Summary
Detta protokoll visar samtidig upptäckt av reaktiva syrearter (ROS), levande celler och döda celler i levande primära kulturer från musokulära ytceller. 2',7'-Diklorfluoresceindiacetate, propidium jodid och Hoechst färgning används för att bedöma ROS, döda celler och levande celler, respektive, följt av bildbehandling och analys.
Abstract
Den okulära ytan utsätts för vanligt slitage på grund av olika miljöfaktorer. Exponering för UV-C-strålning utgör en hälsorisk för arbetsplatsen. Här visar vi exponeringen av primära stamceller från musokulär yta till UV-C-strålning. Reaktiv syreart (ROS) bildning är avläsningen av omfattningen av oxidativ stress/skada. I en experimentell in vitro-miljö är det också viktigt att bedöma andelen döda celler som genereras på grund av oxidativ stress. I den här artikeln kommer vi att visa 2',7'-Diklorfluoresceceindiacetate (DCFDA) färgning av UV-C exponerade mus primära okulär ytstamceller och deras kvantifiering baserat på fluorescerande bilder av DCFDA färgning. DCFDA färgning motsvarar direkt ROS generation. Vi visar också kvantifieringen av döda och levande celler genom samtidig färgning med propidiumjodid (PI) och Hoechst 3332 respektive och andelen DCFDA (ROS positiva) och PI positiva celler.
Introduction
Den okulära ytan (OS) är en funktionell enhet som huvudsakligen består av det yttre lagret och körtelepithelia av hornhinnan, lachrymal körtel, meibomian körtel, bindhinnan, en del av ögonlockmarginaler och innervations som transduce signaler1. Den genomskinliga kupolformade hornhinnans skikt fokuserar ljus på näthinnan. Denna akulärvävnad består av cellulära komponenter såsom epitelceller, keratocyter och endotelceller och acellulära komponenter såsom kollagen och glykosaminoglycans2. Området dräneras av tårar som också levererar de flesta av näringsämnen. Os anatomiska position tvingar den att vara i direkt kontakt med den yttre miljön, vilket ofta utsätter det för olika hårda komponenter som starkt ljus, mikrober, dammpartiklar och kemikalier. Denna faktor predisponerar OS till fysiska skador och gör det benägna att olika sjukdomar.
Oxidativ stress orsakas på grund av obalansen mellan produktionen av reaktiva syrearter (ROS) och endogena antioxidant försvar mekanismer3. ROS klassificeras i reaktiva molekyler och fria radikaler, som båda härrör från molekylärt syre (O2) genom mitokondriell oxidativ fosforylering4. Den tidigare gruppen består av icke-radikala arter som väteperoxid (H2O2), singlet syre(1O2) och den senare omfattar arter som superoxidanioner (O2-) och hydroxylradikaler (•OH), bland annat. Dessa molekyler är biprodukter av normala cellulära processer och deras roller har varit inblandade i viktiga fysiologiska funktioner såsom signaltransduktion, genuttryck och värdförsvar5. En förbättrad produktion av ROS är känt för att genereras som svar på faktorer som patogen invasion, xenobiotika, och exponering för ultraviolett (UV) strålning4. Denna överproduktion av ROS resulterar i oxidativ stress som leder till skador av molekyler som nukleinsyror, proteiner och lipider6.
