इस अनुच्छेद में हम उपस्थित हैं और संश्लेषण और न्यूक्लिक एसिड microarrays के अनुप्रयोगों में नए घटनाक्रम पर चर्चा situ में निर्मित. विशेष रूप से, हम बताते हैं कि कैसे डीएनए संश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल आरएनए करने के लिए बढ़ाया जा सकता है और कैसे microarrays retrievable न्यूक्लिक एसिड पुस्तकालयों बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
फोटोलिथोग्राफी कांच स्लाइड पर डीएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड ्स्डल के संश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है, क्योंकि यह माइक्रोमीटर आकार के दर्पण से परावर्तित यूवी प्रकाश की परिशुद्धता और घनत्व के साथ फॉस्फोरामिआइट युग्मन प्रतिक्रियाओं की दक्षता को जोड़ती है। फोटोलिथोग्राफी microarrays कि कई लाख अलग डीएनए दृश्यों, 100-nt या अब, केवल कुछ ही घंटों में हजारों की सैकड़ों से समायोजित कर सकते हैं पैदावार. यह बहुत बड़े अनुक्रम अंतरिक्ष के साथ, microarrays न्यूक्लिक एसिड-लिगंड बातचीत, जो आरएनए के मामले में विशेष रूप से प्रासंगिक हैं के तंत्र की खोज के लिए आदर्श प्लेटफार्मों रहे हैं. हमने हाल ही में आरएनए फॉस्फोरामिडीज के एक नए सेट की तैयारी के बारे में रिपोर्ट की है जो सिटू फोटोलिथोग्राफी के साथ संगत है और जिसे बाद में आरएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स, होमोपॉलीमर के साथ-साथ मिश्रित-आधार दृश्यों को विकसित करने के लिए उपयोग किया गया था। यहाँ, हम आरएनए microarray निर्माण की प्रक्रिया को विस्तार से वर्णन, प्रयोगात्मक डिजाइन से, वाद्य सेटअप करने के लिए, सरणी संश्लेषण, deprotection और अंतिम संकरीकरण परख एक टेम्पलेट 25mer एक उदाहरण के रूप में सभी चार ठिकानों युक्त अनुक्रम का उपयोग कर. समानांतर में, हम संकरीकरण आधारित प्रयोगों से परे जाते हैं और जटिल न्यूक्लिक एसिड पुस्तकालयों के लिए एक सस्ती प्रवेश द्वार के रूप में microarray photolithgraphy शोषण. ऐसा करने के लिए, उच्च घनत्व डीएनए microarrays एक आधार के प्रति संवेदनशील मोनोमर है कि डीएनए आसानी से cleaved और संश्लेषण और deprotection के बाद प्राप्त किया जा करने की अनुमति देता है पर निर्मित कर रहे हैं. निर्माण प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया गया है ताकि सिंथेटिक त्रुटियों की संख्या को सीमित किया जा सके और उस प्रभाव को, यूवी फोटॉनों को अवशोषित करने के लिए जेड-कैरोटीन समाधान की एक परत पेश की जाती है जो अन्यथा संश्लेषण substrates पर वापस प्रतिबिंबित हो सकती है। हम एक कदम दर कदम तरीके से पुस्तकालय की तैयारी की पूरी प्रक्रिया में वर्णन, डिजाइन से दरार और परिमाणीकरण के लिए.
