Summary
Detta protokoll beskriver en ursprunglig inställning som kombinerar spektral-och fluorescenslivstids mätningar för att utvärdera Förster resonans energiöverföring (FRET) mellan rhodamine-baserade fluorescerande sonder och lignin polymer direkt i tjocka Plant sektioner.
Abstract
I lignocellulosa biomassa (lb), aktiviteten av enzymer begränsas av uppkomsten av icke-specifika interaktioner med lignin under hydrolys processen, som upprätthåller enzymer långt från deras substrat. Karakterisering av dessa komplexa interaktioner är därför en utmaning i komplexa substrat såsom LB. Metoden här mäter molekylära interaktioner mellan fluorophore-märkta molekyler och infödda autofluorescent lignin, som ska avslöjas av Förster resonans Energy Transfer (FRET). I motsats till FRET mätningar i levande celler med hjälp av två exogena fluoroforer, FRET mätningar i växter som använder lignin är inte trivialt på grund av dess komplexa autofluorescence. Vi har utvecklat en ursprunglig förvärvs-och analyspipeline med korrelerad observation av två kompletterande egenskaper för fluorescens: fluorescensutsläpp och livslängd. sFLIM (Spectral och fluorescerande livstid Imaging Microscopy) ger kvantifiering av dessa interaktioner med hög känslighet, avslöjar olika interaktions nivåer mellan biomolekyler och lignin.
Introduction
Hydrolyzing lignocellulosa till monomersocker såsom glukos kräver enzymer. Deras verksamhet är känd för att hindras av inrättandet av icke-specifika interaktioner mellan enzymer och lignin1,2, densenare är en hydrofob polymer och en viktig beståndsdel i lignocellulosa3. Sålunda, kvantitativt mäta sådana interaktioner direkt på cell skalan är en utmaning som måste åtgärdas för att optimera enzym katalytisk aktivitet och lignocellulosa förbehandling4.
Förster (eller Fluorescence) resonans energiöverföring (FRET) mätning är en metod för att välja att åsnor biomolekyler interaktion in situ. Denna icke strålningsenergi överföring kan uppstå mellan en givare och en acceptor fluorophore om de uppfyller olika villkor. Givar spektrumet för utsläpp måste, åtminstone delvis, överlappa det acceptorer som är magnetiseringen. Valet av fluoroforer är således avgörande för sådana experiment. Därefter minskar överföringen effektivitet med den sjätte kraften av deras avstånd5 och endast uppstår om båda molekylerna är i nära närhet (typiskt i nanometer Range). Andra oförutsedda händelser kan förändra överföringen effektivitet såsom dipole-dipole orientering men mildras om fluoroforer har flexibilitet.
FRET kan mätas med olika tekniker och detaljerade beskrivningar finns i litteraturen6,7. I korthet förlitar sig de huvudsakliga metoderna på: i) sensibiliserade utsläpp där variationen i acceptorns emissions fluorescens följs och ger huvudsakligen kvalitativa resultat. II) acceptor photoblekning där givaren emissions fluorescens mäts före och efter acceptor photoblekning (i detta fall, mer exakt FRET uppskattningar kan uppnås men kräver stark lasereffekt tillämpas på fasta prover); och III) livstids mätning som minskar för givaren i närvaro av acceptorn. Denna metod kräver specifika instrument och möjliggör precisa och känsliga interaktions mätningar mellan fluoroforer. Med tanke på bandet mätning mellan fluorescerande sonder och lignocellulosa, är den största svårigheten att lignocellulosa är inte en enda väl kännetecknas fluorophore: den har en stark infödda och spektralt hela autofluorescence, främst från lignin, och beroende av biomassa arter8,9.
I detta dokument föreslår vi ett nytt och originellt förfarande anpassat till delar av trä-/växtprover. Denna sFLIM baserad metod öppnar vägen till kvantitativa FRET mätningar mellan fluorescerande sonder och lignin i inhemska lignocellulosa prover.
Protocol
1. provberedning
Anmärkning: successiva steg för att förbereda proverna beskrivs i figur 1.
- Beredning av växtprover
- Från trä stammar eller fragment, skära 1 cm långa prover med rakblad utan att skada deras struktur.
