I denne artikel præsenterer og diskuterer vi nye udviklinger i syntesen og anvendelser af nukleinsyre-mikroarrays, som er fabrikeret in situ. Konkret viser vi, hvordan protokollerne for DNA-syntese kan udvides til RNA, og hvordan mikromatricer kan bruges til at oprette hentes nukleinsyre-biblioteker.
Photolithography er en kraftfuld teknik til syntesen af DNA-oligonukleotider på glas skred, da det kombinerer effektiviteten af phosphoramidite kobling reaktioner med præcision og tæthed af UV-lys reflekteres fra mikrometer-størrelse spejle. Photolithography giver mikroarrays, der kan rumme fra hundredtusinder op til flere millioner forskellige DNA-sekvenser, 100-NT eller længere, på kun et par timer. Med denne meget store sekvens plads, er mikroarrays ideelle platforme til at udforske mekanismerne i nukleinsyre · ligand interaktioner, som er særligt relevante i tilfælde af RNA. Vi rapporterede for nylig om forberedelsen af et nyt sæt af RNA-phosphoramiditer, der er kompatible med in situ-fotolitografi, og som efterfølgende blev brugt til at dyrke RNA-oligonukleotider, homopolymere samt blandede base sekvenser. Her illustrerer vi i detaljer processen med RNA-mikroarray fabrikation, fra det eksperimentelle design, til instrumentelle setup, array syntese, deprotection og endelige hybridiseringassay ved hjælp af en skabelon 25mer sekvens, der indeholder alle fire baser som et eksempel. Parallelt, vi går ud over hybridization-baserede eksperimenter og udnytte microarray litografiske som en billig gateway til komplekse nukleinsyre biblioteker. For at gøre dette, er high-density DNA-mikroarrays fremstillet på en base-følsom monomer, der gør det muligt for DNA at være bekvemt spaltet og hentes efter syntese og debeskyttelse. Fabrikations protokollen er optimeret for at begrænse antallet af syntetiske fejl, og med henblik herpå introduceres et lag β-caroten-opløsning for at absorbere UV-fotoner, der ellers kan afspejle sig tilbage på syntese substrater. Vi beskriver i en trinvis måde den komplette proces af bibliotekets forberedelse, fra design til spaltning og kvantificering.
Den praktiske anvendelse af DNA-mikrosystemer har traditionelt været i studiet af variationerne i genekspressions niveauerne mellem to cellepopulationer ved hjælp af komplementære tråde og fluorescens som en detektionsmetode1. Lejlighedsvis, DNA-mikroarrays venture i bindende begivenheder med ikke-nukleinsyre ligands, såsom proteiner, med en strategi for systematisk sekvens permutation, der giver et omfattende overblik over det bindende landskab2,3, 4,5. Denne tilgang omdanner effektivt mikroarrays fra blotte hybridiserings flader til platforme med bred sekvens dækning, hvilket ville være et aktiv for studiet af den rigere og mere komplekse verden af RNA-struktur og-funktion. Understøttet af den ekstremt effektive phosphoramidite kobling reaktion6, in situ SYNTETISEREDE DNA-arrays kan nu også betragtes som en billig kilde til DNA7, som er ved at blive særlig relevant i betragtning af den stadigt stigende efterspørgsel efter nukleinsyre materiale til genmontering af genet8,9, DNA-baserede nanostrukturer10, informationslagring eller sekvensering11,12. Tilsvarende kan sekvensering teknologier forventes at drage fordel af udviklingen af metoder, der giver meget komplekse blandinger af RNA oligonukleotider13. I denne sammenhæng, array fabrikations protokoller, der giver mulighed for oligonukleotider at syntetiseres in situ og ved høj densitet er ideelt placeret til at opfylde behovene i det hastigt voksende område af nukleinsyre bioteknologi. Med et så mangfoldigt område som bioteknologi kan formålet med hver ansøgning dog kræve, at DNA på mikroarray produceres enten ved høj gennemløb eller med en meget lille mængde syntetiske fejl14,15eller begge, hvilket kræver en nærmere kig på de syntese protokoller af DNA-mikroarrays, som historisk set primært er blevet optimeret til hybridiseringassays. I mellemtiden, in situ syntese af RNA-mikroarrays har været fundet at være en udfordrende bestræbelse, med de fleste af de vanskeligheder forbundet med beskyttelse gruppe for 2 ‘-Oh funktion, normalt en af-delen i standard solid-fase syntese, der er fjernet med fluor baserede reagenser, kemikalier, der er uforenelige med glas-eller silicium-overflader. Disse problemer og udfordringer i DNA og RNA-mikroarray syntese har sidst været genstand for en stor mængde af arbejde, især med litografiske tilgang16.
