Summary
この手順では、DsRedベースのエピトープリガンドが固定化され、タンパク質Aの代替として、粗植物抽出物または細胞培養上清からのモノクローナル抗体の捕捉のための高選択的親和性樹脂を産生する。
Abstract
モノクローナル抗体(mAbs)の精製は、一般的にプロテインAアフィニティクロマトグラフィーによって達成され、これは全体的なプロセスコストの最大25%を占めることができます。そのため、単一のmAbを大量に製造する工業規模の製造では、コスト効率の高い代替キャプチャステップが有益です。ここでは、DsRedベースのエピトープリガンドを架橋したアガロース樹脂に固定化する方法を提示し、タンパク質Aを使用せずに粗植物抽出物からHIV中和抗体2F5を選択的に捕捉することを可能にする。線形エピトープELDKWAは、最初に蛍光タンパク質DsRedに遺伝的に融合し、融合タンパク質は固定化された金属イオン親和性クロマトグラフィーによって精製される前にトランスジェニックタバコ(ニコチアナ・タバカム)植物で発現した。さらに、活性化された架橋アガロースに基づく方法は、高リガンド密度、効率的な結合および低コストのために最適化された。pHおよび緩衝液組成物および可溶性リガンド濃度は、カップリング手順中に最も重要なパラメータであり、実験の設計アプローチを用いて改善された。得られた親和性樹脂は、粗植物抽出物中の標的mAbを選択的に結合する能力について試験し、溶出バッファーは、高mAb回収、製品活性およびアフィニティ樹脂安定性のために最適化された。この方法は、線形エピトープを持つ他の抗体に容易に適合させることができる。新しい樹脂は、タンパク質Aよりも穏やかな溶出条件を可能にし、mAb生産のための初期捕捉ステップのコストを削減することもできます。
Introduction
バイオ医薬品は、医学1のほぼすべての分野における幅広い疾患の治療に重要である。モノクローナル抗体(mAbs)はバイオ医薬品市場を支配しており、2020年には世界の売上が約1,100億ユーロに達すると予測されています。mAbsに好まれる発現プラットフォームは、通常、培養スーパーネート3、4で最大10g∙L-1の高mAbチテーターを産生する中国ハムスター卵巣細胞株である。しかしながら、哺乳動物細胞培養におけるmAbsの産生は、培地のコストが高く、無菌発酵5の必要性に起因して高価である。プラントなどの代替式プラットフォームは、工業生産6、7に対して、より速く、よりシンプルで、より安価でスケーラブルなアプローチを提供する可能性があります。
哺乳類細胞培養に関連するコストに加えて、製品キャプチャのためのプロテインAアフィニティクロマトグラフィーの広範な使用は、mAbsの工業生産のための主要なコストドライバーです。タンパク質Aは、黄色ブドウ球菌細胞の表面に自然に見出され、特定のマウスおよびヒト抗体の結晶化可能(Fc)領域に結合し、それによって体液性免疫系8を回避する防御機構として作用する。タンパク質Aは、細胞培養上清からのmAbsの捕捉のための業界のゴールドスタンダードとなっており、また、それは非常に選択的であるため、研究コミュニティによって広く使用されており、典型的には、単一のステップ8で〜95%のmAb純度を達成する。当然のことながら、過去20年間のプロテインAの売上は、mAbs8の売上を密接に反映しています。生産規模に応じて、プロテインAのコストは、総プロセスコストの25%以上に対応することができ、それによって€2,000 g-15、9まですることができる治療用mAbsの市場価格に影響を与えることができます。したがって、同様の精製性能を有する代替クロマトグラフィー樹脂は、生産コストを大幅に削減する可能性があり、より多くの患者に対して抗体ベースの治療を利用可能にする10,11 、12.このような選択肢は、低pH(通常<3.5)での過酷な溶出条件を含むタンパク質Aクロマトグラフィーの欠点を回避し、mAbsが凝集を促進する立体構造変化を引き起こす可能性がある13.重要なことに、プロテインAは特定のIgGサブクラスのFc領域に対してのみ選択的であり、切り捨てられた結合ドメインを有する非機能分子は無傷の製品5と共に精製し、一鎖変数フラグメントなどのmAbデリバティを選択する可能性がある。プロテインAに全く結合しないでください。
ここでは、その線形エピトープELDKWA(1文字アミノ酸コード)5,14を用いてHIV中和mAb2F5を捕捉するための代替親和性クロマトグラフィー樹脂について説明する。2F5エピトープを、担体およびレポーター分子として機能した蛍光タンパク質DsRedのC-終位に遺伝的に融合し、トランスジェニックタバコ(DFE)で得られたタンパク質DSRed-2 F 5-Eピトープ(DFE)を産生した(ニコチアナ・タバカム)植物。DFEは、単段固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー(IMAC)により精製した。精製されたDFEアフィニティリガンドを架橋アガロース樹脂に固定化し、N-ヒドロキシスチニミド(NHS)活性化架橋アガロースカラムを用いて化学結合することによって達成した。その後、統計的実験計画を用いて、固定化手順と結合効率15を最適化した。mAb 2F5の精製戦略は、抗体純度、収量およびリガンド安定性の観点から評価された。Fc領域に結合するタンパク質Aとは対照的に、DFEは2F5の相補性決定領域に結合し、無傷のパラトープを有する分子の精製を保証する。我々の概念は、線形エピトープまたはマイクロアレイ研究16によって容易に同定することができる他のペプチドベースの親和性リガンドを有する任意のmAbに容易に適合させることができる。
図1:粗植物抽出物または細胞培養上清からのmAbsの捕捉に使用できるエピトープ親和性樹脂の調製のためのプロセスフロースキーム。(A)アフィニティリガンドDFEは、トランスジェニックタバコ植物で発現した。収穫した葉を均質化する前に熱降ステップ(B)を含有した(C)。(D) 粗植物抽出物を袋ろ過、深さろ過、0.2μm無菌濾過により明らかにした。(E) DFEは、その後、IMACによって精製された。(F, G)精製されたDFEアフィニティリガンドをEDC/NHS活性化架橋アガロースカラムに固定化した。(H)T-DNAコード抗体2F5を担持する細菌培養物は、フィトトロンで増殖したN.ベンタミアナ植物(I)における一過性発現に用いた。(J)N.ベンタミアナ葉をD.(K)mAb2F5に記載の通りに収穫して処理し、DFE親和性カラム(L)を用いて精製した抽出物から精製した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Protocol
