Summary
Dieses Protokoll beschreibt, wie man schnelle low-cost Luziferase-Assays bei mittlerem Durchsatz mit einer Insulin-verknüpften Gaußsia-Luziferase als Proxy für Insulinsekretion aus Beta-Zellen durchführt. Der Assay kann mit den meisten Lumineszenzplattenlesern und Mehrkanalpipetten durchgeführt werden.
Abstract
Die Durchführung von Antikörper-basierten Assays für die sekrete Insulin-Nachprobensammlung erfordert in der Regel ein paar Stunden bis zu einem Tag Assay-Zeit und kann teuer sein, je nach dem spezifischen Assay. Abgesonderte Luziferase-Assays beschleunigen die Ergebnisse und senken die Assay-Kosten pro Probe erheblich. Hier stellen wir einen relativ ungenutzten Ansatz zur Messung der insulinsekretotischen Aktivität von Bauchspeicheldrüsenzellen mit Gaussia luciferase vor, die genetisch in das C-Peptid eingefügt wurde. Während der proteolytischen Verarbeitung von Proinsulin wird das C-Peptid ausgeschnitten und die Luziferase innerhalb des Insulinsekretotische vesikelfrei freigesetzt, wo es mit Insulin mitsekretiert wird. Die Ergebnisse können innerhalb von Minuten nach der Probenentnahme aufgrund der Geschwindigkeit von Luziferase-Assays erhalten werden. Eine Einschränkung des Assays ist, dass es sich um eine relative Messung der Insulinsekretion handelt und nicht um eine absolute Quantifizierung. Dieses Protokoll ist jedoch wirtschaftlich, skalierbar und kann mit den meisten Standard-Leuchtplattenlesern durchgeführt werden. Analoge und digitale Mehrkanalpipetten ermöglichen mehrere Schritte des Assays. Viele verschiedene experimentelle Variationen können gleichzeitig getestet werden. Sobald eine fokussierte Reihe von Bedingungen entschieden ist, sollten Insulinkonzentrationen direkt mit Antikörper-basierten Assays mit Standardkurven gemessen werden, um die Ergebnisse des Luziferase-Assays zu bestätigen.
Introduction
Die hier vorgestellte Methode ermöglicht es, die Insulinsekretion aus einer genetisch veränderten Beta-Zelllinie schnell und kostengünstig im 96-Well-Platten-Format zu erhalten. Der Schlüssel zu diesem Protokoll ist eine modifizierte Version von Insulin mit der natürlich sezernierten Gaussia-Luziferase (GLuc, 18 kDa) in das C-Peptid eingeführt, um Insulin-Gaussia (InsGLuc)1,2zu erzeugen. Andere größere Proteine, wie GFP (ca. 25 kDa), wurden erfolgreich in das C-Peptid von Insulin eingeführt und zeigten die erwartete posttranslationale Verarbeitung von Proinsulin-GFP zu Insulin und GFP-C-Peptid3,4. Für den Assay in diesem Protokoll wurde GLuc für die Expression von Säugetieren kodonoptimiert und zwei Mutationen wurden eingeführt, um die glühende Kinetik5,6zu verbessern. Mehrere Kombinationen und Replikationen von Behandlungsbedingungen können einfach im 96-Well-Plattenformat getestet werden und die Sekretionsergebnisse können unmittelbar nach dem Experiment erzielt werden.
