Summary
在此过程中，基于DsRed的表位配体被固定，以产生一种高度选择性的亲和树脂，用于从粗植物提取物或细胞培养上生子中捕获单克隆抗体，作为蛋白质A的替代品。
Abstract
单克隆抗体（mAbs）的纯化通常通过蛋白质A亲和色谱法实现，该色谱可占整个工艺成本的25%。因此，在工业规模制造中，具有成本效益的替代方案，在工业规模制造中，生产了大量单 mAb。在这里，我们提出了一种将基于DsRed的表位配体固定到交联的甘蔗树脂的方法，允许在不使用蛋白质A的情况下从粗植物提取物中选择性地捕获HIV中和抗体2F5。线性表位ELDKWA首先与荧光蛋白DsRed进行基因融合，融合蛋白在转基因烟草（尼科蒂亚娜塔巴库姆）植物中表达，然后通过固定金属-电偶亲相色谱进行纯化。此外，针对高配体密度、高效耦合和低成本，对基于活化交联甘蔗的方法进行了优化。pH和缓冲液组合物以及可溶性配体浓度是耦合过程中最重要的参数，采用实验设计方法进行了改进。对所得的亲和树脂进行了测试，使其能够在粗植物提取物中选择性地结合目标mAb，并优化了洗脱缓冲液，使其具有高mAb回收率、产品活性和亲和树脂稳定性。该方法可以很容易地适应其他具有线性表位的抗体。与蛋白质 A 相比，新树脂允许更温和的洗脱条件，还可以降低 mAb 生产初始捕获步骤的成本。
Introduction
生物制药产品对于治疗几乎所有医学分支中的各种疾病都非常重要。单克隆抗体（mAbs）主导生物制药市场，预计到2020年全球销售额将达到近1100亿欧元。mAbs青睐的表达平台是中国仓鼠卵巢细胞系，在培养上清3、4中通常产生高达10 g+L-1的高mAb分子。然而，由于培养基物成本高，且需要无菌发酵5，哺乳动物细胞培养物中的mAbs生产成本高昂。替代表达平台，如工厂，可能为工业制造6，7提供更快、更简单、更便宜和更可扩展的方法。
除了与哺乳动物细胞培养相关的成本外，广泛使用蛋白质 A 亲和色谱进行产品捕获是 mAbs 工业生产的主要成本驱动因素。蛋白质A天然存在于金黄色葡萄球菌细胞的表面，它与某些鼠和人体抗体的可结晶（Fc）片段区域结合，从而作为防御机制来逃避体液免疫系统8。蛋白质A已成为从细胞培养超生物中捕获mAbs的行业标准，也被广泛用于研究界，因为它是高度选择性的，通常达到95%的mAb纯度在一个单一的步骤8。毫不奇怪，过去二十年蛋白质A的销售与mAbs8的销售非常接近。根据生产规模，蛋白质A的成本可以相当于总工艺成本的25%以上，从而影响治疗性mAbs的市场价格，最高可达2000克-15，9。因此，具有类似纯化性能的替代色谱树脂有可能大幅降低生产成本，使更多的患者能够获得基于抗体的疗法10、11 ，12.此类替代品还可以规避蛋白质 A 色谱的缺点，包括 pH 值低（通常为 <3.5）的恶劣洗脱条件，可能导致 mAbs 发生共性变化，促进聚集13.重要的是，蛋白质A仅对某些IgG子类的Fc区域有选择性，因此具有截断结合域的非功能分子可能与完整的产物5共同纯化，而mAb衍生物如单链可变片段根本不与蛋白质A结合。
在这里，我们描述了一种替代亲和色谱树脂，用于捕获HIV中和mAb 2F5使用其线性表位ELDKWA（一个字母氨基酸代码）5，14。我们从基因上将2F5表位与荧光蛋白DsRed的C端融合，作为载体和报告分子，在转基因烟草中产生产生的蛋白质DSRed-2F5-E pitope（DFE） （尼科蒂亚娜·塔巴库姆植物.DFE通过单步固定金属-电亲色谱（IMAC）进行纯化。使用N-羟基琥珀化（NHS）激活的交联琼脂柱进行化学耦合，将纯化DFE亲和配体固定到交叉链接琼脂树脂上。然后采用统计实验设计优化固定程序，提高耦合效率15.从抗体纯度、产量和配体稳定性的角度对mAb 2F5的纯化策略进行了评价。与结合Fc区域的蛋白质A相比，DFE与2F5的互补性决定区域结合，确保用完好的副体纯化分子。我们的概念可以很容易地适应任何mAb与线性表位或其他基于肽的亲和配体，可以很容易地识别微阵列研究16。
图1：制备表位亲和树脂的工艺流程方案，可用于从粗植物提取物或细胞培养上生子中捕获mAbs。（A） 亲和配体DFE在转基因烟草植物中表达。在收获的叶子被均匀化之前，包括热沉淀步骤 （B） 。（D） 通过袋过滤、深度过滤和0.2μm无菌过滤来澄清粗植物提取物。（E） DFE 然后由 IMAC 进行纯化.（F， G）纯化DFE亲和配体固定在EDC/NHS激活的交联琼脂柱上。（H） 携带T-DNA编码抗体2F5的细菌培养物用于生长在植物中的N.benthamiana植物（I）的瞬态表达。（J） N. 本查米亚纳叶被收获和处理，如 D. （K） mAb 2F5 使用 DFE 亲缘柱 （L） 从澄清的提取物中纯化.请点击此处查看此图的较大版本。
Protocol
1. 培育转基因烟草植物
注：DFE融合蛋白和转基因植物的生成设计在5、17别处作了描述。
- 在土壤中发芽转基因烟草幼苗。用1.0克的灌溉植物L-1肥料溶液。当植物生长到直径为 ±0.04 m 时，将其转移到单个 100 mm x 100 mm x 60 mm（长度、宽度、高度）的盆中。
- 在具有16小时光周期（25/22°C光/暗温度机制）的温室中培育转基因烟草植物，具有70%的相对湿度和1.0克的自动施肥。L-1肥料溶液每小时15分钟。
- 7周后，收获除植物茎底部的四片叶外的所有叶子。立即处理收获的叶子，如下所述。
2. 宿主细胞蛋白的热沉淀
- 在不锈钢加热容器（0.3 m x 0.3 m x 0.3 m）中设置一个工作体积为 20 L 的水浴。开始时，在水浴中放置一个磁泵，以5Lmin-1的流量永久搅拌液体。在水浴上安装可调节恒温器，用于温度控制（步骤 2.4 和 2.8）。