डीएनए माइक्रोरेरेंस का व्यावहारिक उपयोग पारंपरिक रूप से दो कोशिकाओं की आबादी के बीच जीन अभिव्यक्ति के स्तर में बदलाव के अध्ययन में रहा है, एक पहचान विधि1के रूप में पूरक किस्में और फ्लोरोसेंट का उपयोग करते हुए। कभी कभी, डीएनए microarrays ऐसे प्रोटीन के रूप में गैर न्यूक्लिक एसिड ligands के साथ बाध्यकारी घटनाओं में उद्यम, व्यवस्थित अनुक्रम क्रम क्रम परिवर्तन की एक रणनीति है कि बाध्यकारी परिदृश्य2,3की एक व्यापक सिंहावलोकन प्रदान करता है के साथ, 4,5. यह दृष्टिकोण प्रभावी रूप से व्यापक अनुक्रम कवरेज के साथ प्लेटफार्मों में मात्र संकरीकरण सतहों से microarrays बदल देती है, जो आरएनए संरचना और समारोह के अमीर और अधिक जटिल दुनिया के अध्ययन के लिए एक परिसंपत्ति होगी। अत्यंत कुशल फॉस्फोरामिडाइट युग्मन प्रतिक्रिया6द्वारा समर्थित , situ संश्लेषित डीएनए सरणियों में अब भी डीएनए7के एक सस्ते स्रोत के रूप में माना जा सकता है , जो विशेष रूप से प्रासंगिक होता जा रहा है के लिए बढ़ती मांग पर विचार जीन एसेम्बली8,9, डीएनए आधारित नैनोस्ट्रक्चर10, सूचना भंडारण या अनुक्रमण11,12के लिए न्यूक्लिक एसिड सामग्री . इसी प्रकार अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों से उन विधियों के विकास से लाभ होने की संभावना है जो आरएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स13के बहुत जटिल मिश्रण उत्पन्न करते हैं। इस संदर्भ में, सरणी निर्माण प्रोटोकॉल है कि oligonucleotides के लिए अनुमति देने के लिए situ में संश्लेषित किया जा करने के लिए और उच्च घनत्व पर आदर्श न्यूक्लिक एसिड जैव प्रौद्योगिकी के तेजी से विस्तार क्षेत्र की जरूरतों को पूरा करने के लिए रखा जाता है. हालांकि, जैव प्रौद्योगिकी के रूप में विविध के रूप में एक क्षेत्र के साथ, प्रत्येक आवेदन के उद्देश्य की आवश्यकता हो सकती है कि microarray पर डीएनए या तो उच्च throughput पर या सिंथेटिक त्रुटियों की एक बहुत कम राशि के साथ उत्पादन किया जा14,15, या दोनों, की आवश्यकता होती है एक डीएनए microarrays के संश्लेषण प्रोटोकॉल पर करीब देखो, जो ऐतिहासिक, मुख्य रूप से संकरीकरण assays के लिए अनुकूलित किया गया है. इस बीच, आरएनए microarrays के situ संश्लेषण में एक चुनौतीपूर्ण प्रयास हो पाया गया है, 2′-OH समारोह के लिए सुरक्षा समूह के साथ जुड़े कठिनाई के अधिकांश के साथ, आमतौर पर मानक ठोस चरण संश्लेषण है कि के साथ हटा दिया जाता है में एक silyl moiety फ्लोरीन आधारित अभिकर्मकों, रसायन है कि कांच या सिलिकॉन सतहों के साथ असंगत हैं. उन मुद्दों और डीएनए और आरएनए microarray संश्लेषण में चुनौतियों हाल ही में काम का एक बड़ा शरीर का विषय रहा है, विशेष रूप से photolithgraphy दृष्टिकोण16के साथ .
