Summary
Denne protokollen beskriver et originalt oppsett som kombinerer Spectral og fluorescens livstids målinger for å evaluere Förster resonans energi overføring (bånd) mellom rhodamine-baserte fluorescerende sonder og lignin polymer direkte i tykke plante seksjoner.
Abstract
I lignocelluloseholdige biomasse (LB), aktiviteten av enzymer er begrenset av utseendet av ikke-spesifikk interaksjon med lignin under hydrolyse prosessen, som opprettholder enzymer langt fra underlaget. Karakterisering av disse komplekse interaksjoner er dermed en utfordring i komplekse underlag som LB. Metoden her måler molekylære interaksjoner mellom fluoroforen-merkede molekyler og innfødte autofluorescent lignin, å bli avslørt av Förster resonans energi overføring (SLITE). I motsetning til bånd målinger i levende celler ved hjelp av to eksogene fluorophores, bånd målinger i planter ved hjelp av lignin er ikke trivielt på grunn av sin komplekse autofluorescence. Vi har utviklet en original oppkjøp og analyse rørledning med korrelert observasjon av to komplementære egenskaper av fluorescens: fluorescens utslipp og levetid. sFLIM (Spectral og fluorescerende levetid Imaging mikroskopi) gir kvantifisering av disse interaksjoner med høy følsomhet, avslørende ulike interaksjon nivåer mellom biomolekyler og lignin.
Introduction
Hydroloserende lignocellulose inn monomere sukker som glukose krever enzymer. Deres aktivitet er kjent for å være behersket ved etablering av ikke-spesifikke interaksjoner mellom enzymer og lignin1,2, sistnevnte er en hydrofobe polymer og en stor bestanddel av lignocellulose3. Således er kvantitativt måle slike interaksjoner direkte på den cellulære skalaen en utfordring som må rettes for å optimalisere enzymet katalysator og lignocellulose pre-Treatment4.
Förster (eller fluorescens) resonans energi overføring (bånd) måling er en metode for valg til esler biomolekyler interaksjon in situ. Dette ikke strålingspådrivet energi overføring kan forekomme mellom en donor og en Acceptor fluoroforen hvis de oppfyller ulike forhold. Donor utslipps spekteret må overlappe, i det minste delvis, aksept Orer eksitasjon spektrum. Valget av fluorophores er således avgjørende for slike eksperimenter. Deretter overføringen effektiviteten avtar med den sjette kraften i deres avstand5 og bare oppstår hvis begge molekylene er i umiddelbar nærhet (vanligvis i nanometer området). Andre beredskap kan endre Overføringseffektiviteten som dipol-dipol orientering, men er dempet hvis fluorophores har fleksibilitet.
Bånd kan måles ved ulike teknikker og detaljerte beskrivelser finnes i litteraturen6,7. I korte trekk, de viktigste metodene stole på: i) sensibilisert utslipp der variasjonen i Acceptor utslipps fluorescens følges og gir hovedsakelig kvalitative resultater; II) Acceptor photobleaching der donor utslipps fluorescens måles før og etter Acceptor photobleaching (i dette tilfellet kan mer presise bånd anslag oppnås, men krever sterk laser effekt påføres faste prøver); og III) livstids måling som avtar for giveren i nærvær av Acceptor. Denne metoden krever spesifikke instrumenter og gir presise og følsomme interaksjons målinger mellom fluorophores. Vurderer bånd måling mellom fluorescerende sonder og lignocellulose, det viktigste problemet er at lignocellulose er ikke et enkelt godt preget fluoroforen: den har en sterk innfødt og Spectrally autofluorescence, hovedsakelig stammer fra lignin, og avhengig av biomasse Art8,9.
I denne utredningen, foreslår vi en ny og original prosedyre tilpasset deler av tre/plante prøver. Denne sFLIM-baserte metoden åpner veien til kvantitative bånd målinger mellom fluorescerende sonder og lignin i innfødte lignocellulose prøver.
Protocol
1. prøve forberedelser
Merk: etterfølgende trinn for klargjøring av prøvene er beskrevet i figur 1.
- Forberedelse av plante prøver
- Fra trestammer eller fragmenter, klipp 1 cm lange prøver med barberblad uten å skade deres struktur.
- Embed prøver i polyetylen glykol (PEG) medium, ved å dyppe dem i suksessive løsninger av økende PEG konsentrasjon fortynnet i vann til å nå 100% PEG.
