Summary
Этот протокол описывает, как выполнять быстрые недорогие анализы люциферазы на средней пропускной связи с использованием инсулина связанных Гауссия luciferase в качестве прокси для секреции инсулина из бета-клеток. Ассеи может быть выполнен с большинством люминесценции пластины читателей и многоканальных пипетки.
Abstract
Выполнение антител на основе анализов для секретированных инсулина после образца сбора обычно требует нескольких часов в день анализ времени и может быть дорогим, в зависимости от конкретного анализа. Засекреченные luciferase анализы ускорить результаты и снизить стоимость анализов на образец существенно. Здесь мы представляем относительно недоиспользованный подход к оценке инсулина секреторной активности из поджелудочной железы и клеток с помощью Gaussia luciferase генетически вставлены в C-пептид. Во время протеолитической обработки проинсулина, C-пептид высечены выпуская люциферазу в инсулин секреторной везикулы, где он совместно секретируется с инсулином. Результаты могут быть получены в течение нескольких минут после сбора образцов из-за скорости анализов люциферазы. Ограничением проверки является то, что это относительное измерение секреции инсулина, а не абсолютная количественная оценка. Тем не менее, этот протокол является экономичным, масштабируемым, и может быть выполнен с помощью большинства стандартных считывателей люминесценции. Аналоговые и цифровые многоканальные пипетки облегчают несколько этапов ассеи. Множество различных экспериментальных вариаций могут быть протестированы одновременно. После того, как целенаправленный набор условий определяются, концентрации инсулина должны быть измерены непосредственно с помощью антител на основе анализов со стандартными кривыми, чтобы подтвердить результаты анализлю люциферазы.
Introduction
Представленный здесь метод позволяет быстро и доступно из-за секреции инсулина из генетически модифицированной бета-клеточной линии быстро и доступно в формате 96-хорошо. Ключом к этому протоколу является модифицированная версия инсулина с естественно-секретной luciferase Gaussia (GLuc, No 18 kDa) вставлена (см. Рисунок 1) в C-пептид для генерации инсулина-Gaussia (InsGLuc)1,2. Другие более крупные белки, такие как GFP (No 25 kDa), были успешно вставлены в C-пептид инсулина и выставлены ожидаемые пост-трансляционной обработки от проинсулин-GFP инсулина и GFP-C-пептид3,4. Для проведения в этом протоколе, GLuc был кодон-оптимизирован для выражения млекопитающих и две мутации были введены для повышения свечения, как кинетика5,6. Несколько комбинаций и репликации лечебных заболеваний могут быть легко протестированы в формате 96-хорошо пластины и результаты секреции могут быть получены сразу же после эксперимента.
Основным преимуществом, как отмечалось ранее2, является низкая стоимость этого luciferase основе секреции измерения (злот; $ 0,01 /хорошо), который отличает его от относительно более высоких затрат и технических аспектов фермент-связанных иммуносорбентных анализов (ELISAs) ( В качестве антитела на основе антител на основе антител, основанных на 2 долларах, и однородной флуоресценции (HTRF) или других рецензировании, говорится о том, что они будут передаваться из-под другого спора о рецензировании (FRET). По сравнению с этими антителами на основе анализов, которые измеряют концентрацию инсулина, ссылаясь на стандартную кривую, Анализ InsGLuc измеряет секреторную деятельность как относительное сравнение с контролем скважин на пластине. По этой причине каждый эксперимент требует включения надлежащего контроля. Это различие является компромиссом, позволяющим проводить быстрые и недорогие измерения. Тем не менее, было доказано, что секреция InsGLuc сильно коррелирует с секрецией инсулина, измеренной ELISA1,2. Эта технология была масштабирована для высокой пропускной связи скрининга1,2,7 и привела к выявлению новых модуляторов секреции инсулина, включая ингибитор канала калия, приложенный к напряжению7 а также натуральный ингибитор продукта функции клеток, хромомицин A28. Использование InsGLuc является наиболее подходящим для исследователей, которые планируют постоянно тестировать множество различных условий лечения для их воздействия на секрецию инсулина. В последующих экспериментах необходимо повторить ключевые выводы в родительской линии клеток, а оптимально в мурин или человеческих островках, и измерить секрецию инсулина с помощью анализа на основе антител.