1. トランスジェニックタバコ植物の栽培
注:DFE融合タンパク質の設計およびトランスジェニック植物の生成は、他の場所で5、17について説明されている。
- トランスジェニックタバコの苗を土壌中に発芽させる。1.0 g·L-1肥料溶液。直径約0.04mに成長する際は、100mm x 100 mm x 60 mm (長さ、幅、高さ) ポットに植物を移します。
- 16時間の光周期(25/22°C光/暗い温度体制)で温室でトランスジェニックタバコ植物を栽培し、70%の相対湿度と1.0gで自動受精を行う·L-1肥料溶液を毎時間15分間使用します。
- 7週間後、植物の茎の基部にある4つのコチルドン葉を除くすべての葉を収穫する。以下に説明するように、収穫した葉を直ちに処理します。
2. 宿主細胞タンパク質の熱沈殿
- ステンレス鋼の加熱容器(0.3 m x 0.3 m x 0.3 m)に20Lの作業量を持つ水浴をセットアップします。開始時に、5 L分-1の流れで液体を永久に攪拌するために水浴に磁気ポンプを置きます。温度制御のために水浴に調節可能なサーモスタットを取り付けます(ステップ2.4および2.8)。
注意:2.10までの次のすべてのステップは、熱い液体の取り扱いを伴います。断熱手袋やゴーグルを含む適切な個人用保護具を着用してください。 - 水浴に15Lの脱イオン水を加え、液体を70°Cに加熱する。
- 磁気攪拌機の上に5Lの脱イオン水で満たされた10Lのバケツを置きます。リン酸ナトリウムを120mMの最終濃度に加えます。10M塩酸を使用してpHを8.14に調整します。すべての成分が溶解したら、得られた濃縮ブランチバッファ(5L)をステップ2.2から水浴に加えます。
- 温度が70°Cに達するまで水浴を攪拌する。必要に応じて、10 M 塩酸を使用して pH を 8.14 に調整します。必要な温度と pH に達した後、少なくとも 15 分間撹拌を続け、アセンブリ全体が熱平衡状態にあることを確認します。
- 20Lバケツ(0.3 m x 0.3 m x 0.3 m)を約17°Cの温度(ステップ2.9に必要)で脱イオン水で満たします。
- ステップ1.3から収穫されたタバコの葉の400グラムのアリコットを準備します。穴があいたバスケットに 1 つのアリコートを置きます (0.2 m x 0.2 m x 0.2 m; 細孔幅は少なくとも 0.02 m x 0.02 m)。植物材料でバスケットを過剰に充填したり、葉をきつく詰めすぎて組織を傷つけないようにしてください。
- ステップ2.4からホットブランチバッファにバスケットを完全に沈め、すべての葉が液体表面の下に残っていることを確認します。必要に応じて、表面の下に葉を保持するために、熱安定シリコーンスプーンを使用してください。
- ポンプがまだ液体を攪拌している間、タバコの葉をブランチ液で1.5分間インキュベートします。インキュベーション期間中の液体温度を監視します。タバコの葉でポンプ入り込み水を塞ぐのは避けてください。
- ブランチングバッファーからタバコの葉のバスケットを取り出し、30 s. 冷たい水で満たされたバケツにバスケットを移し(ステップ2.5から)、30sの葉を取り除き、残水を水から排出します。均質化の前に30sのavesを持つ(ステップ3)。
- 2.6から2.9までのステップを2.6から2.9に繰り返し、収穫されたバイオマス全体が処理されるまで、新鮮なアリコートを使用します。常に監視し、水浴中のブランチバッファのpHと温度を調整します。
注:ブランチされた植物材料は、バイオマス全体を処理するためにいくつかのブランチサイクルが必要な場合、最大30分間氷上に保存することができます。ブランチの葉は、少なくとも3週間-80°Cで真空密封袋に保存することができます。ただし、ストレージの延長によって DFE 歩留まりが低下する可能性があるため、即時処理をお勧めします。
3. タンパク質抽出と明確化
注意:次の手順では、回転ブレードを持つブレンダーを使用します。モーターユニットに動力を与えられたり取り付けたりする場合は、ブレンダー容器で動作しないでください。
- ブレンダー容器に150g(湿式質量)のタバコの葉(ステップ2.9)を入れ、抽出バッファーの450 mL(リン酸ナトリウム50m、塩化ナトリウム500m、ジズルフィットナトリウム10mM、pH 7.5)を加えます。ブレンダーキャップをしっかりと閉じて、植物材料やバッファーがこぼれないようにします。
- 各パルスの間に30sの休憩で、30sのための3倍のための葉を均質化する。すべての葉が均質化され、ブレンダー容器の上部に固執しないことを確認します。必要に応じて、休憩中にブレンダーを開き、きれいなシリコーンスプーンを使用して、容器の上部に付着した葉を押し下げます。
- 均質化後、その後の分析のためにホモジネートの1.0 mLサンプルを採取してください(ステップ7)。
- 適切なサイズの容器で均質を収集します(例えば、総バイオマス1.0kgで作業する場合は、少なくとも5Lの容量を持つ容器を使用してください)。すべてのブランチバイオマスが均質化されるまで、手順 3.1 ~ 3.3 を繰り返します。
- 袋フィルターをフィルターマウントに取り付け、アセンブリの下に別の適切なサイズの容器(3.4を参照)を配置します。均質を約0.15L分-1の割合でバッグフィルターに適用します。その後の分析(ステップ7)のために各リットルの後に袋濾過のサンプルを採取し、濁度計または類似の装置を使用して抽出バッファーの1:10希釈として袋濾過プールの濁度を測定する。
- さらに、バッグ濾液プールのリットル当たりK700(上)とKS50(下)深度フィルタ層の0.02m2を用いて袋ろ過プールを明らかにする。流量3.0L分-1~m-2を最大圧力0.2MPaまで適用します。次いで、前述の5として0.2 μmの無菌フィルターを通して明確化された濾液を通過させることによって残留粒子を除去する。
4. DFEアフィニティリガンドの精製
- 溶出バッファー(10mMリン酸ナトリウム、300mMイミダゾール、pH 7.4)、洗浄バッファー(10mMリン酸ナトリウム、pH7.4)および平衡バッファー(20mMリン酸ナトリウム、500mM塩化ナトリウム)でフラッシングすることにより、高速タンパク質液体クロマトグラフィーシステムを調べます。葉バイオマス1キログラム当たり約50mLのキレート架橋アガロース樹脂(約2.5L深度濾過)を含むカラムを取り付けます。