- Plasser prøven under vakuum for å fjerne vann.
- Rør prøvene forsiktig i 30% v/v PEG for 24 timer.
- Rør prøvene forsiktig i 50% v/v PEG for 24 timer.
- Rør prøvene forsiktig i 100% PEG i 24 timer ved 70 ° c (ren PEG er fast ved romtemperatur).
- Plasser prøver i kapsler ved 70 ° c (på en varm plate) og gradvis senke temperaturen til når romtemperatur.
- Forbered nøye 30-60 μm tykkelse flate seksjoner fra disse PEG blokkene ved hjelp av en mikrotomen og forbruksmateriell kniver.
- Samle og vask seksjoner i tre påfølgende bad med vann i 5 min for å fjerne PEG fra seksjonene.
- Forberedelse av fluorescerende sonde
- Klargjør buffer løsning på 30 mM fosfat ved pH 6,0.
- Veie PEG rhand dextran rhodamine sonde pulver.
- Løs opp sonde pulveret i bufferen med kontinuerlig omrøring i et hetteglass for 1 time i mørket ved en endelig konsentrasjon på 0,1 g/L.
- Plant prøve farging
- Ruge seksjoner med 500 μL av fluorescerende sonde (se 1.2.3) for 72 h (ingen omrøring) i et plastrør (ikke mer enn 3 seksjoner per rør) i mørket.
- Plukk opp en seksjon med en pensel, adsorbere bufferen med et rent ark (unngå tørking av seksjonen), og Monter deretter de inkubert seksjonene mellom et dekkglass og en #1.5H dekkglass.
2. fluorescens levetid og Spectral måling system kalibrering
Merk: den komplette arbeidsflyten for sFLIM-måling er presentert i figur 2.
- Bestem bredden på sFLIM-detektoren.
- Sett urea krystaller i en kultur boks med en 0,17 μm glassbunn.
- Plasser kulturen boksen på et mikroskop prøve holderen og velg det 20x målet.
- Velg en ti: sa-laser med en bølgelengde på 900 NM og 2% strøm, og slå på skanningen.
- Samle det andre harmoniske signalet på sFLIM-detektoren.
Merk: det andre harmoniske signalet slippes ut på nøyaktig halv eksitasjon bølgelengde på 450 nm; mens momentant, dette tiltaket gir også instrumental respons funksjon av systemet. - Gradvis justere laser eksitasjon bølgelengde fra 900 til 980 NM til det andre harmoniske signalet er samlet i den andre Spectral kanalen (462,5 NM).
- Bestem lengden på Spectral vinduet (12,5 NM).
- Hvis Spectral-serien er forskjellig fra det som er forventet, kan du feilsøke ved å gjøre følgende:
- Juster laseren til 910 NM.
- Beveg gitter posisjonen med et rullehjul for å måle det andre harmoniske signalet på den første kanalen (første kanal grense).
- Juster laseren til 935 NM.
- Beveg gitter posisjonen med et rullehjul for å måle det andre harmoniske signalet på den første kanalen (andre kanal grenser).
- Kalibrering av de generelle spektrometer kanalene
- Sett inn speilet på scenen på mikroskopet.
- Velg den synlige kontinuerlige laseren (458 NM, 1% strøm).
- Samle refleksjon signal på sFLIM detektor og sjekk om fotoner er målt i den aktuelle Spectral kanal.
- Gjenta trinn 2.2.2 og 2.2.3 med alle tilgjengelige kontinuerlige lasere (514 NM, 561 NM og 633 NM).
- Hvis Spectral-kanalen er forskjellig fra det som er forventet, flytter du rist posisjonen med rullehjulet og gjentar trinn 2,1 og 2,2.
3. prøve fluorescens karakterisering
- I en spectrofluorometer utstyrt med tilbehør for film holder (f. eks Jasco FP-8500 instrument), plasser anlegget delen prøven (ikke inkubert med fluorescerende sonde).
- Mål fluorescens utslipp vanligvis på området 300-600 NM mens spennende prøven typisk på området 250-550 NM.
- Tegn fluorescens intensitet kontra eksitasjon og utslipps bølgelengder for å tegne et 3D fluorescens kart.
- Bestem det maksimale eksitasjon/utslippsområdet fra tomten.
4. Spectral bånd-måling
- Autofluorescence kalibrering
- Velg målsettingen 20x (NA: 0,8).