Ein großer Vorteil, wie bereits erwähnt2, sind die niedrigen Kosten dieser auf Luziferase basierenden Sekretionsmessung (< 0,01 USD/well), die sie von den relativ höheren Kosten und technischen Aspekten enzymgebundener Immunsorbent-Assays (ELISAs) ( > 2 USD/well) und homogene zeitaufgelöste Fluoreszenz (HTRF) oder andere Aufenthalten von Förster-Resonanzenergieübertragung (FRET)-basierten Antikörpern (> 1/well) Im Vergleich zu diesen Antikörper-basierten Assays, die die Insulinkonzentration durch Bezugnahme auf eine Standardkurve messen, misst der InsGLuc-Assay die sekretorische Aktivität als relativen Vergleich zu Kontrollbrunnen auf der Platte. Aus diesem Grund erfordert jedes Experiment die Einbeziehung ordnungsgemäßer Kontrollen. Diese Unterscheidung ist ein Kompromiss, um schnelle und kostengünstige Messungen zu ermöglichen. Jedoch, InsGLuc Sekretion wurde gezeigt, dass stark mit Insulin-Sekretion gemessen mit ELISA1,2. Diese Technologie wurde für das Hochdurchsatzscreening1,2,7 skaliert und hat zur Identifizierung neuartiger Modulatoren der Insulinsekretion einschließlich eines spannungsgebundenen Kaliumkanalinhibitors7 geführt. sowie ein natürlicher Produktinhibitor der Zellfunktion, Chromomycin A28. Die Verwendung von InsGLuc ist am besten geeignet für Forscher, die planen, kontinuierlich viele verschiedene Behandlungsbedingungen auf ihre Auswirkungen auf die Insulinsekretion zu testen. In Folgeexperimenten ist es notwendig, wichtige Befunde in einer elterlichen Zelllinie und optimalerweise in murinen oder menschlichen Inseln zu wiederholen und die Insulinsekretion mit einem Antikörper-basierten Assay zu messen.
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Protocol
1. Herstellung von Reagenzien, Medien und Puffern (Tabelle 1)
- Bereiten Sie MIN6-Komplettmedium in 500 ml hochglukosen (4,5 g/L) Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit folgenden Additiven vor: 15% fetales Rinderserum (FBS), 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 g/mL Streptomycin, 292 g/ml L-Glutamin und 50 Mercaptoethanol.
HINWEIS: Die stabile Zelllinie wird in diesem Fall in 250 g/ml G418-Antibiotikum gehalten. - Bereiten Sie Krebs-Ringer BicarbonatPuffer (KRBH) durch eine Lösung mit 5 mM KCl, 120 mM NaCl, 15 mM HEPES (pH 7.4), 24 mM NaHCO3, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2und 1 mg/mL radioimmunoassay-grade Rinderserumalbumin (BSA). Glucose ist zuzuführen, wenn aus einem 2 M Bestand angegeben.
HINWEIS: KRBH wird verwendet, um die Zellen mit und ohne Stimulation zu inkubieren, um Insulin und/oder Gaussia luziferase Sekretion zu bewerten. - Bereiten Sie die Coelenterazin (CTZ) Lagerlösung wie folgt vor. Bereiten Sie versauertes Methanol vor, indem Sie 106 l konzentriertem HCl auf 10 ml Methanol aufbringen. Als nächstes lyophilisiertes CTZ in angesäuertem Methanol bei 1 mg/ml auflösen und bei -80 °C in Schraubkappenrohren lagern.
HINWEIS: Diese Bestände behalten ausreichende Aktivität in routinemäßigen Luziferase-Assays, auch nach 1 Jahr ordnungsgemäßer Lagerung. - Bereiten Sie Gaußier luziferase (GLuc) Assay Puffer auf der Grundlage der Literatur9 sowie Patentinformationen10 zur Unterstützung in der Halbwertszeit der Gaußsia luciferase Assay in 96 Well Plate Format. Verwenden Sie die Formel: 25 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA, 5% Glycerin, 1 mg/mL Na2PO4, 300 mM Natriumascorbat, 200 mM Na2SO3 in Wasser. Lagerbestände bei -20 °C einfrieren. Nach dem Auftauen den Puffer bei 4 °C aufbewahren.
- Zur Vorbereitung der Gaussia-Luziferase-Arbeitslösung fügen Sie dem GLuc-Assaypuffer 4,2 l/ml der 1 mg/ml (2,36 mM) CTZ-Lagerlösung hinzu. Daraus ergibt sich eine 2x-Arbeitslösung von 10 m CTZ, die eine Endkonzentration von 5 m im Assay aufweist.
