarsmekanismer3. ROS er klassifisert i reaktive molekyler og frie radikaler, som begge er avledet fra molekylært oksygen (O2) gjennom mitokondrieoksidatorylering4. Den tidligere gruppen består av ikke-radikale arter som hydrogenperoksid (H2O2),enkeltoksygen (1O2) og sistnevnte inkluderer blant annet arter som superoksidanioner (O2-) og hydroksylradikaler (•OH). Disse molekylene er biprodukter av normale cellulære prosesser og deres roller har vært innblandet i viktige fysiologiske funksjoner som signaltransduksjon, genuttrykk og vertsforsvar5. En forbedret produksjon av ROS er kjent for å bli generert som svar på faktorer som patogen invasjon, xenobiotika, og eksponering for ultra fiolett (UV) stråling4. Denne overproduksjonen av ROS resulterer i oksidativt stress som fører til skade på molekyler som nukleinsyrer, proteiner og lipider6.
Naturlig sollys, den mest dominerende kilden til UV-stråling, består av UV-A (400–320 nm), UV-B (320–290 nm) og UV-C (290–200 nm)7. En invers sammenheng mellom bølgelengden og spektralenergiene er rapportert. Selv om naturlige UV-C-strålinger absorberes av atmosfæren, avgir kunstige kilder som kvikksølvlamper og sveiseinstrumenter, og utgjør derfor en yrkesfare. Symptomer på eksponering for øyne inkluderer fotokeratitt og fotokeratoconjunctivitis8. Produksjon av ROS er en av de viktigste mekanismene for å påføre UV-indusert cellulær skade9. I den nåværende studien viser vi påvisning av ROS ved hjelp av 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA) farging ser metode i musen primære okulære overflateceller / stamceller utsatt for UV-C. Den grønne fluorescensen ble fanget ved hjelp av fluorescerende mikroskopi. Cellene var motfarget med to fargestoffer, Hoechst 33342 og rød propidiumjodid, for å beise de levende og døde cellene, henholdsvis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimentet ble utført på primære okulære celler / stamceller avledet fra det sveitsiske albino museøyet. Bruken av dyr for høsting av øynene for dette eksperimentet ble godkjent av Institutional Animal Ethical Committee, Yenepoya (Anses å være Universitet) (IEAC godkjenningsnummer, 6a/19.10.2016).
1. Preparater av reagenser
MERK: Avledning av primærceller/stamceller fra musens okulære overflate er utenfor omfanget av denne protokollen. Derfor demonstrerer vi UV-C-eksponeringsdosene, reagensforberedelsen for vurdering av ROS, levende og døde celler og deres kvantifisering. Se tabell 1 for de respektive volumene til reagensene (10 % føtal storfeserum, DCFDA, Hoechst og propidiumjoodidelagerløsninger som skal legges til for å oppnå den endelige fargeløsningen).
- Forbered en lagerløsning på 10 mM DCFDA ved å oppløse 25 mg DCFDA pulver i 5,13 ml DMSO. Aliquot 250 μL hver i gul farget 1,5 ml rør og lagre ved -20 °C.
- Forbered en lagerløsning på 10 mg/ml (16,23 mM-oppløsning) Hoechst 33342 ved å oppløse hele innholdet i hetteglasset på 25 mg i 2,5 ml avdeionisert vann. Lag aliquots på 100 μL i gulfargede mikrocentrifugerør og oppbevar ved 2-6 °C i opptil 6 måneder. For lengre tidsoppbevaring, oppbevar ess ved -20 °C.
- Forbered en lagerløsning på 1 mg/ml propidiumjodid i avionisert vann, aliquot 1 ml hver i gulfargede 1,5 ml rør, og oppbevar ved 4 °C.
2. Celleplating og UV-C strålebehandling
- Før plating, dissosiere musen primære okulære overflateceller isolert i vårt laboratorium (upubliserte resultater; slike celler er en blanding av hornhinne epitel, stromal celler og keratocytter) ved hjelp av en mild celle dissosiasjon smiddel (Tabell av materialer).
- Plate 0,2 x 106 mus primære okulære overflateceller i 35 mm 0,2% kjeller membran matrise belagt celle kultur retter i 2,5 ml komplette medier. Inkuber over natten ved 37 °C i en 5% CO2 og fuktet inkubator.
