Summary
Este protocolo demonstra a detecção simultânea de espécies de oxigênio reativa (ROS), células vivas e células mortas em culturas primárias vivas de células superficiais do rato. 2',7'-Diclorofluoresceindiacetato, iodeto de propídio e coloração hoechst são usados para avaliar o ROS, células mortas e células vivas, respectivamente, seguidas de imagem e análise.
Abstract
A superfície ocular é submetida a desgaste regular devido a vários fatores ambientais. A exposição à radiação UV-C constitui um risco para a saúde ocupacional. Aqui, demonstramos a exposição de células-tronco primárias da superfície ocular do rato à radiação UV-C. A formação de espécies de oxigênio reativo (ROS) é a leitura da extensão do estresse/dano oxidativo. Em um ambiente in vitro experimental, também é essencial avaliar o percentual de células mortas geradas devido ao estresse oxidativo. Neste artigo, demonstraremos a coloração de 2',7'-Diclorofluoresceindiacetato (DCFDA) de células-tronco primárias de superfície ocular exposta do rato UV-C e sua quantificação com base nas imagens fluorescentes da coloração DCFDA. A coloração DCFDA corresponde diretamente à geração ROS. Demonstramos também a quantificação de células mortas e vivas por coloração simultânea com iodeto de propídio (PI) e Hoechst 3332, respectivamente, e o percentual de células Positivas DCFDA (ROS positivo) e PI.
Introduction
A superfície ocular (OS) é uma unidade funcional composta principalmente pela camada externa e epíterlia glandular de córnea, glândula lacrimosa, glândula meibomiana, conjuntiva, parte das margens da tampa ocular e invações que transducam sinais1. A camada córnea em forma de cúpula transparente foca luz na retina. Este tecido avascular é composto por componentes celulares, como células epiteliais, ceratocitos e células endoteliais e componentes acelulares, como colágeno e glicosaminoglicanos2. A área é drenada por lágrimas que também fornecem a maioria dos nutrientes. A posição anatômica do SO obriga-o a estar em contato direto com o ambiente externo, muitas vezes expondo-o a vários componentes ásperos, como luz brilhante, micróbios, partículas de poeira e produtos químicos. Esse fator predispõe o SO a lesões físicas e o torna propenso a várias doenças.
O estresse oxidativo é causado devido ao desequilíbrio entre a produção de espécies de oxigênio reativa (ROS) e os mecanismos endógenos de defesa antioxidante3. Ros são classificados em moléculas reativas e radicais livres, ambos derivados de oxigênio molecular (O2) através da fosforilação oxidativa mitocondrial4. O antigo grupo é composto por espécies não radicais como peróxido de hidrogênio (H2O2), oxigênio singlet (1O2) e este último inclui espécies como anões de superóxido (O2-) e radicais hidroxilos(• OH),entre outras. Essas moléculas são subprodutos de processos celulares normais e seus papéis foram implicados em importantes funções fisiológicas, como transdução de sinal, expressão genética e defesa hospedeira5. Sabe-se que uma produção aprimorada de ROS é gerada em resposta a fatores como invasão de patógenos, xenobióticos e exposição à radiação ultra violeta (UV)4. Essa superprodução de ROS resulta em estresse oxidativo que leva ao dano de moléculas como ácidos nucleicos, proteínas e lipídios6.
A luz solar natural, a fonte mais predominante de radiação UV, é composta por UV-A (400-320 nm), UV-B (320-290 nm) e UV-C (290-200 nm)7. Uma correlação inversa entre o comprimento de onda e as energias espectrais foi relatada. Embora as radiações NATURAIS UV-C sejam absorvidas pela atmosfera, fontes artificiais como lâmpadas de mercúrio e instrumentos de soldagem emitem e, portanto, constituem um risco ocupacional. Os sintomas de exposição aos olhos incluem fotoqueratite e fotoqueratoconjuntivite8. A produção de ROS é um dos principais mecanismos de infligir danos celulares induzidos por UV9. No presente estudo, demonstramos a detecção de ROS utilizando o método de colorcetato diacetato de 2',7'-Diclororodihidrofluorescena (DCFDA) em células de superfície ocular primárias do camundongo/células-tronco expostas ao UV-C. A fluorescência verde foi capturada usando microscopia fluorescente. As células foram contra-manchadas com dois corantes, Hoechst 33342 e iodeto de propídio vermelho, para manchar as células vivas e mortas, respectivamente.