2. Kultur der InsGLuc MIN6-Zellen und Aussaat für Sekretionstests
- Um MIN6-Zellen zu kulturieren, versuchen Sie, die Zellen einmal pro Woche mithilfe von Standard-Zellkulturtechniken auszusäen. Ändern Sie die Medien in den Zellen alle zwei bis drei Tage. Fügen Sie geeignete selektionsiöse Selektionsantibiotika, wie z. B. 250 g/ml G418, in die Medien ein.
- Um eine ausreichende Anzahl von Zellen wöchentlich für Experimente bereitzustellen, halten Sie die Zellen in T75-Flaschen aufrecht. Die Aussaat von 6 x 106 Zellen pro T75 in 10 ml Medien ergibt in der Regel 30 x 106 bis 40 x 106 Zellen insgesamt pro T75 nach 7 Tagen Kultur.
- Um Zellen für die Beschichtung in 96-Well-Platten vorzubereiten, waschen Sie eine konfluente T75 von InsGLuc MIN6-Zellen zweimal mit PBS und fügen Sie 2 ml Trypsin hinzu. Inkubieren Sie bei 37 °C für ca. 5 min oder bis sich die Zellen vom Kolben lösen. Bestimmen Sie die Zellkonzentration pro Milliliter.
- Verdünnen Sie die Zellen in vollständigen Medien auf 1 x 106 Zellen/ml, so dass 1 x 105 Zellen in 100 l pro Brunnen in einer 96-Well-Platte entstehen. Die Zellen sollten für den Test nach 3–4 Tagen ausreichend konfluent sein.
HINWEIS: Um die Kulturperiode zu verlängern, kann die Hälfte der Zellkonzentration plattiert werden. Medienveränderungen sind vor dem Tag des Testes nicht erforderlich, es sei denn, die Zellen sollen experimentellen Behandlungen unterzogen werden.
- Verdünnen Sie die Zellen in vollständigen Medien auf 1 x 106 Zellen/ml, so dass 1 x 105 Zellen in 100 l pro Brunnen in einer 96-Well-Platte entstehen. Die Zellen sollten für den Test nach 3–4 Tagen ausreichend konfluent sein.
3. Glukose-stimulierte Gaußkoluzife-Sekretion-Test
- Am Tag des Assays bereiten Sie genügend KRBH für das Experiment vor (Schritt 1.2). Mindestens 50 ml KRBH pro 96-Well-Platte sind erforderlich, daher bereiten Sie mindestens 75 ml vor, um einen ausreichenden Puffer für das Experiment zu gewährleisten. Bereiten Sie zusätzlichen Puffer vor, wenn verschiedene Kombinationen von medikamentösen Behandlungsbedingungen KRBH für die Verdünnung erfordern.
- Bereiten Sie ein Reservoir mit glukosefreiem KRBH vor. Dekantieren Sie das Medium von 96-Well-Platten, indem Sie die Platte schnell über eine Laborspüle umkehren und dann fest auf einem Stapel Papiertücher bumchen, um überschüssiges Medium zu entfernen.
- Mit einer elektronischen oder manuellen 8-Kanal-Pipette, Pipette 100 l /well KRBH aus dem Reservoir über die 96-Well-Platte(n). Wiederholen Sie dies für insgesamt zwei Wähbe.
- (Optionaler Schritt der Akutbehandlung) Wenn Sie keine medikamentösen Behandlungen durchführen, fahren Sie mit den Schritten 3.5 und 3.6 ohne Änderung fort. Um die Auswirkungen kleiner Moleküle auf die Insulinsekretion zu testen, können den Zellen während der Vorinkubationszeit, der Stimulationsphase oder beidem Verbindungen zugesetzt werden.
- Eine Technik besteht darin, dem KRBH in 1,5 ml-Rohren Chargen verbindungen hinzuzufügen und eine einstellbare 8-Kanal-Digitalpipette zu verwenden, um das Medikament-KRBH von den Röhren auf Zellen in 96-Well-Platten zu übertragen.