Photolithography bruger UV-lys til at fjerne blokeringen af oligonukleotider før kobling og kræver masker til at konstruere et mønster af UV-eksponering, og dermed spatialt organisere og kontrollere væksten af oligonukleotider. Fysiske masker er blevet erstattet af computerstyrede micromirrorer, hvis hældning selektivt reflekterer UV-lys på mikroarray substratet17,18,19. Som en UV-kilde, bruger vi 365 nm lys fra en høj effekt LED kilde20. Nuværende fotolitografiske opsætninger er udstyret med betegnelsen Micromirror Device arrays, der indeholder 1024 × 768 spejle, svarende til mere end 780.000 individuelt adresserbare pletter (“funktioner”) på et lille område på kun 1,4 cm2eller 1080p med arrays af 1920 × 1080, eller > 2 millioner spejle. Hver af spejlene i enheden har derfor direkte kontrol over den sekvens, som dyrkes på den tilsvarende funktion. Med undtagelse af UV-lys, fotolitografi funktioner som en solid-fase syntese teknik og vedtager cyklus-baserede phosphoramidite kemi. Kun det kræver en helt anden beskyttelse strategi for RNA syntese til at lykkes. Vi har udviklet en ny serie af lysfølsomme RNA-phosphoramiditter, der bærer hydrazin-labile beskytter grupper21. Disse monomerer gør det muligt for RNA at blive debeskyttet under milde forhold, der ikke påvirker integriteten af overfladen. Et første deprotection trin bruger triethylamin til at fjerne cyanoethyl fosfodiester beskyttende grupper, mens hydrazin anvendes i et andet, separat trin for at fjerne dem på 2 ‘-OH og exocyclic Amin funktioner. Derved kan RNA-oligonukleotider ~ 30-NT i længden og af enhver sekvens nu syntetiseres in situ på mikroarrays22,23. Parallelt hermed er vi også for nylig begyndt at behandle spørgsmålene om gennemløb, kvalitet og hastighed i DNA og RNA photolithography. Vi målte koblings effektivitet > 99% for alle DNA-og RNA-amiditter (figur 1) og undersøgte hvert enkelt trin i oligonukleotidforlængede cyklussen, fra oxidations tiden, til valg af aktivator og til optimal UV-eksponering24 , 25. vi har bragt i nye lys-følsomme 5 ‘ beskyttelse grupper, der kan fjernes i sekunder kun, omdanne syntesen af hundredtusinder af 100mers i et par timer-lang proces26. Vi har også fordoblet gennemløb af array fabrikation ved at udsætte to substrater samtidigt27. Endelig har vi introduceret en dT phosphoramidite, der indeholder en base-følsom succinyl gruppe som en bekvem måde at kløve, indsamle og analysere DNA og RNA-oligonukleotider, hvilket er centralt for Biblioteks forberedelse28.
På trods af den relativt verdsligt aspekt af DNA og RNA solid-fase syntese, især for nukleinsyre kemikere, mikroarray litografiske forbliver en ikke-triviel opgradering kræver en kompleks opsætning, omhyggelig kontrol og tilsyn med processen, og separate instruktioner for post-syntetisk håndtering afhængigt af arten af oligonukleotid og typen af ansøgning. I denne artikel ønsker vi at give en detaljeret præsentation af hele trin-for-trin procedure af in-situ syntese af DNA og RNA-mikroarrays ved photolithography, fra eksperimentel design til dataanalyse, med vægt på forberedelse af instrumenter og Forbrugsvarer. Vi beskriver derefter de post-syntetiske debeskyttelses metoder, der svarer til det tilsigtede formål med mikroarray fabrikation (dvs. enten hybridisering eller genopretning af nukleinsyre biblioteker).
Solid-fase DNA og RNA syntese er brød og smør af hver nukleinsyre kemi Lab, og selv om tilsætning af litografiske komponenten er ganske vist en kompleks operation, mikroarray fabrikation medieret af UV-lys er også en meget pålidelig proces . Det er desuden den eneste tilgængelige metode til in situ-RNA-syntese på mikroarrays. Stadig, som i enhver flertrins eksperimenterende procedure, der er rigelig plads til menneskelige fejl.