警告：以下所有步骤高达 2.10 涉及热液体的处理。佩戴适当的个人防护设备，包括热绝缘手套和护目镜。 - 在水浴中加入15L的去离子水，将液体加热至70°C。
- 将装有 5 L 去离子水的 10 L 铲斗放在磁力搅拌器上。将磷酸钠加入120 mM的最终浓度。使用10M盐酸将pH-调整至8.14。当所有组件溶解后，从步骤 2.2 将产生的浓缩发泡缓冲液 （5 L） 添加到水浴中。
- 搅拌水浴，直到温度达到70°C。如有必要，使用 10 M 盐酸将 pHH 调节到 8.14。达到所需温度和 pH 值后，继续搅拌至少 15 分钟，以确保整个组件处于热平衡状态。
- 准备一个 20 L 桶（0.3 m x 0.3 m x 0.3 m），在 ±17 °C 温度下充满去离子水（步骤 2.9 需要）。
- 从步骤1.3制备400克收获的烟叶等分。将一个等分放入穿孔篮中（0.2 米 x 0.2 米 x 0.2 米;孔宽至少 0.02 m x 0.02 m）。避免用植物材料过度填充篮子或将叶子包装得太紧，以免损坏组织。
- 从步骤 2.4 开始，将篮完全浸入热发白缓冲液中，并确保所有叶子都留在液体表面之下。如有必要，使用热稳定的硅胶勺将叶子保持在表面之下。
- 在泵仍在搅拌液体时，在发泡液中孵育烟叶 1.5 分钟。在整个潜伏期监测液体温度。避免用烟叶堵塞泵入口。
- 从发泡缓冲液中取出烟篮，将残留的缓冲液从叶子中取出30s。将烟篮转移到装满冷水的桶中（从步骤2.5开始），将叶子浸泡30s。取出篮子，从叶子中排出残留水。在均质化之前为 30 s（步骤 3）。
- 重复步骤2.6至2.9，从2.6起使用新鲜的等分，直到处理整个收获的生物量。持续监控和调整水浴中洗浴缓冲液的pH和温度。
注：当处理整个生物量需要几个发泡周期时，在冰上储存的白化植物材料可以储存长达 30 分钟。发白的叶子也可以储存在真空密封袋中，在+80°C下至少3周。但是，建议立即处理，因为长时间存储会降低 DFE 产量。
3. 蛋白质提取和澄清
警告：以下步骤涉及带旋转刀片的搅拌机。在电机单元上通电或安装时，请勿在搅拌机容器中工作。
- 将150克（湿质量）的白烟叶（步骤2.9）放入搅拌机容器内，并加入450 mL的萃取缓冲液（50 mM磷酸钠、500 mM氯化钠、10 mM脱硫钠、pH 7.5）。紧闭搅拌机盖，防止植物材料或缓冲液溢出。
- 使叶子均匀化3倍30秒，每个脉冲之间有30秒的断裂。确保所有叶子均质化，并且没有粘到搅拌机容器的顶部。如有必要，在破裂时打开搅拌机，并使用干净的硅胶勺将粘在容器上部的叶子向下推下。
- 均质化后，取一个1.0 mL的均质样品进行后续分析（步骤7）。
- 在足够大小的容器中收集均质物（例如，如果使用总生物量为 1.0 kg 时，请使用容量至少为 5 L 的容器）。重复步骤 3.1 到 3.3，直到所有变白的生物量均质化。
- 将袋式过滤器安装到过滤器安装件中，并将另一个尺寸合适的容器（参见 3.4）放在组件下方。以 ±0.15 Lmin-1的速率将均质剂涂在袋过滤器中。在每升后采集袋液样品，以便进行后续分析（步骤7），并使用浊度计或类似装置测量袋滤池的浊度，作为1：10稀释提取缓冲液。
- 进一步明确袋滤池使用0.02 m2的K700（顶部）和KS50（底部）深度过滤层组合每升袋滤池。施加 3.0 L 最小-1μm-2的流量，最大压力为 0.2 MPa。然后，通过前述的0.2μm无菌过滤器，通过澄清的滤液去除残余颗粒。
4. DFE 亲和力连体净化
- 使用洗脱缓冲液（10 mM磷酸钠、300 mM imidazole、pH 7.4）、洗涤缓冲液（10 mM磷酸钠，pH 7.4）和平衡缓冲液（20 mM磷酸钠、500 mM氯化钠、pH 7.4）制备快速蛋白质液相色谱系统。每公斤叶生物量（±2.5 L深度滤液）安装含有±50 mL的合合交联甘蔗脂的柱。
- 通过应用 5 列体积 （CV） 的 200 mM 硫酸镍溶液，用 5 CV 洗脱缓冲液清洗该柱。使用 50 cmh-1的流速，并监控 260、280 和 558 nm 的 UV 信号，用于所有后续色谱步骤。
- 使用 10 CV 平衡缓冲器对列进行平衡。然后，将澄清的植物提取物（从步骤 3.6）的 50 CV 加载到条件柱上。
- 用 10 CV 的洗涤缓冲液清洗柱子。使用 5 CV 洗脱缓冲液洗脱 DFE 融合蛋白，并在 280 nm 和 558 nm 的 UV 信号增加到高于基线 5 mAU 时收集含产物的分数。
- 从洗脱分数中抽取 0.2 mL 样品，以测量总可溶性蛋白 （TSP） 浓度（步骤 7.1）、DFE 浓度（步骤 7.2 和 7.3）和 DFE 纯度（步骤 7.4）。
- 在色谱系统上安装含有 ±50 m0 mL 的交联 dextran 树脂的柱。使用 5 CV 耦合缓冲液（200 mM HEPES、500 mM 氯化钠、pH 8.5）对柱进行平衡。注入 10 mL 的 DFE 洗脱分数（步骤 4.4）进行缓冲液交换，并在 280 和 558 nm 处监测紫外线吸收。
- 一旦 280 nm 和 558 nm 处的 UV 信号增加到高于基线的 5 mAU 以上，则收集包含 DFE 的分数。取0.2 mL样品，确定TSP浓度、DFE浓度和DFE纯度（步骤7）。
- 在离心机中，使用离心集中管在3000 x g下在4°C下将纯化DFE样品（从步骤4.7）浓缩至15g L-1，30分钟。继续耦合反应（步骤 5）。
注：如果浓度或耦合步骤不能立即执行，则将 DFE 溶液储存在 4°C。
5. 将DFE与已激活的交联甘蔗树脂耦合
注：在满足所有耦合设备和解决方案之前，请勿更换用于存储 NHS 激活柱的异丙醇。切勿让柱子干涸。