फोटोलिथोग्राफी युग्मन से पहले ओलिगोन्यूक्लिओटाइडको अनब्लॉक करने के लिए यूवी प्रकाश का उपयोग करता है और यूवी जोखिम के पैटर्न का निर्माण करने के लिए मास्क की आवश्यकता होती है, जिससे स्थानिक रूप से आयोजन और ओलिगोन्यूक्लिओटाइड के विकास को नियंत्रित किया जाता है। भौतिक मास्कों को कंप्यूटर-नियंत्रित माइक्रोमिरोर्स द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है जिसका झुकाव चुनिंदा रूप से माइक्रोरेरे सब्सट्रेट17,18,19पर यूवी प्रकाश को दर्शाता है . एक यूवी स्रोत के रूप में, हम एक उच्च शक्ति एलईडी स्रोत20से 365 एनएम प्रकाश का उपयोग करें। वर्तमान photolithographic setups 1024 – 768 दर्पण युक्त micromirror सरणियों से लैस हैं, अधिक से अधिक 780.000 व्यक्तिगत addressable स्पॉट के लिए इसी (“विशेषताएं”) सिर्फ 1.4 सेमी2के एक छोटे से क्षेत्र पर, या 1080p की सरणियों के साथ 1920 $ 1080, या 2 लाख दर्पण. इसलिए डिवाइस में दर्पण के प्रत्येक इसी सुविधा पर हो अनुक्रम पर सीधा नियंत्रण है. यूवी प्रकाश के अपवाद के साथ, एक ठोस चरण संश्लेषण तकनीक की तरह photolithgraphy कार्य करता है और चक्र आधारित फॉस्फोरामिाइट रसायन शास्त्र को गोद ले। केवल यह आरएनए संश्लेषण के लिए एक पूरी तरह से अलग सुरक्षा रणनीति की आवश्यकता है सफल होने के लिए. हमने प्रकाश-संवेदी आरएनए फॉस्फोरामिडाइट्स की एक नई श्रृंखला विकसित की है जिसमें हाइड्रैजीन-लेबिल सुरक्षा समूह21हैं। इन मोनोमरों से आरएनए को हल्की परिस्थितियों में निष्क्रिय किया जा सकता है जो सतह की अखंडता को प्रभावित नहीं करते हैं। एक पहले deprotection कदम cyanoethyl फॉस्फोडाइस्टर की रक्षा समूहों को दूर करने के लिए triethylamine का उपयोग करता है, जबकि hydrazine एक दूसरे में प्रयोग किया जाता है, अलग कदम 2′-OH और exocyclic amine कार्यों में उन लोगों को दूर करने के लिए. ऐसा करने में, आरएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स की लंबाई में और किसी भी अनुक्रम का अब माइक्रोरेयरे पर स्थिति में संश्लेषित किया जा सकता है22,23. समानांतर में, हमने हाल ही में डीएनए और आरएनए फोटोलिथोग्राफी में थ्रूपुट, गुणवत्ता और गति के प्रश्नों का समाधान करना भी शुरू किया है। हम युग्मन क्षमता मापा और सभी डीएनए और आरएनए amidites के लिए 99% (चित्र 1) और oligonucleotide बढ़ाव चक्र में प्रत्येक व्यक्ति के कदम की जांच की, ऑक्सीकरण समय से, उत्प्रेरक के चुनाव के लिए और इष्टतम यूवी जोखिम24 , 25.हम नए प्रकाश के प्रति संवेदनशील 5 ‘ सुरक्षा समूहों है कि सेकंड में ही हटाया जा सकता है में लाया है, कुछ ही घंटों लंबी प्रक्रिया26में 100mers के हजारों की सैकड़ों के संश्लेषण को बदलने . हमने27एक साथ दो सब्सट्रक् रेटों को उजागर करके सरणी निर्माण के थ्रूपुट को भी दोगुना कर दिया है . अंत में, हमने एक डीटी फॉस्फोरामाइड पेश किया है जिसमें आधार-संवेदी सक्सिनिल समूह शामिल है, जो डीएनए को इकट्ठा करने और विश्लेषण करने का एक सुविधाजनक तरीका है, जो पुस्तकालय की तैयारी28के लिए केंद्रीय है।
डीएनए और आरएनए ठोस चरण संश्लेषण के अपेक्षाकृत सांसारिक पहलू के बावजूद, विशेष रूप से न्यूक्लिक एसिड केमिस्टों के लिए, microarray photolithgraphy एक जटिल सेटअप की आवश्यकता होती है एक गैर-trivial उन्नयन रहता है, सावधान नियंत्रण और प्रक्रिया के पर्यवेक्षण, और ओलिगोन्यूक्लिओटाइड की प्रकृति और अनुप्रयोग के प्रकार के आधार पर पोस्ट-सिंथेटिक हैंडलिंग के लिए अलग-अलग निर्देश। इस अनुच्छेद में, हम उपकरणों की तैयारी पर जोर देने के साथ, प्रयोगात्मक डिजाइन से डेटा विश्लेषण करने के लिए, फोटोलिथोग्राफी द्वारा डीएनए और आरएनए microarrays के situ संश्लेषण में पूरे कदम दर कदम प्रक्रिया की एक विस्तृत प्रस्तुति प्रदान करना चाहते हैं और उपभोग्य वस्तुएं। हम तो पोस्ट सिंथेटिक deprotection तरीकों है कि microarray निर्माण के उद्देश्य से मेल खाते हैं (यानी, या तो संकरीकरण या न्यूक्लिक एसिड पुस्तकालयों की वसूली).