- Bädda in prover i polyetylenglykol (PEG) medium, genom att doppa dem i successiva lösningar av ökande PEG koncentration utspädd i vatten tills de når 100% PEG.
- Placera provet under vakuum för att avlägsna vatten.
- Försiktigt rör prover i 30% v/v PEG för 24 h.
- Försiktigt rör prover i 50% v/v PEG för 24 h.
- Försiktigt rör prover i 100% PEG för 24 h vid 70 ° c (ren pinne är fast vid rumstemperatur).
- Placera proverna i kapslar vid 70 ° c (på en värmeplatta) och sänk gradvis ned temperaturen tills den når rumstemperatur.
- Förbered noga 30-60 μm tjocklek platta sektioner från dessa PEG block med en mikrotom och engångsartiklar blad.
- Samla och tvätta sektioner i tre på varandra följande badvatten i 5 min för att ta bort PEG från sektionerna.
- Fluorescerande sond beredning
- Bered buffertlösning på 30 mM fosfat vid pH 6,0.
- Väga PEG rhand dextran rodamin sond pulver.
- Lös upp sond pulvret i bufferten med kontinuerlig omrörning i en injektionsflaska av glas för 1 h i mörker vid en slutkoncentration på 0,1 g/L.
- Färgning av växtprover
- Inkubera sektioner med 500 μL av den fluorescerande sonden (se 1.2.3) för 72 h (ingen omrörning) i ett plaströr (högst 3 sektioner per tub) i mörker.
- Plocka upp ett avsnitt med en borste, adsorberat bufferten med ett rent ark (Undvik torkning av avsnittet) och montera sedan de inkuberade sektionerna mellan ett täckglas och en #1.5H täckplåt.
2. fluorescens livstid och spektrala mätsystem kalibrering
Obs: det kompletta arbetsflödet för sFLIM-mätning presenteras i figur 2.
- Bestäm den spektrala fönsterbredden på sFLIM-detektorn.
- Sätt urea kristaller i en kultur låda med en 0,17 μm glasbotten.
- Placera kultur boxen på ett Mikroskop provhållare och välj 20x mål.
- Välj en TI: sa-laser med en 900 nm våglängd och 2% effekt, och slå på skanningen.
- Samla in den andra harmoniska signalen på sFLIM-detektorn.
Anmärkning: den andra harmoniska signalen avges vid exakt halva excitation våglängd av 450 nm; även momentant, detta mått ger också instrumentella responsfunktion av systemet. - Gradvis justera laser excitation våglängd från 900 till 980 nm tills den andra harmoniska signalen samlas i den andra spektralkanalen (462,5 nm).
- Bestäm spektralfönstrets längd (12,5 nm).
- Om spektralintervallet skiljer sig från vad som förväntas, felsöka genom att göra följande.
- Justera lasern till 910 nm.
- Flytta gallerpositionen med ett rullningshjul för att mäta den andra harmoniska signalen endast på den första kanalen (första kanal gränsen).
- Justera lasern till 935 nm.
- Flytta gallerpositionen med ett rullningshjul för att mäta den andra harmoniska signalen på den första kanalen (den andra kanal gränsen).
- Kalibrering av de övergripande spektrometerkanalerna
- För in spegeln på Mikroskop stadiet.
- Välj den synliga kontinuerliga lasern (458 nm, 1% effekt).
- Samla in reflektions signalen på sFLIM-detektorn och kontrollera om fotoner mäts i lämplig spektralkanal.
- Upprepa steg 2.2.2 och 2.2.3 med alla tillgängliga kontinuerliga lasrar (514 nm, 561 nm och 633 nm).
- Om spektralkanalen skiljer sig från vad som förväntas, flytta gallerpositionen med rullningshjulet och upprepa steg 2,1 och 2,2.
3. exempel på fluorescenskarakterisering
- I en Spektrofluorometer utrustad med ett tillbehör till filmhållaren (t. ex. JASCO FP-8500 instrument), placera växt sektionens prov (inte inkuberas med den fluorescerande sonden).
- Mät fluorescensutsläpp typiskt på området 300-600 Nm medan spännande provet typiskt på intervallet 250-550 Nm.
- Rita fluorescensintensiteten kontra excitation och emissions våglängder för att dra en 3D-fluorescenskarta.
- Bestäm den maximala excitation/utsläpp område från observationsområdet.