- Sett to-Foton laser eksitasjon på 750 NM.
- Plasser den eneste plante delen av hvete strå (vrangen) mellom lysbildet og dekkglass.
- Bruk følgende parametere i programvaren. Bytt til lambda-modus. Velg Spectral detektor ChS med en 9,7 NM oppløsning. Velg Spectral rekkevidde mellom 420 og 722 NM.
- Skaff bildet.
- Bestem utslipps toppen for giveren (470 NM med dette oppsettet).
- Acceptor ' s kalibrering
- Plasser rhodamine-baserte fluorescerende sonder i en kultur boks med en 0,17 μm glassbunn.
- Hent bildet med den samme innstillingen.
- Bestem den Acceptor utslipps toppen (570 NM med dette oppsettet).
- Bestem Spectral Range med maksimal "WS Alone" signal og ingen Acceptor signal som donor bare utslipp for sFLIM målinger (460-490 NM med dette oppsettet).
- Måling av prøver
- Plasser farget plante delen mellom lysbildet og dekkglass.
- Hent bildet med den samme innstillingen.
- Lagre den LSM filen.
- Kvalitativt knytte en sterk bånd hendelse med en nedgang i donor utslipp Peak i forhold til "WS alene sample" og en økning i Acceptor utslipp Peak i forhold til rhodamine prøven.
5. sFLIM målinger
Merk: for sFLIM oppsett, systemet som brukes er et tids domene sFLIM oppsett som beskrevet tidligere10. En oppreist mikroskop og ulike tid korrelert enkelt Foton telle kort og konfokalmikroskopi mikroskop produsenter kan brukes og protokollen bør tilpasses tilsvarende.
- Bytte systemet til sFLIM modus.
- Still inn det konfokalmikroskopi mikroskopet som beskrevet i 4.1.1 og 4.1.2.
- Bytt til ikke-Descanned modus i programvaren for å sende fluorescerende fotoner til sFLIM-detektoren.
- Sett sFLIM oppkjøpet til enable -modus for å tillate Foton TELLING på SPC150.
- Velg 30 s tids samling på SPC150.
- Sjekk at CFD er mellom 1 x 105 og 1 x 106.
FORSIKTIG: Kontroller at antall fotoner målt på TCSPC-kortet alltid er mindre enn 1% av laser eksitasjon frekvensen (i dette oppsettet er laser eksitasjon frekvensen 80 MHz, og deteksjons raten kan ikke overskride 800 kHz i en hvilken som helst piksel for å unngå at det hoper seg opp effekt11).
- Plasser "WS Alone"-anleggs delen mellom lysbildet og dekkglass.
- Sett programvaren til kontinuerlig modus for å tillate laserskanning.
- Velg måleområdet på prøven.
- Klikk Start på SPC150.
- Lagre SDT-filen.
- Gjenta prosessen for minst 10 prøver per betingelse.
- Plasser farget plante delen mellom lysbildet og dekkglass.
- Gjenta trinn 5.2.1-5.2.5.
6. sFLIM analyse
- Velg sFLIM data ervervet fil på "WS alene" og importere dem til SPCImage programvare ved hjelp av fil | For import.
- Velg tilpasnings parametere.
- Fra alternativ | Modell, velg ufullstendig multi-exponentials: 12,5 NS.
- Fra alternativ | Innstillinger, velger du Beregn instrumental respons automatisk.
- Fra hovedmenyen til høyre velger du den 2-eksponentiell Fit-modellen:
- For hver kanal bruker du tilpasnings modellen og lagrer tilpasnings parameterne i et regneark (a1, a2, t1, t2).
- For sammenligning mellom kanaler og eksperimenter beregner du gjennomsnittlig levetid for fluorescens i et regneark (Tm):
- Beregn gjennomsnittlig levetid for alle prøvene (minst 10) i alle kanaler.
- Analyser Tm på giver kanaler (fra kanal 1 til 3:460-490 NM) og Bestem den dedikerte kanalen (kanal 2 tilsvarende 467,5-480 NM) som viser det høyeste Foton-nummeret og tilsvarer lignin maksimale utslipp. Verdier fra kanal 2 må brukes i trinn 6,7.
- Velg sFLIM data ervervet fil på farget WS og importere dem til SPCImage programvare.
- Gjenta trinn 6.1-6.4.
