Summary
该协议描述了如何使用胰岛素相关的高辛比酶作为β细胞胰岛素分泌的代理,在中等通量下执行快速低成本荧光素酶测定。大多数发光板读取器和多通道移液器都可以进行测定。
Abstract
对分泌胰岛素样品后收集进行基于抗体的检测通常需要几个小时到一天的测定时间,并且可能非常昂贵,具体取决于特定的测定。分泌的荧光素酶测定可加快结果,大大降低每个样品的测定成本。在这里,我们提出了一种相对使用不足的方法,通过使用高西亚荧光素酶基因插入C肽中,测量胰腺β细胞的胰岛素分泌活性。在蛋白酶处理蛋白酶胰岛素过程中,将C-肽切除释放胰岛素分泌囊泡内的荧光素酶,与胰岛素共同分泌。由于荧光素酶测定的速度,在样品收集后几分钟内即可得到结果。测定的一个限制是,它是胰岛素分泌的相对测量,而不是绝对定量。但是,此协议经济、可扩展,可以使用大多数标准发光板读取器执行。模拟和数字多通道移液器有助于多个步骤的测定。可以同时测试许多不同的实验变异。一旦确定了一组聚焦条件,应直接使用具有标准曲线的基于抗体的测定法测量胰岛素浓度,以确认荧光素酶测定结果。
Introduction
这里介绍的方法允许从转基因β细胞系的胰岛素分泌快速和负担得起的96孔板格式测定。该协议的关键是胰岛素的改良版本,将自然分泌的高斯卢西酶(GLuc,#18 kDa)插入C肽(见图1),以产生胰岛素高西亚(InsGLuc)1,2。其他较大的蛋白质,如GFP(+25 kDa),已成功插入胰岛素的C-肽中,并表现出从蛋白酶-GFP到胰岛素和GFP-C-肽3、4的预期转化后处理。对于该协议中的测定,GLuc已经针对哺乳动物的表达进行了柯顿优化,并引入了两个突变来增强发光动力学5,6。治疗条件的多种组合和复制可以很容易地以96孔板格式进行测试,并在实验后立即获得分泌结果。
如前所述,如前所述,一个主要优势是这种基于荧光酶的分泌测量(<0.01美元/井)的成本较低,这与酶相关免疫吸附测定(ELISAs)的成本和技术方面相对较高。> $2/油井) 和同质时间解荧光 (HTRF) 或其他 Fürster 共振能量转移 (FRET) 为基础的抗体 (> $1/well) 测定。与通过参照标准曲线测量胰岛素浓度的基于抗体的测定相比,InsGLuc 测定测量分泌活性,作为对板上控制井的相对比较。因此,每个实验都需要包含适当的控件。这种区别是一种权衡,允许快速和廉价的测量。然而,InsGLuc分泌已被证明与ELISA1,2测量的胰岛素分泌高度相关。该技术已扩展至高通量筛选1、2 、7,并确定了胰岛素分泌的新型调制器,包括电压门状钾通道抑制剂7以及天然产物抑制剂β细胞功能,色霉素A28。InsGLuc 的使用最适合那些计划持续测试许多不同的治疗条件以测试其对胰岛素分泌的影响的研究人员。在后续实验中,有必要在亲子细胞系中重复关键发现,在小鼠或人类胰岛中以最佳方式重复关键发现,并使用基于抗体的测定测量胰岛素分泌。
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Protocol
1. 试剂、介质和缓冲液的制备(表1)
- 用以下添加剂制备500 mL高葡萄糖(4.5克/升)Dulbeco改性鹰培养基(DMEM)的完整介质:15%胎儿牛血清(FBS)、100单位/mL青霉素、100微克/mL链霉素、292微克/mL L-谷氨酰胺和50μMβ-麦卡托托乙醇。
注:本例中稳定的细胞系在G418抗生素的250μg/mL中保持。 - 通过制造含有 5 mM KCl、120 mM NaCl、15 mM HEPES (pH 7.4)、24 mM NaHCO 3、1mM MgCl2、2 mM CaCl2和 1 mg/mL 放射性免疫性血清白蛋白 (BSA) 的溶液,制备克雷布斯-林格碳酸氢盐缓冲液 (KRBH)。葡萄糖是添加从2M股票指定的地方。
注:KRBH用于在无刺激和无刺激的情况下孵育细胞,以评估胰岛素和/或高星花酶分泌。 - 准备锥素 (CTZ) 库存溶液,如下所示。将106μL的浓缩HCl加入10 mL甲醇制备酸化甲醇。接下来,在1mg/mL的酸化甲醇中溶解冻干CTZ,并储存在-80°C的螺帽管中。
注:即使在适当储存1年之后,这些库存在常规荧光酶测定中仍保持足够的活性。 - 根据文献9以及专利信息10制备高斯卢西酶(GLuc)测定缓冲液,以帮助在96孔板格式中帮助高斯卢西酶测定的半寿命。使用公式: 25 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA, 5% 甘油, 1 毫克/mL Na2PO4, 300 mM 钠抗坏血酸钠, 200 mM Na2SO3在水中.将库存冻结在 -20°C。解冻后,将缓冲液储存在4°C。
- 要制备高斯卢西沙酶工作溶液,将1mg/mL(2.36 mM)CTZ库存溶液的4.2μL/mL添加到GLuc测定缓冲液中。这产生了10μMCTZ的2倍工作溶液,在测定中的最终浓度为5μM。
2. InsGLuc MIN6细胞培养和分泌测定种子
- 要培养MIN6细胞,使用标准细胞培养技术每周对细胞进行胰蛋白化和播种一次。每两到三天更改单元格上的介质。在介质中加入适当的选择抗生素,如 250 μg/mL G418。