4. spektrala bandet mätning
- Autofluorescenskalibrering
- Välj mål 20x (NA: 0,8).
- Ställ in två-Photon laser excitation vid 750 nm.
- Placera vete halm (WS) ensam växt sektion mellan bilden och täckglaset.
- Använd följande parametrar i programvaran. Växla till lambda-läge. Välj spektraldetektor ChS med en 9,7 nm-upplösning. Välj spektralområdet mellan 420 och 722 nm.
- Hämta bilden.
- Bestäm donatorns utsläpps topp (470 nm med denna inställning).
- Acceptors kalibrering
- Placera rhodamine-baserade fluorescerande sonder i en kultur låda med en 0,17 μm glasbotten.
- Hämta bilden med samma inställning.
- Bestäm den acceptor emission Peak (570 nm med denna inställning).
- Bestäm spektralområdet med den maximala "WS Alone"-signalen och ingen acceptor-signal som givaren endast emission för sFLIM-mätningar (460-490 nm med denna inställning).
- Provmätning
- Placera den färgade Plant sektionen mellan bilden och täckglaset.
- Hämta bilden med samma inställning.
- Spara lsm-filen.
- Förknippar kvalitativt en stark FRET händelse med en minskning av givaren utsläpp topp jämfört med "WS Alone prov" och en ökning av acceptor utsläpp topp jämfört med rodamin provet.
5. sFLIM mätningar
Obs: för sFLIM setup, är det system som används en tidsdomän sFLIM setup som beskrivs tidigare10. Ett upprätt Mikroskop och olika tid korrelerade enstaka foton räkna kort och konfokala Mikroskop tillverkare kan användas och protokollet bör anpassas i enlighet med detta.
- Växla systemet till sFLIM-läge.
- Ställ in det konfokala mikroskopet enligt beskrivningen i 4.1.1 och 4.1.2.
- Växla till det icke-Avbebrända läget i programvaran för att skicka fluorescerande fotoner till sFLIM-detektorn.
- Ställ in sFLIM-anskaffningen i Aktivera läge för att tillåta att fotonen räknar på SPC150.
- Välj 30 s tids samling på SPC150.
- Kontrollera att CFDN är mellan 1 x 105 och 1 x 106.
Varning: se till att antalet fotoner som mäts på TCSPC-kortet alltid är mindre än 1% av laserexciteringsfrekvensen (i denna inställning är laser magnetiseringen frekvensen 80 MHz och detekterings hastigheten kan inte överstiga 800 kHz i någon pixel för att undvika en uppstapel effekt11).
- Placera "WS Alone" plant avsnitt mellan bilden och täckglaset.
- Ställ in programvaran i kontinuerligt läge för att tillåta laserskanning.
- Välj mätområde på provet.
- Klicka på Start på SPC150.
- Spara SDT-filen.
- Upprepa processen för minst 10 prover per tillstånd.
- Placera den färgade Plant sektionen mellan bilden och täckglaset.
- Upprepa steg 5.2.1-5.2.5.
6. sFLIM-analys
- Välja sFLIM datan förvärvat arkivera på "WS ensam" och importera dem till SPCImage mjukvaran användande arkivera | Importera.
- Välj Anpassa parametrar.
- Från option | Modell, Välj ofullständig multi-exponentials: 12,5 ns.
- Från option | Inställningarväljer du Beräkna instrumentalt svar automatiskt.
- I huvudpanelens högra meny väljer du 2 exponentiell passform:
- För varje kanal använder du monterings modellen och sparar lämpliga parametrar i ett kalkylblad (a1, a2, t1, t2).
- För jämförelse mellan kanaler och experiment beräknar du medelvärdet för fluorescenslivstiden i ett kalkylblad (Tm):
- Beräkna den genomsnittliga livstiden för alla prover (minst 10) i alla kanaler.
- Analysera Tm på givar kanaler (från kanal 1 till 3:460-490 nm) och Bestäm den dedikerade kanalen (kanal 2 som motsvarar 467,5-480 nm) som visar det högsta fotontalet och motsvarar lignins maximala utsläpp. Värden från kanal 2 måste användas i steg 6,7.
- Välj sFLIM data förvärvade filen på färgade WS och importera dem till SPCImage programvaran.
- Upprepa steg 6.1-6.4.