Måske er det mest kritiske skridt koblingen af en phosphoramidite, da det skal være en konstant højtydende kemisk reaktion for at give oligonukleotider med få syntetiske fejl. I vores microarray syntese protokol, phosphoramidite kobling er endnu mere afgørende for den samlede syntese kvalitet, da fremstillingsprocessen omgår capping og forhindrer oligonucleotid rensning. Der er beregnet trinvis koblings effektivitet på over 99% for alle lysfølsomme DNA-og RNA-phosphoramiditer, selv for meget korte koblingstider (15 s)24 , men der kan lejlighedsvis forekomme lavere koblings udbytter, navnlig for GD amidites vedkommende. Stabiliteten af de solubilized phosphoramiditer ved stuetemperatur er blevet undersøgt før og blev påvist at afhænge af arten af nukleobasen, med guanosin phosphoramiditer tilbøjelige til omfattende nedbrydning i kun et spørgsmål om dage29, 30. Men ved opbevaring ved-25 °C blev GD phosphoramiditer opløst i ACN, da 30 mM opløsning fandtes at være stabile i flere uger. Den relative ustabilitet i GD phosphoramidite-opløsninger ved stuetemperatur betyder dog, at de ikke skal holdes fastgjort til DNA-synthesizeren i flere dage.
For RNA-phosphoramiditer er koblings udbyttet meget afhængigt af phosphoramidite-kvaliteten (som kan vurderes ved 31P NMR-spektroskopi) og koblings tiden. Koblingstider på 5 minutter for rA, rG, rC og 2 min for rU synes nødvendige. Faktisk fandt vi, at afkortning af kondensations tiden til 2 min for alle RNA phosphoramiditer førte til signifikant lavere hybridiserings signaler.
DNA-synthesizeren selv, såvel som reagenser og opløsningsmidler, skal helt sikkert være så ren som muligt for at opnå det højeste udbytte af oligonukleotidsyntesen. Imidlertid, uopløseligt materiale, salte eller partikler, kan ophobes over tid i linjer og slanger af leveringssystemet, hvilket fører til en gradvis fald i forbruget af reagenser og reactanter. Hvis en generel rengøring af synthesizeren ikke løser et lavt udgangsvolumen, kan en stigning i antallet af impulser være en alternativ løsning. Særlig nyttig i tilfælde af lavt phosphoramidit-forbrug kan linjen i koblings protokollen, der svarer til pumpning af en blanding af phosphoramidite og aktivator (tredje linje i koblings under afsnittet i tabel 1 og tabel 2), modificeret fra 6 til 9 impulser uden nogen mærkbar negativ virkning på syntese kvaliteten. Desuden er antallet af pulser af aktivator nødvendig for at bringe amidite/aktivator blandingen til syntesen substrat (i øjeblikket 6, fjerde linje i koblingen under afsnit, se tabel 1 og tabel 2) afhænger af DNA-synthesizer selv samt på slange længde i syntese cellen. Dette tal kan justeres efter udskiftning af phosphoramiditten med en farvet opløsning og tælle antallet af impulser, der er nødvendige for at skubbe den farvede blanding til glas substrat for kobling.
Den beskrevne metode gør det muligt for DNA og RNA-syntese at fortsætte samtidig, på samme mikroarray. Hybrider af DNA og RNA kan også forberedes uden ændring af array fabrikations protokollerne, og så længe tretrins-debeskyttelses protokollen følges. Det skal dog bemærkes, at kun RNA-mikroarrays kræver en to-trins debeskyttelse: en decyanoethylering først med et3N efterfulgt af hydroxyl og base deprotection med hydrazin. DNA-nukleobaser blev fundet ufuldstændigt debeskyttet under disse betingelser og har brug for yderligere trin i EDA for at gennemføre fuldstændig fjernelse af phenoxyacetyl (PAC) grupper. Denne ekstra behandling med EDA er kortere (5 min) end for standard debeskyttelse af DNA-mikroarrays31, men det er tilstrækkeligt at køre den til færdiggørelse efter triethylamin-og hydrazinbehandlinger. Desuden begrænser en kort reaktionstid med EDA eksponeringen af et fuldt debeskyttet RNA-oligonukleotid til grundlæggende betingelser.
En fordel af in situ RNA array syntese over alternative metoder som spotting eller DNA transkription32,33,34 er evnen til at opbevare den syntetiserede RNA mikrochip i beskyttet form indtil brug, og dermed undgå risiko for potentiel RNA-nedbrydning. Efter syntetiske procedurer for RNA betyder på den anden side, at forbrugsstoffer og reagenser holdes sterile, og at håndteringen udføres under RNase-frie forhold. Bemærk, vi fandt, at tilføjelsen af RNase-hæmmer til hybridiseringmixet ikke gav stærkere hybridiserings signaler til RNA-funktionerne.