- 为了每周为实验提供足够数量的细胞,请保持T75瓶中的细胞。在 10 mL 的介质中每 T75 播种 6 x 106个细胞,在培养 7 天后,通常每 T75 产生 30 x 106到 40 x 106个细胞。
- 要制备细胞电镀到96孔板中,用PBS洗涤InsGLuc MIN6细胞的汇流T75两次,并加入2 mL的胰蛋白酶。在37°C孵育+5分钟,或直到细胞脱离烧瓶。确定每毫升的细胞浓度。
- 将完整介质中的细胞稀释至 1 x 106细胞/mL,在 96 孔板中每孔 100 μL 中产生 1 x 105个细胞。细胞应在3~4天后充分结合进行测定。
注:为了延长培养期,可以镀一半的细胞浓度。除非细胞要接受实验性治疗,否则在测定日之前不需要更换介质。
- 将完整介质中的细胞稀释至 1 x 106细胞/mL,在 96 孔板中每孔 100 μL 中产生 1 x 105个细胞。细胞应在3~4天后充分结合进行测定。
3. 葡萄糖刺激高斯卢西酶分泌测定
- 在测定当天为实验准备足够的KRBH(步骤1.2)。每96孔板至少需要50 mBH的KRBH,因此至少准备75 mL,以确保为实验提供足够的缓冲。准备额外的缓冲,如果不同的药物治疗条件组合将需要KRBH稀释。
- 准备一个储液罐,无葡萄糖KRBH。将介质从 96 孔板中去除,快速将板倒置在实验室水槽上,然后牢固地在纸巾上印上,以去除多余的介质。
- 使用电子或手动 8 通道移液器,移液器 100 μL /孔 KRBH 从储液罐穿过 96 孔板。重复两次。"
- (急性复合治疗的可选步骤)如果不进行药物治疗,则不进行步骤 3.5 和 3.6,无需修改。为了测试小分子对胰岛素分泌的影响,可以在预孵育期、刺激期或两者同时向细胞添加化合物。
- 一种技术是在1.5 mL管中批量向KRBH添加化合物,并使用可调节的8通道数字移液器将药物KRBH从管转移到96孔板中的细胞。
注:如果没有可调节移液器,则可以制作药物KRBH的96孔板,并使用标准的8通道移液器来传输缓冲液。可以进一步修改治疗模式,在测定前在介质中治疗细胞24小时,如前所述1,8。
- 一种技术是在1.5 mL管中批量向KRBH添加化合物,并使用可调节的8通道数字移液器将药物KRBH从管转移到96孔板中的细胞。
- 加入含有所需葡萄糖或化合物浓度的KRBH100 μL,并将菜肴放入37°C培养箱1小时。
注:根据实验布局,使用电子多通道移液器,允许将通道距离从 8 根 1.5 mL 管的列转换为 96 孔板的 8 行,这是非常有用的。 - 预孵化 1 小时后,将缓冲液放入水槽中,并在纸巾上牢固地印上斑点。每口井加入100μL无葡萄糖KRBH,洗去高斯荧光素酶的累积背景。再次将板分给板,并在每孔 100 μL 时向板添加控制和刺激条件。将盘子放入 37°C 培养箱中 1 小时。
- 使用多通道移液器仔细收集 50 μL 的上清液,根据需要在治疗条件之间更换提示,并将上清液转移到干净不透明的白色 96-和测定板。
注:如有必要,可以使用白墙透明底板,但会丢失大量荧光素酶信号。 - 收集50μL的KRBH上清液后,样品可立即测定。如有必要,将样品密封并在4°C下存放几天(GLuc活性半寿命=6天)或-20°C,长达1个月11,12。
4. 秘密高斯卢西酶测定
- 要制备 GLuc 测定工作溶液,请将所需量的 CTZ 库存溶液 (4.2 μL/mL) 移入 GLuc 测定缓冲液中。为防止 CTZ 升温,在 -80°C 冷冻室快速移液 CTZ 或将管放在干冰上。
- 使用电子多通道移液器,在包含收集的KRBH超生剂的96井盘上,快速添加每口96井的GLuc测定工作溶液50μL。如果任何井的两侧有任何液滴,在桌面回转桶离心机中短暂旋转板。
- 在几分钟内阅读合适的板读器中的发光,并读取每个井,并具有 0.1 秒的集成时间。
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Representative Results
为了测量在控制条件下的测定性能,可以完成一个简单的葡萄糖剂量反应曲线或使用二氧化二氮范式的刺激。在前者的情况下,在无葡萄糖条件下预孵化细胞1小时,然后以葡萄糖浓度增加治疗1小时,在5 mM及以下的分泌活性应极小,而观察到8以上增加的分泌mM 葡萄糖 (图 2)35 mM KCl 的刺激也可用作刺激分泌的阳性控制。在刺激期间纳入分泌调节药物应给予分泌的GLuc活性的预期抑制或强效(图3)。例如,二氧化二氮结合KATP通道,防止其在增加[ATP/ADP]比增加时关闭,阻止膜去极化,防止分泌13。像甲氧安非他明(PMA)这样的phorbol酯激活蛋白激酶C(PKC),是已知的胰岛素分泌放大器14。最后,用1μM肾上腺素刺激激活β2A-肾上腺素受体,进而激活异质性G-蛋白复合Gi,抑制膜脱极化和胰岛素分泌15。重要的是要认识到,虽然MIN6细胞是不朽的细胞系,它们开始失去适当的葡萄糖诱导胰岛素分泌反应(如反应曲线的左移)后延长通过16。因此,最好在从液氮库存重新开始之前,对所有 MIN6 细胞系进行长达八周的培养(每周分裂一次)。