- 设置实验设计（DoE）模型，以pH、缓冲液组合物和DFE浓度为因子，优化DFE与活性树脂的耦合。DoE 方法的详细信息将在其他地方15进行说明。
- 在浓度范围为 0.5±15 g* 的浓度范围内制备亲和配体溶液（从步骤 4.8 开始）L-1或 DoE 中定义，并将其存储在冰上，直到耦合反应准备就绪（步骤 5.5）。用DFE溶液填充至少10个2 mL注射器，并准备一个适配器，将注射器安装在床容量为1.0 mL的NHS激活的交联琼脂柱上。
- 对于用于耦合的每10列，制备30 mL的失活溶液（0.5M乙醇胺、0.5 M氯化钠、pH 8.3）、30 mL的低pH溶液（0.1M醋酸钠、0.5M氯化钠、pH 4.0）和10 mL的储存溶液（0.05 M磷酸二钠），0.1% （m/v） 阿齐德钠，pH 7.0）。
- 在管子中制备20 mM盐酸，并在冰上孵育至少20分钟。准备一个精密刻度，以监测耦合反应过程中所有步骤的流过分数（步骤5.7）。
- 打开密封的 NHS 激活交联琼脂柱，并将注射器适配器安装在柱入口。在将缓冲液连接到注射器之前，通过在适配器入口上施加一滴缓冲液，防止任何空气进入柱。
- 用6 mL的冰冷1 mM盐酸（从步骤5.4开始）以<1 mLmin-1的流速清洗柱子，并立即进入步骤5.7。
- 使用 2 mL 注射器以 <1 mLmin-1的流速注射 1.5 mL DFE 溶液（步骤 5.2），并在精度刻度（步骤 5.4）上收集流过分数，以便后续分析（步骤 7）。密封两端的柱子，在 22°C 下孵育 15-45 分钟，具体取决于 DoE 设置。
- 注入6 mL的失活溶液，然后注入6 mL的低pH溶液，流速为<1 mL min-1，从树脂中去除非共价结合的配体。然后注入6 mL的失活溶液，孵育柱15分钟。
- 将 6 mL 的低 pH 溶液注入柱中，然后注入 6 mL 的失活溶液。然后，再向柱中注入6mL的低pH溶液。
- 将 2 mL 的存储溶液注入柱中，并在 4°C 下存储。
6. 测试从澄清植物提取物中净化mAbs
- 从首选的基于细胞的表达系统中制备含有2F55或上清液的澄清植物提取物100mL，也含有2F5。
- 制备平衡缓冲液（20 mM磷酸钠，500 mM氯化钠，pH 7.4），低pH洗脱缓冲液（0.05 M柠酸酸，0.05 M氯化钠，pH 4.0~3.25），以及高离子强度洗脱缓冲液（1.0~4.0 M氯化镁，0.1M HEPES，pH 8.0）
- 用缓冲液冲洗色谱系统。在色谱系统上安装 DFE 亲和柱（从步骤 5.10 开始），并在 1.0 mL 最小-1的流速下与 5 CV 平衡缓冲液进行平衡。在 280 nm 处监测紫外线吸收。
注：将植物提取物或细胞培养上清液加载到柱上会导致背压增加。将高压警报设置为 0.2 MPa，以避免损坏色谱系统或 DFE 柱。 - 以0.5 mLmin-1的流速将澄清的植物提取物或上清液（步骤6.1）加载到柱上，以保证接触时间为2分钟。 收集2 mL分数的流经样品，以进行突破性曲线重建（步骤7.3）。如果无法立即进行样品分析，则将流过样品储存在 4°C。
- 使用 6 CV 平衡缓冲液清洗列。在此步骤的开头、中间和结尾收集洗涤的样本。
-
具有 5 CV 低 pH 洗脱缓冲液或高离子强度洗脱缓冲液（0.1 M HEPES，1.25 M 氯化镁，pH 8.0）的 Elute mAb 2F5。当 UV 280 nm 信号增加到高于基线的 5 mAU 时，收集 DFE 分数。
- 优化每个表位-抗体对的洗脱缓冲液。对于 2F5，1.25 M 氯化镁实现了产品回收和配体稳定性之间的最佳平衡。
注：氯化镁溶液容易沉淀。因此，将氯化镁溶解在±700 mL的水中。将 HEPES 单独溶解在 100 mL 水中，并将 pHH 调节到 8.0。将溶解的氯化镁溶液添加到 HEPES 溶液中，并将水添加到 1.0 L 的最终体积中。溶解氯化镁后不要调整pH，因为这会导致沉淀。
- 优化每个表位-抗体对的洗脱缓冲液。对于 2F5，1.25 M 氯化镁实现了产品回收和配体稳定性之间的最佳平衡。
- 使用布拉德福德方法分析步骤 6.4_6.6 期间采集的所有样品、多氯二硫酸锂聚丙烯酰胺凝胶电泳 （LDS-PAGE） 和表面质子共振 （SPR） 光谱（步骤 7）。
7. 样本分析
- 使用布拉德福德方法18，19测量TSP浓度。
- 在三合一中，将每个样品的移液器 2.5 μL 放入 96 孔板的单个孔中。使用八种牛血清白蛋白 （BSA） 标准，涵盖范围为 0~2，000 mg*L-1.
- 在每个井中加入 200 μL 的布拉德福德试剂，然后轻轻上下移液进行混合。保持移液器水平，以避免形成扭曲后续读出的气泡。
- 在 22°C 下孵育板 10 分钟，并在分光光度计中测量 595 nm 的吸光度。根据通过 BSA 参考点的标准曲线计算样本中的 TSP 浓度。
- 通过荧光测量法量化 DFE
- 在三联中，将每个样品的移液器50μL放入黑色96孔半面积板的单孔中。包括六个DsRed标准，涵盖范围0~225毫克*L-1.
- 使用 530 × 30 nm 激励滤波器和分光光度计中的 590 ± 35 nm 发射滤波器测量荧光两次。根据通过 DsRed 参考点的标准曲线计算样本中的 DFE 浓度。
- 通过SPR光谱20测量2F5浓度。
- 准备 HBS-EP 运行缓冲液 （10 mM 4-（2-羟基）-1-管道乙烷酸 （HEPES）， 3 m M 乙烯二甲四乙酸 （EDTA）， 150 mM 氯化钠， 0.005% v/v Tween-20， pH H 7.4）， 并通过 0.2m 真空吸尘器进行过滤消毒瓶顶过滤器。将缓冲液解气15分钟。