Syntesen af DNA-biblioteker på en base-følsom monomer er mere kompleks end syntesen af et par kontrol sekvenser på en overflade, og som sådan er helt sikkert mere tilbøjelige til at designe fejl. Men under forudsætning af, at sekvens design (dvs. karakteren og antallet af sekvenser) er korrekt, omdanne denne liste til en samling af eksponerings masker og en bestilt serie af koblingscyklusser forbliver en ligetil proces. Men, vigtige variationer fra standard microarray syntese findes og er afgørende for en vellykket fabrikation af en high-density bibliotek array.
Først, en base-følsom dT monomer er koblet som den første phosphoramidite efter syntese af linker. Koblings udbyttet af denne monomer (figur 1) blev fundet at være relativt lav, omkring 85%28, hvilket er grunden til bestræbelserne på at forbedre sin iblanding, enten ved at øge sin koncentration i ACN fra 30 mm til 50 mm, eller ved at gentage koblings trin: to på hinanden følgende koblings reaktioner ved hjælp af friske monomerer eller to separate, men fortløbende koblingscyklusser.
Den anden ændring er tilføjelsen af en β-caroten opløsning i den bageste kammer af syntese cellen, som bekvemt absorberer 365 nm lys. Dette er en vigtig modifikation af fotolitografi opsætningen, da det forhindrer UV-lys i at reflektere tilbage på array substrat. Faktisk, efter at have krydset den interstitielle medium mellem substrater, indkommende UV-lys udgange gennemboret dias og når kvarts blok af cellen. Fresnel ligninger forudsige, at ~ 4% af vinkelret hændelse UV-lys vil afspejle fra hver af de tre downstream luft-glas interfaces (udgang side af 2nd substrat og begge sider af kvarts blokken) og tilbage på syntese substrat, som fører til utilsigtet eksponering af photoprotected oligonukleotider. Diffraktion og spredning bidrager også til “off-Target” foto beskyttelse og dermed til nukleotid indsættelse, som direkte påvirker fejlfrekvensen af syntese, men disse bidrag er meget mindre end refleksioner og kan primært løses ved reducere syntese tæthed (efterlader huller mellem funktioner). Vi har konstateret, at niveauet af β-caroten opløsning i det nedre kammer af cellen tendens til let falde kun i løbet af de første minutter af array syntese, og derfor skal overvåges og justeres.
Endelig er den tredje ændring den debeskyttelses løsning, der erstatter EtOH for toluen, som holder det kløvede DNA-bibliotek bundet til overfladen, formentlig gennem elektrostatiske interaktioner. Hvis du anvender en lille mængde vand til syntese området efter ACN-vask, kan biblioteket nemt samles. Processen er dog kun vellykket, hvis vandindholdet i EDA og toluen er minimal, hvilket gør nukleinsyre helt uopløseligt i deprotection cocktail. Alternativt kan DNA-biblioteker blive kløvet af chippen ved hjælp af ammoniak9,10,14,35og derefter yderligere debeskyttet ved at opvarme den DNA-holdige ammoniakopløsning til 55 °c natten over. Genopretning af DNA-biblioteker med ammoniak er dog ikke kompatibelt med RNA. RNA-oligonukleotider på et underlag med base-spaltning kan eluppes fra overfladen ved hjælp af den samme EDA/toluen-procedure, der er beskrevet ovenfor, men kun i den næstsidste fase efter et3N og hydrazin to-trins debeskyttelses strategi28.
Alternative strategier til at inddrive oligonucleotid puljer fra mikroarrays uden behov for en specifik grundlæggende behandling eksisterer, er i princippet forenelige med fotolitografi og stole på brugen af enzymer. For eksempel kan et enkelt deoxyuracil nucleotid være målet for uracil-DNA DNA (udg) og fjernet fra resten af DNA-sekvensen, eller en enkelt RNA-enhed kan genkendes af RNase H type 2-enzymer og fosfodiester-obligationen 5 ‘ til RNA-kløvet , frigivelse af 5 ‘ DNA del23.