MERK: Komplett media for å kulere primære celler fra musen okulær overflate består av DMEM høy glukose som inneholder 20% FBS, 1% Pen-strep, 1% Glutamax, 1% ikke-essensiell aminosyre (NEAA), 1% natrium pyruvate, og 0,1% β-mercaptoetanol. - Før du eksponerer cellene for ulike doser uv-C, kast det maksimale volumet av medier og la bare et tynt lag med medier (~ 500 μL) forbli i kontakt med cellene, akkurat nok til å dekke dem.
- Ta oppvasken, en om gangen til UV-C kilde / kammer (det nedre kammeret i en hybridisering ovn / UV krysslinker; Tabell over materialer). Plasser parabolen i kammeret og fjern lokket på parabolen. Den åpne lokkposisjonen til parabolen sikrer at cellene får maksimal UV-C-dose under UV-C-eksponeringen.
- Utsett cellene for forskjellige karakterer/doser av UV-C: 1 J/m2, 100J/m2,1000 J/m2 og 10 000 J/m2.
- Etter UV-C-eksponeringen, skift lokket på hver av oppvasken umiddelbart og fjern dem fra UV-C-kildekammeret.
- Ta med hver av rettene til laminar luftstrømhetten og fyll opp hver av rettene med 2 ml friske komplette medier.
- Inkuber cellene i 3 timer i en 37 °C CO2 inkubator. Tre timer med inkubasjon etter UV-C-eksponering er optimal for å visualisere og kvantifisere de tidlige effektene.
3. Utarbeidelse av live-celle farging media
- Forbered fargingsmediet friskt i løpet av de siste 15 min av 3 t celleinkubasjonen etter UV-C-eksponering.
- Pre-varm 10 ml av farging media som inneholder 10% FBS-DMEM supplert med 1% Pen-Strep til 37 ° C.
- Tilsett 5 μL av 10 mM DCFDA; 5 μL 10 mg/ml Hoechst-oppløsning og 200 μL med 1 mg/ml propidiumjodid. De endelige konsentrasjonene av DCFDA, Hoechst og PI er henholdsvis 5 μM, 5 μg/ml og 20 μg/ml i henholdsvis 10 ml fargingsmidler.
4. DCFDA farging av UV-C eksponert mus primære okulære celler
- Etter 3 t inkubasjon av UV-C eksponert mus primære okulære celler ved ulike doser, aspirer ei media fra 35 mm retter.
- Fyll opp med 2 ml nylagde DCFDA farging media til hver av rettene forsiktig fra sidene.
- Inkuber cellene med fargematerialet i 15 min i mørket i en 37 °C CO 2-inkubator for levende cellefarging.
5. Visning av DCFDA (ROS), Hoechst og PI-fargede celler
- Etter ferdigstillelse av inkubasjon, kast flekker.
- Legg til friske komplette medier til cellene og observere cellene under et omvendt fluorescerende mikroskop / celleimager (Materialtabell). Fotografi de ønskede feltene: lyse felt, blå fluorescens, rød fluorescens, grønn fluorescens.
MERK: De blå fluorescerende fargede cellene er kjernene, den grønne fluorescensen er for ROS genererende celler og den røde fluorescensen indikerer PI positive døde celler.
6. Kvantifisering av fargede celler (Hoechst-Blue, PI-Dead og Green-ROS) ved hjelp av bildeteknikker
- Eksporter bildene tatt under det inverterte fluorescerende mikroskopet/cellebildet til ImageJ for kvantifisering.
- Åpne hvert av bildene én om gangen, ved hjelp av hver kanal (dvs. blå (Nuclei/Hoechst), grønn (ROS), rød (Dead/PI positiv)) sekvensielt, for telling. Start fra ueksponert kontroll og sekvensielt flytte til 1, 100, 1000 og 10.000 J/m-2.
- Telle cellene ved hjelp av celletellingsverktøyet merket som et kors i programvaremenyen for hvert av feltene [blå positiv (Hoechst positiv; kjerner), rød positiv (PI-positiv; døde celler); grønn positiv (ROS)] i hvert av bildene som tilsvarer hver av Behandlinger.
- Tell ved å klikke på hvert av de spesifikke signalene i hvert av feltene. For eksempel vil det å klikke på de blå/Hoechst-fargede kjernene gi det totale antallet kjerner i et gitt felt.
