I denna artikel presenterar vi och diskuterar nya utvecklingar i syntes och tillämpningar av nukleinsyremikromatriser fabricerade in situ. Närmare bestämt visar vi hur protokollen för DNA-syntes kan utökas till RNA och hur mikromatriser kan användas för att skapa hämtningsbara nukleinsyrebibliotek.
Photolithography är en kraftfull teknik för syntes av DNA oligonukleotides på glas diabilder, eftersom den kombinerar effektiviteten av fosforamidite koppling reaktioner med precision och täthet av UV-ljus reflekteras från mikrometer stora speglar. Photolithography ger Microarrays som rymmer från hundratusentals upp till flera miljoner olika DNA-sekvenser, 100-NT eller längre, på bara några timmar. Med denna mycket stora sekvens utrymme, Microarrays är idealiska plattformar för att utforska mekanismerna för nukleinsyra · ligandinteraktioner, som är särskilt relevanta när det gäller RNA. Vi rapporterade nyligen om utarbetandet av en ny uppsättning av RNA-fosforamiditer kompatibla med in situ Photolithography och som senare användes för att odla RNA oligonukleotides, homopolymerer samt blandade-bas sekvenser. Här illustrerar vi i detalj processen för RNA microarray Fabrication, från experimentell design, instrumentell installation, array syntes, deprotection och final hybridisering assay med hjälp av en mall 25mer sekvens som innehåller alla fyra baser som ett exempel. Parallellt går vi bortom hybridisering-baserade experiment och utnyttja microarray Photolithography som en billig inkörsport till komplexa nukleinsyra bibliotek. För att göra det, är hög densitet DNA Microarrays fabricerade på en bas-känslig monomer som gör att DNA för att vara bekvämt klyvs och hämtas efter syntes och deprotection. Tillverknings protokollet är optimerat för att begränsa antalet syntetiska fel och för detta, ett skikt av β-karoten lösning införs för att absorbera UV-fotoner som annars kan reflektera tillbaka på syntes substrat. Vi beskriver i ett steg-för-steg hur hela processen med biblioteks förberedelse, från design till klyvning och kvantifiering.
Den praktiska användningen av DNA-mikromatriser har traditionellt varit i studiet av variationer i gen uttrycks nivåer mellan två cellpopulationer, med hjälp av kompletterande strängar och fluorescens som en detektionsmetod1. Ibland, DNA Microarrays venture till bindande händelser med icke-nukleinsyra ligander, såsom proteiner, med en strategi för systematisk sekvens permutation som erbjuder en omfattande översikt av bindningen landskap2,3, 4,5. Denna metod omvandlar effektivt mikromatriser från enbart hybridisering ytor till plattformar med bred sekvens täckning, vilket skulle vara en tillgång för studiet av den rikare och mer komplex värld av RNA struktur och funktion. Med stöd av den extremt effektiva fosforamidite-kopplingsreaktionen6, kan in situ SYNTETISERADE DNA-matriser nu också betraktas som en billig källa till DNA7, vilket blir särskilt relevant med tanke på den ständigt ökande efterfrågan på nukleinsyraferial för gen församlingen8,9, DNA-baserade nanostrukturer10, informationslagring eller sekvensering11,12. På samma sätt kommer sekvenseringstekniker sannolikt att gynnas av utvecklingen av metoder som ger mycket komplexa blandningar av RNA-oligonukleotider13. I detta sammanhang, array Fabrication protokoll som gör det möjligt för oligonukleotides att syntetiseras på plats och vid hög densitet är idealiskt placerade för att tillgodose behoven hos det snabbt växande området av nukleinsyra bioteknik. Med ett så vitt skilda område som bioteknik kan syftet med varje ansökan dock kräva att DNA på microarray produceras antingen vid hög genomströmning eller med en mycket låg mängd syntetiska fel14,15, eller båda, vilket kräver en närmare titt på syntes protokollen av DNA Microarrays som historiskt sett har främst optimerats för hybridisering assays. Under tiden, in situ syntes av RNA Microarrays har visat sig vara en utmanande strävan, med de flesta av de svårigheter som är förknippade med den skyddande gruppen för 2 ‘-OH funktion, oftast en silylgrupp del i standard solid-fas syntes som avlägsnas med fluor-baserade reagenser, kemikalier som är oförenliga med glas-eller kisel ytor. Dessa frågor och utmaningar i DNA och RNA microarray syntes har nyligen varit föremål för en stor kropp av arbete, i synnerhet med Photolithography förhållningssätt16.