- Beräkna bandet effektivitet Efret för givaren i den tidigare valda kanalen WS Alone (tMD) och från målat Plant prov (tmDA):
- Jämför sFLIM och EFRET värden mellan WS och provet.
- Överväg en positiv EFRET samband med en homogen livstid minskning mellan WS och provet som ska analyseras som en FRET händelse (se representativa resultat och verk av SPRIET et al.12 och terryn et al.10 för detaljer).
- Överväg en livstids minskning fördelas annorlunda bero på en blandning av FRET och lignin kompaktionsnivå och inte tolkar som molekylära interaktioner.
- Överväg ingen livstid modifiering som frånvaro av mätbara FRET signal, men inte som en brist på interaktion med lignin
Representative Results
För att demonstrera sflim förmåga att dissekera molekylära interaktioner mellan lignin och fluorescently-märkta molekyler, använde vi först tre olika prover (figur 3): infödda vete halm (WS), infödda vetestrå inkuberas med PEG märkta med rodamin (PR10), och infödda vete halm med dextran märkta med rodamin (DR10). PR10 är känt för att interagera med lignin medan DR10 är tänkt att vara inert13,14,15. sFLIM kurvor (figur 3, överst) visar några ändringar som kan uppnås mellan referensprovet (WS) och två interaktions fall (DR10 och PR10). I själva verket kan man först lätt märka fluorescensförhöjningen i spektralområden som motsvarar rodamin emissions område. Noggrann observation av de tre första kanal Photon Decay kurvor avslöjar också en starkare böjning för DR10 än för PR10. Efter montering av foton förfall kurvor och beräkna varje kanal medelvärdet fluorescens livstid, bandet signaturen blir mer uppenbar (figur 3, botten). Medan fluorescenslivstiden alternativt ökar och minskar längs fluorescensspektrat för WS-provet, observeras en tydlig FRET signatur för både PR10 och DR10 med: 1) ett konstant livstidsvärde i den givar bara emissions kanalen (3 första kanalerna, i blått). och 2) en ökande fluorescenslivstid i spektralkanalen som motsvarar ett ökat bidrag från den höga livslängden för donatorfluorophore.
När entydiga FRET har fastställts, jämförelse av lignin fluorescens livstid (kanal 2) möjliggör kvantifiering av livslängden minska mellan WS (0,47 NS), DR10 (0,42 NS) och PR10 (0,36 NS) och därmed, avslöjar molekylära interaktioner mellan lignin och både PR10 och DR10 med en starkare affinitet för PR10.
För att illustrera relevansen av denna metod för att kvantifiera olika interaktions nivåer, vi väljer tre andra prover, imitera enzym tillgänglighet vid behandlade anläggningen prover: Acid-behandlade WS (AWS), i kombination med PR av två kontrasterade molekylvikter på 5 kDa och 20 kDa (PR5 och PR20). Efter noggrann inspektion av sFLIM-signaturer extraheras livslängden för lignin-fluorescens (figur 4). Som tidigare nämnts kan ligninfluorescenslivstiden ändras genom sin omgivning16,17. Efter syrabehandling, fluorescens livstid åtgärder i AWS (0,28 NS) blir lägre än tidigare mätt för WS (0,47 NS), som bekräftar kravet på sFLIM förfarande för entydig tolkning av livstid minskning och behovet av negativa kontroller för varje testad villkor. Som förväntat observeras en stark livstid minskning när du lägger till PR till AWS medan den interagerar med lignin. Vidare, interaktionen är starkare med PR5 (0,14 NS) jämfört med PR20 (0,16 NS), vilket är förenligt med deras hydrodynamiska radie mätning (2,3 nm och 4,8 nm för PR5 och PR20, respektive), inducera olika sterisk begränsningar och därmed högre tillgänglighet av PR5 till lignin.
Båda experimenten visar relevansen av denna metod för att fint bedöma lignininteraktioner med enzymer, beroende på deras storlek och på växtprover förbehandling.