HINWEIS: Wenn keine verstellbare Pipette verfügbar ist, kann eine Replik 96-Well-Platte von Drug-KRBH hergestellt werden und eine Standard 8-Kanal-Pipette kann verwendet werden, um Puffer zu übertragen. Weitere Änderungen am Behandlungsparadigma können vorgenommen werden, um Zellen für 24 h in Medien vor dem Test zu behandeln, wie zuvor beschrieben1,8.
- Eine Technik besteht darin, dem KRBH in 1,5 ml-Rohren Chargen verbindungen hinzuzufügen und eine einstellbare 8-Kanal-Digitalpipette zu verwenden, um das Medikament-KRBH von den Röhren auf Zellen in 96-Well-Platten zu übertragen.
- Fügen Sie 100 l KRBH mit der gewünschten Glukose- oder -konzentration hinzu und legen Sie die Schale 1 h im 37 °C-Inkubator.
HINWEIS: Je nach experimentellem Layout ist es äußerst hilfreich, eine elektronische Mehrkanalpipette zu haben, die den Übergang der Kanalabstände von einer Säule von acht 1,5-ml-Rohren zu den 8 Reihen einer 96-Well-Platte ermöglicht. - Nach der 1 h Der Inkubation den Puffer in die Spüle dekantieren und fest auf dem Papiertuch bumen. Fügen Sie 100 L glukosefreien KRBH pro Brunnen hinzu, um den angesammelten Hintergrund der Gaußsia-Luziferase wegzuwaschen. Decant die Platte wieder und fügen Sie Kontroll- und Stimulatorische Bedingungen auf die Platte bei 100 l pro Brunnen. Legen Sie die Schale in den 37°C Inkubator für 1 h.
- Sammeln Sie vorsichtig 50 l Überstand mit einer Mehrkanalpipette, wechseln Sie bei Bedarf die Spitzen zwischen den Behandlungsbedingungen, und übertragen Sie den Überstand auf eine saubere, undurchsichtige weiße 96-Well-Assay-Platte.
HINWEIS: Weißwandige Klarbodenplatten können bei Bedarf verwendet werden, obwohl eine erhebliche Menge an Luziferase-Signal verloren geht. - Nach der Entnahme von 50 l KRBH-Überstand kann die Probe sofort untersucht werden. Bei Bedarf Proben bei 4 °C für ein paar Tage (GLuc-Aktivität Halbwertszeit von 6 Tagen) oder -20 °C für bis zu einem Monat versiegeln und lagern11,12.
4. Abgesonderte Gaußierluzifase-Assay
- Um die GLuc-Assay-Arbeitslösung vorzubereiten, pipette die benötigte Menge an CTZ-Lagerlösung (4,2 l/ml) in den GLuc-Assaypuffer. Um eine Erwärmung des CTZ zu verhindern, pipetten Sie den CTZ schnell am -80 °C Gefrierschrank oder halten Sie das Rohr auf Trockeneis.
- Mit einer elektronischen Mehrkanalpipette können Sie schnell 50 L der GLuc-Assay-Arbeitslösung pro Brunnen über die 96-Well-Schale mit den gesammelten KRBH-Überwasserstoffen hinzufügen. Wenn sich tröpft an den Seiten von Brunnen Tröpfchen befinden, drehen Sie die Platte kurz in einer Tisch-Schaukel-Eimer-Zentrifuge.
- Lesen Sie die Lumineszenz in einem geeigneten Plattenleser innerhalb weniger Minuten und lesen Sie jeden gut mit einer 0,1 s Integrationszeit.