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка реагентов, носителей и буферов (таблица 1)
- Подготовка MIN6 полный носитель в 500 мл высокоглюкози (4,5 г/л) Dulbecco в модифицированных Eagle среды (DMEM) со следующими добавками: 15% плода бычьей сыворотки (FBS), 100 единиц /мл пенициллин, 100 мкг /мл streptomycin, 292 мкг/мl L-г-г-г-г-г-л-глю-л-L-L-L-L-L-L-L -меркаптоэтанол.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стабильная клеточная линия в этом случае поддерживается в 250 мкг/мл антибиотика G418. - Подготовка буфера бикарбоната Krebs-Ringer (KRBH) путем создания раствора, содержащего 5 мм ККЛ, 120 мМ NaCl, 15 mM HEPES (pH 7.4), 24 mM NaHCO3, 1 мМ ММ MgCl2, 2 мм CaCl2, и 1 мг/мл радиоиммунопастия-класса сывороточный альбом (BSA). Глюкоза должна быть добавлена, где указаны из 2 M акций.
ПРИМЕЧАНИЕ: KRBH используется для инкубации клеток с и без стимуляции для того, чтобы оценить инсулин и / или Гауссия люциферазы секреции. - Подготовьте акционерное решение coelenterazine (CT' следующим образом. Приготовьте подкисленный метанол, добавив 106 л концентрированного HCl до 10 мл метанола. Далее, растворите лиофилизированный КТЗ в подкисленном метаноле при 1 мг/мл и храните при -80 градусов по Цельсию в трубках с винтовой крышкой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти запасы сохраняют достаточную активность в обычных анализов люциферазы, даже после 1 года надлежащего хранения. - Подготовка Gaussia luciferase (GLuc) asay буфер на основе литературы 9, а также патентной информации10, чтобы помочь в период полураспада Gaussia luciferase асссее в 96 хорошо пластины формата. Используйте формулу: 25 мм Tris pH 8, 1 мМ EDTA, 5% глицерол, 1 мг/мл Na2PO4,300 мм натрия ascorbate, 200 мм Na2SO3 в воде. Заморозить запасы при -20 градусов по Цельсию. После оттаивания храните буфер при 4 градусах Цельсия.
- Для подготовки рабочего раствора Gaussia luciferase добавьте 4,2 л/мл 1 мг/мл (2,36 мМ) штучного раствора КТЗ в буфер GLuc assay. Это приводит к 2x рабочий раствор 10 ММ КТЗ, который будет иметь 5 мкм окончательную концентрацию в ассе.
2. Культура InsGLuc MIN6 клеток и посева для секреции анализов
- Для культуры MIN6 клеток, trypsinize и семян клеток один раз в неделю с использованием стандартных методов культуры клеток. Изменение носителя на клетках каждые два-три дня. Включите в сми соответствующий отбор антибиотиков, таких как 250 мкг/мл G418.
- Чтобы обеспечить достаточное количество клеток еженедельно для экспериментов, поддерживать клетки в T75 колбы. Посев 6 х 106 ячеек на T75 в 10 мл средств массовой информации, как правило, дают 30 х 10до 40 х 106 ячеек в общей сложности T75 после 7 дней культуры.
- Чтобы подготовить клетки для покрытия в 96-колодцы пластины, мыть конфлятор T75 InsGLuc MIN6 клетки дважды с PBS и добавить 2 мл трипсина. Инкубировать при 37 градусах Цельсия в течение 5 мин или до тех пор, пока клетки не отмежеваются от колбы. Определите концентрацию клеток на миллилитр.
- Разбавить клетки в полном носителе до 1 х 106 клеток / мл, чтобы привести к 1 х 105 клеток в 100 Л на хорошо в 96-хорошо пластины. Клетки должны быть достаточно сливовыми для ассеидов через 3-4 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы продлить период культуры, половина концентрации клеток может быть покрыта. Медиа-изменения не требуются до дня проведения ассеа, если клетки не должны подвергаться экспериментальному лечению.