图 1:InsGLuc 报告器的描述。(A) 首先,生成一个稳定的β细胞系(在本例中为MIN6细胞),表达来自大鼠胰岛素启动子的胰岛素-高西亚转基因。(B) 全蛋白与内源性胰岛素一起合成并包装在胰岛素颗粒中。前列腺转换酶将肽裂解,用星号表示。(C) 处理过的胰岛素和高斯亚是共分泌的,荧光素酶活性通过在与ATP无关的、依赖氧气的反应中加入CTZ来检测。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2:InsGLuc报告器是MIN6β细胞胰岛素分泌的忠实代理。(A) MIN6 InsGLuc细胞对葡萄糖浓度增加和KCl(35 mM)与高斯卢西酶分泌物的反应。数据是三个独立实验的平均折叠荧光素酶活性 = SE 与 0 mM 葡萄糖条件相比。*, P < 0.05.这个数字已经修改,经卡尔瓦特等人许可,ACS传感器20161。2016©美国化学学会。(B) MIN6细胞中的InsGLuc报告器表现出对二氧化二氮(Dz)范式的预期分泌反应,其中250μM Dz处理使KATP通道保持开放,阻止膜去极化,除非提供细胞外KCl(35 mM)引发"触发"钙的流入。在 Dz + KCl 条件下进一步添加葡萄糖 (20 mM) 可揭示分泌物的代谢放大,而不进一步增加钙的流入。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:在葡萄糖刺激InsGLuc分泌过程中加入分泌调节化合物。以96孔格式镀的InsGLuc MIN6细胞在无葡萄糖KRBH中预孵化1小时,然后以二甲基磺胺(DMSO)(0.1%)、KCl(35 mM)、二氧化二氮(250μM)、PMA(100 nM)或肾上腺素 (1 μM) 为 1 h. 条形图表示至少 3 个独立实验的平均值 = SE。请点击此处查看此图的较大版本。
| 克雷布斯-林格碳酸氢盐缓冲液(KRBH) | |||
| 库存溶液或粉末 | 股票 | 最终浓度 | 100 mL |
| 氯化钾 | 0.25米 | 5 mM | 2毫升 |
| Nacl | 4 M | 120 mM | 3 毫升 |
| 海平,pH 7.4 | 1米 | 15 mM | 1.5毫升 |
| NaHCO3 | 0.5米 | 24 mM | 4.8毫升 |
| MgCl2 | 1米 | 1 mM | 0.1毫升 |
| CaCl2 | 1米 | 2 mM | 0.2毫升 |
| 水 | H2o | 88.4毫升 | |
| RIA 级 BSA | 粉 | 1毫克/升 | 100毫克 |
| 在实验当天做新鲜。 | |||
| 高西亚测定缓冲区* | |||
| 库存溶液或粉末 | 股票 | 最终浓度 | 50 mL |
| 磷酸二钠 | 粉 | 0.1% (1 毫克/升) | 50毫克 |
| 甘油 | 40% | 5% | 6.25 mL |
| 溴化钠 | 粉 | 150 mM | 772毫克 |
| EDTA pH 8 | 0.5中号 | 1 mM | 100 μL |
| Tris-HCl pH 8 | 1M | 25 mM | 1.25 mL |
| 抗坏血酸* | 粉 | 300 mM | 2.64 克 |
| Na2SO3* | 粉 | 200 mM | 1.26 克 |
| 水 | 高达 50mL | ||
| 储存在-20°C的等分中,一次解冻一个,并保持在4°C。 | |||
| *Luft等人的修改配方 BMC 生物化学 2014, 15:14. | |||
| 酸化美欧 | |||
| 库存溶液或粉末 | 股票 | 最终浓度 | 10 mL |
| 甲醇 | 100% | 10 mL | |
| 盐酸 | 11.65 米 | 1.06% | 0.106 mL |
| 科林塔辛溶液 | |||
| 库存溶液或粉末 | 股票 | 最终浓度 | 1 mL |
| 科埃林塔辛 | 粉 | 1毫克/升(2.36 mM) | 1毫克 |
| 酸化甲醇 | 1 mL | ||
| 4.2 μL 库存每 1 mL 高西亚分析缓冲液产生 10 μM CTZ,用作 2 倍工作溶液。 | |||
| 例如,将50μL的2倍工作溶液加入含有分泌高西亚的50μLKRBH样品中。 | |||
表1:用于执行所呈现的检测的缓冲和库存溶液配方。
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Discussion
在这里,我们提出一种方法,快速评估来自MIN6+细胞的葡萄糖刺激胰岛素分泌反应。为了在测定中获得最佳反应,重要的是将MIN6细胞播种在适当的密度,并允许它们成为85-95%的汇合物。这改善β细胞对葡萄糖的反应,因为改善的细胞-细胞接触和同步,这发生在主小岛17,18,19,20,21以及MIN6细胞16,18.为了防止对葡萄糖刺激的分泌反应损失,在从液氮储存中解冻新小瓶之前,将细胞保持在尽可能低的通道中,并培养细胞仅6-8周,这一点很重要。可以修改协议第 2 节中的电镀策略,以便根据需要适应可用的设备。将 InsGLuc MIN6 细胞电镀到 96 孔板中进行分泌化测定,可提供大量用于实验操作(包括复制)的孔,并在正常的实验室环境中保持电镀精度,如电镀到高孔的盘子中数字通常需要特殊设备,通常位于高通量筛选芯中。