ठोस चरण डीएनए और आरएनए संश्लेषण हर न्यूक्लिक एसिड रसायन विज्ञान प्रयोगशाला की रोटी और मक्खन है, और हालांकि photolithgraphy घटक के अलावा बेशक एक जटिल आपरेशन है, microarray निर्माण यूवी प्रकाश द्वारा मध्यस्थता भी एक बहुत ही विश्वसनीय प्रक्रिया है . इसके अतिरिक्त, माइक्रोरेअर्स पर इन सीटू आरएनए संश्लेषण के लिए एकमात्र उपलब्ध विधि है। फिर भी, के रूप में किसी भी बहु चरण प्रयोगात्मक प्रक्रिया में, वहाँ मानव त्रुटि के लिए पर्याप्त जगह है.
शायद सबसे महत्वपूर्ण कदम एक फॉस्फोरामिदीट का युग्मन है, क्योंकि कुछ सिंथेटिक त्रुटियों के साथ ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स को वहन करने के लिए इसे लगातार उच्च उपज वाली रासायनिक प्रतिक्रिया की आवश्यकता होती है। हमारे microarray संश्लेषण प्रोटोकॉल में, फॉस्फोरामिआइट युग्मन समग्र संश्लेषण गुणवत्ता के लिए और भी अधिक निर्णायक है क्योंकि निर्माण प्रक्रिया कैपिंग को नजरअंदाज कर देती है और ओलिगोन्यूक्लिओटाइड शोधन को रोकती है। चरणबद्ध युग्मन क्षमता 99% से ऊपर सभी photosensitive डीएनए और आरएनए फॉस्फोरामिडीज के लिए गणना की गई है, यहां तक कि बहुत कम युग्मन समय के लिए (15 s)24 लेकिन कम युग्मन पैदावार कभी कभी हो सकता है, विशेष रूप से डीजी amidites के मामले में. कमरे के तापमान पर solubilized फॉस्फोरामिडाइट्स की स्थिरता पहले जांच की गई है और न्यूक्लिओबेस की प्रकृति पर निर्भर करने के लिए दिखाया गया था, ग्वानोसाइन फॉस्फोरामिडाइट्स के साथ केवल29दिनों के एक मामले में व्यापक गिरावट के लिए प्रवण , 30| लेकिन जब -25 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है, तो डीजी फॉस्फोरामिडाइट्स एसीएन में भंग हो जाते हैं क्योंकि 30 एमएम समाधान कई हफ्तों तक स्थिर पाया गया। कमरे के तापमान पर डीजी फॉस्फोरामिदीट समाधान के रिश्तेदार अस्थिरता हालांकि वे कई दिनों के लिए डीएनए सिंथेसाइज़र से जुड़े नहीं रखा जाना चाहिए कि इसका मतलब है.