- Beregn resultatene som prosentandelen av celledød ved UV-skade (antall PI positive celler x 100 delt på antall Hoechst positive celler) og prosentandelen av ROS produksjon av UV-skade (antall DCFDA positive celler x 100 delt på antall Hoechst positive celler).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DCFDA er en fargeløs fargestoff som er en kjemisk redusert form for fluorescein som brukes som en indikator for å oppdage ROS i celler. Dette fargetået blir fanget inne i celler og oksideres lett til fluorescerende diklorodihydrofluorescein (DCF), som avgir en grønn fluorescens. Denne fluorescensen kan oppdages ved hjelp av fluorescerende mikroskopi. Cellene kan visualiseres og korreleres med ROS akkumulering som følger: (i) levende celler uten ROS avgir høy blå fluorescens; (ii) levende celler med ROS akkumulering avgir høy blå fluorescens med lav grønn fluorescens; og (iii) døde celler med ROS akkumulering avgir lav blå fluorescens med høy rød og høy grønn fluorescens.
Kontrollceller og celler eksponert for 1 J/ m2 UV-C viste ikke DCFDA / ROS og PI positive celler. UV-C ueksponert kontroll viste atomfarging bare som indikert av Hoechst-farmen (figur 1). Det ble imidlertid ikke sett noen PI- eller DCFDA-positive celler i UV-C-ueksponerte kontrollceller (figur 1).
Celler eksponert for 100 J / m2 av UV-C viste lave ROS og PI positive celler. Primærceller fra musen okulær overflate ved eksponering for UV-C i en dose på 100 J / m2 viste ca 5% co-farging av DCFDA og PI, og dermed indikerer dannelsen av ROS og celle død i 5% av cellene (Figur 1).
Celler eksponert for 1000 J/m2 UV-C viste 60%–70 % ROS og PI-positive celler. Primærceller fra musen okulær overflate ved eksponering for UV-C i en dose på 1000 J / m2 viste ca 70% co-farging av DCFDA og PI, og dermed indikerer dannelsen av ROS og celle død i 70% av cellene (Figur 1).
Celler eksponert for 10.000 J / m2 av UV-C utstilt 100% ROS positive celler og ~ 100% celledød. Den høyeste UV-C dosen (10 000 J/m2)når den ble utsatt for musen okulære primærceller resulterte i 100% celledød (PI positive celler) og ROS dannelse (DCFDA farging), og indikerer dermed den høyeste dødeligheten av denne spesielle UV-C dose (Figur 1).
Celler behandlet med 1 J/m2 UV-C-stråling viste ingen akkumulering av ROS, og prosentandelen av levende celler i denne dosen var sammenlignbar med kontrollcellene. Celler viste en betydelig mengde celledød og ROS akkumulering ved 100 J / m2. Den høyeste mengden ros akkumulering og celledød ble observert i celler behandlet med 10.000 J /m2 av UV-C stråling.
De kvantifiserte resultatene (prosentandel av ROS-generering og prosentandel av celledød i henhold til formler gitt under § 6.3) ble plottet i form av en stolpegraf (figur 2). X-aksen representerer UV-C-dosene mens Y-aksen representerer prosentandelen av celler. Den grønne linjen representerer prosentandelen ros, og de røde stolpene representerer celledøden ved forskjellige doser UV-C-stråling (figur 2). Prosentandelen ros og døde celler var i størrelsesorden 0%, 0%, 10%, 70% og 100% ved UV-C doser: ueksponert kontroll, 1 J/ m2, 100 J / m2, 1000 J / m2 og 10.000 J / m2, henholdsvis (Figur 2).