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Protocol
O experimento foi realizado em células oculares primárias/células-tronco derivadas do olho do rato albino suíço. O uso de animais para a colheita dos olhos para este experimento foi aprovado pelo Comitê Institucional de Ética Animal, Yenepoya (Considerado Universidade) (número de aprovação do IEAC, 6a/19.10.2016).
1. Preparativos de reagentes
NOTA: A derivação das células primárias/células-tronco da superfície ocular do camundongo está além do escopo deste protocolo. Assim, demonstramos as doses de exposição UV-C, a preparação de reagente para avaliar ros, células vivas e mortas e sua quantificação. Consulte a Tabela 1 para os respectivos volumes dos reagentes (10% de soro bovino fetal, DCFDA, Hoechst e soluções de iodeto de propidium a serem adicionadas para obter a solução final de coloração).
- Prepare uma solução de estoque de 10 mM DCFDA dissolvendo 25 mg de pó DCFDA em 5,13 mL de DMSO. Aliquot 250 μL cada em tubos de 1,5 mL de cor âmbar e armazenar a -20 °C.
- Prepare uma solução de estoque de 10 mg/mL (solução de 16,23 mM) Hoechst 33342 dissolvendo todo o conteúdo do frasco de 25 mgs em 2,5 mL de água desionizada. Faça alíquotas de 100 μL em tubos de microcentrífugas de cor âmbar e armazene a 2-6 °C por até 6 meses. Para armazenamento a longo prazo, guarde a -20 °C.
- Prepare uma solução de estoque de 1 mg/mL propidium iodeto em água deionizada, alíquota 1 mL cada em tubos de 1,5 mL coloridos âmbar e armazenamento a 4 °C.
2. Revestimento celular e tratamento de radiação UV-C
- Antes de chapeamento, dissociaas as células de superfície ocular primárias do camundongo isoladas em nosso laboratório (resultados inéditos; tais células são uma mistura de epiteliais epiteliais córneas, células estrônias e ceratocitos) usando um agente de dissociação celular suave (Tabela de Materiais).
- Placa 0,2 x 106 células de superfície ocular primária susoculares em 35 mm 0,2% de matriz de membrana revestida de pratos de cultura celular em 2,5 mL de mídia completa. Incubar durante a noite a 37 °C em um CO2 de 5% e incubadora umidificada.
NOTA: A mídia completa para o culing as células primárias da superfície ocular do camundongo é composta por glicose alta DMEM contendo 20% FBS, 1% Pen-estrep, 1% Glutamax, 1% aminoácido não essencial (NEAA), 1% piriuvate de sódio e 0,1% β-mercaptoetanol. - Antes de expor as células a várias doses de UV-C, descarte o volume máximo de mídia e permita que apenas uma fina camada de mídia (~500 μL) permaneça em contato com as células, apenas o suficiente para cobri-las.
- Leve os pratos, um de cada vez para a fonte/câmara UV-C (a câmara inferior de um forno hibridização/linker cruzado UV; Tabela de Materiais). Coloque o prato na câmara e retire a tampa do prato. A posição de tampa aberta do prato garante que as células recebam a dose MÁXIMA UV-C durante a exposição UV-C.
- Expor as células a diferentes graus/doses de UV-C: 1 J/m2,100J/m2,1.000 J/m2 e 10.000 J/m2.
- Após a exposição uv-C, substitua a tampa de cada um dos pratos imediatamente e remova-os da câmara de origem UV-C.
- Leve cada um dos pratos para o capô de fluxo de ar laminar e cubra cada um dos pratos com 2 mL de mídia completa fresca.
- Incubar as células por 3h em uma incubadora de 37 °C CO2. Três horas de incubação pós-exposição UV-C é ideal para visualizar e quantificar os efeitos precoces.
3. Preparação de mídia de coloração de células ao vivo
- Prepare a mídia de coloração fresca durante os últimos 15 min da incubação celular de 3 h exposição pós UV-C.
- Pré-quente 10 mL da mídia de coloração contendo 10% FBS-DMEM complementado com 1% pen-strep a 37 °C.