- 在对接卡博格甲基化 dextran 表面芯片并使用主函数对系统进行平衡之前，将 HBS-EP 运行缓冲器连接到 SPR 仪器。以 30 μL 最小-1的流速开始手动运行，并在流量 30 μL 最小 -1 的流量下，在流细胞 1 和 2 上交替注入 30 mM 盐酸和 25 mM 氢氧化钠（每次注射两次），从而对芯片表面进行调节，流量为 30 μL 最小-1 1 分钟。
- 准备300 μL的500毫克*L-1蛋白 10m 醋酸钠（pH 4.0）中的溶液。含有0.4M 1-乙-3-（3-二甲基氨基丙基）和0.1M氢酸酯（EDC）和0.1M NHS的解冻小瓶，在16，000 x g下用离心机1分钟，然后混合70μLEDC和70μL的NHS。
- 将 EDC/NHS 混合物和蛋白质 A 溶液转移到 7 mm 塑料样品小瓶，并放置在样品架中。在流量1和2的流量下，将EDC/NHS混合物注入流细胞1和2，以10μL最小-1的流量10分钟，激活卡博格甲基化脱氧核片表面。
- 将蛋白质 A 与活性的甲基化脱氧核素表面耦合，在流细胞 2 上注入蛋白质 A 溶液，流速为 15 μL 最小-1 15 分钟。
- 在耦合蛋白质A时，将1.0M氢盐酸乙醇胺（pH 8.5）的瓶解冻，并在16，000 x g下将离心机解冻1分钟，将150μL转移到7毫米塑料小瓶中，并放入仪器中。步骤 7.3.5 完成后，通过在流单元 1 和 2 上注入乙醇胺溶液，以 10 μL 最小-1的流速 7 分钟来停用芯片表面。
- 在流单元1和2上交替注入30 mM盐酸和25 mM氢氧化钠（每次注射两次），在流率为30 μL-1 0.5分钟，从而调节芯片表面。
- 在HBS-EP运行缓冲液中制备浓度为500μg的抗体2F5标准*L-1和含有 HBS-EP 中 2F5 的稀释样品，最终浓度在 20~1，000 μg*L-1.以30μL最小-1的流速在流细胞1和2上注入样品和标准，3分钟。每15个样品后注射2F5标准。
- 从每个样品的流单元2（测量单元）信号中减去流单元1（参考单元）的相对单位（RU）信号，并根据2F5标准注射的RU信号计算抗体浓度。
- 每次样品或标准注射后，在流细胞1和2上注入30 mM盐酸，流速为30μL-1，以0.5分钟再生芯片表面。
- 将步骤 6.4 中每个流过样品的 2F5 浓度与流通体积进行绘制，以获得 2F5 突破曲线。当负载 2F5 浓度达到 10% 时，计算注入 2F5 的量，以获得 10% 的动态绑定容量 （DBC）。
- 通过 LDS-PAGE 分析蛋白质样本。
- 打开一个即用型 4-12% BisTris LDS 聚丙烯酰胺凝胶，并将其放入电泳模块中。将 800 mL 的运行缓冲液（50 mM MES、50 mM Tris 碱基、0.1% （m/v） SDS、1 mM EDTA、pH 7.3）转移到模块中，并加入 0.5 mL 的抗氧化溶液。
- 在1.5 mL反应管中，将10μL的加载缓冲液与4μL的还原剂和26μL的蛋白质样品混合。在80°C下在热块中孵育管10分钟。将管在 500 x g下离心 30 s。
- 将 LDS 聚丙烯酰胺凝胶（每通道 10 μL 样品）加载，并在单独的通道中加载 5 μL 的预染色蛋白质标准 （10-180 kDa）。
- 关闭电泳室并连接电源。电泳应运行 40 分钟，在常数 200 V 下运行。
- 从电泳室中取出凝胶。在 19 rpm 的摇床上打开凝胶奶机，在水中清洗凝胶 15 分钟。在 19 rpm 的摇床上将凝胶在染色溶液中染色 1 小时。
- 在 19 rpm 的摇床上将凝胶在水中污渍 1 小时。使用胶片扫描仪扫描凝胶。
Representative Results
亲和配体的表达与纯化
融合蛋白DFE在温室生长的转基因烟草植物中表达。产量为±120mg+kg-1叶质量，每株平均生物量为±130克。在脱脂前，在粗植物提取物中，DFE纯度为TSP的<5%，但在70°C加热后增加至+40%，为1.5分钟，沉淀了+gt;97%的宿主细胞蛋白。洗发步骤很容易集成到收获和提取程序（图1），并花了不到2小时的额外时间，包括设置水浴。DFE 的整体回收量为 23.5 mg kg 1，纯度为 >90%。造成产品损失的步骤是发泡、深度过滤和IMAC，具体损失分别为40%、27%和45%。深度滤波器容量平均为135 ± 36 Lm -2 （=SD， n=3），因此在文献21中报告的值的上部范围。DFE产量随植物老化而增加（图2）。
NHS激活色谱柱上亲和配体的固定
在初始耦合测试中，我们发现HEPES缓冲液（pH 8.3）将耦合效率提高到89 ± 6%（±SD， n=3），而制造商推荐的碳酸氢盐缓冲液的耦合效率为78 ± 9%（±SD， n=3）。因此，HEPES被用于所有后续耦合实验。选择了 DoE 方法，以优化 DFE 与 NHS 激活的交联琼脂树脂的耦合效率。树脂上固定的 DFE 的绝对量随注入柱中的 DFE 质量而增加，并稳定在 ±15 g*L-1，而耦合率随着注入更多的DFE而持续下降（图2）。酸性缓冲液的耦合率也降低了 50%，表明需要根据情况筛选每个配体的适当耦合条件。利用DoE软件的数值优化工具，确定了耦合产量、固定DFE的绝对数量和列成本方面的理想条件。最理想的条件（pH 9.0 和 7.0 mg DFE 每 1 mL 的交联甘蔗脂）位于一个大的高原上，因此非常坚固。DFE分子即使在耦合后仍保留其红色荧光，并且颜色强度对应于固定DFE的总量（图2）。因此，柱颜色可以作为一个简单的质量控制参数来估计耦合效率和列质量。荧光还证实DFE融合蛋白组装在原生的DsRed的四分之一状态。