- 200mMの硫酸ニッケル溶液の5カラム容積(CV)を塗布してニッケルイオンでカラムを充電し、溶出バッファーの5 CVで洗浄します。50 cm h-1の流量を使用し、後続のすべてのクロマトグラフィーステップについて、260、280、558 nm の UV 信号を監視します。
- 平衡バッファーの 10 CV で列を平衡化します。次に、明確化された植物抽出物の50 CV(ステップ3.6から)を条件付きカラムにロードします。
- 10 CVの洗浄バッファーでカラムを洗います。DFE融合タンパク質を5 CV溶出バッファーで溶出し、280 nmおよび558 nmのUV信号がベースラインを超える5mAU以上に増加した後、製品含有分数を収集します。
- 溶離率(TSP)濃度(ステップ7.1)、DFE濃度(ステップ7.2および7.3)、およびDFE純度(ステップ7.4)を測定するために、溶離画画分から0.2 mLサンプルを採取します。
- クロマトグラフィーシステム上にクロスリンクデキストラン樹脂の約50 mLを含むカラムを取り付けます。カップリングバッファーの5 CV(200 mM HEPES、500 mM塩化ナトリウム、pH 8.5)でカラムを平衡化します。バッファー交換用のDFE溶出率(ステップ4.4)の10 mLを注入し、280および558 nmで紫外線吸光度を監視します。
- 280 nm および 558 nm の UV 信号がベースラインより 5 mAU を超えると、DFE 含有分数を収集します。0.2 mLサンプルを採取し、TSP濃度、DFE濃度、およびDFE純度を決定します(ステップ7)。
- 精製されたDFEサンプル(ステップ4.7から)を遠心分離機で30分間4°Cで3,000 x gの遠心濃縮管を用いて15gL-1に濃縮します。カップリング反応を続ける(ステップ5)。
注:濃度またはカップリング工程を直ちに行うことができない場合は、DFE溶液を4°Cで保存してください。
5. 活性化されたクロスリンクアガローゼ樹脂へのDFEの結合
注:カップリング用のすべての機器とソリューションの準備ができるまで、NHS活性カラムの保管に使用されるイソプロパノールを交換しないでください。カラムを乾かさせてください。
- pH、バッファー組成、DFE濃度を因子として、活性樹脂へのDFEの結合を最適化する実験(DoE)モデルの設計を設定します。DoE メソッドの詳細については、他の場所15.
- 0.5~15gの濃度範囲でアフィニティリガンド溶液(ステップ4.8から)を調出すL-1またはDoEで定義されているように、カップリング反応が準備ができるまで氷の上に保存します(ステップ5.5)。DFEソリューションで少なくとも10個の2 mLシリンジを充填し、ベッド容積が1.0 mLのNHS活性化架橋アガロースカラムに注射器を取り付けるアダプタを準備します。
- カップリングに使用される10カラムごとに、30mLの不活性化溶液(0.5Mエタノールアミン、0.5M塩化ナトリウム、pH 8.3)、低pH溶液30mL(酢酸0.1M、塩化ナトリウム0.5M、pH4.0)、10mLの貯蔵液(0.05M)を調製します。、0.1% (m/v) アジ化ナトリウム、pH 7.0)
- チューブに1mM塩酸の20 mLを準備し、少なくとも20分間氷の上でインキュベートし、カップリング反応中のすべてのステップのフロースルー分画を監視する精密スケールを準備します(ステップ5.7)。
- 密封されたNHS活性化架橋アガローズカラムを開き、カラム入り江にシリンジアダプタを取り付けます。シリンジに接続する前に、アダプターの入り江にバッファーのドロップを適用して、カラムに入る空気を防ぎます。
- 氷冷1 mM塩酸(ステップ5.4から)の6 mLでカラムを洗い流し、直ちにステップ5.7に進みます。
- 流量<1 mL min-1の流量で2 mLシリンジを使用してDFE溶液の1.5 mL(ステップ5.2)を注入し、その後の分析のために精密スケール(ステップ5.4)でフロースルー分率を収集します(ステップ7)。両端のカラムをシールし、DoEの設定に応じて22°Cで15〜45分間インキュベートします。
- 6 mLの不活性化溶液を注入し、続いて6 mLの低pH溶液を流量で<1 mL min-1で注入し、樹脂から非共結合リガンドを除去する。次いで6mLの不活性化溶液を注入し、カラムを15分間インキュベートする。
- 低pH溶液の6 mLをカラムに注入し、続いて6mLの非活性化溶液を注入する。次に、カラムに別の6mLの低pH溶液を注入する。
- 2 mLの貯蔵液をカラムに注入し、4°Cで保存します。
6. 明確化された植物抽出物からのmAbsの精製の試験
- 好ましい細胞系発現系から2F555または上清を含有する透明植物抽出物の100mLを調製し、また2F5を含有する。
- 平衡バッファー(20 mMリン酸ナトリウム、500m塩化ナトリウム、pH 7.4)、低pH溶出バッファー(0.05Mクエン酸塩、0.05M塩化ナトリウム、pH 4.0-3.25)、高イオン強度溶出バッファー(1.0~4.0M)を調製
- クロマトグラフィーシステムをバッファでフラッシュします。クロマトグラフィーシステムにDFEアフィニティカラム(ステップ5.10から)を取り付け、流量1.0 mL min-1で5 CVの平衡バッファーで平衡化します。280 nmで紫外線吸収率を監視します。
注:カラムに植物抽出物または細胞培養上清をロードすると、背圧の増加を引き起こす可能性があります。クロマトグラフィーシステムまたはDFEカラムの損傷を避けるために、高圧アラートを0.2 MPaに設定します。 - 明確化された植物抽出物または上清(ステップ6.1)の80mLを0.5mL min-1の流量でカラムに積み込み、2分の接触時間を保証し、2mL分のフロースルーサンプルを集めて画期的な曲線再構成を行います(ステップ7.3)。即時サンプル分析が不可能な場合は、フロースルーサンプルを4°Cに保管してください。
- 平衡バッファーの 6 CV でカラムを洗います。このステップの最初、中央および終わりに洗浄のサンプルを収集します。