- Adicione 5 μL de 10 mM DCFDA; 5 μL de 10 mg/mL Solução Hoechst e 200 μL de 1 mg/mL propidium iodeto. As concentrações finais de DCFDA, Hoechst e PI são de 5 μM, 5 μg/mL e 20 μg/mL, respectivamente, nos 10 mL dos meios de coloração.
4. Coloração DCFDA de células oculares primárias do rato exposto uv-C
- Após 3 h de incubação de células oculares primárias do rato exposto uv-C em várias doses, aspirar a mídia dos pratos de 35 mm.
- Reponha com 2 mL de mídia de coloração DCFDA recém-preparada para cada um dos pratos suavemente das laterais.
- Incubar as células com a mídia de coloração por 15 min no escuro em uma incubadora de 37 °C CO2 para coloração de células vivas.
5. Visualização de células manchadas DCFDA (ROS), Hoechst e PI
- Após a conclusão da incubação, descarte a mídia de coloração.
- Adicione novos meios de comunicação completos às células e observe as células um microscópio fluorescente invertido/imager celular(Tabela de Materiais). Fotografe os campos desejados: campo brilhante, fluorescência azul, fluorescência vermelha, fluorescência verde.
NOTA: As células manchadas fluorescentes azuis são os núcleos, a fluorescência verde é para as células geradoras ros e a fluorescência vermelha indica as células mortas positivas pi.
6. Quantificação de células manchadas (Hoechst-Blue, PI-Dead e Green-ROS) usando técnicas de imagem
- Exporte as imagens capturadas o microscópio fluorescente invertido/imager celular para ImageJ para quantificação.
- Abra cada uma das imagens uma de cada vez, usando cada canal (ou seja, azul (Nuclei/Hoechst), verde (ROS), vermelho (Morto/PI positivo)) sequencialmente, para contagem. Comece a partir do controle não exposto e mova-sentialmente para 1.100, 1.000 e 10.000 J/m-2.
- Conte as células usando a ferramenta de contagem celular marcada como uma cruz no menu de software para cada um dos campos [azul positivo (Hoechst positivo; núcleos), vermelho positivo (PI positivo; células mortas); verde positivo (ROS)] em cada uma das imagens correspondentes a cada uma das imagens correspondentes a cada uma das imagens Tratamentos.
- Conte clicando em cada um dos sinais específicos em cada um dos campos. Por exemplo, clicar nos núcleos manchados azul/hoechst dará o número total de núcleos em um determinado campo.
- Calcule os resultados como percentual de morte celular por dano UV (número de células positivas pi x 100 divididas pelo número de células positivas de Hoechst) e a porcentagem de produção ros por dano UV (número de células positivas DCFDA x 100 divididas pelo número de células positivas de Hoechst).
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Representative Results
DCFDA é um corante incolor que é uma forma quimicamente reduzida de fluoresceína usada como indicador para detectar ROS nas células. Este corante fica preso dentro das células e é facilmente oxidado à diclorodfluoresceína fluorescente (DCF), que emite uma fluorescência verde. Essa fluorescência pode ser detectada usando microscopia fluorescente. As células podem ser visualizadas e correlacionadas com o acúmulo de ROS da seguinte forma: (i) células vivas sem ros emitem alta fluorescência azul; (ii) células vivas com acúmulo ros emitem alta fluorescência azul com baixa fluorescência verde; e (iii) células mortas com acúmulo de ROS emitem baixa fluorescência azul com alta fluorescência vermelha e alta verde.
Células de controle e células expostas a 1 J/m2 de UV-C não apresentaram células positivas DCFDA/ROS e PI. O controle não exposto UV-C mostrou manchas nucleares apenas como indicado pela coloração hoechst (Figura 1). No entanto, nenhuma célula positiva pi ou DCFDA foi vista nas células de controle não expostas UV-C(Figura 1).
Células expostas a 100 J/m2 de CÉLULAs UV-C apresentaram células baixas ros e PI positivas. As células primárias da superfície ocular do camundongo após a exposição ao UV-C em uma dose de 100 J/m2 mostraram cerca de 5% de co-coloração de DCFDA e PI, indicando assim a formação de ROS e morte celular em 5% das células(Figura 1).
As células expostas a 1.000 J/m2 de CÉLULAs UV-C apresentaram células positivas ros e PI de 60% a 70%. As células primárias da superfície ocular do camundongo após a exposição ao UV-C em uma dose de 1.000 J/m2 mostraram cerca de 70% de co-coloração de DCFDA e PI, indicando assim a formação de ROS e morte celular em 70% das células(Figura 1).