Vi har nu en kraftfuld, pålidelig og high-density metode til syntese af DNA, RNA, og hybrid DNA/RNA-mikroarrays. Disse kan ikke kun fungere som platforme for hybridisering eller bindende assays36, men de repræsenterer også en hurtig og billig måde at producere komplekse nukleinsyre biblioteker. For DNA-baseret digital datalagring kan mikroarray fotolitografi blive en potentiel løsning på “skrivning” flaskehalsen (dvs. til kodning af oplysninger ved syntese). Succesen i digital kodning på DNA og i de Novo gensamling afhænger af sekvens troskab, som på syntese niveau, giver sig udslag i fejlfrekvensen. Syntetiske og optiske fejl i vores nuværende array fabrikations protokoller vil blive diskuteret og rapporteret på andre steder. Parallelt hermed er der nu bestræbelser på at øge fabrikations skalaen og-gennemstrømningen yderligere.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af den østrigske videnskabs fond (FWF Grants P23797, P27275 og P30596) og den schweiziske National Science Foundation (Grant #PBBEP2_146174).
Slide functionalization | |||
Acetic acid >99.8% | Sigma | 33209 | For RNA deprotection |
CNC router | Stepcraft | 300 CK | |
Ethanol absolute | VWR | 1.07017.2511 | For deprotection and functionalization |
N-(3-triethoxysilylpropyl)-4-hydroxybutyramide | Gelest | SIT8189.5 | Silanizing reagent |
Nexterion Glass D microscope slides | Schott | 1095568 | |
Polymax 1040 | Heidolph | Orbital shaker | |
Proclean 507 Ultrasonic water bath | Ulsonix | To clean slides after drilling | |
Tickopur RW 77 Special Purpose Cleaner | Sigma | Z860086 | To clean slides after drilling |
Microarray synthesis | |||
0.25 M dicyanoimidazole in ACN | Biosolve | 0004712402BS | Activator |
0.7 XGA DMD | Texas Instruments | Digital Micromirror Device | |
20 mM I2 in pyridine/H2O/THF | Sigma | L860020-06 | Oxidizer |
250 μm thick Chemraz 584 perfluoroelastomer | FFKM | Lower teflon gasket | |
2'-O-ALE RNA phosphoramidites | ChemGenes | ||
365 nm high-power UV-LED | Nichia | NVSU333A | |
5'BzNPPOC DNA phosphoramidites | Orgentis | ||
5'NPPOC DNA phosphoramidites | FlexGen | ||
Acetonitrile | Biosolve | 0001205402BS | For DNA synthesis |
Amidite Diluent for DNA synthesis | Sigma | L010010 | For dissolving phosphoramidites |
Cleavable dT | ChemGenes | Base-sensitive monomer for library preparation | |
DMSO | Biosolve | 0004474701BS | As exposure solvent |
DNA and RNA microarray deprotection | |||
Ethylenediamine >99.5% | Sigma | 3550 | For deprotection |
Expedite 8909 | PerSeptive Biosystems | DNA synthesizer | |
Hydrazine hydrate 50-60% hydrazine | Sigma | 225819 | For RNA deprotection |
Imidazole | Sigma | 56750 | |
Industrial Strength lower-density PTFE tape | Gasoila | Thin, upper teflon gasket | |
Pyridine >99% | Sigma | P57506 | For RNA deprotection |
Triethylamine >99% | Sigma | T0886 | For RNA deprotection |
β-carotene | Sigma | C9750 | For library preparation |
Hybridization and scanning | |||
20x Sodium Saline Citrate | Roth | 1054.1 | |
5'Cy3-labelled complementary strand | Eurogentec | For duplex hybridization | |
Biopur Safe-Lock microcentrifuge tube | Eppendorf | ||
BSA (10 mg/mL) | Promega | R3961 | |
EDTA molecular biology grade | Promega | H5031 | |
GenePix 4100A | Molecular Devices | Microarray scanner | |
Hybridization oven | Boekel Scientific | 230500 | |
MES monohydrate | Sigma | 69889 | |
MES sodium | Sigma | M3058 | |
NaCl >99.5% | Sigma | 71376 | |
SecureSeal SA200 hybridization chamber | Grace BioLabs | 623503 | |
Spectrafuge mini | Labnet | C1301 | Microarray centrifuge |
Tween-20 molecular biology grade | Sigma | P9416 | |
Data extraction | |||
Excel | Microsoft | For data extraction | |
MatLab | MathWorks | Microarray design | |
NimbleScan 2.1 | Roche NimbleGen | ||
Desalting and quantification | |||
NanoDrop One Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
Toluene | Merck | ||
ZipTip C18 | Millipore | ZTC18s008 | Desalting pipet tips |