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低pH溶出バッファーまたは高イオン強度溶出バッファー(0.1 M HEPES、塩化マグネシウム1.25M、pH 8.0)の5 CVを有するElute mAb 2F5。UV 280 nm 信号がベースラインより 5 mAU に増加した場合に、DFE 分数を収集します。
- 各エピトープ抗体ペアの溶出バッファーを最適化します。2F5では、1.25M塩化マグネシウムが製品回収とリガンド安定性の最適なバランスを達成しました。
注:塩化マグネシウム溶液は沈殿しやすい。そのため、塩化マグネシウムを約700mLの水に溶解させる。別に100 mLの水でHEPESを溶解し、pHを8.0に調整します。溶存した塩化マグネシウム溶液をHEPES溶液に加え、最終容積1.0Lに水を加えます。これは沈殿を引き起こすので、塩化マグネシウムを溶解した後にpHを調整しないでください。
- 各エピトープ抗体ペアの溶出バッファーを最適化します。2F5では、1.25M塩化マグネシウムが製品回収とリガンド安定性の最適なバランスを達成しました。
- ブラッドフォード法、リチウムドデシルスルフェートポリアクリルアミドゲル電気泳動(LDS-PAGE)および表面プラズモン共鳴(SPR)分光法(ステップ7)を使用して、ステップ6.4〜6.6の間に採取されたすべてのサンプルを分析します。
7. サンプル分析
- ブラッドフォード法18,19を用いてTSP濃度を測定する。
- 三量体では、各サンプルのピペット2.5 μLを96ウェルプレートの単一のウェルに入れます。0-2,000 mgの範囲をカバーする三つ三つトリケートで8つのウシ血清アルブミン(BSA)標準を使用する·L-1.
- 各ウェルに200 μLのブラッドフォード試薬を加え、上下にゆっくりとピペッティングして混ぜます。後続の読み出しを歪める気泡の形成を避けるために、ピペットレベルを維持します。
- 22 °Cで10分間プレートをインキュベートし、分光光度計で595nmで吸光度を測定します。BSA基準点を通る標準曲線に基づいてサンプル内のTSP濃度を計算します。
- フッ素によるDFEの定量化
- 三量体では、各サンプルのピペット50 μLを黒い96ウェル半面積プレートの単一ウェルに入れます。範囲0-225 mgをカバーする6つのDsRed標準を含める·L-1.
- 分光光度計で530±30nm励起フィルターと590±35nm発光フィルタを使用して蛍光を2回測定します。DsRed 基準点を通る標準曲線に基づいてサンプル内の DFE 濃度を計算します。
- SPR分光法20による2F5濃度を測定する。
- HBS-EPランニングバッファー(10 mM 4-(2-ヒドロキセチル)-1-ピペラジネエタンスルホン酸(HEPES)、3mMエチレンディアミンテトラセチン酸(EDTA)、150mM塩化ナトリウム、0.005%v/v Tween-20、pH 7.4を介して真空を通過するボトルトップフィルター。バッファーを15分間ドガします。
- カルボキシメチル化デキストランサーフェスチップをドッキングする前に、HBS-EPランニングバッファをSPR計測器に接続し、素数機能を使用してシステムを平衡化します。流量30μL min-1の手動実行を開始し、30 mM塩酸と25mMの水酸化ナトリウム(各2回の注入)をフローセル1と2に交互に注入し、1分間30μL min-1の流量でチップ表面を調整します。
- 500 mg の 300 μL を準備 ·L-1タンパク質 10 mM 酢酸ナトリウム(pH 4.0)中の溶液。0.4 M 1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)を含むバイアルを解凍し、0.1 M NHSおよび0.1 M NHSおよび遠心分離機を1分間16,000xgで混合してから、70 μLのEDCと70μLのNHSを混合する。
- EDC/NHS混合物とプロテインA溶液を7mmのプラスチックサンプルバイアルに移し、サンプルラックに入れます。流量10μL分-1の流量でEDC/NHS混合物を10分間注入することにより、カルボキシメチル化デキストランチップ表面を活性化します。
- カップルタンパク質Aを活性化カルボキシメチル化デキストラン表面に、15μL分-1の流量でフローセル2上にタンパク質A溶液を15分間注入する。
- プロテインAを結合しながら、1.0Mエタノールアミン塩酸塩(pH 8.5)のバイアルを解凍し、遠心分離機を1分間16,000 x gで解凍し、150 μLを7mmのプラスチックバイアルに移し、器具に入れて置きます。ステップ7.3.5が完了したら、7分間10 μL分-1の流量で流量セル1および2上にエタノールアミン溶液を注入してチップ表面を非活性化します。
- 30mMの塩酸と25mMの水酸化ナトリウム(各2回の注入)を流量セル1と2に交互に注入し、流量30μLmin-1を0.5分間注入してチップ表面を調整します。
- 500 μgの濃度でHBS-EPランニングバッファーで抗体2F5の基準を調製·HBS-EP中の2F5を含むL-1および希釈サンプルは、20〜1,000 μgの範囲の最終濃度に及ぶ·L-1.3分間30μL分-1の流量でフローセル1および2上のサンプルおよび標準を注入し、15サンプルごとに2F5標準を注入する。
- 各試料のフローセル2(測定セル)のシグナルからフローセル1(参照セル)の相対単位(RU)信号を引き出し、2F5標準注射のRUシグナルに基づいて抗体濃度を算出します。
- すべての試料または標準注入の後、30 mM塩酸を流量30μL分-1の流量で注入してチップ表面を再生し、フローセル1および2に対して0.5分の間。
- ステップ 6.4 からの各フロースルー サンプルの 2F5 濃度を、流量を通すフローに対してプロットし、2F5 ブレークスルー カーブを取得します。荷重2F5濃度の10%に達したときの注入された2F5の量を計算し、10%の動的結合能力(DBC)を得る。
- LDS-PAGEでタンパク質サンプルを分析します。
- すぐに使用可能な4-12%のBisTris LDSポリアクリルアミドゲルを開き、電気泳動モジュールに入れください。800 mLのランニングバッファー(50 mM MES、50 mMトリスベース、0.1%(m/v)SDS、1 mM EDTA、pH 7.3)をモジュールに転送し、0.5 mLの抗酸化溶液を追加します。
- 1.5 mLの反応管で、10 μLのローディングバッファーを還元剤の4μLとタンパク質サンプルの26μLと混合します。80°Cで10分間熱ブロックでチューブをインキュベートします。チューブを 500 x gで 30 s の遠心分離します。