Células expostas a 10.000 J/m2 de UV-C apresentaram células positivas 100% ROS e ~100% de morte celular. A maior dose UV-C (10.000 J/m2) quando exposta às células primárias oculares do rato resultou em 100% de morte celular (células positivas de PI) e formação ROS (coloração DCFDA), indicando assim a maior letalidade desta dose UV-C particular(Figura 1).
As células tratadas com 1 J/m2 de radiação UV-C não apresentaram nenhum acúmulo de ROS e a porcentagem de células vivas nesta dose era comparável com a das células de controle. As células demonstraram uma quantidade significativa de morte celular e acúmulo de ROS a 100 J/m2. A maior quantidade de acumulação ros e morte celular foi observada em células tratadas com 10.000 J/m2 de radiação UV-C.
Os resultados quantificados (percentual de geração ros e percentual de morte celular conforme a fórmula dada a seção 6.3) foram traçados na forma de um gráfico de barras (Figura 2). O eixo X representa as doses UV-C, enquanto o eixo Y representa a porcentagem de células. A barra verde representa a porcentagem de ROS, e as barras vermelhas representam a morte celular em diferentes doses de radiação UV-C (Figura 2). O percentual de ROS e células mortas foram da ordem de 0%, 0%, 10%, 70% e 100% nas doses UV-C: controle não exposto, 1 J/m2, 100 J/m2, 1.000 J/m2 e 10.000 J/m2,respectivamente (Figura 2).
Figura 1: Imagens compostas de células ao vivo das células primárias da superfície ocular do mouse expostas a várias doses de UV-C (controle não exposto, 1.100, 1.000, 10.000 J/m2). Estas imagens foram capturadas diferentes filtros: campo brilhante (para morfologia celular), azul (mancha nuclear de Hoechst), verde (geração ROS) e vermelho (células mortas manchadas de iodeto de propídio). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Gráficos de barras mostrando os resultados de quantificação obtidos após calcular a porcentagem de geração ros e porcentagem de células mortas após a exposição de células de superfície ocular do rato primário a várias doses de radiação UV-C. O eixo X representa as doses UV-C, enquanto o eixo Y representa a porcentagem de células. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
| Componente | Volume |
| 10% Soro bovino fetal contendo DMEM | 9790 μL |
| Solução de ações DCFDA | 5 μL |
| Solução de ações hoechst 33342 | 5 μL |
| Solução de estoque de iodeto de propídio | 200 μL |
Tabela 1: Reagentes necessários para a elaboração da solução de coloração.
| Problema | Razões prováveis | Solucionando problemas | Comentários |
| Não ou muito pouca ros ou pi células positivas são manchadas quando as células foram tratadas com dose UV alta a mais alta | i. Uso de uma velha solução de coloração. | i. Use solução de coloração recém-preparada. | i. Solução de coloração preparada anteriormente leva a manchas inadequadas das células. |
| ii. Prato de cultura de sobrefluente resultando em resgate de danos uvc pelas células. | ii. Prato apenas 0,2 milhões de células em cada prato de cultura celular de 35 mm e nunca permite que as células cresçam por mais de 12 h antes de expô-las a doses de UVC. | ii. As células de sobrefluentepodem salvar danos uvc, e, portanto, nenhuma ou pouca ros e PI células positivas serão visualizadas. |
Tabela 2: Solução de problemas.
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Discussion
O método de coloração DCFDA descrito aqui permite a visualização de ROS em células vivas oculares primárias do camundongo tratadas com radiação UV-C. Uma vantagem desse método de coloração é que ele também permite que os pesquisadores estudem os efeitos imediatos da UV-C (3 horas após a exposição ao UVC) nas células vivas e sua enumeração simultânea para a porcentagem de ros positivo, bem como, células mortas. Além disso, como o método de coloração é usado nas células vivas, as células podem ser incubadas ainda mais na mesma mídia por um tempo maior (vários dias) para o estudo dos efeitos atrasados da radiação UV-C. Assim, esse método de coloração permite visualizar a geração ROS (verde) e simultaneamente distinguir as populações vivas, apoptóticas e de células mortas em células vivas um microscópio de fluorescência invertido. No entanto, certas circunstâncias, apesar da antecipação de obtenção de células positivas ros positivas e PI, a visualização pode falhar. Para tais casos, é sugerido solução de problemas(Tabela 2).