Photolithography använder UV-ljus för att avblockera oligonukleotides innan kopplingen och kräver masker för att konstruera ett mönster av UV-exponering, därigenom rumsligt organisera och kontrollera tillväxten av oligonukleotides. Fysiska masker har ersatts av datorstyrda micromirrors vars vippning selektivt reflekterar UV-ljus på mikroarraysubstratet17,18,19. Som UV-källa använder vi 365 nm ljus från en hög effekt LED-källa20. Nuvarande photolithographic uppställningar är utrustade med Micromirror Device matriser som innehåller 1024 × 768 speglar, vilket motsvarar mer än 780 000 individuellt adresserbara fläckar (“egenskaper”) på en liten yta på bara 1,4 cm2, eller 1080p med matriser av 1920 × 1080, eller > 2 miljoner speglar. Var och en av speglarna i enheten har därför direkt kontroll över sekvensen som odlas på motsvarande funktion. Med undantag av UV-ljus, Photolithography fungerar något liknande enarrangera gradvis syntes teknik och adopterar den cykla-baserade phosphoramiditekemin. Bara det kräver en helt annan skyddsstrategi för RNA-syntes för att lyckas. Vi utvecklade en ny serie av ljuskänsliga RNA-fosforamiditer med hydrazin-labila skyddande grupper21. Dessa monomerer tillåter RNA att deskyddas under milda förhållanden som inte påverkar integriteten av ytan. En första deprotection steg använder trietylamin att ta bort cyanoetylfosfodiester skydda grupper, medan hydrazin används i en andra, separat steg för att ta bort dem på 2 ‘-OH och exocykliska Amin funktioner. På så sätt, RNA oligonukleotides ~ 30-NT i längd och i varje sekvens kan nu syntetiseras in situ på Microarrays22,23. Parallellt har vi också nyligen börjat ta itu med frågor om genomströmning, kvalitet och snabbhet i DNA och RNA Photolithography. Vi mätte kopplingen effektivitetsvinster > 99% för alla DNA och RNA amiditer (figur 1) och undersökt varje enskilt steg i oligonukleotid förlängning cykel, från oxidation tid, val av aktivator och optimal UV-exponering24 , 25. vi har fört in nya ljuskänsliga 5 “skydda grupper som kan avlägsnas på bara några sekunder, omvandla syntesen av hundratusentals 100mers till några timmar långa process26. Vi har också fördubblat genomströmningen av array Fabrication genom att exponera två substrat samtidigt27. Slutligen har vi infört en dT fosforamidite som innehåller en bas känslig Succinyl grupp som ett bekvämt sätt att klyva, samla in och analysera DNA och RNA oligonukleotides, som är centralt för biblioteks beredning28.
Trots den relativt vardagliga aspekten av DNA och RNA solid-fas syntes, särskilt för nukleinsyrafokemister, microarray Photolithography förblir en icke-trivial uppgradering som kräver en komplex installation, noggrann kontroll och övervakning av processen, och separata instruktioner för post-syntetisk hantering beroende på typen av oligonukleotid och typ av ansökan. I denna artikel vill vi ge en detaljerad presentation av hela steg-för-steg-förfarandet för in situ-syntes av DNA och RNA-mikromatriser av Photolithography, från experimentell design till dataanalys, med betoning på beredning av instrument och Förbrukningsvaror. Vi beskriver sedan de post-syntetiska deprotection metoder som motsvarar det avsedda syftet med microarray Fabrication (dvs, antingen hybridisering eller återvinning av nukleinsyra bibliotek).
Solid-fas DNA och RNA-syntes är bröd och smör i varje nukleinsyra kemi Lab, och även om tillägg av Photolithography komponenten är visserligen en komplicerad operation, microarray Fabrication medieras av UV-ljus är också en mycket tillförlitlig process . Det är dessutom den enda tillgängliga metoden för in situ RNA-syntes på mikromatriser. Fortfarande, som i alla etappvis experimentella förfarande, det finns gott om utrymme för mänskliga fel.