图2：对NHS激活的交联琼脂树脂的DFE固定性优化。（A） LDS-PAA凝胶，含有西体斑点覆盖的均质和洗脱样品，来自未发白的转基因DFE植物提取物。播种后38、45或52天进行植物收获。西方的污点是使用抗他6抗体5进行。（B） 如果耦合 pH 和纯化 DFE 的总质量注入到 NHS 激活的交联琼脂胶柱上，则依存的偶联 DFE 亲和配体总量。红点表示为构建响应表面模型而执行的实际实验。（C） 耦合过程之后的 DFE 关联列。这些数字对应于面板 B. dps = 播种后天数中突出显示的耦合条件。请点击此处查看此图的较大版本。
使用 DFE 亲和树脂测试 2F5 隔离
重组剂2F5抗体在尼科蒂亚纳本查米亚纳植物中暂时产生，生长在植物5。使用亲和柱和+7.0毫克纯化DFE（步骤6）对从粗植物提取物中捕获的2F5进行了测试。蛋白质A树脂的洗脱通常涉及酸性缓冲液（pH=3.3）13。因此，我们最初评估了 DFE 列的不同低 pH 洗脱缓冲液 （pH 6.0-3.25）。在pH值低于4.5时，2F5的洗脱成功，在pH 3.25下的最高回收率为±35%。然而，低pH洗脱灭活性抗体（由SPR光谱学确认）和DFE配体（如颜色损失和较低的DBC所示，图3）。后者是预料之中的，因为本地的DsRed在pH <4.022，23处变性。为了避免产品和配体变性，我们测试了氯化镁作为替代洗脱剂，因为它以前曾被用来从其他亲和树脂24中洗脱mAbs。氯化镁浓度为1.25 M，足以从DFE亲和树脂中洗去2F5，回收率为105 ±11%（±SD，n=3），纯度为97±3%（±SD，n=3）。这种性能与蛋白质A树脂25、26相当。DFE纯化2F5抗体和合成配体Fuzeon的平衡解离常数（K D）为791 pM，而蛋白A纯化对应物的平衡解离常数为763 pM5。此外，在总共25个结合和洗脱周期中，树脂中未观察到大量颜色损失。DFE亲和力树脂的DBC在10%2F5突破过程中线性下降至初始值的±15%（图3）。
图3：使用DFE亲和树脂从澄清的植物提取物中检测2F5的分离。（A） DFE 亲和树脂在一个洗脱周期后使用4.0-3.0范围内不同pH值的缓冲液，在pH 6.0的中和步骤后使用相同的树脂。（B） DFE亲和树脂在一周六周期的2F5纯化后，使用1.25M或4.00 M氯化镁作为洗脱剂。（C） 正面载荷实验（突破曲线）的色谱图，以确定使用氯化镁作为埃乐的DFE树脂的循环依赖性动态结合能力。对4.0 M和1.25 M氯化镁洗脱缓冲液和各种循环数进行了突破曲线测量。（D） 使用 1.25 M 氯化镁作为稀释剂的 DFE 的循环依赖性动态结合能力。请点击此处查看此图的较大版本。
Discussion
新型亲和树脂的应用
我们已经表明，用于捕获mAbs的定制亲和色谱树脂可以通过固定含有mAb特异性表位的配体到NHS激活的交联琼脂蔗质来制造。要设计这样的树脂，必须知道表位序列并使用线性表位。由此产生的树脂有利于捕获mAbs，因为它们可能会取代昂贵的蛋白质A亲和色谱步骤。在我们的案例研究中，2F5 和 DFE 之间的相互作用由表位 - 副体结合来调节，因此我们的配体应比蛋白质 A 更具选择性，后者与大多数鼠和人类 IgG 的 Fc 区域结合。由于每个 mAb 都需要单独的配体，我们的方法最初可能主要适用于大规模产生的抗体。然而，通过结合我们的方法与快速的植物性瞬态蛋白表达，新的亲和配体可以在2周内制备27，用最小的努力28。因此，该方法也适用于小规模mAb纯化。
亲和配体的生产和潜在改进
工厂为亲和配体5、29、30提供快速、安全的生产平台，如本案例研究中介绍的DFE融合蛋白。一步地对植物材料进行发泡，大大减少了宿主细胞蛋白的数量，并可轻松集成到标准澄清程序中。然而，配体在当前设置中恢复率较低，可能是由于其温和的热稳定性和一些与过滤层的非特定约束力，如其他产品31、32、33所所报道的那样。因此，工程载体以提高其热稳定性可能有助于提高配体产量，在未来，如描述的疟疾疫苗候选CCT，抗肿瘤酶PpADI或嗜血β-葡糖酶34， 35，36.深度过滤步骤也是如此，蛋白质工程可能有助于减少与过滤材料的非特定结合37。DFE和类似配体的生产成本也可以通过提高使用絮凝剂或过滤添加剂38、39的整体澄清效率来降低。
当DsRed用作载体时，它形成四元复合物。这是有利的，因为它增加了每个配体表位的数量，但它也可能使配体在亲和色谱法期间更容易被分解或变性。因此，像mCherry这样的单体载体蛋白可能更可取，因为它在低pH值40下保持稳定，并且表位的串联重复会增加配体的多样性，从而增加树脂容量5，26,41.对于简单的载体表蛋白（即，那些没有二硫化物键或转化后修饰的蛋白），微生物生产系统可以降低制造成本，使配体与蛋白质A更具竞争力。例如，绿色荧光蛋白在细菌细胞中表达，其产量为±1 gμkg-1生物量，这将显著降低配体生产成本42。
无论表达宿主如何，在耦合过程中都需要纯化的亲和配体，以尽量减少宿主细胞蛋白或培养基体的固定，否则会降低树脂选择性和容量。IMAC纯化的聚他氨酸标签在一步中提高了纯度至+90%，促进快速和廉价的配体生产5，43，44。然而，融合标记的位置是重要的，因为它有潜在的消毒阻碍表位结合或诱导从载体45，46的标记或表位的裂解。
NHS激活色谱柱上亲和配体的固定
固定是手动或使用色谱系统进行的。每列的缓冲量较小，似乎有利于手动处理（例如，由于浪费量最小）。但是，如果需要多根/更大的柱，色谱系统使耦合条件更易于控制（例如，调节流速），因此更有可能在 DBC 方面实现可重现的结果。我们的研究表明，耦合缓冲液和pH对耦合效率和总柱成本有重要影响。因此，影响耦合反应的筛选因子，并针对每种载体蛋白（甚至每个载体-配体融合）对其进行调整，可以提高耦合效率和树脂性能，我们建议采用这种方法。