- Beregn bånd effektiviteten Ebånd for giveren i den forrige valgte kanalen WS Alone (tMD) og fra farget plante sample (tmDA):
- Sammenlign sFLIM-og E-bånd verdier mellom WS og prøven.
- Vurder en positiv Ebånd assosiert med en homogen levetid NEDGANG mellom WS og prøven skal analyseres som et bånd hendelse (se representative resultater og verker av Spriet et al.12 og Terryn et al.10 for detaljer).
- Vurder en levetid nedgang fordelt annerledes å være på grunn av en blanding av bånd og lignin komprimeringsnivå og ikke tolke som molekylær interaksjoner.
- Vurder ingen levetid modifikasjon som et fravær av målbare bånd signal, men ikke som en mangel på interaksjon med lignin
Representative Results
Å demonstrere det sFLIM evnen å analysere molekylær vekselvirkningen imellom lignin og fluorescensmerkete-merket molekyler, vi for det første anvendt tre annerledes eksemplar (skikkelsen 3): innfødt wheat HALM (WS), innfødt wheat halm INKUBERT med Peg merket med RHODAMINE (PR10), og innfødt wheat halm med dextran merket med RHODAMINE (DR10). PR10 er kjent for å samhandle med lignin mens DR10 er ment å være inert13,14,15. sFLIM-kurver (Figur 3, topp) viser noen endringer som kan oppnås mellom referanse PRØVEN (WS) og to interaksjons tilfeller (DR10 og PR10). Faktisk kan man først enkelt legge merke til den fluorescens økningen i Spectral regioner som tilsvarer det rhodamine utslippsområdet. Forsiktig observasjon av de tre første kanalen Foton forfall kurver avslører også en sterkere Bøyning for DR10 enn for PR10. Etter montering av Foton forfall kurver og beregning av hver kanal betyr fluorescens levetid, blir bånd signatur mer opplagt (Figur 3, bunn). Faktisk, mens den fluorescens levetiden alternativt øker og minker langs fluorescens spekteret for WS prøven, en klar bånd signatur er observert for både PR10 og DR10 med: 1) en konstant levetid verdi i donor-bare utslipps kanal (3 første kanaler, i blått); og 2) en økende fluorescens levetid i Spectral kanalen som tilsvarer et økende bidrag av høy levetid donor fluoroforen.
Når entydig bånd er fastslått, kan sammenligning av lignin fluorescens levetid (kanal 2) tillate kvantifisering av levetiden reduseres mellom WS (0,47 NS), DR10 (0,42 NS) og PR10 (0,36 NS) og dermed avslører molekylære interaksjoner mellom lignin og både PR10 og DR10 med en sterkere affinitet for PR10.
For å illustrere relevansen av denne metoden for å kvantifisere ulike samhandlings nivåer velger vi tre andre prøver, som etterligner enzym tilgjengelighet ved behandlede plante prøver: syre-behandlet WS (AWS), i kombinasjon med PR av to kontra molekylære vekter på 5 kDa og 20 kDa (PR5 og PR20). Etter nøye inspeksjon av sFLIM signaturer, lignin fluorescens levetid er hentet (Figur 4). Som tidligere nevnt, lignin fluorescens levetid kan endres ved sitt miljø16,17. Etter syre behandling, fluorescens levetid tiltak i AWS (0,28 NS) blir lavere enn tidligere målt for WS (0,47 NS), som bekrefter kravet til sFLIM prosedyre for entydig tolkning av levetid nedgang og behovet for negative kontroller for hver testet tilstand. Som forventet, en sterk levetid nedgang er observert når du legger PR til AWS mens den samhandler med lignin. Videre er samspillet sterkere med PR5 (0,14 NS) sammenlignet med PR20 (0,16 NS), som er konsistent med sine hydrodynamisk radius måling (2,3 NM og 4,8 NM for PR5 og PR20, henholdsvis), inducing ulike elektrosteriske begrensninger og dermed høyere tilgjengelighet av PR5 til lignin.
Begge eksperimenter demonstrere relevansen av denne metoden for å fint vurdere lignin interaksjoner med enzymer, avhengig av størrelse og på plante prøver pre-behandling.