Este protocolo deve ser realizado com precisão para obter resultados ideais. Os resultados ideais indicam uma correlação do sinal fluorescente verde emitido/ROS gerado como uma leitura precisa da dose UV-C específica induzida por Danos de DNA. Em outras palavras, para a realização desta etapa, o volume de mídia que está em contato com as células durante a exposição UV-C não deve ser tanto para que a dose UV-C não provoque os danos necessários. Assim, é essencial manter um volume mínimo de mídia, digamos 500 μL por prato de 35 mm, apenas o suficiente para cobrir as células durante a exposição UV-C em todas as doses especificadas. Em segundo lugar, o volume de mídia não deve ser tão pequeno que as células secam durante a exposição uv-C. Finalmente, imediatamente após a exposição das células ao UV-C, as células devem ser cobertas com mídia fresca ao volume ideal (digamos 2 mL), a fim de evitar ainda mais quaisquer danos e geração ROS.
Uma limitação dessa técnica é o tipo de ROS gerado. Outros ensaios adicionais devem ser realizados para detectar o tipo ROS específico em resposta às faixas de dose UV-C. Tais ensaios incluem a avaliação do radical hidroxilo intracelular(• OH),radicais intracelulares de superóxido, espécies intracelulares de nitrogênio reativo, radicais hidroxilos mitocondriais, superóxidos mitocondriais e peróxido de hidrogênio em células vivas usando kits comercialmente disponíveis. Outra limitação dessa técnica é a detectabilidade da geração DE ROS percentual em doses abaixo de 10 J/m2 e acima de 10.000 J/m2. Aparentemente, nenhuma célula ros positiva era visível quando as células primárias/células-tronco da superfície ocular do rato foram expostas a doses UV-C inferiores a 10 J/m2. Pelo contrário, as células positivas ros 100% eram visíveis quando as células foram expostas à dose UV-C acima de 10.000 J/m2. Assim, outros ensaios (por exemplo, análise de enzimas, medição de marcadores de estresse oxidativo, como 8-hidroxideoxyguanosina (8-OHdG) (marcador de dano de DNA), e análise de manchas ocidentais de proteínas de danos de DNA em várias doses) podem ser úteis para entender a extensão/tipo de danos celulares/moleculares em vários níveis. Uma terceira limitação dessa técnica é a correlação das doses UV-C com o ROS gerado em vários tipos celulares. Isso precisa ser validado.
Atualmente, os kits DCFDA estão disponíveis comercialmente para detecção ros usando microscopia ou citometria de fluxo10,11. No entanto, esses kits são caros e não podem ser oferecidos por laboratórios de pesquisa em países restritos a recursos. Assim, este protocolo é muito útil com uma eficiência semelhante aos métodos vendidos comercialmente. Em segundo lugar, incorporamos a mancha de célula sem saída de propídio junto com a geração DCFDA/ROS. Assim, o monitoramento de células vivas de células ros positivas e mortas pode ser realizado simultaneamente usando este método.
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Disclosures
Os autores receberam apoio financeiro da Bio-Rad Laboratories India Private Limited para patrocinar o artigo.
Acknowledgments
Os autores reconhecem o apoio do Centro de Pesquisa Yenepoya, Yenepoya (Considerado Universidade) para as instalações de infraestrutura.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA) | Sigma | D6883 | 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species. |
| Cell culture dish (35 mm) | Eppendorf | SA 003700112 | Sterile dishes for culturing the cells. |
| DMEM High Glucose | HiMedia | AT007 | Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose. |
| Fetal Bovine Serum, EU Origin | HiMedia | RM99955 | One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements. |
| GlutMax | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth. |
| HL-2000 Hybrilinker | UVP | Hybridization oven/UV cross linker | |
| Hoechst 33342 | Sigma | B2261 | Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive. |
| Matrigel | Corning | Basement membrane matrix | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100X) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Used as a supplement to increase the cell growth and viability. |
| Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture. |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170 | Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells. |
| TryplE Express | Thermo Fisher Scientific | Gentle cell dissociation agent | |
| ZOE Fluorescent Cell Imager | Bio-rad |
References
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