Naturligt solljus, den mest dominerande källan till UV-strålning, består av UV-A (400–320 nm), UV-B (320–290 nm) och UV-C (290–200 nm)7. Ett omvänt samband mellan våglängden och spektralenergierna har rapporterats. Även om naturliga UV-C-strålning absorberas av atmosfären, avger artificiella källor som kvicksilverlampor och svetsinstrument och utgör därför en yrkesrisk. Symtom på exponering för ögon inkluderar photokeratitis och photokeratoconjunctivit8. Produktion av ROS är en av de viktigaste mekanismerna för att tillfoga UV inducerad cellulära skador9. I den aktuella studien visar vi detektion av ROS med hjälp av 2',7'-Dichlorodifluorescein diacetate (DCFDA) färgning metod i mus primära okulär ytceller / stamceller som exponeras för UV-C. Den gröna fluorescensen fångades med fluorescerande mikroskopi. Celler var motfärgade med två färgämnen, Hoechst 33342 och röd propidium jodid, att färga levande och döda celler, respektive.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experimentet utfördes på primära okulär celler / stamceller som härrör från den schweiziska albino mus öga. Användningen av djur för att skörda ögonen för detta experiment godkändes av Institutional Animal Ethical Committee, Yenepoya (anses vara universitetet) (IEAC-godkännandenummer, 6a/19.10.2016).
1. Beredningar av reagenser
Obs: Härledning av primära celler/stamceller från musokulärt ytan ligger utanför ramen för detta protokoll. Därför visar vi UV-C exponering doser, reagens beredning för att bedöma ROS, levande och döda celler och deras kvantifiering. Se tabell 1 för respektive volym av reagenser (10% fetala nötkreatur serum, DCFDA, Hoechst och propidium jodid lager lösningar som skall läggas till för att få den slutliga färgning lösning).
- Förbered en lagerlösning på 10 mM DCFDA genom upplösning 25 mg DCFDA pulver i 5,13 ml DMSO. Aliquot 250 μL vardera i bärnstensfärgade 1,5 ml rör och förvaras vid -20 °C.
- Förbered en lagerlösning på 10 mg/ml (16,23 mM-lösning) Hoechst 33342 genom att upplösa hela innehållet i 25 mg injektionsflaskan i 2,5 ml avjoniserat vatten. Gör alikvoter på 100 μL i bärnstensfärgade mikrocentrifugrör och förvaras vid 2-6 °C i upp till 6 månader. För längre tid lagring, förvaras vid -20 °C.
- Förbered en stamlösning på 1 mg/ml propidiumjodid i avjoniserat vatten, aliquot 1 mL vardera i bärnstensfärgade 1,5 ml rör och förvaras vid 4 °C.
2. Strålbehandling och UV-C-strålbehandling
- Innan plätering, separera musen primära okulär ytceller isolerade i vårt laboratorium (opublicerade resultat; sådana celler är en blandning av hornhinnans epitel, stromal celler och keratocyter) med hjälp av en mild cell dissociation agent(Table of Materials).
- Platta 0,2 x 106 mus primära okulär ytceller i 35 mm 0,2% källare membran matris belagda cell odlingrätter i 2,5 ml kompletta medier. Inkubera över natten vid 37 °C i en 5% CO2 och fuktad inkubator.
OBS: Kompletta medier för odling av primära celler från musokulär ytan består av DMEM hög glukos som innehåller 20% FBS, 1% Pen-strep, 1% Glutamax, 1% icke-essentiella aminosyra (NEAA), 1% natrium pyruvat och 0,1% β-mercaptoetanol. - Innan du utsätter cellerna för olika doser av UV-C, kasta den maximala volymen av media och låt endast ett tunt lager av media (~ 500 μL) att förbli i kontakt med cellerna, precis tillräckligt för att täcka dem.
- Ta disken, en i taget till UV-C källa / kammare (den nedre kammaren av en hybridisering ugn / UV cross linker; Materialbord). Placera skålen i kammaren och ta bort skålens lock. Skålens öppna lockposition säkerställer att cellerna får den maximala UV-C-dosen under UV-C-exponeringen.
- Exponera cellerna för olika kvaliteter/doser av UV-C: 1 J/m2, 100J/m2, 1 000 J/m2 och 10 000 J/m2.
- Efter UV-C-exponeringen, byt omedelbart ut locket på var och en av disken och ta bort dem från UV-C-källkammaren.
- Ta med var och en av rätterna till laminarluftflödeshuven och fyll på var och en av rätterna med 2 ml färska kompletta medier.