Figur 1: Sammensatte levende cellebilder av musenokulær overflate primære celler utsatt for ulike doser av UV-C (Ueksponert kontroll, 1, 100, 1000, 10.000 J/m2). Disse bildene ble tatt under forskjellige filtre: lyse felt (for cellemorfologi), blå (Hoechst kjernefysisk flekk), grønn (ROS generasjon) og rød (propidium jodid farget døde celler). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Stolpegrafer som viser kvantifiseringsresultatene oppnådd etter beregning av prosentandelen ros-generering og prosentandel av døde celler ved eksponering av primære mus okulære overflateceller til ulike doser av UV-C-stråling. X-aksen representerer UV-C-dosene, mens Y-aksen representerer prosentandelen av celler. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
| Komponent | Volum |
| 10 % føtal storfeserum som inneholder DMEM | 9790 μL |
| DCFDA lager løsning | 5 μL (5 μL) |
| Hoechst 33342 lagerløsning | 5 μL (5 μL) |
| Propidium iodide lager løsning | 200 μL |
Tabell 1: Reagenser som kreves for fremstilling av fargingsoppløsning.
| Problem | Sannsynlige årsaker | Feilsøking | Kommentarer |
| Ingen eller svært lite ROS eller PI positive celler er farget når cellene ble behandlet med høy til høyeste UV dose | i. Bruk av en gammel fargingsløsning. | i. Bruk nyforberedt fargingsløsning. | i. Tidligere forberedt fargingsløsning fører til feil flekker av cellene. |
| ii. Overkonfluent kulturrett som resulterer i berging av UVC skade av cellene. | ii. Plate bare 0,2 millioner celler i hver 35 mm celle kultur rett og aldri la cellene vokse i mer enn 12 timer før utsette dem for UVC doser. | ii. Overkonfluent celler kan redde UVC skade, og dermed ingen eller lite ROS og PI positive celler vil bli visualisert. |
Tabell 2: Feilsøking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DCFDA farging metoden beskrevet her muliggjør visualisering av ROS i musen primære okulære levende celler behandlet med UV-C stråling. En fordel med denne fargemetoden er at det også gjør det mulig for forskerne å studere de umiddelbare effektene av UV-C (3 timer etter UVC-eksponering) på levende celler og deres samtidige opplisting for prosentandelen av ROS-positive, så vel som døde celler. Videre, som farging metoden brukes på levende celler, cellene kan bli ytterligere inkubert i samme media i lengre tid (flere dager) for studiet av forsinkede effekter av UV-C stråling. Derfor gjør denne fargemetoden det mulig å visualisere ROS-generasjonen (grønn) og samtidig skille levende, apoptotiske og døde cellepopulasjoner i levende celler under et omvendt fluorescensmikroskop. Men under visse omstendigheter, til tross for forventning om å skaffe ROS positive og PI positive celler, visualisering kan mislykkes. For slike tilfeller foreslås feilsøking (tabell 2).
Denne protokollen må utføres nøyaktig for å oppnå optimale resultater. Optimale resultater indikerer en korrelasjon av det grønne fluorescerende signalet som slippes ut/ROS, som genereres som en nøyaktig avlesning av den spesifikke UV-C-dosen indusert DNA-skade. Med andre ord, for å utføre dette trinnet, bør volumet av medier som er i kontakt med cellene under UV-C-eksponeringen ikke være så mye, slik at UV-C-dosen ikke fremkaller den nødvendige skaden. Derfor er det viktig å holde et minimalt volum av medier, sier 500 μL per 35 mm parabolen, akkurat nok til å dekke cellene under UV-C eksponering ved alle de angitte doser. For det andre bør volumet av medier ikke være så lite at cellene tørker opp under UV-C-eksponering. Til slutt, umiddelbart etter eksponeringen av cellene til UV-C, bør cellene fylles opp med friske medier til det optimale volumet (si 2 ml), for ytterligere å unngå eventuelle skader og ROS-generering.
En begrensning av denne teknikken er typen ROS generert. Andre tilleggsanalyser må utføres for å oppdage den spesifikke ROS-typen som svar på UV-C-doseområdene. Slike analyser inkluderer vurderingen av intracellulære hydroksylradikaler (•OH), intracellulære superoksidradikaler, intracellulære reaktive nitrogenarter, mitokondriehydroksylradikaler, mitokondriesuperoksider og hydrogenperoksid i levende celler ved hjelp av kommersielt tilgjengelige sett. En annen begrensning av denne teknikken er påvisbarheten til den prosentvise ROS-generasjonen ved doser under 10 J/m2 og over 10 000 J/m2. Tilsynelatende var ingen ROS positive celler synlige når primærcellene / stamcellene fra musenokulær overflate ble utsatt for UV-C doser mindre enn 10 J / m2. Tvert imot var 100% ROS positive celler synlige når cellene ble utsatt for UV-C dose over 10.000 J/m2. Derfor kan andre analyser (f.eks. enzymanalyse, måling av oksidative stressmarkører som 8-hydroksydeoksyguanosin (8-OHdG) (DNA-skademarkør), og vestlig blotanalyse av DNA-skadeproteiner ved ulike doser) være nyttig for å forstå omfanget/typen cellulær/molekylære skader på ulike nivåer. En tredje begrensning av denne teknikken er korrelasjonen til UV-C-dosene til ROS generert på tvers av ulike celletyper. Dette må valideres.