- Разбавить клетки в полном носителе до 1 х 106 клеток / мл, чтобы привести к 1 х 105 клеток в 100 Л на хорошо в 96-хорошо пластины. Клетки должны быть достаточно сливовыми для ассеидов через 3-4 дня.
3. Глюкоза стимулировали Гауссия luciferase секреции секреции
- В день асссея подготовьте достаточно KRBH для эксперимента (шаг 1.2). Минимум 50 мл KRBH на 96-хорошую пластину требуется, поэтому подготовить по крайней мере 75 мл, чтобы обеспечить достаточный буфер для эксперимента. Подготовьте дополнительный буфер, если различные комбинации лекарственного лечения потребуют KRBH для разбавления.
- Приготовьте резервуар с глюкозой, свободной KRBH. Decant среды из 96-ну хорошо пластины (ы) быстро инвертирования пластины над лабораторной раковиной, а затем пятно твердо на стопку бумажных полотенец, чтобы удалить избыток среды.
- Используя либо электронную, либо ручную 8-канальный пипетку, пипетку 100 Л/ну KRBH из резервуара через 96-колодую пластину (ы). Повторите в общей сложности две стихи.
- (Необязательный шаг лечения острых соединений) Если не выполняется медикаментозное лечение, продолжайте шаги 3.5 и 3.6 без изменений. Чтобы проверить влияние малых молекул на секрецию инсулина, соединения могут быть добавлены к клеткам в период преинкубации, период стимуляции, или оба.
- Один из методов заключается в добавлении соединений в партии KRBH в 1,5 мл труб и использовать регулируемый 8-канальный цифровой пипетки для передачи наркотиков KRBH из труб в клетки в 96-колодцепластины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если регулируемый пипетка недоступен, можно сделать копию 96-ну колодца пластины препарата KRBH и использовать стандартный 8-канальный пипетку для передачи буфера. Дальнейшие изменения в парадигме лечения могут быть сделаны для лечения клеток в течение 24 ч в средствах массовой информации до проведения асссе, как ранее описано1,8.
- Один из методов заключается в добавлении соединений в партии KRBH в 1,5 мл труб и использовать регулируемый 8-канальный цифровой пипетки для передачи наркотиков KRBH из труб в клетки в 96-колодцепластины.
- Добавьте 100 кЛ KRBH, содержащую нужную концентрацию глюкозы или соединений, и поместите блюдо в инкубатор 37 градусов по Цельсию на 1 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от экспериментальной компоновки, это чрезвычайно полезно иметь электронный многоканальный пипетка, которая позволяет переход расстояния канала от колонны из восьми 1,5-мл труб в 8 рядов 96-хорошо пластины. - После 1 ч преинкубации, decant буфера в раковину и пятно твердо на бумажное полотенце. Добавьте 100 л без глюкозы KRBH на колодец, чтобы смыть накопленный фон люциферазы Гауссии. Снова освящайте тарелку и добавляйте контрольные и стимулирующие условия к пластине при 100 кЛ на скважину. Поместите блюдо в инкубатор 37 градусов по Цельсию на 1 ч.
- Тщательно соберите 50 зл супернатантов с помощью многоканального пипетки, изменяя кончики между условиями лечения по мере необходимости, и перенесите супернатант в чистую непрозрачую белую 96-хорошую ассеи-пластину.
ПРИМЕЧАНИЕ: Белостенные прозрачные нижние пластины могут быть использованы в случае необходимости, хотя значительное количество сигнала люциферазы будет потеряно. - После сбора 50 злитроду супернатанта KRBH, образец может быть немедленно проанализирован. При необходимости, печать и хранить образцы на 4 кВ в течение нескольких дней (GLuc деятельности период полураспада 6 дней) или -20 градусов по Цельсию на срок до одного месяца11,12.