Det kanske mest kritiska steget är kopplingen av en fosforamidite, eftersom det måste vara en ständigt högavkastande kemisk reaktion för att ge oligonukleotides med få syntetiska fel. I vårt microarray Synthesis Protocol är phosphoramidite koppling ännu mer avgörande för övergripande syntes kvalitet eftersom tillverkningsprocessen kringgår tak och förebygger oligonukleotidrening. Stegvis koppling effektivitet över 99% har beräknats för alla ljuskänsliga DNA och RNA-fosforamiditer, även för mycket korta kopplingstider (15 s)24 men lägre kopplings avkastning kan ibland förekomma, särskilt när det gäller GD amidites. Stabiliteten hos de solubiliserade fosforamiditer vid rumstemperatur har undersökts innan och visades bero på vilken typ av nukleobas, med guanosin fosforamiditer benägna att omfattande nedbrytning i endast en fråga om dagar29, 30. Men vid förvaring vid-25 ° c konstaterades att GD fosforamiditer som upplöstes i ACN som 30 mM lösning var stabila i flera veckor. Den relativa instabiliteten hos GD fosforamidite-lösningar vid rumstemperatur innebär dock att de inte bör hållas knutna till DNA-syntesen i flera dagar.
För RNA-fosforamiditer, är kopplingen avkastningen mycket beroende av fosforamidite kvalitet (som kan bedömas med 31P NMR spektroskopi) och kopplingstid. Kopplingstider på 5 minuter för rA, rG, rC och 2 min för rU förefaller nödvändiga. Faktum är att vi fann att förkorta kondensations tiden till 2 min för alla RNA-fosforamiditer ledde till betydligt lägre hybridisering signaler.
Själva DNA-syntet, liksom reagenser och lösningsmedel, måste absolut vara så rena som möjligt för att uppnå den högsta avkastningen av oligonukleotidsyntes. Men olösligt material, salter eller partiklar, kan ackumuleras över tiden i linjer och slangar i leveranssystemet, vilket leder till en gradvis minskning av konsumtionen av reagenser och reaktanter. Om en allmän rengöring av syntet inte löser en låg effekt volym, kan en ökning av antalet pulser vara en alternativ lösning. Särskilt användbart när det gäller låg fosforamidite-förbrukning, kan linjen i kopplings protokollet som motsvarar pumpningen av en blandning av fosforamidite och aktivator (tredje raden i kopplings underavsnittet i tabell 1 och tabell 2) 6 till 9 pulser utan märkbar negativ effekt på syntes kvaliteten. Dessutom, antalet pulser av aktivator som behövs för att få amidite/Activator blanda till syntesen substrat (för närvarande 6, fjärde raden i kopplingen underavsnitt, se tabell 1 och tabell 2) beror på DNA-synthesizer själv samt på slanglängd i syntes cellen. Detta nummer kan justeras efter byte av fosforamidite med en färgad lösning och räkna antalet pulser som behövs för att driva den färgade blandningen till glaset substrat för koppling.
Metoden som beskrivs häri gör det möjligt för DNA och RNA-syntes att fortsätta samtidigt, på samma mikroarray. Hybrider av DNA och RNA kan också förberedas utan ändring av array Fabrication-protokollen, och så länge som trestegs deprotection-protokollet följs. Det bör dock noteras att RNA-bara mikromatriser bara kräver en två-stegs deprotection: en decyanoethylation först med et3N följt av hydroxylgrupp och bas deprotection med hydrazin. DNA-nukleobaser befanns vara ofullständigt deprotected under dessa förhållanden, och behöver ytterligare steg i EDA för att verkställa fullständig avlägsnande av fenoxyacetyl (PAC) grupper. Denna extra behandling med EDA är kortare (5 min) än för standard deprotection av DNA Microarrays31, men det är tillräckligt för att köra den till slutförande efter trietylamin och hydrazin behandlingar. Dessutom begränsar en kort reaktionstid med EDA exponeringen av en fullständigt avskyddad RNA-oligonukleotid till grundläggande villkor.
En fördel med in situ RNA-matris syntes över alternativa metoder som spotting eller DNA-transkription32,33,34 är förmågan att lagra syntetiserade RNA mikrochip i skyddad form tills den används, vilket undviker risk för potentiell RNA-nedbrytning. Post-syntetiska procedurer för RNA innebär å andra sidan att förbrukningsvaror och reagenser hålls sterila och att hanteringen utförs under RNase-fria förhållanden. Notera, vi fann att tillsats av RNase inhibitor till hybridisering mixen inte ger starkare hybridisering signaler för RNA-funktioner.