आरएनए फॉस्फोरामिडीज के लिए, युग्मन उपज फॉस्फोरामिटाइट गुणवत्ता पर बहुत निर्भर है (जो 31पी एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है) और युग्मन समय। rA, rG, rC और rU के लिए 2 मिनट के लिए 5 मिनट के युग्मन समय आवश्यक दिखाई देते हैं. वास्तव में, हमने पाया कि सभी आरएनए फॉस्फोऐस्फोऐमिडीज के लिए संघनन समय को 2 मिनट तक कम करने से संकरीकरण संकेतों में काफी कमी आई।
डीएनए सिंथेसाइज़र ही, साथ ही अभिकर्मकों और सॉल्वैंट्स, निश्चित रूप से oligonucleotide संश्लेषण के उच्चतम उपज को प्राप्त करने के क्रम में संभव के रूप में स्वच्छ होने की जरूरत है. हालांकि, अघुलनशील सामग्री, लवण या कणों, लाइनों और वितरण प्रणाली की ट्यूबिंग में समय के साथ जमा कर सकते हैं, अभिकर्मकों और reactants की खपत में एक क्रमिक कमी करने के लिए अग्रणी. जहां सिंथेसाइज़र की एक सामान्य सफाई एक कम उत्पादन मात्रा को हल नहीं करता है, दालों की संख्या में वृद्धि एक वैकल्पिक समाधान हो सकता है. कम फॉस्फोरामिआइट खपत के मामले में विशेष रूप से उपयोगी, युग्मन प्रोटोकॉल में रेखा फॉस्फोरामिआइट और उत्प्रेरक के मिश्रण के पम्पिंग के लिए संगत (तालिका 1 और तालिका 2में युग्मन उपधारा की तीसरी पंक्ति) हो सकता है संशोधित, से 6 करने के लिए 9 दालों संश्लेषण की गुणवत्ता पर किसी भी प्रशंसनीय नकारात्मक प्रभाव के बिना. इसके अलावा, उत्प्रेरक की दालों की संख्या संश्लेषण सब्सट्रेट करने के लिए amidite / सक्रियक मिश्रण लाने की जरूरत (वर्तमान में 6, युग्मन उपधारा में चौथी लाइन, तालिका 1 और तालिका 2देखें) डीएनए सिंथेसाइज़र पर ही के रूप में अच्छी तरह से पर निर्भर करता है संश्लेषण कोशिका में ट्यूबिंग लंबाई. यह संख्या एक रंगीन समाधान के साथ फॉस्फोरामिडाइट की जगह और युग्मन के लिए कांच सब्सट्रेट करने के लिए रंगीन मिश्रण पुश करने के लिए आवश्यक दालों की संख्या की गिनती के बाद समायोजित किया जा सकता है।
विधि यहाँ वर्णित डीएनए और आरएनए संश्लेषण के लिए एक साथ आगे बढ़ने के लिए अनुमति देता है, एक ही microarray पर. डीएनए और आरएनए के संकर भी सरणी निर्माण प्रोटोकॉल के लिए किसी भी परिवर्तन के बिना तैयार किया जा सकता है, और जब तक तीन कदम deprotection प्रोटोकॉल का पालन किया है. हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि आरएनए केवल microarrays केवल एक दो कदम deprotection की आवश्यकता: एक decyanoethylation पहले के साथ एट3एन के बाद हाइड्रेक्सिल और base deprotection hydrazine के साथ. डीएनए न्यूक्लिओबेस उन परिस्थितियों में अपूर्ण रूप से deprotected पाया गया, और PHENoxyacetyl (Pac) समूहों की पूरी तरह से हटाने को प्रभावित करने के क्रम में EDA में अतिरिक्त कदम की जरूरत है. EDA के साथ यह अतिरिक्त उपचार कम है (5 मिनट) डीएनए microarrays के मानक deprotection के लिए की तुलना में31, लेकिन यह triethylamine और hydrazine उपचार के बाद पूरा करने के लिए इसे ड्राइव करने के लिए पर्याप्त है. इसके अलावा, EDA के साथ एक छोटी प्रतिक्रिया समय बुनियादी स्थितियों के लिए एक पूरी तरह से संरक्षित आरएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड के जोखिम को सीमित करता है।
पता लगना आर एन ए सरणी संश्लेषण का एक लाभ के वैकल्पिक तरीकों पर खोलना या डीएनए प्रतिलेखन32,33,34 का उपयोग करें, इस प्रकार से बचने तक संरक्षित रूप में संश्लेषित आरएनए माइक्रोचिप स्टोर करने की क्षमता है संभावित आरएनए गिरावट का खतरा. आरएनए के लिए पोस्ट-सिंथेटिक प्रक्रियाओं, दूसरी ओर, मतलब है कि उपभोग्य और अभिकर्मकों बाँझ रखा जाता है और है कि हैंडलिंग RNase मुक्त शर्तों के तहत किया जाता है. नोट की, हमने पाया कि संकरीकरण मिश्रण करने के लिए RNase अवरोध करनेवाला के अलावा आरएनए सुविधाओं के लिए मजबूत संकरीकरण संकेतों उपज नहीं था.