4. Засекреченная гауссия люциферазы
- Чтобы подготовить рабочее решение GLuc assay, пипетка необходимое количество штучного раствора КТЗ (4,2 л/мл) в буфер асссеа GLuc. Чтобы предотвратить потепление КТЗ, пипетка КТЗ быстро на -80 градусов морозильник или держать трубку на сухом льду.
- Используя электронную многоканальная пипетка, быстро добавьте 50 зл и слой работы GLuc рабочего решения в скважине через 96-ну хорошо блюдо, содержащее собранные KRBH супернатанты. Если есть какие-либо капли по бокам любых скважин, кратко спина пластины в столе швейных ведра центрифуги.
- Прочитайте люминесценцию в подходящем считывателе пластин в течение нескольких минут и прочитайте каждый хорошо с 0,1 с интеграции времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для оценки производительности анализ в условиях контроля, простая кривая доза глюкозы-ответ или стимуляции с использованием парадигмы диазоксида может быть завершена. В случае первого, предварительноинноинизм клетки в течение 1 ч в условиях, свободных от глюкозы следуют лечения в течение 1 ч с увеличением концентрации глюкозы должно привести к очень мало секреторной активности на и ниже 5 мм, в то время как увеличение секреции наблюдается выше 8 мМ глюкозы(рисунок 2). Стимулирование с 35 мМ KCl также служит положительным контролем для стимулируемой секреции. Включение секреционно-модулирующих препаратов в период стимуляции должно дать ожидаемое ингибирование или потенцирование высеченной активности GLuc(рисунок 3). Например, диазоксид связывает канал KATP и предотвращает его от закрытия при повышенном соотношении «ATP/ADP», блокируя деполяризацию мембраны и предотвращая секрецию13. Phorbol эфиры, как пара-метоксиамфетамин (PMA) активировать протеин киназы C (PKC) и известны усилители секреции инсулина14. Наконец, стимуляция с 1 мкм эпинефрин активирует No 2A-адренергических рецепторов, которые в свою очередь активировать гетеротримический G-белковый комплекс Gi, ингибируя деполяризации мембраны и секреции инсулина15. Важно признать, что в то время как mIN6 клетки бессмертной клеточной линии, они начинают терять надлежащие глюкозы индуцированной инсулина секреции ответов (таких, как левый сдвиг кривой ответа) после длительного прохождения16. По этой причине, это хорошая практика, чтобы регулярно культуры всех MIN6 клеточных линий на срок до восьми недель (расщепление один раз в неделю), прежде чем начать все сначала из запасов жидкого азота.
Рисунок 1: Описание репортера InsGLuc. ()Во-первых, стабильная линия клеток (в данном случае mIN6 клеток) была создана выражая инсулин-Gaussia трансгена от крысы инсулина промоутер. (B) Полный белок синтезируется и упакован в гранулы инсулина вместе с эндогенным инсулином. Преобразовательные преобразовательство расщепляет пептид, указанный звездочками. (C) Обработанный инсулин и Gaussia совместно секретируются и активность люциферазы обнаруживается добавлением КТЗ в АТФ-независимой, кислородозависимой реакции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Репортер InsGLuc является верным прокси секреции инсулина из бета-клеток MIN6. (A) Ответ клеток MIN6 InsGLuc на повышение концентрации глюкозы и KCl (35 мМ) с секрецией luciferase Gaussia. Данные представляют среднее сливки люциферазы активность SE по сравнению с 0 мМ глюкозы условия для трех независимых экспериментов. К, Злт; 0,05. Цифра была изменена с разрешения Kalwat et al. ACS Sensors 20161. © 2016 года Американское химическое общество. (B) Репортер InsGLuc в клетках MIN6 экспонатов ожидаемого секреторного ответа на диазоксид (Dz) парадигмы, где 250 ММ Dz лечение держит канал KAtP открытым, блокирование мембранной деполяризации, если внеклеточной KCl (35 мМ) предоставляется вызвать "запуск" притока кальция. Дальнейшее добавление глюкозы (20 мМ) при состоянии Дз и ККЛ показывает метаболическое усиление секреции, которое происходит без дальнейшего увеличения притока кальция. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Включение секреционно-модулирующих соединений во время глюкозы-стимулирует Секрецию InsGLuc. Клетки InsGLuc MIN6, покрытые 96-ну хорошо, как описано, были заранее инкубированы в без глюкозы KRBH в течение 1 ч. Клетки затем лечились с глюкозой или без 20 ММ в присутствии диметилсульфида (ДМСО) (0,1%), KCl (35 мМ), диазоксида (250 мкм), PMA (100 нм), или эпинефрин (1 мкм) на 1 ч. Бар-график представляет собой среднее sE, по крайней мере, 3 независимых эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Буфер Бикарбоната Кребс-Рингер (KRBH) | |||
| Фондовый раствор или порошок | Фондовая | Окончательная концентрация | 100 мл |
| Kcl | 0,25 м | 5 мМ | 2 мл |
| Nacl | 4 М | 120 мМ | 3 мл |
| Гепы, рН 7.4 | 1 M | 15 мМ | 1,5 мл |
| NaHCO3 | 0,5 м | 24 мМ | 4,8 мл |
| MgCl2 | 1 M | 1 мМ | 0,1 мл |
| CaCl2 | 1 M | 2 мМ | 0,2 мл |
| Воды | H2o | 88,4 мл | |
| РИА-класс BSA | Порошок | 1 мг/мл | 100 мг |
| Сделать свежий в день эксперимента. | |||
| Гауссия Ассай Баффере | |||
| Фондовый раствор или порошок | Фондовая | Окончательная концентрация | 50 мл |
| Фосфат динатрия | Порошок | 0,1% (1 мг/мл) | 50 мг |
| Глицерин | 40% | 5% | 6,25 мл л. |
| Бромид натрия | Порошок | 150 мМ | 772 мг |
| EDTA pH 8 | 0,5 млн. | 1 мМ | 100 л |
| Tris-HCl pH 8 | 1M | 25 мМ | 1,25 мл л. |
| Аскорбиновая кислота | Порошок | 300 мМ | 2,64 г |
| Na2SO3 | Порошок | 200 мМ | 1,26 г |
| Воды | до 50 мл | ||
| Хранить в aliquots при -20 градусах по Цельсию, оттаивать по одному и держать при 4 градусах Цельсия. | |||
| «Модифицированный рецепт от Luft et al. BMC Biochemistry 2014, 15:14. | |||
| Кислотный MeOH | |||
| Фондовый раствор или порошок | Фондовая | Окончательная концентрация | 10 мл |
| Метанола | 100% | 10 мл | |
| Hcl | 11.65 М | 1,06% | 0,106 мл л. |
| Решение Coelenterazine | |||
| Фондовый раствор или порошок | Фондовая | Окончательная концентрация | 1 мл |
| Коэлэнтеразин | Порошок | 1 мг/мл (2,36 мМ) | 1 мг |
| Кислотный метанол | 1 мл | ||
| 4,2 юл запаса на 1 мл gaussia Assay Buffer приводит к тому, что 10 мкм КТЗ будет использоваться в качестве 2x рабочего решения. | |||
| Например, добавьте 50 юл 2x рабочего раствора к 50 ЗЛ образца KRBH, содержащему секретизированную Гауссию. | |||
Таблица 1: Рецепты буферных и биржевых решений, используемые для выполнения представленных анализов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом мы представляем метод для быстрой оценки глюкозостимулированных реакций на секрецию инсулина от клеток MIN6. Для лучших ответов в асссе важно сеять клетки MIN6 при надлежащей плотности и позволить им стать 85-95% слив. Это улучшает реакцию клеток на глюкозу из-за улучшения контактов клеток и синхронизации, которая происходит как в первичных островках17,18,19,20,21, а также MIN6 клетки16,18. Для предотвращения потерь в секреторной реакции на стимуляцию глюкозы, важно поддерживать клетки на как можно ниже прохода, как это возможно и культуры клеток только 6-8 недель до оттаивания нового флакона из запасов жидкого азота. В соответствии со стратегией покрытия в разделе 2 протокола могут быть внесены изменения, с тем чтобы при необходимости адаптироваться к имеющегося оборудованию. Покрытие InsGLuc MIN6 в 96-колодцевые пластины для секреции дает большое количество скважин для экспериментальных манипуляций (включая репликации), а также поддержание точности покрытия в обычной обстановке лаборатории, как покрытие в посуду с более высоким колодцем номера часто требует специального оборудования, обычно доступного в ядрах высокой пропускной связи.