Figur 1: olika berednings steg för proverna. Vete halm (WS) (a) reduceras först i storlek (B) för att bäddas in i PEG medium (C). Blocket skärs med en mikrotom som är försedd med engångsblad (D). Efter tvättning, resulterande avsnitt (E) är placerade för inkubering i PEG eller dextran märkta-rhodamine lösning (F). Märkta sektioner är monterade för sFLIM-mätningar (G). Skalstreck är 2 cm (A), 1 cm (B och C), 200 μm (E och G). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: komplett arbetsflöde av spektralbandet-baserade interaktioner mätningar. Figuren visar inställningen som kombinerar spektralfluorescensintensitet och livstids mätningar. Spektralfluorescensbilder förvärvas med ett konfokalmikroskop, och sekventiellt fluorescens livstider för varje spektralområde mäts med hjälp av s-detektorn. Analys av fotonsönderfalls kurvor möjliggör noggrann bestämning av interaktioner mellan provet och molekyler av intresse. Kalibreringar måste bearbetas för att undvika artefakter. Först måste sFLIM detektorn vara spektralt kalibrerad och dess instrumentella responsfunktion måste kontrolleras. För det andra måste den komplexa autofluorescenssignalen kalibreras exakt för varje prov för att bestämma fluorescenslivstiden i varje kanal innan en acceptormolekyl har tillsats. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa sFLIM-mätningar. sflim kurvor (övre panelen) förvärvades på infödda vete halm (WS), WS inkuberas med PEG märkta med rodamin (WS + PEG) och infödda vete halm med dextran märkta med rodamin (WS + DEX). För varje prov var sFLIM-kurvor försedda med en bi-exponentiell sönderfalls modell och medelvärdet för fluorescensen beräknades för varje kanal (botten panel). WS + PEG-och WS + DEX-prover uppvisar en minskning av fluorescenslivstiden i den kanal som endast motsvarar autofluorescens (tre första staplar) som associeras med en livstids ökning i kanal som motsvarar en blandad emission av autofluorescence och rhodamine. Detta beteende är kännetecknande för en FRET händelse mellan lignin och rhodamine-märkta molekyler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: analys av Fluorescenslivstiden för den kanal som motsvarar lignin autofluorescens. Efter validering av en FRET händelse baserad på sFLIM signatur, medelvärdet fluorescens livstid mättes på Acid-behandlade WS (AWS), i kombination med PR5 eller PR20 (5 kDa och 20 kDa, respektive). Medan båda PR-proverna uppvisar en livstids minskning, kännetecknas den mindre av en starkare livstids reduktion, vilket avslöjar en starkare molekylär interaktion med lignin. Metoden är således känslig nog att skilja mellan båda (medelvärde och standardfel representeras, n > 10 per villkor). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Korrelering av fluorescenslivstiden och mätningar av utsläpps spektrum gör det möjligt att kombinera fördelar med båda metoderna. Faktum är att spektralmätningar enbart saknar känslighet och förblir kvalitativa. Å andra sidan, fluorescens livstid är den metod för val för traditionella kvantitativa FRET mätningar, men det visades att lignin autofluorescence kan variera beroende på lignin sammansättning och miljö16. Således kan lignin interaktioner med en acceptor eller lignin strukturella förändringar inte diskrimineras eftersom de båda resulterar i en livstid minskning. Som visats ger den utvecklade metoden entydig, känslig och kvantitativ mätning av interaktioner mellan lignin-och acceptormolekyler i växt sektioner. Även om de olika stegen i metoden rigoröst optimerats, måste försiktighet iakttas särskilt för följande punkter.
När det gäller proverna är kvaliteten på anläggningen avsnitt avgörande för att säkerställa i-fokus avbildning. De olika stegen för PEG inbäddning bör strikt följas. Det slutliga tvättsteget är viktigt för att säkerställa att inga störningar från PEG kvar i proverna. Dessutom bör buffertkoncentrationen och pH-värdet hållas strikt identiska för alla mätningar, eftersom alla förändringar kan ha en stark inverkan på fluorescensegenskaper.
Livstids mätning kan också vara delikat. Fluorescensens livstid för givaren kan vara instabil, till exempel på grund av en hög excitation. I ett sådant fall, tuning lasern makt och zoom kan åtgärda problemet. En annan välkänd källa till artefakter i TCSPC mätningar är Photon Pulse Pile-up. I själva verket kan TCSPC inte mäta hastigheten på två fotoner som avges mellan samma två laserpulser. Medan växtprover är mycket strukturerade, fluorescens är inte homogen och kan leda till en dold puls pileup effekt. Medan antalet fotoner per sekund förblir under 1% excitation gränsen, det kan vara högre i vissa provområden. För att säkerställa inga pileup experiment, mäta givarens fluorescens livslängd vid en annan Photon Flux kan övervägas. Om livslängden ökar medan flödet minskar, ändrar en pileup-effektmätningar. Optimal Photon Flux uppnås med givarens livstid stabilitet.