Figur 1: ulike forberedelser trinn av prøvene. Hvete strå (WS) (A) er først redusert i størrelse (B) for å være innebygd i Peg medium (C). Blokken er kuttet ved hjelp av en mikrotomen er utstyrt med engangsblader (D). Etter vask, resulterende seksjoner (E) er plassert for INKUBASJONS i Peg eller dextran merket-rhodamine løsning (F). Merkede deler er montert for sFLIM målinger (G). Vektstenger er 2 cm (A), 1 cm (B og C), 200 μm (E og G). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: komplett arbeidsflyt av SPECTRAL bånd-baserte interaksjoner målinger. Figuren presenterer oppsettet som kombinerer Spectral fluorescens intensitet og levetid målinger. Spectral fluorescens-bilder oppnås med et konfokalmikroskopi mikroskop, og fluorescens levetid for hvert Spectral-område måles med sFLIM-detektoren. Analyse av Foton forfall kurver gir nøyaktig bestemmelse av interaksjoner mellom prøven og molekyler av interesse. Kalibreringer må behandles for å unngå artefakter. For det første, det sFLIM merker nødvendig å bli Spectrally kalibrert og dens instrumental svaret funksjonen har å bli avkrysset. For det andre må det komplekse autofluorescence signalet kalibreres nøyaktig for hver prøve for å bestemme fluorescens levetid i hver kanal før det legges til et Acceptor molekyl. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representative sFLIM målinger. sFLIM kurver (top panel) ble kjøpt på Native hvete strå (WS), WS inkubert med PEG merket med rhodamine (WS + PEG) og innfødte hvete halm med dextran merket med rhodamine (WS + DEX). For hver prøve ble sFLIM-kurver utstyrt med en bi-eksponentiell forfall modell og gjennomsnittlig fluorescens levetid ble beregnet for hver kanal (nederste panel). WS + PEG og WS + DEX prøver presenterer en nedgang i fluorescens levetid i kanalen som tilsvarer autofluorescence bare (tre første barer) forbundet med en livstids økning i kanalen som tilsvarer en blandet utslipp av autofluorescence og rhodamine. Denne virkemåten er karakteristisk for et bånd hendelse mellom lignin og rhodamine-merkede molekyler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: fluorescens livstids analyse av kanalen som tilsvarer lignin autofluorescence. Etter å ha validert en bånd-hendelse basert på sFLIM signatur, gjennomsnittlig fluorescens levetid ble målt på syre-behandlet WS (AWS), i kombinasjon med PR5 eller PR20 (5 kDa og 20 kDa, henholdsvis). Mens både PR-prøver presentere en levetid nedgang, de mindre er preget av en sterkere levetid reduksjon, avslører en sterkere molekylær interaksjon med lignin. Metoden er derfor følsom nok til å skille mellom begge (middelverdi og standard feil representeres, n > 10 per betingelse). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Samkjøre fluorescens levetid og utslipps spektrum målinger gjør det mulig å kombinere fordelene med begge metodene. Faktisk, Spectral målinger alene mangler følsomhet og forblir kvalitative. På den annen side er fluorescens levetid metoden for valg for tradisjonelle kvantitative bånd målinger, men det ble demonstrert at lignin autofluorescence kan variere avhengig av lignin sammensetning og miljø16. Dermed kan lignin interaksjoner med en Acceptor eller lignin strukturelle endringer ikke diskriminert siden de begge resulterer i en levetid nedgang. Som demonstrert, den utviklede metoden gir entydig, følsom og kvantitativ måling av interaksjoner mellom lignin og Acceptor molekyler i plante seksjoner. Selv om de ulike trinnene i metoden var grundig optimalisert, må forsiktighet være spesielt tatt for følgende punkter.
Når det gjelder prøvene, er kvaliteten på anlegget delen avgjørende for å sikre in-Focus Imaging. De forskjellige trinnene for PEG-innebygging bør følges nøye. Det siste vaske trinnet er avgjørende for å sikre at det ikke blir interferens fra PEG som gjenstår i prøvene. Videre bør buffer konsentrasjon og pH holdes strengt identiske for alle målinger siden enhver endring kan ha en sterk innvirkning på fluorescens egenskaper.