Текущие анализы для секреции инсулина, кроме косвенного анализ люциферазы описаны здесь, включают в себя: ELISAs, которые используют колористые считывания (прямой анализ), радиоиммуноанализы (конкурсный анализ), которые используют радиоактивные считывания, ФРЕТ основе антител конкуренция анализа22 и HTRF23, который использует FRET между красителя миноносной антител для измерения инсулина непосредственно, и ДНК aptamers24. Каждый из этих методов имеет свои преимущества, но в целом они являются более дорогостоящими и / или трудоемким, чем luciferase самосха. Одним из ключевых ограничений InsGLuc асссея является тот факт, что люминесцентная активность совместно секретированной люциферазы является лишь прокси для фактической секреции инсулина. Кроме того, нет никакой ожидаемой разницы в активности люциферазы между Гауссией с фрагментами C-пептида на его N- и C-termini или Gaussia в проинсулин-белке, так как luciferase Gaussia успешно используется в качестве тега для измерения секреции другие белки25. Это подчеркивает требование подтверждения исследований с использованием анализов, которые измеряют обработанный инсулин в частности. Альтернативы прямым и косвенным измерениям секреции инсулина также могут быть использованы для оценки функции клеток. Разнообразие оптических репортеров существуют для считывания, включая коэффициент АТФ: ADP, приток кальция, соотношение NADи/NADH, внеклеточные сигнальные сигнальные активации киназы (ERK) или циклический аденозин монофосфат (cAMP) уровни26.
Будущие приложения InsGLuc, в частности, как представляется, в высокой пропускной продавчивой скрининга. Этот ассес уже был использованв горстке опубликованных небольших экранов 1,2 и неопубликованные большие экраны либо завершены7 или ведется. Развитие других итераций этой технологии может включать пометки других выделяемых гормонов острова с люциферазами для облегчения быстрых измерений, таких как глюкагон или соматостатин. Изменения могут быть внесены в любом случае, когда клеточная линия воссоздана с использованием альтернативных подходов, включая CRISPR/Cas9, лентивирус или транспозазо-опосредованную вставку в любую подходную линию бета-клеток. Дополнительные возможные изменения в оригинальный репортер может включать замену альтернативных секретированных люциферас для Гауссии или объединения нескольких различных секретированных люциферас, связанных с различными гормонами для мультиплексированного асссея. Помимо клеточной культуры, технология CRISPR/Cas9 представляет возможность создания мышиной модели, где подходящая люцифераза вбивается в область c-пептидного кодирования Ins2 в геноме. Такая мышь была бы осуществима, учитывая, что трансгенные мыши были созданы с GFP постучал в тот же C-пептид сайт27 и позволит измерения эндогенной функции клеток с luciferase асссе in vivo или ex vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят всех нынешних и бывших сотрудников лаборатории Кобб за ценную работу и дискуссии, и Дионн Уэйр за административную помощь. Майкл Калват поддерживается Фондом исследований диабета для несовершеннолетних SRA-2019-702-З-Р. Эта работа стала возможной через NIH R37 DK34128 и Уэлч Фонд Грант I1243 Мелани Кобб. Ранние части этой работы были также поддержаны NIH F32 DK100113 Майклу Калвату.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials | |||
| rIns-GLuc stable MIN6 cells | Parental MIN6 cell line stably expressing pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc and maintained in 250 ug/ml G418 | ||
| DMEM | Sigma | D6429 | 4.5 g/L glucose media |
| fetal bovine serum, heat-inactivated | Sigma | F4135 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fisher Scientific | SV30010 | |
| beta-mercaptoethanol | Thermo-Fisher Scientific | BP 176-100 | |