胰岛素分泌的当前检测,除了此处描述的间接荧光素酶测定,包括:使用彩色读出(直接测定)、放射性免疫测定(竞争测定)使用放射性读出、基于FRET的抗体的ELISAs竞争测定22和HTRF23使用FRET之间的染料相关抗体直接测量胰岛素,和DNAaptaer24。这些方法各有其优点,但一般来说,它们比荧光素酶测定更昂贵和/或耗时。InsGLuc测定的一个关键限制是,共分泌的荧光素酶的发光活性只是实际胰岛素分泌的代理。此外,高斯亚在蛋白的N-和C-termini或高西亚的C-肽片段中,在荧光素酶活性方面没有预期的差异,因为高斯拉西荧光素酶已经成功地用作标记,以测量其他蛋白质25。这突出了使用专门测量加工胰岛素的测定分析的确认研究的要求。直接和间接测量胰岛素分泌的替代方法也可用于评估β细胞功能。各种光学记者从读出存在,包括ATP:ADP比,钙流入,NAD+/NADH比,细胞外信号调节激酶(ERK)激活,或环腺苷单磷酸(cAMP)水平26。
InsGLuc 的未来应用尤其处于高通量筛选中。这个测定已经用于少数已发布的小屏幕1,2和未发表的大屏幕要么完成7或正在进行中。开发该技术的其他迭代可能涉及标记其他分泌胰岛激素与荧光素酶,以促进快速测量,如胰高血糖素或索马他汀素。在任何情况下,使用替代方法(包括CRISPR/Cas9、慢病毒或转位酶介导插入在任何合适的β细胞系中)重新创建细胞系,都可以进行修改。对原始报告器的其他可能修改可能包括将交替分泌的荧光素酶替代高西亚,或结合与不同激素相关的多个不同分泌荧光素酶进行多路复用测定。除了细胞培养,CRISPR/Cas9技术提供了产生小鼠模型的可能性,在小鼠模型中,合适的荧光素酶被敲开到基因组中Ins2的C-肽编码区域。这种小鼠是可行的,因为转基因小鼠已经创造了与GFP敲开到同一C-肽位点27,并允许测量内源β细胞功能与荧光素酶测定在体内或外体。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢科布实验室的所有现任和前任成员所做的宝贵工作和讨论,感谢迪奥内·沃提供行政援助。Michael Kalwat 得到青少年糖尿病研究基金会 SRA-2019-702-Q-R 的支持。这项工作是通过NIH R37 DK34128和韦尔奇基金会授予I1243梅兰妮·科布。这项工作的早期部分也得到了NIH F32 DK100113对迈克尔·卡尔瓦特的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials | |||
| rIns-GLuc stable MIN6 cells | Parental MIN6 cell line stably expressing pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc and maintained in 250 ug/ml G418 | ||
| DMEM | Sigma | D6429 | 4.5 g/L glucose media |
| fetal bovine serum, heat-inactivated | Sigma | F4135 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fisher Scientific | SV30010 | |
| beta-mercaptoethanol | Thermo-Fisher Scientific | BP 176-100 | |
| glutamine | Thermo-Fisher Scientific | BP379-100 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T3924-500 | |
| G418 | Gold Biotechnology | G418-10 | Stock solution 250 mg/mL in water. Freeze aliquots at -20C. |
| T75 tissue culture flasks | Fisher Scientific | 07-202-000 | |
| 96 well tissue culture plates | Celltreat | 229196 | |
| Reagent reservoirs (50 mL) | Corning | 4870 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secretion assay reagents | |||
| BSA (RIA grade) | Thermo-Fisher Scientific | 50-146-952 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| KCl | Thermo-Fisher Scientific | P217-500 | |