- Inkubera cellerna för 3 h i en 37 °C CO 2-inkubator. Tre timmars inkubation efter UV-C-exponering är optimal för att visualisera och kvantifiera de tidiga effekterna.
3. Beredning av levande cell färgning media
- Förbered färgningsmediet färska under de sista 15 min av 3 h cell inkubation efter UV-C exponering.
- Förvarm 10 ml av färgningsmediet som innehåller 10% FBS-DMEM kompletterad med 1% Pen-Strep till 37 °C.
- Tillsätt 5 μL av 10 mM DCFDA; 5 μL 10 mg/mL Hoechst-lösning och 200 μL 1 mg/ml propidiumjodid. De slutliga koncentrationerna av DCFDA, Hoechst och PI är 5 μM, 5 μg/ml respektive 20 μg/ml, i 10 ml färgningsmedia.
4. DCFDA färgning av UV-C exponerade mus primära okulär celler
- Efter 3 h inkubation av UV-C exponerade mus primära okulärceller vid olika doser, aspirera media från 35 mm rätter.
- Fyll på med 2 ml nyberedda DCFDA-färgningsmedia till var och en av rätterna försiktigt från sidorna.
- Inkubera cellerna med färgningsmedia i 15 min i mörkret i en 37 °C CO 2-inkubator för levande cellfärgning.
5. Visning av DCFDA (ROS), Hoechst och PI färgade celler
- Efter avslutad inkubation, kasta färgningsmediet.
- Lägg till färska kompletta medier till cellerna och observera cellerna under ett inverterat fluorescerande mikroskop/cellavbildare (Materialstabell). Fotografera önskade fält: ljusfält, blå fluorescens, röd fluorescens, grön fluorescens.
OBS: De blå lysrörsfärgade cellerna är kärnorna, den gröna fluorescensen är för ROS-genererande celler och den röda fluorescensen indikerar PI positiva döda celler.
6. Kvantifiering av färgade celler (Hoechst-Blue, PI-Dead och Green-ROS) med hjälp av bildteknik
- Exportera bilderna som tagits under det inverterade fluorescerande mikroskopet/cellavlyssnaren till ImageJ för kvantifiering.
- Öppna var och en av bilderna en i taget, med hjälp av varje kanal (dvs. blå (Nuclei/Hoechst), grön (ROS), röd (Dead / PI positiv)) sekventiellt, för räkning. Börja från den oexponerade kontrollen och sekventiellt flytta till 1, 100, 1000 och 10.000 J /m-2.
- Räkna cellerna med hjälp av cellräkningsverktyget markerat som ett kors i programvarumenyn för vart och ett av fälten [blå positivt (Hoechst positive; nuclei), rött positivt (PI-positiv; döda celler); grönt positivt (ROS)] i var och en av de bilder som motsvarar var och en av de bilder som motsvarar var och en av de bilder som motsvarar var och en av de Behandlingar.
- Räkna genom att klicka på var och en av de specifika signalerna i vart och ett av fälten. Om du till exempel klickar på den blå/Hoechst färgade kärnorna ger det totala antalet kärnor i ett visst fält.
- Beräkna resultaten som procentandel av celldöd av UV-skador (antal PI positiva celler x 100 dividerat med antalet Hoechst positiva celler) och andelen ROS produktion av UV-skador (antal DCFDA positiva celler x 100 dividerat med antalet Hoechst positiva celler).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DCFDA är ett färglöst färgämne som är en kemiskt minskad form av fluorescein som används som en indikator för att upptäcka ROS i celler. Detta färgämne fastnar inuti celler och oxideras lätt till fluorescerande dichlorodihydrofluorescein (DCF), som avger en grön fluorescens. Denna fluorescens kan detekteras med fluorescerande mikroskopi. Cellerna kan visualiseras och korreleras med ROS ackumulering enligt följande: (i) levande celler utan ROS avger hög blå fluorescens; ii) Levande celler med ROS-ansamling avger högblå fluorescens med låg grön fluorescens. och (iii) döda celler med ROS-ansamling avger lågblå fluorescens med hög röd och hög grön fluorescens.