| glutamine | Thermo-Fisher Scientific | BP379-100 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T3924-500 | |
| G418 | Gold Biotechnology | G418-10 | Stock solution 250 mg/mL in water. Freeze aliquots at -20C. |
| T75 tissue culture flasks | Fisher Scientific | 07-202-000 | |
| 96 well tissue culture plates | Celltreat | 229196 | |
| Reagent reservoirs (50 mL) | Corning | 4870 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secretion assay reagents | |||
| BSA (RIA grade) | Thermo-Fisher Scientific | 50-146-952 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| KCl | Thermo-Fisher Scientific | P217-500 | |
| NaCl | Thermo-Fisher Scientific | S271-3 | |
| Hepes, pH 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 50-213-365 | |
| NaHCO3 | Thermo-Fisher Scientific | 15568414 | |
| MgCl2 | Thermo-Fisher Scientific | M9272-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C-7902 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optional drugs for stimulation experiments | |||
| Diazoxide | Sigma | D9035 | Stock solution: 50 mM in 0.1N NaOH. Add equal amount of 0.1N HCl to any buffer where diazoxide is added. |
| epinephrine (bitartrate salt) | Sigma | E4375 | Stock solution: 5 mM in water |
| PMA (phorbol 12-myristate) | Sigma | P1585 | Stock solution: 100 µM in DMSO |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guassia assay materials | |||
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Thermo-Fisher Scientific | S374-500 | |
| Glycerol | Thermo-Fisher Scientific | G334 | |
| Sodium Bromide | Thermo-Fisher Scientific | AC44680-1000 | |
| EDTA | Thermo-Fisher Scientific | AC44608-5000 | Stock solution: 0.5 M pH 8 |
| Tris base | RPI | T60040-1000.0 | Stock solution: 1 M pH 8 |
| Ascorbic Acid | Fisher Scientific | AAA1775922 | US Patent US7718389 suggested ascorbate can increase coelenterazine stability. |
| Na2SO3 | Sigma | S0505-250G | US Patent US8367357 suggested sulfite may decrease background due to BSA |
| Coelenterazine (native) | Nanolight / Prolume | 3035MG | Stock solution: 1 mg/ml in acidified MeOH (2.36 mM) |
| OptiPlate-96, White Opaque 96-well Microplate | Perkin Elmer | 6005290 | Any opaque white 96 well plate should be sufficient. Clear bottom plates will also work, however some signal will be lost. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Synergy H1 Hybrid plate reader or equivalent | BioTek | 8041000 | A plate reader with luminescence detection and 96-well plate capabilities is required. |
| 8-channel VOYAGER Pipette (50-1250 µL) | Integra | 4724 | An automated multichannel pipette is extremely useful for rapid addition of luciferase reagents and plating cells in 96 well format |
| 8-channel 200 µL pipette | Transferpette S 20-200 µL | 2703710 |
References
- Kalwat, M. A., et al. Insulin promoter-driven Gaussia luciferase-based insulin secretion biosensor assay for discovery of beta-cell glucose-sensing pathways. ACS Sensors. 1 (10), 1208-1212 (2016).
- Burns, S. M., et al. High-throughput luminescent reporter of insulin secretion for discovering regulators of pancreatic Beta-cell function. Cell Metabolism. 21 (1), 126-137 (2015).
- Rajan, S., et al. In vitro processing and secretion of mutant insulin proteins that cause permanent neonatal diabetes. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (3), E403-E410 (2010).
- Watkins, S., et al. Imaging Secretory Vesicles by Fluorescent Protein Insertion in Propeptide Rather Than Mature Secreted Peptide. Traffic. 3 (7), 461-471 (2002).
- Welsh, J. P., Patel, K. G., Manthiram, K., Swartz, J. R. Multiply mutated Gaussia luciferases provide prolonged and intense bioluminescence. Biochemical Biophysical Research Communications. 389 (4), 563-568 (2009).