एक आधार के प्रति संवेदनशील मोनोमर पर डीएनए पुस्तकालयों के संश्लेषण एक सतह पर कुछ नियंत्रण दृश्यों के संश्लेषण की तुलना में अधिक जटिल है, और इस तरह के रूप में निश्चित रूप से अधिक डिजाइन त्रुटियों के लिए प्रवण है. फिर भी, यह मानते हुए कि अनुक्रम डिजाइन (यानी, प्रकृति और दृश्यों की संख्या) सही है, जोखिम मास्क का एक संग्रह में इस सूची को बदलने और युग्मन चक्र का एक आदेश दिया श्रृंखला एक सीधी प्रक्रिया बनी हुई है. हालांकि, मानक microarray संश्लेषण से महत्वपूर्ण बदलाव मौजूद हैं और एक उच्च घनत्व पुस्तकालय सरणी के एक सफल निर्माण के लिए महत्वपूर्ण हैं.
सबसे पहले, एक आधार के प्रति संवेदनशील डीटी मोनोमर linker के संश्लेषण के बाद पहले फॉस्फोरामिडाइट के रूप में युग्मित है। इस मोनोमर की युग्मनउपज अपेक्षाकृत कम पाई गई , लगभग 85%28, यही कारण है कि इसके निगमन दर में सुधार करने के प्रयास किए जाते हैं, या तो ACN में अपनी सांद्रता को 30 m से बढ़ाकर 50 M, या दोहराकर युग्मन कदम: ताजा monomers, या दो अलग लेकिन लगातार युग्मन चक्र का उपयोग कर दो लगातार युग्मन प्रतिक्रियाओं.
दूसरा परिवर्तन संश्लेषण सेल के पिछले कक्ष में एक जेड-कैरोटीन विलयन का योग है, जो आसानी से 365 एनएम प्रकाश को अवशोषित करता है। यह photolithgraphy सेटअप का एक महत्वपूर्ण संशोधन के रूप में यह सरणी सब्सट्रेट पर वापस प्रतिबिंबित से यूवी प्रकाश रोकता है. वास्तव में, substrates के बीच अंतराकाशी माध्यम traversing के बाद, आने वाली यूवी प्रकाश drilled स्लाइड के माध्यम से बाहर निकालता है और सेल के क्वार्ट्ज ब्लॉक तक पहुँचता है. फ्रेनल समीकरणों का अनुमान है कि सीधा घटना यूवी प्रकाश के 4% तीन बहाव हवा ग्लास इंटरफेस में से प्रत्येक से प्रतिबिंबित करेगा (2एन डी सब्सट्रेट के एक तरफ और क्वार्ट्ज ब्लॉक के दोनों पक्षों) और वापस संश्लेषण सब्सट्रेट पर, जिससे फोटोप्रोक्षित ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स का अनपेक्षित प्रदर्शन होता है। Diffraction और प्रकीर्णन भी करने के लिए योगदान “ऑफ-लक्ष्य” photodeprotection और, इसलिए, न्यूक्लिओटाइड प्रविष्टि के लिए, जो सीधे संश्लेषण की त्रुटि दर को प्रभावित करता है, लेकिन इन योगदान प्रतिबिंब की तुलना में बहुत छोटे हैं और मुख्य रूप से संबोधित किया जा सकता है संश्लेषण घनत्व को कम करने (सुविधाओं के बीच अंतराल छोड़). हमने पाया है कि सेल के निचले कक्ष में र्-कैरोटीन विलयन का स्तर केवल सरणी संश्लेषण के प्रथम मिनट के दौरान ही कम हो जाता है, और इसलिए इसकी निगरानी और पुनर्समायोजित करने की आवश्यकता होती है।