Kontrollceller och celler som exponeras för 1 J/m2 av UV-C uppvisade inte DCFDA/ROS och PI-positiva celler. UV-C oexponerad kontroll visade nukleär färgning endast som anges av Hoechst färgning(figur 1). Emellertid, inga PI eller DCFDA positiva celler sågs i UV-C oexponerade kontrollceller(figur 1).
Celler som exponeras för 100 J/m2 av UV-C uppvisade låga ROS- och PI-positiva celler. Primära celler från musokulär yta vid exponering för UV-C vid en dos av 100 J/m2 visade ca 5% samfärgning av DCFDA och PI, vilket indikerar bildandet av ROS och celldöd i 5% av cellerna(figur 1).
Celler som exponerades för 1 000 J/m2 AV UV-C uppvisade 60–70 % ROS- och PI-positiva celler. Primära celler från musokulär yta vid exponering för UV-C vid en dos av 1.000 J/m2 visade ca 70% co-färgning av DCFDA och PI, vilket indikerar bildandet av ROS och celldöd i 70% av cellerna(figur 1).
Celler som utsätts för 10.000 J /m2 av UV-C uppvisade 100% ROS positiva celler och ~ 100% cell död. Den högsta UV-C-dosen (10 000 J/m2)när den exponerades för musokulära primära celler resulterade i 100% celldöd (PI positiva celler) och ROS-bildning (DCFDA färgning), vilket indikerar den högsta dödligheten i just denna UV-C dos (Figur 1).
Celler som behandlades med 1 J/m2 UV-C-strålning visade inte någon ackumulering av ROS och andelen levande celler i denna dos var jämförbar med kontrollcellernas. Celler visade en betydande mängd celldöd och ROS ackumulering på 100 J/m2. Den högsta mängden ROS ackumulering och celldöd observerades i celler som behandlades med 10 000 J/m2 UV-C-strålning.
De kvantifierade resultaten (procentandel av ROS-generering och procentandel av celldöd enligt de formler som anges i avsnitt 6.3) ritades i form av ett stapeldiagram (figur 2). X-axeln representerar UV-C-doserna medan Y-axeln representerar procentandelen celler. Den gröna stapeln representerar andelen ROS, och de röda staplarna representerar celldöd vid olika doser av UV-C-strålning(figur 2). Andelen ROS och döda celler var i den ordning 0%, 0%, 10%, 70% och 100% vid UV-C doser: oexponerad kontroll, 1 J /m2, 100 J/m2, 1.000 J/m2 och 10.000 J/m2, respektive (Figur 2).
Bild 1: Sammansatta levande cellbilder av musokulära ytan primära celler utsätts för olika doser av UV-C (Oexponerad kontroll, 1, 100, 1000, 10.000 J /m2). Dessa bilder fångades under olika filter: ljusfält (för cellmorfologi), blå (Hoechst nukleär fläck), grön (ROS generation) och rött (propidium jodid färgade döda celler). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Stapeldiagram som visar kvantifieringsresultaten som erhållits efter beräkning av procentandelen ROS-generering och procentandel av döda celler vid exponering av primära musokulära ytceller till olika doser av UV-C-strålning. X-axeln representerar UV-C-doserna, medan Y-axeln representerar procentandelen celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Komponent | Volym |
| 10% Fetalt Nötkreatur Serum som innehåller DMEM | 9790 μL |
| DCFDA lagerlösning | 5 μl |
| Hoechst 33342 lagerlösning | 5 μl |
| Propidium jodid lager lösning | 200 μl |
Tabell 1: Reagenser som krävs för beredning av färgningslösning.