使用 DFE 亲和树脂测试 2F5 隔离
产品产量和纯度是树脂性能的重要方面，在DFE中，我们实现了105~11%（±SD，n=3）的收率和97~3%的纯度（±SD，n=3），与基准蛋白A树脂25的性能相当。，26.树脂的另一个关键性能指标（尤其是基于亲和配体）的 DBC 是 10% 的产品突破，因为此参数会影响特定工艺所需的树脂量，从而影响成本。对于 DFE 配体，初始 DBC 为 [4 g]L-1树脂，在类似条件下（仅 2 分钟接触时间）为蛋白质 A 相应值的 ±13%，25、47，但比其他自定义亲和树脂（如抗FSH-免疫亲和配体使用相同的停留时间2分钟48。DFE的DBC在25个结合和洗脱周期后下降到起始值的15%，而在商业蛋白A树脂49中，DBC的相同损失需要超过50个周期。然而，重要的是要注意到，我们的载体尚未得到优化到与蛋白质A相同的程度，蛋白质A在过去四十年中得到了全面的研究和改进。
到目前为止，我们已经提高了树脂的稳定性和产品回收，从低pH洗脱缓冲液切换到高浓度氯化镁（图3），如早期研究13建议。亲和配体的特征红色在25个结合和脱热周期中没有显著褪色，所以我们推测澄清的植物提取物31中的内源性植物蛋白酶可能已经截断，从而灭活了表位。配体。因此，设计抗蛋白酶链接器来连接载体和表位可能有助于在延长的周期内保持初始 DBC。鉴于DFE配体的快速和简单的表达和纯化，其直接耦合商业色谱树脂，其优异的产品产量和纯度，我们相信，我们的方法提供了一个合适的替代蛋白质A纯化不结合蛋白A的mAbs和抗体衍生物，特别是如果载体和连接剂的改进可以提高DBC和配体稳定性。这一假设得到了DFE纯化和蛋白质A-纯化2F5抗体5分离常数的微小差异的支持，表明我们的新型亲和配体能够恢复高质量的mAbs。
方法的优点和当前限制
与载体蛋白一起生产亲和配体，可增加水缓冲液中的溶解度，从而与典型的配体耦合条件相容。相反，从这些条件下产生从固相肽合成中提取的空白肽的溶解度可能有限，因为它们的序列50，这是不能改变的，因为它是由mAb识别的表位的氨基酸序列决定的。被净化。因此，其他人使用了蛋白石配体51的树脂合成。所得树脂的静态结合能力高（±80 g*L-1），但树脂制备过程漫长，未报告动态结合能力，所得纯度和回收率低于我们的方法。在实验室规模中，融合蛋白配体的另一个优点是，在易于使用的高通表达系统中，可以以最小的努力快速生产、纯化和测试配体及其变体。
这里介绍的方法的两个当前限制是3 g的低动态绑定能力。L-1及其在 25 个绑定和空合周期5的过程中减少了 90%。这些限制可以在将来通过应用不太严格的装载条件，并分别用工程化、更稳定的变型替换当前的 DsRed 托架来解决。例如，将当前接触时间从 2 分钟翻倍到 4 分钟，有可能使动态结合能力翻倍，如某些蛋白质 A 树脂26所示。
故障 排除
下表突出显示了在此协议期间可能遇到的潜在问题，并提供了有关如何解决这些问题的提示（表 1）。
| 表 1：可能遇到的潜在问题和可能的修复。 | |||
| 协议步骤 | 问题 | 库斯 | 修复 |
| 1 | 植物不生长 | 增长条件受损 | 检查肥料的pH值和电导率 |
| 检查温度和光况 | |||
| 2 和 3 | 提取后存在大量宿主细胞蛋白 | 不完全降水 | 在发白期间检查温度 |
| 检查发泡浴中的搅拌 | |||
| 2 和 3 | 在植物提取物中未发现产品 | 发白温度过高 | 在发白过程中检查温度和 pH 值 |
| pH 在发泡缓冲液中过低 | |||
| 3 | 提取后，大茎或叶部分仍然存在 | 搅拌机中不完全混合 | 确保植物材料不会形成搅拌机中的插头 |
| 3 | 深度过滤过程中压力快速升高 | 过滤器选择和/或方向不正确 | 检查过滤器类型和方向 |
| 4 | 洗脱过程中的小融合蛋白/ 流中大量的融合蛋白 | IMAC树脂未带金属离子 | 检查 IMAC 树脂是否正确充满离子 |
| 融合蛋白失去亲和力标记 | 在植物种植过程中避免强烈的阳光和高温 | ||
| 4 | 聚变蛋白在浓缩过程中丢失 | 与膜结合的融合蛋白 | 检查膜类型 |
| 确保浓度系数不是过高 | |||
| 5 | 低耦合率 | 耦合试剂添加顺序不正确 | 检查试剂标签和添加顺序 |
| 耦合前列的准备不正确 | 检查柱预帕拉子的条件 | ||
| 5 和 6 | 低 mAb 产量 | 植物生物量中的低 mAb 表达 | 生物量中的测试 mAb 表达 |
| 低配体密度 | 检查融合蛋白制剂的纯度 | ||
| 7 | 布拉德福德测定中极低/高蛋白质浓度 | 移液过程中的气泡形成 | 检查 96 well te 中的气泡 |
| 7 | SPR 测量过程中的 mAb 浓度低 | 受损蛋白 A 芯片 | 与已知浓度的标准mAb结果进行比较 |
| 样品稀释不正确 | 检查稀释率和缓冲液 | ||
表 1：故障排除。
Disclosures
提交人没有利益冲突可披露。
Acknowledgments
我们要感谢易卜拉欣·阿梅迪培育转基因烟草植物，并感谢托马斯·拉德马赫博士提供烟草表达载体。作者希望感谢理查德·特威曼博士的编辑协助和马库斯·萨克对DFE亲和力配体结构的富有成果的讨论。这项工作部分由格兰特号下的弗劳恩霍夫-格塞尔舍夫内部方案资助。吸引125-600164和北莱茵-威斯特法伦州根据莱斯通森特鲁姆赠款423号"网络，自适应生产"。这项工作得到了德国福森斯格明舍夫特（DFG）在研究培训组"靶向药物交付"赠款331065168框架内的支持。GE 医疗保健支持本文的开放访问发布。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 L/20 L Bucket | n/a | n/a | Blanching equipment |