Syntesen av DNA-bibliotek på en bas känsliga monomer är mer komplex än syntesen av några kontrollsekvenser på en yta, och som sådan är säkert mer benägna att designa fel. Ändå, förutsatt att sekvensen design (dvs. arten och antalet sekvenser) är korrekt, omvandla denna lista till en samling av exponerings masker och en ordnad serie av kopplingscykler förblir en enkel process. Emellertid, viktiga variationer från standard microarray syntes finns och är avgörande för en lyckad tillverkning av en hög densitet bibliotek array.
Först kopplas en Base-Sensitive avskiljare monomer som den första phosphoramiditen efter syntes av länkaren. Kopplings avkastningen för denna monomer (figur 1) konstaterades vara relativt låg, cirka 85%28, varför ansträngningar görs för att förbättra dess införlivande takt, antingen genom att öka dess koncentration i ACN från 30 mm till 50 mm, eller genom att upprepa kopplings steg: två sammanhängande kopplings reaktioner med färska monomerer eller två separata men sammanhängande kopplingscykler.
Den andra förändringen är tillsatsen av en β-karoten lösning i den bakre kammaren i syntes cellen, som bekvämt absorberar 365 nm ljus. Detta är en viktig modifiering av Photolithography setup eftersom det hindrar UV-ljus från att reflektera tillbaka till mat ris substrat. Faktum är att efter passage av interstitiell mediet mellan substrat, inkommande UV-ljus utgångar genom den borrade bilden och når kvarts blocket av cellen. Den Fresnel ekvationer förutsäga att ~ 4% av vinkelrätt incident UV-ljus kommer att reflektera från var och en av de tre nedströms luft-glas gränssnitt (Exit sidan av 2nd substrat och båda sidor av kvarts blocket) och tillbaka på syntesen substrat, som leder till oavsiktlig exponering av fotoskyddade oligonukleotider. Diffraktion och spridning bidrar också till “off-Target” photodeprotection och därför till nukleotid insättning, som direkt påverkar felfrekvensen av syntes, men dessa bidrag är mycket mindre än reflektioner och kan främst åtgärdas genom minska syntes tätheten (lämnar luckor mellan funktioner). Vi har funnit att nivån av β-karoten lösning i den nedre kammaren av cellen tenderar att något minska endast under de första minuterna av array syntes, och därför måste övervakas och justeras.
Slutligen, den tredje förändringen är deprotection lösning, ersätter EtOH för toluen, som håller klyvs DNA-biblioteket bunden till ytan, förmodligen genom elektrostatiska interaktioner. Genom att applicera en liten mängd vatten i syntes området efter ACN-tvättning kan biblioteket enkelt samlas in. Processen är dock endast framgångsrik om vattenhalt i EDA och toluen är minimal, vilket gör att nukleinsyran helt olöslig i deprotection cocktail. Alternativt kan DNA-bibliotek klyvas av chip med ammoniak9,10,14,35, sedan ytterligare deprotected genom upphettning av DNA-innehållande vattenlösning ammoniak till 55 ° c över natten. Återhämtningen av DNA-bibliotek med ammoniak är dock inte förenligt med RNA. RNA-oligonukleotider på ett basklyvbart substrat kan elueras från ytan med samma EDA/toluenförfarande som beskrivs ovan, men endast i det näst sista stadiet efter et3N och hydrazin två stegs deprotection strategi28.
Alternativa strategier för att återvinna oligonukleotid pooler från Microarrays utan behov av en specifik grundbehandling finns, är i princip förenligt med Photolithography och förlita sig på användningen av enzymer. Till exempel kan en enda deoxyuracil nukleotid vara målet för uracil-DNA glykosylase (UDG) och exciderade från resten av DNA-sekvensen, eller en enda RNA-enhet kan kännas igen av RNase H typ 2 enzymer och Phosphodiester Bond 5 “till RNA-klyvt , frigöra 5 ‘ DNA del23.