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Representative Results
Um die Leistung des Assays unter Kontrollbedingungen zu messen, kann eine einfache Glukose-Dosis-Wirkungs-Kurve oder eine Stimulation mit dem Diazoxid-Paradigma abgeschlossen werden. Im Falle ersterer sollte die Vorinkubation der Zellen für 1 h unter glukosefreien Bedingungen, gefolgt von der Behandlung von 1 h mit steigenden Glukosekonzentrationen, zu einer sehr geringen sekretotigen Aktivität bei und unter 5 mM führen, während eine erhöhte Sekretion über 8 mM Glukose (Abbildung 2). Die Stimulation mit 35 mM KCl dient auch als positiv zur Verfügung steht für die stimulierte Sekretion. Die Aufnahme von sekretionsmodulierenden Medikamenten während der Stimulationsphase sollte die erwartete Hemmung oder Potenzierung der abgesonderten GLuc-Aktivität geben (Abbildung 3). Beispielsweise bindet Diazoxid den K ATP-Kanal und verhindert, dass er sich bei erhöhtem [ATP/ADP]-Verhältnis schließt, die Depolarisation der Membran blockiert und die Sekretion verhindert13. Phorbolester wie Paramethoxyamphetamin (PMA) aktivieren proteinkinase C (PKC) und sind bekannte Verstärker der Insulinsekretion14. Schließlich aktiviert die Stimulation mit 1 MEpinephrin 2A-adrenerge Rezeptoren, die wiederum den heterotrimerischen G-Protein-Komplex Gi aktivieren und die Membrandepolarisation und Insulinsekretion15hemmen. Es ist wichtig zu erkennen, dass MIN6-Zellen zwar eine unsterbliche Zelllinie sind, aber nach der erweiterten Passierung16beginnen, richtige Glukose-induzierte Insulinsekretionsreaktionen (wie linksverschiebbare Verschiebung der Reaktionskurve) zu verlieren. Aus diesem Grund ist es eine gute Praxis, alle MIN6-Zelllinien routinemäßig für bis zu acht Wochen zu kultiieren (einmal pro Woche) bevor sie von flüssigen Stickstoffvorräten beginnen.
Abbildung 1: Beschreibung des InsGLuc-Reporters. (A) Zunächst wurde eine stabile Zelllinie (in diesem Fall MIN6-Zellen) erzeugt, die das Insulin-Gauß-Transgen aus dem Insulinpromotor der Ratte exzessiver ausdrückte. (B) Das volle Protein wird synthetisiert und zusammen mit endogenem Insulin in Insulingranulat verpackt. Prohormon-Convertasen spalten das Peptid, angezeigt durch Sternchen. (C) Das verarbeitete Insulin und die Gaußme werden mitsezernt und die Luziferaseaktivität wird durch Zugabe von CTZ in einer ATP-unabhängigen, sauerstoffabhängigen Reaktion nachgewiesen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Der InsGLuc-Reporter ist ein treuer Proxy der Insulinsekretion aus MIN6-Betazellen. (A) Reaktion von MIN6 InsGLuc-Zellen auf erhöhung der Glukosekonzentrationen und KCl (35 mM) mit Gaussia-Luziferase-Sekretion. Daten sind die mittlere Falte Luziferase-Aktivität - SE im Vergleich zu 0 mM Glukose-Bedingungen für drei unabhängige Experimente. *, P < 0,05. Die Figur wurde mit Genehmigung von Kalwat et al. ACS Sensors 20161geändert. © 2016 American Chemical Society. (B) Der InsGLuc-Reporter in MIN6-Zellen zeigt die erwartete sekretore Reaktion auf das Diazoxid-Paradigma (Dz), bei dem die Behandlung mit 250 M Dz denK-ATP-Kanal offen hält und die Depolarisation der Membran blockiert, es sei denn, es wird extrazelluläres KCl (35 mM) bereitgestellt. um den "auslösenden" Kalziumzufluss auszulösen. Die weitere Zugabe von Glukose (20 mM) unter der Bedingung Dz + KCl zeigt die metabolische Amplifikation der Sekretion, die ohne weitere Erhöhung des Kalziumzuflusses auftritt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Die Aufnahme von sekretionsmodulierenden Verbindungen während der Glukose-stimuliertin insGLuc-Sekretion. InsGLuc MIN6-Zellen, die im 96-Well-Format, wie beschrieben, plattiert waren, wurden in glukosefreiem KRBH für 1 h vorinkubiert. Zellen wurden dann mit oder ohne 20 mM Glukose in Gegenwart von Dimethylsulfoxid (DMSO) (0,1%), KCl (35 mM), Diazoxid (250 m), PMA (100 nM) oder Epinephrin (1 m) für 1 h. Stabdiagramm stellen den Mittelwert von mindestens 3 unabhängigen Experimenten dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Krebs-Ringer BicarbonatPuffer (KRBH) | |||