अंत में, तीसरा परिवर्तन deprotection समाधान है, toluene के लिए EtOH की जगह, जो सतह से बाध्य cleaved डीएनए पुस्तकालय रहता है, संभवतः इलेक्ट्रोस्टैटिक बातचीत के माध्यम से. ACN धोने के बाद संश्लेषण क्षेत्र के लिए पानी की एक छोटी राशि लागू करने के लिए पुस्तकालय आसानी से एकत्र किया जा करने के लिए अनुमति देता है. प्रक्रिया लेकिन केवल सफल अगर EDA और toluene में पानी की सामग्री कम है, deprotection कॉकटेल में पूरी तरह से अघुलनशील न्यूक्लिक एसिड प्रतिपादन. वैकल्पिक रूप से, डीएनए पुस्तकालयों को अमोनिया9,10,14,35का उपयोग करके चिप को बंद कर दिया जा सकता है, फिर रात भर 55 डिग्री सेल्सियस के लिए डीएनए युक्त जलीय अमोनिया समाधान को गर्म करके और अधिक असुरक्षित किया जा सकता है। अमोनिया का उपयोग कर डीएनए पुस्तकालयों की वसूली हालांकि आरएनए के साथ संगत नहीं है. आरएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स को आधार-क्लीवेबल सब्सट्रेट पर ऊपर वर्णित एक ही EDA/toluene प्रक्रिया का उपयोग करके सतह से हटाया जा सकता है, लेकिन केवल एट3एन और हाइड्रेज़ीन के बाद अंतिम चरण में दो-चरण deprotection रणनीति28.
वैकल्पिक रणनीतियों एक विशिष्ट बुनियादी उपचार के लिए आवश्यकता के बिना microarrays से oligonucleotide पूल ठीक करने के लिए मौजूद हैं, सिद्धांत रूप में photolithgraphy के साथ संगत हैं और एंजाइमों के उपयोग पर भरोसा करते हैं. उदाहरण के लिए, एक एकल deoxyuracil न्यूक्लिओटाइड uracil-डीएनए ग्लाइकोसील (UDG) का लक्ष्य हो सकता है और डीएनए अनुक्रम के बाकी से excised, या एक एकल आरएनए इकाई RNase एच प्रकार 2 एंजाइमों और फॉस्फोडाइस्टर बांड 5′ आरएनए cled के लिए द्वारा मान्यता प्राप्त किया जा सकता है , 5 ‘डीएनए भाग23जारी .
अब हमारे पास डीएनए, आरएनए और हाइब्रिड डीएनए/आरएनए माइक्रोरेअर्स के संश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली, विश्वसनीय और उच्च घनत्व विधि है। ये न केवल संकरीकरण या बाध्यकारी assays36के लिए प्लेटफार्मों के रूप में सेवा कर सकते हैं, लेकिन वे भी जटिल न्यूक्लिक एसिड पुस्तकालयों का उत्पादन करने के लिए एक तेजी से और सस्ती तरीका प्रतिनिधित्व करते हैं. डीएनए आधारित डिजिटल डेटा भंडारण के लिए, microarray photolithography “लेखन” बाधाओं के लिए एक संभावित समाधान बन सकता है (यानी, संश्लेषण द्वारा जानकारी के एन्कोडिंग के लिए). डीएनए पर और de नोवो जीन विधानसभा में डिजिटल एन्कोडिंग में सफलता अनुक्रम निष्ठा पर निर्भर करता है जो, संश्लेषण स्तर पर, त्रुटि दर में तब्दील. हमारे वर्तमान सरणी निर्माण प्रोटोकॉल में सिंथेटिक और ऑप्टिकल त्रुटियों पर चर्चा की जाएगी और कहीं और पर रिपोर्ट. समानांतर में, अब निर्माण पैमाने और थ्रूपुट को और बढ़ाने के प्रयास किए जा रहे हैं।
The authors have nothing to disclose.