När det gäller sFLIM Decay kurva analys, rekommenderar vi att förlita sig på varje individuell kurva passar för att säkerställa att modellen korrekt beskriver mätningar. Om så inte är fallet, se först till att ingen av de tidigare nämnda artefakterna har skadat data. Steg 2.1.4 ger sedan den instrumentella responsfunktionen (IRF) i systemet. Om IRF presenterar vissa avvikelser, optimera den optiska vägen för att minimera dem. En uppmätt IRF för montering under steg 6,2 kan också användas. Slutligen kan montering modellens frihetsgrader ökas till en tre-exponentiell sönderfall i steg 6,2. Emellertid, antalet fotoner som krävs för individuell livstid och andel bestämning är hög och det är därför rekommenderas endast använda dem för att uppnå en stabilare medellivstid från steg 6,4. Mer uttömmande information om FLIM, dess karakterisering18, sflim och dess tillämpning12 särskilt lignin10, finns i litteraturen.
Även utmanande, FRET mätning i växt vävnader med infödda autofluorescence visar några fördelar. I jämförelse med FRET mätningar som utförs på levande vävnader där interaktionsstudier mellan biomolekyler ofta kräver genteknik för att uttrycka inneboende fluorescerande markörer, lignifierade växt vävnader som de som presenteras här, erbjuder naturliga autofluorescence, och extrinsic partner fluorescerande sonder kan enkelt läggas, spara mycket tid. Emellertid, beroende på den analyserade växtarter och på eventuella pre-behandlingar som utförs, autofluorescence kommer sannolikt att ändras, så att den måste noggrant kännetecknas och fluorophore används som sonder kan behöva anpassas.
SFLIM-metoden måste appliceras på fluorescerande prober som saknar katalytisk aktivitet (PEG och dextran). Inom ramen för växtlignocellulosa hydrolys, interaktioner av enzymer i olika biomassa prover kan utföras, möjligen resulterar i bestämning av effekterna av lokalisering (celler och vävnader) på interaktions styrka. Nästa optimerings steg kommer att vara automatisering av analys steget. Med tillräckligt analyserade data skulle en maskininlärningsbaserad ANALYSPROCEDUR kunna användas för automatiserad fenotyp analys, vilket skulle öka dess mottaglighet för snabb screening för effektiv enzym biomassa. Dessutom kräver sFLIM inte fixering av provet och kan enkelt appliceras på dynamiska enzym-lignin interaktionsstudier. En sådan unik metod är sannolikt att vägleda enzym Engineering strategi och biomassa förbehandling för att optimera lignocellulosa valorization.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Fanny Laurent (FARE) är varmt tackade för utarbetandet av siffrorna. Forsknings federationen FRABio (universitetet i Lille, CNRS) erkänns för att tillhandahålla den tekniska miljö som bidrar till att uppnå detta arbete. Finansiering erhölls från Frankrikes nationella forsknings byrå (LIGNOPROG-projektet ANR-14-CE05-0026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscope | ZEISS | LSM 710 NLO | for confocal imaging |
| fine brush | to collect sections | ||
| glass vials | for incubations | ||
| high precision microscope cover glasses 170+/-5µm n°1,5# | Marienfeld | 0107032 | saled by Dutscher s.a in France |
| Infra-red pulsed laser | COHERENT | CHAMELEON VISION | For sample excitation |
| Micropipette Research Plus monocanal 20-200µL | Eppendorf | with corresponding tips | |
| Micropipette Research Plus monocanal 2-20µL | Eppendorf | with corresponding tips | |
| Microscope slides ca. 76 x 26 mm ground edges frosted end | Thermo Fisher Scientific | LR45D | |
| microtome blades disposable (pack of 50) | Agar Scientific | T5024 | saled by Oxford Instruments in France |
| mPEG-Rhodamine, 10 kDa | Creative Peg Works | PSB-2263 | |
| mPEG-Rhodamine, 20 kDa | Creative Peg Works | PSB-22642 | |