| Lagerlösung oder Pulver | vorrat | Endgültige Konzentration | 100 ml |
| Kcl | 0,25 M | 5 mM | 2 ml |
| Nacl | 4 M | 120 mM | 3 ml |
| Hepes, pH 7,4 | 1 M | 15 mM | 1,5 ml |
| NaHCO3 | 0,5 M | 24 mM | 4,8 ml |
| MgCl2 | 1 M | 1 mM | 0,1 ml |
| CaCl2 | 1 M | 2 mM | 0,2 ml |
| wasser | H2o | 88,4 ml | |
| RIA-Grade BSA | pulver | 1 mg/ml | 100 mg |
| Machen Sie frisch am Tag des Experiments. | |||
| Gaußasassaypuffer* | |||
| Lagerlösung oder Pulver | vorrat | Endgültige Konzentration | 50 ml |
| Dinatriumphosphat | pulver | 0,1% (1 mg/ml) | 50 mg |
| Glycerin | 40% | 5% | 6,25 ml |
| Natriumbromid | pulver | 150 mM | 772 mg |
| EDTA pH 8 | 0,5 Mio. | 1 mM | 100 l |
| Tris-HCl pH 8 | 1M | 25 mM | 1,25 ml |
| Ascorbinsäure* | pulver | 300 mM | 2,64 g |
| Na2SO3** | pulver | 200 mM | 1,26 g |
| wasser | bis zu 50mL | ||
| In Aliquots bei -20 °C auftauen, nacheinander auftauen und bei 4 °C halten. | |||
| *Modifiziertes Rezept von Luft et al. BMC Biochemistry 2014, 15:14. | |||
| Versauertes MeOH | |||
| Lagerlösung oder Pulver | vorrat | Endgültige Konzentration | 10 ml |
| Methanol | 100% | 10 ml | |
| Hcl | 11,65 M | 1,06% | 0,106 ml |
| Coelenterazin-Lösung | |||
| Lagerlösung oder Pulver | vorrat | Endgültige Konzentration | 1 ml |
| Coelenterazin | pulver | 1 mg/ml (2,36 mM) | 1 mg |
| Säuertesäuertes Methanol | 1 ml | ||
| 4,2 l Destole pro 1 ml Gaussia Assay Buffer ergeben 10 M CTZ, die als 2-fache Arbeitslösung verwendet werden. | |||
| Fügen Sie z. B. 50 L 2x Arbeitslösung zu 50 L der KRBH-Probe hinzu, die sezernierte Gaußsie enthält. | |||
Tabelle 1: Puffer- und Lagerlösungsrezepte, die zum Durchführen der vorgestellten Assays verwendet werden.
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Discussion
Hierbei stellen wir eine Methode zur schnellen Bewertung der Glukose-stimulierten Insulinsekretionsreaktionen aus MIN6-Zellen vor. Für die besten Antworten im Test ist es wichtig, die MIN6-Zellen bei der richtigen Dichte auszusäen und sie zu 85-95% konfluent zu machen. Dies verbessert die Zellreaktionen auf Glukose aufgrund verbesserter Zell-Zell-Kontakte und Synchronisation, die sowohl in primären Inselchen17,18,19,20,21 sowie MIN6 auftritt Zellen16,18. Um Verluste in der sekretochen Reaktion auf die Glukosestimulation zu verhindern, ist es wichtig, die Zellen so niedrig wie möglich zu halten und die Zellen nur 6-8 Wochen zu kultitonieren, bevor eine neue Durchstechflasche aus flüssigen Stickstoffvorräten auftaut. Änderungen an der Beschichtungsstrategie in Protokollabschnitt 2 können vorgenommen werden, um sich bei Bedarf an die verfügbare Ausrüstung anzupassen. Die Beschichtung von InsGLuc MIN6-Zellen in 96-Well-Platten für Sekretionstests bietet eine große Anzahl von Brunnen für experimentelle Manipulationen (einschließlich Replikationen) sowie die Aufrechterhaltung der Genauigkeit der Beschichtung in einer normalen Laborumgebung, wie die Beschichtung in Geschirr mit höherem Brunnen Nummern erfordern oft spezielle Ausrüstung in der Regel in Hochdurchsatz-Screening-Kerne.