- LDSポリアクリルアミドゲル(レーンあたりサンプルの10 μL)をロードし、予め染められたタンパク質標準(10-180 kDa)の5 μLを別のレーンにロードします。
- 電気泳動室を閉じ、電源装置を接続します。電気泳動は40分間、定数200Vで実行する必要があります。
- 電気泳動室からゲルを取り出します。ゲルシースを開き、19 rpmでシェーカーで水で15分間ゲルを洗います。19 rpmでシェーカーの染色溶液で1時間ゲルを染色します。
- 19 rpmでシェーカーで水に1時間ゲルを汚します。フィルムスキャナを使用してゲルをスキャンします。
Representative Results
アフィニティリガンドの発現と精製
融合タンパク質DFEは、温室で成長したトランスジェニックタバコ植物で発現した。収量は、植物当たり約130gの平均バイオマスで、約120mg·kg-1葉質量であった。DFE純度は、ブランチング前の粗植物抽出物中のTSPの<5%であったが、宿主細胞タンパク質の97%を沈殿させた70°Cでの熱処理後に約40%に増加した。ブランチングステップは、収穫および抽出ルーチン(図1)に容易に統合され、水浴のセットアップを含む余分な時間の2時間未満を要した。DFEの全体的な回復は、純度>90%の23.5 mg kg1であった。製品損失の原因となるステップは、ブランチング、深度ろ過、IMACで、それぞれ40%、27%、45%の特定の損失でした。深度フィルタ容量は平均135±36L m-2(±SD、n=3)であり、文献21で報告された値の上限範囲であった。DFE収量は植物の年齢とともに増加しました(図2)。
NHS活性化クロマトグラフィーカラム上のアフィニティリガンドの固定化
最初のカップリングテストでは、HEPESバッファ(pH 8.3)が、メーカーが推奨する重炭酸塩バッファーの78±9%(±SD、n=3)と比較して、結合効率を89±6%(±SD、n=3)に増加させることがわかりました。したがって、HEPESは、その後のすべてのカップリング実験に使用されました。DFEとNHS活性化架橋アガロース樹脂への結合効率を最適化するDoEアプローチを選択しました。樹脂上に固定化されたDFEの絶対量は、カラムに注入されたDFEの質量と共に増加し、約15g·L-1の一方で、より多くのDFEが注入されるにつれて結合収率は継続的に低下した(図2)。結合収率も酸性バッファーで>50%低く、各リガンドに対して適切なカップリング条件をケースバイケースでスクリーニングする必要性を示した。結合収率、固定化DFEおよびカラムコストの絶対量の観点から理想的な条件は、DoEソフトウェアの数値最適化ツールを使用して同定された。最も望ましい条件(pH 9.0および7.0mgの架橋アガロース樹脂の1mL当たりのDFE)は、大きな高原に位置し、したがって堅牢であった。DFE分子は結合後も赤色蛍光を保持し、色強度は固定化DFEの総量に相当する(図2)。したがって、列色は、カップリング効率とカラム品質を推定するための単純な品質管理パラメータとして使用することができます。蛍光はまた、DFE融合タンパク質が天然DsRedの四面体状態で組み立てられることを確認した。
図2:NHS活性化架橋アガロース樹脂に対するDFE固定化の最適化(A) LDS-PAAゲルと均質化および溶出試料のウェスタンブロットオーバーレイを有する非ブランチおよびブランチトランスジェニックDFE植物抽出物。植物の収穫は、播種後38、45または52日目に行った。ウェスタンブロットは、抗His6-抗体5を用いて行った。(B) NHS活性化架橋アガロースカラムに注入された精製DFEの結合pHおよび全質量の場合の依存性における結合DFEアフィニティリガンドの総量。赤い点は、応答サーフェス モデルを構築するために実行された実際の実験を示します。(C) カップリング・プロシージャーの後の DFE アフィニティ列。数字は、パネル B. dps = シード後の日数で強調表示されているカップリング条件に対応します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
DFEアフィニティ樹脂を用いて2F5分離をテスト
組換え2F5抗体は、フィトトロン5で成長したニコチアナ・ベンタミアナ植物で一過性に製造された。粗植物抽出物からの2F5の捕捉を、約7.0mg精製DFEと結合したアフィニティカラムを用いて試験した(ステップ6)。タンパク質A樹脂からの溶出は、通常、酸性バッファー(pH〜3.3)13を含む。そこで、DFEカラムに対して、最初に異なる低pH溶出バッファ(pH 6.0-3.25)を評価しました。2F5の溶出は4.5以下のpH値で成功し、pH3.25で約35%の回復率が最も高かった。しかし、低pH溶出は、抗体(SPR分光法で確認)とDFEリガンド(色の喪失と低いDBC、図3)の両方を不活性化した。後者は、ネイティブDsRedがpH <4.022、23で変性することを考えると予想されました。製品およびリガンドの変性を避けるために、我々は以前に他の親和性樹脂24からmAbsを溶出するために使用されていたので、代替溶出剤として塩化マグネシウムを試験した。1.25Mの塩化マグネシウム濃度は、DFEアフィニティ樹脂から2F5を溶出するのに十分であり、105±11%(±SD、n=3)の回収と純度97±3%(±SD、n=3)であった。この性能はプロテインA樹脂25、26に匹敵した。DFE精製2F5抗体および合成リガンドフゼオンの平衡解離定数(KD)は791pMであったのに対し、タンパク質A精製相手の平衡解離は763 pM5であった。さらに、合計25の結合および溶出サイクルにわたって樹脂中に実質的な色の損失は認められなかった。10%2F5ブレークスルーにおけるDFEアフィニティ樹脂のDBCは、初期値の約15%に25サイクルの間に直線的に減少した(図3)。