यह काम ऑस्ट्रिया ईएसआइ साइंस फंड (FWF अनुदान P23797, P27275 और P30596) और स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (ग्रेंट #PBBEP2_146174) द्वारा समर्थित किया गया था।
Slide functionalization | |||
Acetic acid >99.8% | Sigma | 33209 | For RNA deprotection |
CNC router | Stepcraft | 300 CK | |
Ethanol absolute | VWR | 1.07017.2511 | For deprotection and functionalization |
N-(3-triethoxysilylpropyl)-4-hydroxybutyramide | Gelest | SIT8189.5 | Silanizing reagent |
Nexterion Glass D microscope slides | Schott | 1095568 | |
Polymax 1040 | Heidolph | Orbital shaker | |
Proclean 507 Ultrasonic water bath | Ulsonix | To clean slides after drilling | |
Tickopur RW 77 Special Purpose Cleaner | Sigma | Z860086 | To clean slides after drilling |
Microarray synthesis | |||
0.25 M dicyanoimidazole in ACN | Biosolve | 0004712402BS | Activator |
0.7 XGA DMD | Texas Instruments | Digital Micromirror Device | |
20 mM I2 in pyridine/H2O/THF | Sigma | L860020-06 | Oxidizer |
250 μm thick Chemraz 584 perfluoroelastomer | FFKM | Lower teflon gasket | |
2'-O-ALE RNA phosphoramidites | ChemGenes | ||
365 nm high-power UV-LED | Nichia | NVSU333A | |
5'BzNPPOC DNA phosphoramidites | Orgentis | ||
5'NPPOC DNA phosphoramidites | FlexGen | ||
Acetonitrile | Biosolve | 0001205402BS | For DNA synthesis |
Amidite Diluent for DNA synthesis | Sigma | L010010 | For dissolving phosphoramidites |
Cleavable dT | ChemGenes | Base-sensitive monomer for library preparation | |
DMSO | Biosolve | 0004474701BS | As exposure solvent |
DNA and RNA microarray deprotection | |||
Ethylenediamine >99.5% | Sigma | 3550 | For deprotection |
Expedite 8909 | PerSeptive Biosystems | DNA synthesizer | |
Hydrazine hydrate 50-60% hydrazine | Sigma | 225819 | For RNA deprotection |
Imidazole | Sigma | 56750 | |
Industrial Strength lower-density PTFE tape | Gasoila | Thin, upper teflon gasket | |
Pyridine >99% | Sigma | P57506 | For RNA deprotection |
Triethylamine >99% | Sigma | T0886 | For RNA deprotection |
β-carotene | Sigma | C9750 | For library preparation |
Hybridization and scanning | |||
20x Sodium Saline Citrate | Roth | 1054.1 | |
5'Cy3-labelled complementary strand | Eurogentec | For duplex hybridization | |
Biopur Safe-Lock microcentrifuge tube | Eppendorf | ||
BSA (10 mg/mL) | Promega | R3961 | |
EDTA molecular biology grade | Promega | H5031 | |
GenePix 4100A | Molecular Devices | Microarray scanner | |
Hybridization oven | Boekel Scientific | 230500 | |
MES monohydrate | Sigma | 69889 | |
MES sodium | Sigma | M3058 | |
NaCl >99.5% | Sigma | 71376 | |
SecureSeal SA200 hybridization chamber | Grace BioLabs | 623503 | |
Spectrafuge mini | Labnet | C1301 | Microarray centrifuge |
Tween-20 molecular biology grade | Sigma | P9416 | |
Data extraction | |||
Excel | Microsoft | For data extraction | |
MatLab | MathWorks | Microarray design | |
NimbleScan 2.1 | Roche NimbleGen | ||
Desalting and quantification | |||
NanoDrop One Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
Toluene | Merck | ||
ZipTip C18 | Millipore | ZTC18s008 | Desalting pipet tips |