| 2100P Portable Turbidimeter | Hach | 4650000 | Turbidimeter |
| ÄKTApure | GE Helthcare | 29018226 | Chromatography system |
| Allegra 25R | Beckman Coulter | 369434 | Centrifuge |
| Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR100050 | SPR chip coupling kit |
| Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR100050 | SPR chip coupling kit |
| Antibody 2G12 | Fraunhofer IME | n/a | Standard for SPR quantification |
| Blender | Waring | 800EG | Blender |
| BP-410 | Fuhr | 2632410001 | Bag filter |
| CanoScan 5600F | Canon | 2925B009 | Scanner |
| Centrifuge tube 50 mL self-standing | Labomedic | 1110504 | Reaction tube |
| Chelating Sepharose FF | GE Helthcare | 17-0575-01 | Chromatography resin |
| Cond 3320 | WTW | EKA 3338 | Conductometer |
| Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n/a | DoE software |
| Discovery Compfort | Gilson | F81029 | Multichannel pipette |
| Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
| Diverse bottles | Schott Duran | n/a | Glas bottles |
| Dri Block DB8 | Techne | Z381373 | Heat block |
| DsRed | Fraunhofe IME | n/a | Standart |
| EDTA | Carl Roth GmbH | 8043.2 | Buffer component |
| EnSpire | Perkin Elmer | 2390-0000 | Plate reader |
| ETHG-912 | Oregon Scientific | 086L001499-230 | Thermometer |
| F9-C | GE Helthcare | 29027743 | Fraction collector |
| Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
| Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Buffer component |
| Hettich Centrifuge Mikro 200 | Hettich | 2400 | Centrifuge |
| HiPrep 26/10 | GE Helthcare | GE17-5087-01 | Chromtography column |
| HiTrap NHS-activated Sepharose HP, 1 mL | GE Helthcare | 17-0716-01 | Chromatography columns |
| Hydrochloric acid | Carl Roth GmbH | 4625.1 | Buffer component |
| Imidazole | Carl Roth GmbH | 3899.2 | Buffer component |
| K700 | Pall | 5302305 | Depth filter layer |
| KM02 basic | IKA | n/a | Magnetic stirrer |
| KS50P 60D | Pall | B12486 | Depth filter layer |
| L/S 24 | Masterflex | SN-06508-24 | Tubing |
| Lauda E300 | Lauda Dr Wobser GmbH | Z90010 | Immersion circulator |
| Magnesium chloride | Carl Roth GmbH | KK36.2 | Buffer component |
| Masterflex L/S | Masterflex | HV-77921-75 | Peristaltic pump |
| Minisart 0.2 µm | Sartorius | 16534K | Filter unit |