図3:DFEアフィニティ樹脂を用いて、明確化された植物抽出物からの2F5の単離を試験する。(A) DFE アフィニティ樹脂は、pH 6.0 の中和ステップの後に 4.0~ 3.0 の範囲で異なる pH 値を持つバッファーを使用し、同じ樹脂を使用して 1 回の溶出サイクル後に樹脂を使用します。(B)DFEアフィニティ樹脂は、溶出剤として1.25Mまたは4.00M塩化マグネシウムを用いて2F5精製の1および6サイクル後に樹脂化する。(C) 塩化マグネシウムを溶出剤として用いてDFE樹脂のサイクル依存動的結合能を判定する前頭荷重実験(ブレークスルー曲線)のクロマトグラム。ブレークスルー曲線は、4.0Mと1.25Mの塩化マグネシウム溶出バッファーと各種サイクル数について測定した。(D) 1.25M塩化マグネシウムを溶出剤として用いるDFEのサイクル依存動的結合能力。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
新規親和性樹脂の応用
mAbsの捕捉のためのカスタムアフィニティクロマトグラフィー樹脂は、NHS活性化架橋アガロースにmAb特異的エピトープを含むリガンドを固定することによって製造できることを示した。このような樹脂を設計するには、エピトープ配列を知り、線形エピトープを使用する必要がありました。得られた樹脂は、高価なタンパク質Aアフィニティクロマトグラフィーステップを置き換える可能性があるため、mAbsの捕捉に有利です。我々のケーススタディにおける2F5とDFEの相互作用はエピトープ・パラトープ結合によって媒介されたので、我々のリガンドは、ほとんどのマウスおよびヒトIgGのFc領域に結合するタンパク質Aよりも選択的であるべきである。各mAbには個別のリガンドが必要となるため、当初は非常に大規模に産生される抗体に適していると思われる場合があります。しかし、我々のアプローチを迅速な植物ベースの一過性タンパク質発現と組み合わせることにより、新しい親和性リガンドは、最小限の労力で2週間27未満で調製することができる28。したがって、この方法は、小規模なmAb精製にも適している。
アフィニティリガンドの生産と潜在的な改善
植物は、我々のケーススタディで紹介されたDFE融合タンパク質など、アフィニティリガンド5、29、30のための迅速かつ安全な生産プラットフォームを提供します。植物材料をブランチングすると、1つのステップで宿主細胞タンパク質の量が大幅に減少し、標準的な明確化ルーチンに容易に統合されました。しかし、リガンドの回収は、現在のセットアップでは低く、おそらくその適度な熱安定性およびフィルタ層へのいくつかの非特異的結合のために、他の製品31、32、33について報告された。したがって、その熱安定性を高めるためにキャリアをエンジニアリングすることは、マラリアワクチン候補CCT、抗腫瘍酵素PpADIまたは中親性β-グルコシダーゼ34のために記載されているように、将来的にリガンド収率を改善するのに役立つ可能性があり、35、36.同じことが深度ろ過ステップにも当てはまり、タンパク質工学はフィルター材料37への非特異的結合を減らすのに役立つかもしれない。DFEおよび同様のリガンドの生産コストはまた、凝結剤またはフィルター添加剤38、39を用いて明確化の全体的な効率を改善することによって低減することができる。
DsRedをキャリアとして使用すると、四面体複合体を形成します。これは、リガンドあたりのエピトープの数を増加させるので有利であるが、それはまた、アフィニティクロマトグラフィー中に分解または変形の影響を受けやすいリガンドをレンダリングする可能性があります。したがって、mCherryのような単量体担体タンパク質は、低pH40で安定しているので、好ましいかもしれません、そして、エピトープのタンデムリピートを含めることは、リガンドの生存率を増加させ、したがって、樹脂容量5を増加させるであろう、26歳,41.単純なキャリアエピトープタンパク質(すなわち、ジスルフィド結合または翻訳後修飾を持たないもの)の微生物生産システムは、製造コストを削減し、リガンドをプロテインAとの競争力を高める可能性があります。例えば、緑色蛍光タンパク質は、約1g·kg-1バイオマスの収率を有する細菌細胞で発現されており、これはリガンド製造コスト42を大幅に削減するであろう。
発現宿主にかかわらず、それ以外の場合は樹脂選択性および容量を減少させることができる宿主細胞タンパク質または培体成分の固定化を最小限に抑えるために、カップリング中に精製されたアフィニティリガンドが必要であった。IMAC精製のためのポリヒスチジンタグを含めることは、1つのステップで〜90%に純度を増加させ、迅速かつ安価なリガンド生産5、43、44を容易にした。しかしながら、融合タグの位置は、立体的にエピトープ結合を妨げるか、または担体45、46からタグまたはエピトープのいずれかの切断を誘発する可能性を有するので重要である。
NHS活性化クロマトグラフィーカラム上のアフィニティリガンドの固定化
固定化は、手動またはクロマトグラフィーシステムを用いて行った。列あたりのバッファ量が少ないため、手動での処理が好ましいと思われました(廃棄物量が最小限に抑えられるなど)。しかし、複数/より大きなカラムが必要な場合、クロマトグラフィーシステムは結合条件の制御を容易にし(例えば、規制された流量速度)、したがってDBCの観点から再現可能な結果を達成する可能性が高くなります。我々のデータは、カップリングバッファとpHが結合効率と全体的なカラムコストに重要な影響を及ぼすことを示唆している。カップリング反応に影響を与えるスクリーニング因子を各キャリアタンパク質(または各キャリアリガンド融合)に対して調整することで、結合効率と樹脂性能が向上する可能性があるため、このアプローチをお勧めします。
DFEアフィニティ樹脂を用いて2F5分離をテスト
製品の歩留まりと純度は樹脂性能の重要な側面であり、DFEの場合は105±11%(±SD、n=3)の収率と97±3%(±SD、n=3)の純度を達成し、ベンチマークタンパク質A樹脂25の性能に匹敵します。、26.一般的な樹脂のもう一つの主要な業績指標(特にアフィニティリガンドに基づくもの)は、このパラメータが特定のプロセスに必要な樹脂の量に影響を与え、コストに影響を与えるため、10%の製品ブレークスルーでDBCです。DFEリガンドの場合、最初のDBCは~4 g·L-1樹脂は、同様の条件下でタンパク質Aに対する対応値の約13%(接触時間2分のみ)25、47が、他のカスタム親和性樹脂と比較して約15倍高い2分48の同じ滞留時間を用いた抗FSH-免疫親和性リガンド。DFEのDBCは、25回の結合および溶出サイクル後の開始値の15%に低下したが、市販のタンパク質A樹脂49におけるDBCの同一損失には50サイクル以上が必要である。しかし、我々のキャリアは、過去40年間に包括的に調査され、改善されたプロテインAと同じ程度にまだ最適化されていないことに注意することが重要です8.