Aktuelle Assays für die Insulinsekretion, mit Ausnahme des hier beschriebenen indirekten Luziferase-Assays, umfassen: ELISAs, die kolorimetrische Auslesungen (Direkttest) verwenden, Radioimmunoassays (Wettbewerbstest), die radioaktive Auslesungen verwenden, FRET-basierte Antikörper Wettbewerbstest22 und HTRF23, der FRET zwischen farbstoffgebundenen Antikörpern zur direkten Messung von Insulin und DNA-Aptamern24verwendet. Jede dieser Methoden hat ihre eigenen Vorteile, aber im Allgemeinen sind sie teurer und/oder zeitaufwändiger als ein luziferase Assay. Eine wichtige Einschränkung des InsGLuc-Assays ist die Tatsache, dass die lumineszierende Aktivität der mit sekreseten Luziferase nur ein Proxy für die tatsächliche Insulinsekretion ist. Darüber hinaus ist kein erwarteter Unterschied in der Luziferaseaktivität zwischen Gaußase mit Fragmenten von C-Peptid auf seinem N- und C-Termini oder Gaußsia innerhalb des Proinsulinproteins zu erwarten, da Gaussia luciferase erfolgreich als Tag verwendet wurde, um die Sekretion von andere Proteine25. Dies unterstreicht die Anforderung von Bestätigungsstudien mit Assays, die verarbeitetes Insulin gezielt messen. Alternativen zu direkten und indirekten Messungen der Insulinsekretion können auch verwendet werden, um die Zellfunktion zu beurteilen. Es gibt eine Vielzahl von optischen Reportern für Auslesungen, einschließlich ATP:ADP-Verhältnis, Kalziumzufluss, NAD+/NADH-Verhältnis, extrazelluläre signalregulierte Kiinasen (ERK) Aktivierung oder zyklische adenosine Monophosphat (cAMP) Ebenen26.
Insbesondere die zukünftigen Anwendungen von InsGLuc scheinen sich im Hochdurchsatz-Screening zu befinden. Dieser Assay wurde bereits in einer Handvoll veröffentlichter kleiner Bildschirme1,2 verwendet und unveröffentlichte größere Bildschirme sind entweder7 oder im Gange. Die Entwicklung anderer Iterationen dieser Technologie kann das Markieren anderer sezernierter Islethormone mit Luziferasen beinhalten, um schnelle Messungen zu erleichtern, z. B. für Glucagon oder Somatostatin. Änderungen können in jedem Fall vorgenommen werden, wenn die Zelllinie mit alternativen Ansätzen wie CRISPR/Cas9, Lentivirus oder transposase-vermittelter Insertion in jede geeignete Beta-Zelllinie neu erstellt wird. Weitere mögliche Modifikationen an der ursprünglichen Reporter können ersetzen alternative sezernierte Luziferasen für Gaußsie oder die Kombination mehrerer verschiedener sezernierter Luziferasen mit verschiedenen Hormonen für einen multiplexierten Assay verbunden. Jenseits der Zellkultur bietet die CRISPR/Cas9-Technologie die Möglichkeit, ein Mausmodell zu erzeugen, bei dem eine geeignete Luziferase in den C-Peptid-Codierungsbereich von Ins2 im Genom eingeschlagen wird. Eine solche Maus wäre möglich, wenn man bedenkt, dass transgene Mäuse mit GFP an derselben C-Peptid-Stelle27 angeschlagen wurden und die Messung der endogenen Zellfunktion mit einem Luziferase-Assay in vivo oder ex vivo ermöglichen würde.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken allen aktuellen und ehemaligen Mitgliedern des Cobb-Labors für wertvolle Arbeit und Diskussionen und Dionne Ware für die Amtshilfe. Michael Kalwat wird von der Juvenile Diabetes Research Foundation SRA-2019-702-Q-R unterstützt. Möglich wurde diese Arbeit durch NIH R37 DK34128 und Welch Foundation Grant I1243 an Melanie Cobb. Frühe Teile dieser Arbeit wurden auch von einem NIH F32 DK100113 an Michael Kalwat unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials | |||