Livstids måling kan også være delikat. Fluorescens levetid kan være ustabil, for eksempel på grunn av en høy eksitasjon. I et slikt tilfelle, tuning laseren strøm og zoom kan løse problemet. En annen velkjent kilde til gjenstander i TCSPC målinger er Foton-puls. Faktisk kan TCSPC ikke måle hastigheten på to fotoner slippes mellom de samme to laser pulser. Selv om plante prøvene er svært strukturerte, er fluorescens ikke homogene og kan føre til en skjult puls pileup effekt. Mens antall fotoner per sekund forblir under grensen på 1% eksitasjon, kan det være høyere i noen prøveområder. Å sikre ingen pileup eksperimenter, måle donor fluorescens levetid på en annen Foton Flux kan vurderes. Hvis levetiden øker mens Flux synker, er en pileup effekt endre målinger. Optimal Foton Flux nås med donor levetid stabilitet.
Når det gjelder sFLIM Decay kurve analyse, anbefaler vi å stole på hver enkelt kurve passer for å sikre at modellen nøyaktig beskriver målinger. Hvis det ikke er tilfelle, må du først sørge for at ingen av de tidligere nevnte gjenstandene har ødelagt dataene. Så, steg 2.1.4 skaffer det instrumental svaret funksjonen (IRF) av systemet. Hvis IRF presenterer noen uregelmessigheter, optimalisere den optiske banen for å minimere dem. En målt IRF for montering under trinn 6,2 kan også brukes. Til slutt kan tilpasnings modellens frihetsgrader økes til en tre-eksponentiell forfall i trinn 6,2. Antallet fotoner som kreves for individuell levetid og proporsjon er imidlertid høy, og det anbefales derfor bare å bruke dem til å oppnå en mer stabil gjennomsnittlig levetid fra trinn 6,4. Mer utfyllende informasjon om FLIM, dets karakterisering18, sFLIM og dets anvendelse12 spesielt til lignin10, kan bli funnet i litteraturen.
Selv om utfordrende, bånd måling i plante vev bruker native autofluorescence viser noen fordeler. I forhold til bånd målinger utført på levende vev der interaksjonsstudier mellom biomolekyler ofte krever genetisk engineering å uttrykke egen verdi fluorescerende markører, lignified plante vev som de som presenteres her, tilbyr naturlig autofluorescence, og ytre partner fluorescerende sonder kan enkelt legges til, noe som sparer mye tid. Imidlertid, avhenger på analysert plantearter og opp på mulig pre-handling utført, autofluorescence er sikkert å bli modifisert, i den grad at den nødvendig å bli forsiktig kjennetegnet og fluoroforen anvendt idet sonder kunne nød å bli omarbeidet.
SFLIM-metoden må brukes på fluorescerende sonder som mangler katalysator (PEG og dextran). I rammen av anlegget lignocellulose hydrolyse, interaksjoner av enzymer i ulike biomasse prøver kunne utføres, muligens resulterer i fastsettelse av virkningen av lokalisering (celler og vev) på samspillet styrke. Det neste optimaliserings trinnet vil være automatisering av analyse trinnet. Faktisk, med nok analysert data, en maskinlæring-basert analyse prosedyre kunne distribueres for automatisert fenotype analyse, noe som vil øke sin amenability til rask enzym-biomasse effektivitet screening. Videre, sFLIM ikke krever fiksering av prøven og kan enkelt brukes på dynamiske enzym-lignin interaksjonsstudier. En slik unik metode er sannsynlig å veilede enzym ingeniør strategi og biomasse forbehandling å optimalisere lignocellulose valorization.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Fanny Laurent (FARE) er varmt takket for utarbeidelse av tallene. The Research Federation FRABio (University of lille, CNRS) er anerkjent for å gi det tekniske miljøet som bidrar til å oppnå dette arbeidet. Finansiering ble innhentet fra det franske nasjonale forsknings byrået (LIGNOPROG prosjekt ANR-14-CE05-0026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscope | ZEISS | LSM 710 NLO | for confocal imaging |
| fine brush | to collect sections | ||
| glass vials | for incubations | ||
| high precision microscope cover glasses 170+/-5µm n°1,5# | Marienfeld | 0107032 | saled by Dutscher s.a in France |
| Infra-red pulsed laser | COHERENT | CHAMELEON VISION | For sample excitation |
| Micropipette Research Plus monocanal 20-200µL | Eppendorf | with corresponding tips | |
| Micropipette Research Plus monocanal 2-20µL | Eppendorf | with corresponding tips | |