| NaCl | Thermo-Fisher Scientific | S271-3 | |
| Hepes, pH 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 50-213-365 | |
| NaHCO3 | Thermo-Fisher Scientific | 15568414 | |
| MgCl2 | Thermo-Fisher Scientific | M9272-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C-7902 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optional drugs for stimulation experiments | |||
| Diazoxide | Sigma | D9035 | Stock solution: 50 mM in 0.1N NaOH. Add equal amount of 0.1N HCl to any buffer where diazoxide is added. |
| epinephrine (bitartrate salt) | Sigma | E4375 | Stock solution: 5 mM in water |
| PMA (phorbol 12-myristate) | Sigma | P1585 | Stock solution: 100 µM in DMSO |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guassia assay materials | |||
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Thermo-Fisher Scientific | S374-500 | |
| Glycerol | Thermo-Fisher Scientific | G334 | |
| Sodium Bromide | Thermo-Fisher Scientific | AC44680-1000 | |
| EDTA | Thermo-Fisher Scientific | AC44608-5000 | Stock solution: 0.5 M pH 8 |
| Tris base | RPI | T60040-1000.0 | Stock solution: 1 M pH 8 |
| Ascorbic Acid | Fisher Scientific | AAA1775922 | US Patent US7718389 suggested ascorbate can increase coelenterazine stability. |
| Na2SO3 | Sigma | S0505-250G | US Patent US8367357 suggested sulfite may decrease background due to BSA |
| Coelenterazine (native) | Nanolight / Prolume | 3035MG | Stock solution: 1 mg/ml in acidified MeOH (2.36 mM) |
| OptiPlate-96, White Opaque 96-well Microplate | Perkin Elmer | 6005290 | Any opaque white 96 well plate should be sufficient. Clear bottom plates will also work, however some signal will be lost. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Synergy H1 Hybrid plate reader or equivalent | BioTek | 8041000 | A plate reader with luminescence detection and 96-well plate capabilities is required. |
| 8-channel VOYAGER Pipette (50-1250 µL) | Integra | 4724 | An automated multichannel pipette is extremely useful for rapid addition of luciferase reagents and plating cells in 96 well format |
| 8-channel 200 µL pipette | Transferpette S 20-200 µL | 2703710 |
References
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