| Problem | Sannolika skäl | Felsökning | Kommentarer |
| Inga eller mycket små ROS eller PI positiva celler färgas när cellerna behandlades med hög till högsta UV-dos | i. Användning av en gammal färgningslösning. | i. Använd nyberedd färgningslösning. | i. Tidigare beredd färgninglösning leder till felaktig färgning av cellerna. |
| ii. Överkonfluentkulturrätt som resulterar i bärgning av UVC-skador av cellerna. | ii. Platta endast 0,2 miljoner celler i varje 35 mm cell odling skålen och aldrig låta cellerna att växa i mer än 12 h innan utsätta dem för UVC doser. | ii. Overconfluent celler kan rädda UVC skador, och därmed ingen eller liten ROS och PI positiva celler kommer att visualiseras. |
Tabell 2: Felsökning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DCFDA färgning metod som beskrivs här möjliggör visualisering av ROS i mus primära okulär levande celler behandlas med UV-C strålning. En fördel med denna färgning metod är att det också tillåter forskarna att studera de omedelbara effekterna av UV-C (3 timmar efter UVC exponering) på levande celler och deras samtidiga uppräkning för andelen ROS positiva, liksom, döda celler. Dessutom, eftersom färgningsmetoden används på levande celler, cellerna kan ytterligare inkuberas i samma media under en längre tid (flera dagar) för studier av fördröjda effekter av UV-C-strålning. Därför gör denna färgningmetod det möjligt att visualisera ROS-generationen (grön) och samtidigt skilja levande, apoptotiska och döda cellpopulationer i levande celler under ett inverterat fluorescensmikroskop. Men under vissa omständigheter, trots förväntan om att få ROS positiva och PI positiva celler, visualiseringen kan misslyckas. För sådana fall föreslås felsökning (tabell 2).
Detta protokoll måste utföras korrekt för att uppnå optimala resultat. Optimala resultat indikerar en korrelation mellan den gröna lysrör som avges/ROS som genereras som en korrekt avläsning av den specifika UV-C-dosen inducerad DNA-skada. Med andra ord, för att utföra detta steg, bör volymen av media som är i kontakt med cellerna under UV-C-exponeringen inte vara så mycket så att UV-C-dosen inte framkallar den nödvändiga skadan. Därför är det viktigt att hålla en minimal volym av media, säger 500 μL per 35 mm maträtt, precis tillräckligt för att täcka cellerna under UV-C exponering vid alla angivna doser. För det andra bör medievolymen inte vara så liten att cellerna torkar upp under UV-C-exponering. Slutligen, omedelbart efter exponeringen av cellerna till UV-C, cellerna bör fyllas på med färska medier till den optimala volymen (säg 2 ml), för att ytterligare undvika eventuella skador och ROS generation.
En begränsning av denna teknik är den typ av ROS genereras. Andra ytterligare analyser måste utföras för att upptäcka den specifika ROS-typen som svar på UV-C-dosintervallen. Såsom bland annat inkluderar bedömningen av de intracellulära hydroxylradikalerna (•OH), intracellulära superoxidradikaler, intracellulära reaktiva kvävearter, mitokondriellhydroxylradikaler, mitokondriella superoxider och väteperoxid i levande celler med kommersiellt tillgängliga kit. En annan begränsning av denna teknik är detekteringsbarheten hos den procentuella ROS-generationen vid doser under 10 J/m2 och över 10 000 J/m2. Tydligen var inga ROS positiva celler synliga när de primära cellerna / stamceller från musokulär ytan exponerades för UV-C doser mindre än 10 J /m2. Tvärtom var 100% ROS positiva celler synliga när cellerna exponerades för UV-C dos över 10.000 J /m2. Därför kan andra analyser (t.ex. enzymanalys, mätning av oxidativstressmarkörer som 8-hydroxydeoxyguanosin (8-OHdG) (DNA-skademarkör) och västra blotanalys av DNA-skadeproteiner vid olika doser) vara användbara för att förstå omfattningen/typen av cellulära/molekylära skador på olika nivåer. En tredje begränsning av denna teknik är korrelationen mellan UV-C-doserna till ROS som genereras över olika celltyper. Detta måste valideras.