| rIns-GLuc stable MIN6 cells | Parental MIN6 cell line stably expressing pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc and maintained in 250 ug/ml G418 | ||
| DMEM | Sigma | D6429 | 4.5 g/L glucose media |
| fetal bovine serum, heat-inactivated | Sigma | F4135 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fisher Scientific | SV30010 | |
| beta-mercaptoethanol | Thermo-Fisher Scientific | BP 176-100 | |
| glutamine | Thermo-Fisher Scientific | BP379-100 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T3924-500 | |
| G418 | Gold Biotechnology | G418-10 | Stock solution 250 mg/mL in water. Freeze aliquots at -20C. |
| T75 tissue culture flasks | Fisher Scientific | 07-202-000 | |
| 96 well tissue culture plates | Celltreat | 229196 | |
| Reagent reservoirs (50 mL) | Corning | 4870 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secretion assay reagents | |||
| BSA (RIA grade) | Thermo-Fisher Scientific | 50-146-952 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| KCl | Thermo-Fisher Scientific | P217-500 | |
| NaCl | Thermo-Fisher Scientific | S271-3 | |
| Hepes, pH 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 50-213-365 | |
| NaHCO3 | Thermo-Fisher Scientific | 15568414 | |
| MgCl2 | Thermo-Fisher Scientific | M9272-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C-7902 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optional drugs for stimulation experiments | |||
| Diazoxide | Sigma | D9035 | Stock solution: 50 mM in 0.1N NaOH. Add equal amount of 0.1N HCl to any buffer where diazoxide is added. |
| epinephrine (bitartrate salt) | Sigma | E4375 | Stock solution: 5 mM in water |
| PMA (phorbol 12-myristate) | Sigma | P1585 | Stock solution: 100 µM in DMSO |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guassia assay materials | |||
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Thermo-Fisher Scientific | S374-500 | |
| Glycerol | Thermo-Fisher Scientific | G334 | |
| Sodium Bromide | Thermo-Fisher Scientific | AC44680-1000 | |
| EDTA | Thermo-Fisher Scientific | AC44608-5000 | Stock solution: 0.5 M pH 8 |
| Tris base | RPI | T60040-1000.0 | Stock solution: 1 M pH 8 |
| Ascorbic Acid | Fisher Scientific | AAA1775922 | US Patent US7718389 suggested ascorbate can increase coelenterazine stability. |
| Na2SO3 | Sigma | S0505-250G | US Patent US8367357 suggested sulfite may decrease background due to BSA |
| Coelenterazine (native) | Nanolight / Prolume | 3035MG | Stock solution: 1 mg/ml in acidified MeOH (2.36 mM) |
| OptiPlate-96, White Opaque 96-well Microplate | Perkin Elmer | 6005290 | Any opaque white 96 well plate should be sufficient. Clear bottom plates will also work, however some signal will be lost. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Synergy H1 Hybrid plate reader or equivalent | BioTek | 8041000 | A plate reader with luminescence detection and 96-well plate capabilities is required. |
| 8-channel VOYAGER Pipette (50-1250 µL) | Integra | 4724 | An automated multichannel pipette is extremely useful for rapid addition of luciferase reagents and plating cells in 96 well format |
| 8-channel 200 µL pipette | Transferpette S 20-200 µL | 2703710 |
References
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- Rajan, S., et al. In vitro processing and secretion of mutant insulin proteins that cause permanent neonatal diabetes. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (3), E403-E410 (2010).
- Watkins, S., et al. Imaging Secretory Vesicles by Fluorescent Protein Insertion in Propeptide Rather Than Mature Secreted Peptide. Traffic. 3 (7), 461-471 (2002).
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