これまでは、以前の研究13で推奨されているように、低pH溶出バッファーから高濃度の塩化マグネシウム(図3)に切り替えることで樹脂の安定性と製品回収を改善してきました(図3)。アフィニティリガンドの特徴的な赤色は、25の結合および溶出周期の間に実質的にフェードしなかったので、我々は、明らかにされた植物抽出物31の内因性植物プロテアーゼが切り捨てられ、したがって、エピトープを不活性化した可能性があると推測する。リガンド。したがって、キャリアとエピトープを接続するプロテアーゼ耐性リンカーを設計することは、サイクルの長い数にわたって初期DBCを維持するのに役立つ場合があります。DFEリガンドの迅速かつ簡単な発現と精製、市販のクロマトグラフィー樹脂への簡単な結合、および優れた製品収率と純度を考えると、当社の方法はタンパク質Aに適した代替手段を提供すると考えています。タンパク質Aに結合しないmAbsおよび抗体誘導体の精製は、特にキャリアおよびリンカーの改善がDBCおよびリガンド安定性を改善できる場合である。この仮定は、DFE精製およびタンパク質A精製2F5抗体5の解離定数のわずかな差によって支持され、当社の新しい親和性リガンドが高品質のmAbsの回収を可能にすることを示す。
メソッドの利点と現在の制限事項
キャリアタンパク質との遺伝的融合としてアフィニティリガンドを産生すると、水バッファーの溶解性が増加し、典型的なリガンド結合条件との相溶性が高まります。対照的に、固相ペプチド合成に由来するブランクペプチドは、その配列50に起因するこれらの条件下での溶解度が制限され得るが、これはmAbによって認識されるエピトープのアミノ酸配列によって決定されるので変更することができない。浄化される。したがって、他の人はペプチドリガンド51のオンレジン合成を使用している。得られた樹脂の静的結合能力が高かった(~80g·L-1)、樹脂製剤の工程は長いが、動的結合能力は報告されず、得られた純度および回収は我々のアプローチよりも低かった。実験室規模での融合タンパク質リガンドのさらなる利点は、リガンドおよびその変異体が、使いやすい高スルー発現システム52において最小限の労力で迅速に製造、精製、試験できることである。
ここで提示される方法の2つの現在の制限は、3 gの低ダイナミック結合能力です·L-1およびその90%の減少は25の結合および前溶周期のコース5の間に5。これらの制限は、より厳格な負荷条件を適用し、現在のDsRedキャリアをそれぞれ設計された、より安定したバリアントに置き換えることによって、将来的に対処することができます。例えば、現在の接触時間を2分から4分に倍増すると、一部のプロテインA樹脂26に示したように動的結合能力を倍増する可能性がある。
トラブルシューティング
次の表は、このプロトコル中に発生する可能性のある潜在的な問題を示し、それらを解決する方法のヒントを示します (表1)。
| 表 1: 発生する可能性のある問題と修正の可能性について説明します。 | |||
| プロトコル ステップ | 問題 | カウス | 修正 |
| 1 | 植物は成長しない | 妥協された成長条件 | 肥料のpHと導電性を確認する |
| 温度と光の状態を確認する | |||
| 2 および 3 | 大量の宿主細胞タンパク質が抽出後に存在する | 不完全な降水量 | ブランチ中の温度を確認する |
| ブランチ風呂の攪拌を確認する | |||
| 2 および 3 | 植物エキスに製品が見つかりません | ブランチング温度が高すぎる | ブランチ中の温度と pH を確認する |
| ブランチ ング バッファの pH が低すぎる | |||
| 3 | 大きな茎や葉の部品は、抽出後に残ります | ブレンダーでの不完全な混合 | 植物材料がブレンダーのプラグを形成していないことを確認する |
| 3 | 深さのろ過の間の急速な圧力の上昇 | フィルタの選択や向きが正しくありません | フィルタの種類と向きを確認する |
| 4 | 溶出中の小さな融合タンパク質/フロースルー中の多くの融合タンパク質 | IMAC樹脂は金属イオンで充電されなかった | IMAC樹脂がイオンで正しく充電されたかどうかを確認する |
| 融合タンパク質は、親和性タグを失った | 植物栽培中の強い日光と高温を避ける | ||
| 4 | 濃度中に失われた融合タンパク質 | 膜に結合した融合タンパク質 | 膜の種類を確認する |
| 濃度係数が高すぎていないことを確認する | |||
| 5 | 低結合収率 | カップリング試薬添加の順序が正しくありません | 試薬ラベルと添加シーケンスを確認する |
| カップリング前の列の正しい準備 | コラムプリパラトンの条件を確認する | ||
| 5 および 6 | 低mAb収率 | 植物バイオマスにおける低mAb発現 | バイオマスにおけるmAb発現の試験 |
| 低リガンド密度 | 融合タンパク質製剤の純度を確認する | ||
| 7 | ブラッドフォードアッセイにおける非常に低/高タンパク質濃度 | ピペッティング中の気泡形成 | 96ウェルパルテの気泡を確認する |
| 7 | SPR測定中の低mAb濃度 | 侵害されたタンパク質Aチップ | 既知の濃度と標準mAbの結果と比較 |
| 誤ったサンプル希釈 | 希釈率とバッファを確認する | ||
表1:トラブルシューティング。
Disclosures
著者は、開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
私たちは、イブラヒム・アル・アメディがトランスジェニックタバコ植物を栽培し、トーマス・ラデマッハ博士がタバコ発現ベクターを提供したことを認めたいと思います。著者らは、DFEアフィニティリガンド構造に関する実りある議論のために、編集支援とマーカス・サック博士にリチャード・M・ツイマン博士に感謝したいと考えています。この作品は、グラント・ノーの下でフラウンホーファー・ゲッセルシャフト内部プログラムによって一部資金提供されました。125-600164とライストーンスゼントルム交付金第423号「ネットワーク化された適応生産」の下でノースライン・ウェストファリアの状態を引き付けます。この研究は、研究訓練グループ「腫瘍標的薬物送達」助成金331065168の枠組みの中で、ドイツのフォルシュンゲミンシャフト(DFG)によって支援されました。GE ヘルスケアは、この記事のオープンアクセスの公開をサポートしました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 L/20 L Bucket | n/a | n/a | Blanching equipment |
| 2100P Portable Turbidimeter | Hach | 4650000 | Turbidimeter |
| ÄKTApure | GE Helthcare | 29018226 | Chromatography system |
| Allegra 25R | Beckman Coulter | 369434 | Centrifuge |
| Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR100050 | SPR chip coupling kit |
| Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR100050 | SPR chip coupling kit |
| Antibody 2G12 | Fraunhofer IME | n/a | Standard for SPR quantification |
| Blender | Waring | 800EG | Blender |
| BP-410 | Fuhr | 2632410001 | Bag filter |
| CanoScan 5600F | Canon | 2925B009 | Scanner |
| Centrifuge tube 50 mL self-standing | Labomedic | 1110504 | Reaction tube |
| Chelating Sepharose FF | GE Helthcare | 17-0575-01 | Chromatography resin |
| Cond 3320 | WTW | EKA 3338 | Conductometer |
| Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n/a | DoE software |
| Discovery Compfort | Gilson | F81029 | Multichannel pipette |
| Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
| Diverse bottles | Schott Duran | n/a | Glas bottles |
| Dri Block DB8 | Techne | Z381373 | Heat block |
| DsRed | Fraunhofe IME | n/a | Standart |
| EDTA | Carl Roth GmbH | 8043.2 | Buffer component |
| EnSpire | Perkin Elmer | 2390-0000 | Plate reader |
| ETHG-912 | Oregon Scientific | 086L001499-230 | Thermometer |
| F9-C | GE Helthcare | 29027743 | Fraction collector |
| Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
| Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Buffer component |
| Hettich Centrifuge Mikro 200 | Hettich | 2400 | Centrifuge |
| HiPrep 26/10 | GE Helthcare | GE17-5087-01 | Chromtography column |
| HiTrap NHS-activated Sepharose HP, 1 mL | GE Helthcare | 17-0716-01 | Chromatography columns |
| Hydrochloric acid | Carl Roth GmbH | 4625.1 | Buffer component |
| Imidazole | Carl Roth GmbH | 3899.2 | Buffer component |
| K700 | Pall | 5302305 | Depth filter layer |
| KM02 basic | IKA | n/a | Magnetic stirrer |
| KS50P 60D | Pall | B12486 | Depth filter layer |
| L/S 24 | Masterflex | SN-06508-24 | Tubing |
| Lauda E300 | Lauda Dr Wobser GmbH | Z90010 | Immersion circulator |
| Magnesium chloride | Carl Roth GmbH | KK36.2 | Buffer component |
| Masterflex L/S | Masterflex | HV-77921-75 | Peristaltic pump |
| Minisart 0.2 µm | Sartorius | 16534K | Filter unit |
| Nalgene Rapid-Flow PES bottle top filter | Thermo Fischer Scientific | 595-4520 | Vacuum filtration of SPR buffers |
| Nickel sulphate | Carl Roth GmbH | T111.1 | Buffer component |
| Novex NuPAGE 4-12% BisTris LDS gels | Invitrogen | NP0336BOX | LDS-PAA gels |
| Novex X-cell Mini Cell | Invitrogen | EI0001 | PAGE chamber |
| NuPAGE 20x running buffer | Invitrogen | NP0002 | Buffer concentrate |
| NuPAGE antioxidant | Invitrogen | NP0005 | Antioxidant |
| PageRuler protein ladder (10-180 kDa) | Invitrogen | 26616 | Protein standart |
| Perforated bucked | n/a | n/a | Blanching |
| PH 3110 | WTW | 2AA110 | PH meter |
| PowerPac HC | Biorad | 1645052 | Electrophoresis module |
| Protein A from Staphylococcus aureus | Sigma-Aldrich | P7837-5MG | Coating of SPR chips |
| Sephadex G-25 fine, cross linked dextran | GE Helthcare | 17003301 | Chromatography resin |
| Silicone spoon | n/a | n/a | Spoon |
| Simply Blue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | Gel staining solution |
| Sodium acetate | Carl Roth GmbH | 6773.1 | Buffer component |
| Sodium acetate | Carl Roth GmbH | X891.1 | Media component |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-100G | Media component |
| Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Buffer component |
| Sodium citrate | Carl Roth GmbH | HN13.2 | Buffer component |
| Sodium bisulfite | Carl Roth GmbH | 243973-100G | Media component |
| Sodium phosophate | Carl Roth GmbH | T877.2 | Media component |
| SPR Affinity Sensor - High Capacity Amine | Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics | SPR-AS-HCA | SPR chip |
| SPR-2/4 Surface Plasmon Resonance Analyzer | Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics | n/a | SPR device |
| SSM3 | Stuart | 10034264 | Mini Gyro-rocker |
| Heated vessel, 20 L | Clatronic | n/a | Blanching chamber |
| Sterile syringes, 2 mL | B. Braun | 4606027V | Syringes |
| Syringe adpter (Union Luer F) | GE Helthcare | 181112-51 | Syringe adapter |
| TE6101 | Sartorius | TE6101 | Precision scale |
| Tween-20 (Polysorbate) | Merck | 8170721000 | Buffer component |
| Unicorn 6.4 | GE Helthcare | 29056102 | Chromatography software |
| Vacuum bags | Ikea | 203.392.84 | Plant storge |
| VelaPad 60 | Pall | VP60G03KNH4 | Filter housing |
| Vortex-Genie 2 | Scientific industries | SI-0236 | Vortex |
| XK-26/20 column housing | GE Helthcare | 28-9889-48 | Chromtography column |
References
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