| Nalgene Rapid-Flow PES bottle top filter | Thermo Fischer Scientific | 595-4520 | Vacuum filtration of SPR buffers |
| Nickel sulphate | Carl Roth GmbH | T111.1 | Buffer component |
| Novex NuPAGE 4-12% BisTris LDS gels | Invitrogen | NP0336BOX | LDS-PAA gels |
| Novex X-cell Mini Cell | Invitrogen | EI0001 | PAGE chamber |
| NuPAGE 20x running buffer | Invitrogen | NP0002 | Buffer concentrate |
| NuPAGE antioxidant | Invitrogen | NP0005 | Antioxidant |
| PageRuler protein ladder (10-180 kDa) | Invitrogen | 26616 | Protein standart |
| Perforated bucked | n/a | n/a | Blanching |
| PH 3110 | WTW | 2AA110 | PH meter |
| PowerPac HC | Biorad | 1645052 | Electrophoresis module |
| Protein A from Staphylococcus aureus | Sigma-Aldrich | P7837-5MG | Coating of SPR chips |
| Sephadex G-25 fine, cross linked dextran | GE Helthcare | 17003301 | Chromatography resin |
| Silicone spoon | n/a | n/a | Spoon |
| Simply Blue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | Gel staining solution |
| Sodium acetate | Carl Roth GmbH | 6773.1 | Buffer component |
| Sodium acetate | Carl Roth GmbH | X891.1 | Media component |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-100G | Media component |
| Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Buffer component |
| Sodium citrate | Carl Roth GmbH | HN13.2 | Buffer component |
| Sodium bisulfite | Carl Roth GmbH | 243973-100G | Media component |
| Sodium phosophate | Carl Roth GmbH | T877.2 | Media component |
| SPR Affinity Sensor - High Capacity Amine | Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics | SPR-AS-HCA | SPR chip |
| SPR-2/4 Surface Plasmon Resonance Analyzer | Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics | n/a | SPR device |
| SSM3 | Stuart | 10034264 | Mini Gyro-rocker |
| Heated vessel, 20 L | Clatronic | n/a | Blanching chamber |
| Sterile syringes, 2 mL | B. Braun | 4606027V | Syringes |
| Syringe adpter (Union Luer F) | GE Helthcare | 181112-51 | Syringe adapter |
| TE6101 | Sartorius | TE6101 | Precision scale |
| Tween-20 (Polysorbate) | Merck | 8170721000 | Buffer component |
| Unicorn 6.4 | GE Helthcare | 29056102 | Chromatography software |
| Vacuum bags | Ikea | 203.392.84 | Plant storge |
| VelaPad 60 | Pall | VP60G03KNH4 | Filter housing |
| Vortex-Genie 2 | Scientific industries | SI-0236 | Vortex |
| XK-26/20 column housing | GE Helthcare | 28-9889-48 | Chromtography column |
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