- Tannous, B. A., Kim, D. E., Fernandez, J. L., Weissleder, R., Breakefield, X. O. Codon-optimized Gaussia luciferase cDNA for mammalian gene expression in culture and in vivo. Molecular Therarpy. 11 (3), 435-443 (2005).
- Compounds and methods for regulating insulin secretion. World patent. Burns, S. M., Wagner, B. K., Vetere, A. , WO2018175324A1 (2018).
- Kalwat, M. A., et al. Chromomycin A2 potently inhibits glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta cells. Journal of General Physiology. , (2018).
- Luft, C., et al. Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs. BMC Biochemistry. 15 (1), 14 (2014).
- Ohmiya, Y., Wu, C. Stabilizing composition and stabilizing method of coelenterazine solution for high-throughput measurement of luciferase activity. U.S. Patent. , 7,718,389 B2 (2010).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (4), 582-591 (2009).
- Wurdinger, T., et al. A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes. Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).
- Henquin, J. C. Triggering and amplifying pathways of regulation of insulin secretion by glucose. Diabetes. 49 (11), 1751-1760 (2000).
- Mourad, N. I., Nenquin, M., Henquin, J. C. Amplification of insulin secretion by acetylcholine or phorbol ester is independent of beta-cell microfilaments and distinct from metabolic amplification. Molecular & Cellular Endocrinology. 367 (1-2), 11-20 (2013).
- Straub, S. G., Sharp, G. W. Evolving insights regarding mechanisms for the inhibition of insulin release by norepinephrine and heterotrimeric G proteins. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (12), C1687-C1698 (2012).
- Cheng, K., et al. High passage MIN6 cells have impaired insulin secretion with impaired glucose and lipid oxidation. PLoS One. 7 (7), e40868 (2012).
- Head, W. S., et al. Connexin-36 Gap Junctions Regulate In Vivo First- and Second-Phase Insulin Secretion Dynamics and Glucose Tolerance in the Conscious. Diabetes. 61 (7), 1700-1707 (2012).
- Benninger, R. K. P., Head, W. S., Zhang, M., Satin, L. S., Piston, D. W. Gap junctions and other mechanisms of cell-cell communication regulate basal insulin secretion in the pancreatic islet. The Journal of Physiology. 589 (22), 5453-5466 (2011).
- Konstantinova, I., et al. EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets. Cell. 129 (2), 359-370 (2007).
- Jaques, F., et al. Dual effect of cell-cell contact disruption on cytosolic calcium and insulin secretion. Endocrinology. 149 (5), 2494-2505 (2008).
- Calabrese, A., et al. Connexin 36 Controls Synchronization of Ca2+ Oscillations and Insulin Secretion in MIN6 Cells. Diabetes. 52 (2), 417-424 (2003).
- Bielefeld-Sevigny, M. AlphaLISA immunoassay platform- the "no-wash" high-throughput alternative to ELISA. Assay and Drug Development Technologies. 7 (1), 90-92 (2009).
- Aslanoglou, D., George, E. W., Freyberg, Z. Homogeneous Time-resolved Forster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
- Rafati, A., Zarrabi, A., Abediankenari, S., Aarabi, M., Gill, P. Sensitive colorimetric assay using insulin G-quadruplex aptamer arrays on DNA nanotubes coupled with magnetic nanoparticles. Royal Sociecy Open Science. 5 (3), 171835 (2018).
- Hulleman, J. D., Brown, S. J., Rosen, H., Kelly, J. W. A high-throughput cell-based Gaussia luciferase reporter assay for identifying modulators of fibulin-3 secretion. Journal of Biomolecular Screening. 18 (6), 647-658 (2013).
- Frank, J. A., et al. Optical tools for understanding the complexity of beta-cell signalling and insulin release. Nature Reviews Endocrinology. 14 (12), 721-737 (2018).
- Zhu, S., et al. Monitoring C-Peptide Storage and Secretion in Islet beta-Cells In Vitro and In Vivo. Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).