| mPEG-Rhodamine, 5 kDa | Creative Peg Works | PSB-2264 | |
| nail polish | for mounting | ||
| pH meter five easy plus | Mettler toledo | FEP20 | with electrode |
| poly (ethylene Glycol) average mol wt 1450 | Merck (sigma-Aldrich) | P5402-1kg | for sample embedding |
| razor blades, single edges blades, stainless steel, box of 100 | Agar Scientific | T586 | for fragments preparation saled by Oxford Instruments in France |
| rotary microtome | Microm Microtech | HM 360 | |
| sFLim detector | BECKER-HICKL | SPC 150 | for lifetime acquisition |
| sodium dihydrogen phosphate dihydrate NaH2PO4, 2H2O | Merck (sigma-Aldrich) | 71500 | for buffer solution |
| sodium phosphate dibasic dihydrate Na2HPO4,2H2O | Merck (sigma-Aldrich) | 30435-1kg | for buffer solution, old reference, the new one is 71643-1kg |
| tetramethyl rhodamine isothiocyanate-dextran 10 k Da | Merck (sigma-Aldrich) | R8881-100mg |
References
- Inouye, H., et al. Multiscale deconstruction of molecular architecture in corn stover. Scientific Reports. 4, 3756 (2014).
- Li, X., Zheng, Y. Lignin-enzyme interaction: Mechanism, mitigation approach, modeling, and research prospects. Biotechnology Advances. 35 (4), 466-489 (2017).
- Vogel, J. Unique aspects of the grass cell wall. Current Opinion in Plant Biology. 11 (3), 301-307 (2008).
- Lynd, L. R. The grand challenge of cellulosic biofuels. Nature Biotechnology. 35, 912 (2017).
- Clegg, R. M.
- Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced fluorescence microscopy techniques-FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
- Pietraszewska-Bogiel, A., Gadella, T. W. J. FRET microscopy: from principle to routine technology in cell biology. Journal of Microscopy. 241 (2), 111-118 (2011).
- Herbaut, M., et al. Multimodal analysis of pretreated biomass species highlights generic markers of lignocellulose recalcitrance. Biotechnology for Biofuels. 11, 52 (2018).
- Chabbert, B., et al. Fluorescence techniques can reveal cell wall organization and predict saccharification in pretreated wood biomass. Industrial Crops and Products. 123, 84-92 (2018).
- Terryn, C., Paës, G., Spriet, C. FRET-SLiM on native autofluorescence: a fast and reliable method to study interactions between fluorescent probes and lignin in plant cell wall. Plant Methods. 14 (1), 74 (2018).
- Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Cell Structure and Function by Microspectrofluorometry. Kohen, E. , Academic Press. 99-117 (1989).
- Spriet, C., et al. Correlated fluorescence lifetime and spectral measurements in living cells. Microscopy Research and Technique. 70 (2), 85-94 (2007).
- Donaldson, L. A., Newman, R. H., Vaidya, A. Nanoscale interactions of polyethylene glycol with thermo-mechanically pre-treated Pinus radiata biofuel substrate. Biotechnology and Bioengineering. 111 (4), 719-725 (2014).
- Herbaut, M., Zoghlami, A., Paës, G. Dynamical assessment of fluorescent probes mobility in poplar cell walls reveals nanopores govern saccharification. Biotechnology for Biofuels. 11 (1), 271 (2018).
- Paës, G., Chabbert, B. Characterization of arabinoxylan / cellulose nanocrystals gels to investigate fluorescent probes mobility in bio-inspired models of plant secondary cell wall. Biomacromolecules. 13, 206-214 (2012).
- Donaldson, L. A., Radotic, K. Fluorescence lifetime imaging of lignin autofluorescence in normal and compression wood. Journal of Microscopy. 251 (2), 178-187 (2013).
- Auxenfans, T., Terryn, C., Paës, G. Seeing biomass recalcitrance through fluorescence. Scientific Reports. 7, 8838 (2017).
- Waharte, F., Spriet, C., Héliot, L. Setup and characterization of a multiphoton FLIM instrument for protein-protein interaction measurements in living cells. Cytometry A. 4, 299-306 (2016).