För närvarande dcfda kit finns kommersiellt för ROS upptäckt antingen med hjälp av mikroskopi eller flöde cytometri10,11. Sådana kit är dock dyra och kan inte ges av forskningslaboratorier i resursbegränsade länder. Därför är detta protokoll mycket användbart med en effektivitet som liknar de kommersiellt sålda metoderna. För det andra har vi införlivat propidium jodid död cell fläck tillsammans med DCFDA / ROS generation. Därför kan levande cellövervakning av ROS positiva och döda celler utföras samtidigt med denna metod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författare fick stöd från Bio-Rad Laboratories India Private Limited för att sponsra artikeln.
Acknowledgments
Författarna erkänner stöd från Yenepoya Research Centre, Yenepoya (anses vara universitet) för infrastrukturanläggningar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA) | Sigma | D6883 | 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species. |
| Cell culture dish (35 mm) | Eppendorf | SA 003700112 | Sterile dishes for culturing the cells. |
| DMEM High Glucose | HiMedia | AT007 | Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose. |
| Fetal Bovine Serum, EU Origin | HiMedia | RM99955 | One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements. |
| GlutMax | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth. |
| HL-2000 Hybrilinker | UVP | Hybridization oven/UV cross linker | |
| Hoechst 33342 | Sigma | B2261 | Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive. |
| Matrigel | Corning | Basement membrane matrix | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100X) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Used as a supplement to increase the cell growth and viability. |
| Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture. |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170 | Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells. |
| TryplE Express | Thermo Fisher Scientific | Gentle cell dissociation agent | |
| ZOE Fluorescent Cell Imager | Bio-rad |
References
- Gipson, I. K. The ocular surface: the challenge to enable and protect vision: the Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).
- Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmoogy. 66 (2), 190-194 (2018).
- Betteridge, D. J.
- Ray, P. D., Huang, B. W., Tsuji, Y. Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling. Cell Signaling. 24 (5), 981-990 (2012).
- Nita, M., Grzybowski, A. The Role of the Reactive Oxygen Species and Oxidative Stress in the Pathomechanism of the Age-Related Ocular Diseases and Other Pathologies of the Anterior and Posterior Eye Segments in Adults. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3164734 (2016).
- Covarrubias, L., Hernandez-Garcia, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregon, S. Function of reactive oxygen species during animal development: passive or active. Developmental Biology. 320 (1), 1-11 (2008).
- Behar-Cohen, F., et al. Ultraviolet damage to the eye revisited: eye-sun protection factor (E-SPF(R)), a new ultraviolet protection label for eyewear. Clinical Ophthalmology. 8, 87-104 (2014).
- Izadi, M., Jonaidi-Jafari, N., Pourazizi, M., Alemzadeh-Ansari, M. H., Hoseinpourfard, M. J. Photokeratitis induced by ultraviolet radiation in travelers: A major health problem. Journal of Postgraduate Medicine. 64 (1), 40-46 (2018).
- de Jager, T. L., Cockrell, A. E., Du Plessis, S. S. Ultraviolet Light Induced Generation of Reactive Oxygen Species. Advances in Experimental Medicine and Biology. 996, 15-23 (2017).
- Degl'Innocenti, D., et al. Oxadiazon affects the expression and activity of aldehyde dehydrogenase and acylphosphatase in human striatal precursor cells: A possible role in neurotoxicity. Toxicology. 411, 110-121 (2019).
- Li, Z., et al. APC-Cdh1 Regulates Neuronal Apoptosis Through Modulating Glycolysis and Pentose-Phosphate Pathway After Oxygen-Glucose Deprivation and Reperfusion. Cellular and Molecular Neurobiology. 39, 123-135 (2019).