| Microscope slides ca. 76 x 26 mm ground edges frosted end | Thermo Fisher Scientific | LR45D | |
| microtome blades disposable (pack of 50) | Agar Scientific | T5024 | saled by Oxford Instruments in France |
| mPEG-Rhodamine, 10 kDa | Creative Peg Works | PSB-2263 | |
| mPEG-Rhodamine, 20 kDa | Creative Peg Works | PSB-22642 | |
| mPEG-Rhodamine, 5 kDa | Creative Peg Works | PSB-2264 | |
| nail polish | for mounting | ||
| pH meter five easy plus | Mettler toledo | FEP20 | with electrode |
| poly (ethylene Glycol) average mol wt 1450 | Merck (sigma-Aldrich) | P5402-1kg | for sample embedding |
| razor blades, single edges blades, stainless steel, box of 100 | Agar Scientific | T586 | for fragments preparation saled by Oxford Instruments in France |
| rotary microtome | Microm Microtech | HM 360 | |
| sFLim detector | BECKER-HICKL | SPC 150 | for lifetime acquisition |
| sodium dihydrogen phosphate dihydrate NaH2PO4, 2H2O | Merck (sigma-Aldrich) | 71500 | for buffer solution |
| sodium phosphate dibasic dihydrate Na2HPO4,2H2O | Merck (sigma-Aldrich) | 30435-1kg | for buffer solution, old reference, the new one is 71643-1kg |
| tetramethyl rhodamine isothiocyanate-dextran 10 k Da | Merck (sigma-Aldrich) | R8881-100mg |
References
- Inouye, H., et al. Multiscale deconstruction of molecular architecture in corn stover. Scientific Reports. 4, 3756 (2014).
- Li, X., Zheng, Y. Lignin-enzyme interaction: Mechanism, mitigation approach, modeling, and research prospects. Biotechnology Advances. 35 (4), 466-489 (2017).
- Vogel, J. Unique aspects of the grass cell wall. Current Opinion in Plant Biology. 11 (3), 301-307 (2008).
- Lynd, L. R. The grand challenge of cellulosic biofuels. Nature Biotechnology. 35, 912 (2017).
- Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer. Current Opinion in Biotechnology. 6, 103-110 (1995).
- Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced fluorescence microscopy techniques-FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
- Pietraszewska-Bogiel, A., Gadella, T. W. J. FRET microscopy: from principle to routine technology in cell biology. Journal of Microscopy. 241 (2), 111-118 (2011).
- Herbaut, M., et al. Multimodal analysis of pretreated biomass species highlights generic markers of lignocellulose recalcitrance. Biotechnology for Biofuels. 11, 52 (2018).
- Chabbert, B., et al. Fluorescence techniques can reveal cell wall organization and predict saccharification in pretreated wood biomass. Industrial Crops and Products. 123, 84-92 (2018).
- Terryn, C., Paës, G., Spriet, C. FRET-SLiM on native autofluorescence: a fast and reliable method to study interactions between fluorescent probes and lignin in plant cell wall. Plant Methods. 14 (1), 74 (2018).
- Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Cell Structure and Function by Microspectrofluorometry. Kohen, E. , Academic Press. 99-117 (1989).
- Spriet, C., et al. Correlated fluorescence lifetime and spectral measurements in living cells. Microscopy Research and Technique. 70 (2), 85-94 (2007).
- Donaldson, L. A., Newman, R. H., Vaidya, A. Nanoscale interactions of polyethylene glycol with thermo-mechanically pre-treated Pinus radiata biofuel substrate. Biotechnology and Bioengineering. 111 (4), 719-725 (2014).
- Herbaut, M., Zoghlami, A., Paës, G. Dynamical assessment of fluorescent probes mobility in poplar cell walls reveals nanopores govern saccharification. Biotechnology for Biofuels. 11 (1), 271 (2018).
- Paës, G., Chabbert, B. Characterization of arabinoxylan / cellulose nanocrystals gels to investigate fluorescent probes mobility in bio-inspired models of plant secondary cell wall. Biomacromolecules. 13, 206-214 (2012).
- Donaldson, L. A., Radotic, K. Fluorescence lifetime imaging of lignin autofluorescence in normal and compression wood. Journal of Microscopy. 251 (2), 178-187 (2013).
- Auxenfans, T., Terryn, C., Paës, G. Seeing biomass recalcitrance through fluorescence. Scientific Reports. 7, 8838 (2017).
- Waharte, F., Spriet, C., Héliot, L. Setup and characterization of a multiphoton FLIM instrument for protein-protein interaction measurements in living cells. Cytometry A. 4, 299-306 (2016).