For øyeblikket er DCFDA-sett tilgjengelig kommersielt for ROS-deteksjon enten ved hjelp av mikroskopi eller flytcytometri10,11. Slike sett er imidlertid dyre og kan ikke gis av forskningslaboratorier i ressursbegrensede land. Derfor er denne protokollen svært nyttig med en effektivitet som ligner på de kommersielt solgte metodene. For det andre har vi innlemmet propidiumjodiddød celleflekk sammen med DCFDA / ROS generasjon. Derfor kan levende celleovervåking av ROS positive og døde celler utføres samtidig ved hjelp av denne metoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere fikk støtte fra Bio-Rad Laboratories India Private Limited for å sponse artikkelen.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner støtte fra Yenepoya Research Centre, Yenepoya (Anses å være Universitet) for de infrastrukturelle anleggene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA) | Sigma | D6883 | 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species. |
| Cell culture dish (35 mm) | Eppendorf | SA 003700112 | Sterile dishes for culturing the cells. |
| DMEM High Glucose | HiMedia | AT007 | Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose. |
| Fetal Bovine Serum, EU Origin | HiMedia | RM99955 | One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements. |
| GlutMax | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth. |
| HL-2000 Hybrilinker | UVP | Hybridization oven/UV cross linker | |
| Hoechst 33342 | Sigma | B2261 | Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive. |
| Matrigel | Corning | Basement membrane matrix | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100X) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Used as a supplement to increase the cell growth and viability. |
| Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture. |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170 | Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells. |
| TryplE Express | Thermo Fisher Scientific | Gentle cell dissociation agent | |
| ZOE Fluorescent Cell Imager | Bio-rad |
References
- Gipson, I. K. The ocular surface: the challenge to enable and protect vision: the Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).
- Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmoogy. 66 (2), 190-194 (2018).
- Betteridge, D. J.
- Ray, P. D., Huang, B. W., Tsuji, Y. Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling. Cell Signaling. 24 (5), 981-990 (2012).
- Nita, M., Grzybowski, A. The Role of the Reactive Oxygen Species and Oxidative Stress in the Pathomechanism of the Age-Related Ocular Diseases and Other Pathologies of the Anterior and Posterior Eye Segments in Adults. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3164734 (2016).
- Covarrubias, L., Hernandez-Garcia, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregon, S. Function of reactive oxygen species during animal development: passive or active. Developmental Biology. 320 (1), 1-11 (2008).
- Behar-Cohen, F., et al. Ultraviolet damage to the eye revisited: eye-sun protection factor (E-SPF(R)), a new ultraviolet protection label for eyewear. Clinical Ophthalmology. 8, 87-104 (2014).
- Izadi, M., Jonaidi-Jafari, N., Pourazizi, M., Alemzadeh-Ansari, M. H., Hoseinpourfard, M. J. Photokeratitis induced by ultraviolet radiation in travelers: A major health problem. Journal of Postgraduate Medicine. 64 (1), 40-46 (2018).
- de Jager, T. L., Cockrell, A. E., Du Plessis, S. S. Ultraviolet Light Induced Generation of Reactive Oxygen Species. Advances in Experimental Medicine and Biology. 996, 15-23 (2017).
- Degl'Innocenti, D., et al. Oxadiazon affects the expression and activity of aldehyde dehydrogenase and acylphosphatase in human striatal precursor cells: A possible role in neurotoxicity. Toxicology. 411, 110-121 (2019).
- Li, Z., et al. APC-Cdh1 Regulates Neuronal Apoptosis Through Modulating Glycolysis and Pentose-Phosphate Pathway After Oxygen-Glucose Deprivation and Reperfusion. Cellular and Molecular Neurobiology. 39, 123-135 (2019).