Vi har nu en kraftfull, pålitlig och hög densitet metod för syntes av DNA, RNA, och hybrid DNA/RNA Microarrays. Dessa kan inte bara fungera som plattformar för hybridisering eller bindande analyser36, men de utgör också ett snabbt och billigt sätt att producera komplexa nukleinsyra bibliotek. För DNA-baserad digital datalagring, microarray Photolithography kan bli en potentiell lösning på “skriva” flaskhalsen (dvs, till kodning av information genom syntes). Framgången i Digital kodning på DNA och i de Novo gen församling beror på sekvens trohet som, på syntes nivå, översätter till felfrekvens. Syntetiska och optiska fel i våra nuvarande array Fabrication protokoll kommer att diskuteras och rapporteras på annat håll. Parallellt pågår nu insatser för att ytterligare öka tillverknings skala och genomströmning.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av den österrikiska vetenskaps fonden (FWF Grants P23797, P27275 och P30596) och schweiziska National Science Foundation (Grant #PBBEP2_146174).
Slide functionalization | |||
Acetic acid >99.8% | Sigma | 33209 | For RNA deprotection |
CNC router | Stepcraft | 300 CK | |
Ethanol absolute | VWR | 1.07017.2511 | For deprotection and functionalization |
N-(3-triethoxysilylpropyl)-4-hydroxybutyramide | Gelest | SIT8189.5 | Silanizing reagent |
Nexterion Glass D microscope slides | Schott | 1095568 | |
Polymax 1040 | Heidolph | Orbital shaker | |
Proclean 507 Ultrasonic water bath | Ulsonix | To clean slides after drilling | |
Tickopur RW 77 Special Purpose Cleaner | Sigma | Z860086 | To clean slides after drilling |
Microarray synthesis | |||
0.25 M dicyanoimidazole in ACN | Biosolve | 0004712402BS | Activator |
0.7 XGA DMD | Texas Instruments | Digital Micromirror Device | |
20 mM I2 in pyridine/H2O/THF | Sigma | L860020-06 | Oxidizer |
250 μm thick Chemraz 584 perfluoroelastomer | FFKM | Lower teflon gasket | |
2'-O-ALE RNA phosphoramidites | ChemGenes | ||
365 nm high-power UV-LED | Nichia | NVSU333A | |
5'BzNPPOC DNA phosphoramidites | Orgentis | ||
5'NPPOC DNA phosphoramidites | FlexGen | ||
Acetonitrile | Biosolve | 0001205402BS | For DNA synthesis |
Amidite Diluent for DNA synthesis | Sigma | L010010 | For dissolving phosphoramidites |
Cleavable dT | ChemGenes | Base-sensitive monomer for library preparation | |
DMSO | Biosolve | 0004474701BS | As exposure solvent |
DNA and RNA microarray deprotection | |||
Ethylenediamine >99.5% | Sigma | 3550 | For deprotection |
Expedite 8909 | PerSeptive Biosystems | DNA synthesizer | |
Hydrazine hydrate 50-60% hydrazine | Sigma | 225819 | For RNA deprotection |
Imidazole | Sigma | 56750 | |
Industrial Strength lower-density PTFE tape | Gasoila | Thin, upper teflon gasket | |
Pyridine >99% | Sigma | P57506 | For RNA deprotection |
Triethylamine >99% | Sigma | T0886 | For RNA deprotection |
β-carotene | Sigma | C9750 | For library preparation |
Hybridization and scanning | |||
20x Sodium Saline Citrate | Roth | 1054.1 | |
5'Cy3-labelled complementary strand | Eurogentec | For duplex hybridization | |
Biopur Safe-Lock microcentrifuge tube | Eppendorf | ||
BSA (10 mg/mL) | Promega | R3961 | |
EDTA molecular biology grade | Promega | H5031 | |
GenePix 4100A | Molecular Devices | Microarray scanner | |
Hybridization oven | Boekel Scientific | 230500 | |
MES monohydrate | Sigma | 69889 | |
MES sodium | Sigma | M3058 | |
NaCl >99.5% | Sigma | 71376 | |
SecureSeal SA200 hybridization chamber | Grace BioLabs | 623503 | |
Spectrafuge mini | Labnet | C1301 | Microarray centrifuge |
Tween-20 molecular biology grade | Sigma | P9416 | |
Data extraction | |||
Excel | Microsoft | For data extraction | |
MatLab | MathWorks | Microarray design | |
NimbleScan 2.1 | Roche NimbleGen | ||
Desalting and quantification | |||
NanoDrop One Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
Toluene | Merck | ||
ZipTip C18 | Millipore | ZTC18s008 | Desalting pipet tips |