Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

Zeer snelle en specifieke metabolische etikettering van RNA in vivo met 4-thiouracil (Ers4tU)

doi: 10.3791/59952 Published: August 22, 2019

Summary

Het gebruik van gethioleerd uracil om gevoelig en specifiek zuivert nieuw Getranscribeerd RNA van de gist Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Het nucleotide-analogon, 4-thiouracil (4tU), wordt gemakkelijk overgenomen door cellen en opgenomen in RNA zoals het in vivo wordt getranscribeerd, waardoor isolatie van het RNA tijdens een korte periode van etikettering mogelijk is. Dit wordt gedaan door het bevestigen van een Biotine deel van de geïncorporeerde thio groep en affiniteit zuiverende, met behulp van streptavidine gecoate kralen. Het bereiken van een goede opbrengst van zuiver, nieuw gesynthetiseerd RNA dat vrij is van reeds bestaand RNA maakt kortere etiketterings tijden mogelijk en zorgt voor een verhoogde temporele resolutie in kinetische studies. Dit is een protocol voor zeer specifieke, hoge opbrengst zuivering van nieuw gesynthetiseerd RNA. Het hier gepresenteerde protocol beschrijft hoe RNA wordt geëxtraheerd uit de gist Saccharomyces cerevisiae. Het protocol voor de zuivering van thiolated RNA uit totaal RNA moet echter effectief zijn met behulp van RNA uit elk organisme zodra het uit de cellen is geëxtraheerd. Het gezuiverde RNA is geschikt voor analyse door vele veelgebruikte technieken, zoals reverse transcriptase-qPCR, RNA-SEQ en SLAM-SEQ. De specificiteit, gevoeligheid en flexibiliteit van deze techniek maken ongeëvenaarde inzichten in RNA metabolisme mogelijk.

Introduction

RNA heeft een dynamisch karakter; kort na de productie wordt veel RNA snel verwerkt en afgebroken. Momenteel analyseren de meeste onderzoeken naar RNA metabolisme het totale cellulaire RNA, dat meestal volledig is verwerkt en op steady state niveau. Dit niveau is afhankelijk van het evenwicht tussen de percentages van transcriptie, post-transcriptionele rijping en afbraak. Analyse van de processen die leiden tot het steady state evenwicht vereist gespecialiseerde technieken om zeer kortstondige RNA-soorten vast te leggen.

Metabole etikettering van RNA met nucleotide-analogen zoals 4-thiouracil (4tU) of 4-thiouridine (4sU) (Zie Duffy et al.1 voor een uitstekende beoordeling), biedt de mogelijkheid om thio-gelabelde ontluikende rna's en hun verwerking tussen producten te isoleren. Gepubliceerde protocollen hebben echter betrekking op de etiketterings tijden van een aantal minuten2,3, wat traag is ten opzichte van de productiesnelheid van veel transcripties. Het duurt in de orde van één minuut om het gemiddelde gist-gen te transcriberen, dus het labelen van gist RNA voor minder dan een minuut kan als extreem kort worden beschouwd. Het extreem snelle en specifieke 4 thiouracil Protocol (ers4tU) maximaliseert de signaal-ruis verhouding door het maximaliseren van de 4tU-opname en het minimaliseren van het herstel van ongegelabelde, reeds bestaande RNA, waardoor zeer korte etiketterings tijden mogelijk zijn4.

De thio-gemodificeerde basis moet snel en in voldoende hoeveelheden in de cellen worden geïmporteerd om het nieuw gesynthetiseerde RNA (nsRNA) efficiënt te labelen. Om dit te bevorderen, worden cellen gekweekt in uracil-vrij medium, en expressie van een geschikte permease helpt om 4tU of 4sU opname te stimuleren (Zie tabel 1 voor een lijst van plasmiden die geschikte permease genen en aanvullende figuur 1dragen). 4tU's oplosbaarheid in natriumhydroxide vermijdt de noodzaak van toxische organische oplosmiddelen die nodig zijn voor andere nucleotide-analogen. Helaas is het kweken van culturen voor lange perioden met thio-gemodificeerde nucleosiden in concentraties groter dan 50 μM waargenomen om ribosomen5te verstoren. Echter, de concentratie (10 μM) hier gebruikt, en de extreem korte etiketterings tijden, minimaliseren van schadelijke effecten5 (Figuur 1a), terwijl nog steeds voldoende RNA voor analyse.

Deze techniek kan worden gecombineerd met een snelle en specifieke door auxine gemedieerde depletie van een doelwit proteïne6,7 (Figuur 2), aangeduid als het "β-est Aid 4U"-protocol, waarin de β-Estradiol gereguleerde expressie van de auxine induceerbare cytochromen degron (hulp) systeem wordt gecombineerd met 4tu-labeling. Met de β-est AID 4U-benadering kan een doel proteïne worden uitgeput en het effect op het RNA-metabolisme nauwlettend worden gemonitord (Figuur 2). De timing is van cruciaal belang; het is raadzaam om de begeleidende video te bekijken en aandacht te besteden aan Figuur 2 en zijn geanimeerde vorm (Zie aanvullende figuur 2).

De verwerking en afbraak van RNA moeten extreem snel worden gestopt voor een nauwkeurige tijdresolutie. Dit wordt bereikt met methanol op lage temperatuur, dat de celinhoud zeer snel oplost en het celmembraan degradeert met behoud van het nucleïnezuur gehalte8. De RNA-extractie moet efficiënt zijn en het RNA niet beschadigen. Mechanische lysis is effectief in de afwezigheid van chaotrope agenten (vaak deze bevatten thio groepen, dus moet worden vermeden). Lithium chloride precipitatie van RNA heeft de voorkeur, omdat Trna's minder efficiënt worden neergeprecipiteerd. Trna's worden snel getranscribeerd en natuurlijk gethioleerd9, dus het verwijderen van trnas vermindert de concurrentie voor het biotinylation reagens. Als kleine, sterk gestructureerde Rna's van belang zijn, worden op alcohol gebaseerde RNA-precipitatie methoden aanbevolen.

Om het thiolated RNA te herstellen, wordt Biotine met 4tU covalent bevestigd via de thio-groepen die in het RNA zijn opgenomen. Het gebruik van gemodificeerde biotine, die hecht via een splijtbaar bisulfide binding (bijv. hpdp-Biotine (N-[6-(biotinamido)hexyl]-3 ́-(2 ́-pyridyldithio)propionamide) of MTS-Biotine (methaan thiosulfonaat)) wordt aanbevolen omdat het de vrijlating van het RNA mogelijk maakt door toevoeging van een reduceermiddel. De biotinyleerd RNA is affiniteit gezuiverd op streptavidine gekoppeld aan magnetische kralen. Dit protocol is vergelijkbaar met anderen die eerder zijn vermeld10 , maar is intensief geoptimaliseerd om de achtergrond te verminderen.

Er zijn twee soorten thiol-etiketterings experimenten die kunnen worden uitgevoerd, continue en niet-doorlopende etikettering. Elk heeft zijn eigen voordelen. Bij continue etikettering wordt de 4tU toegevoegd aan de cultuur en monsters genomen met regelmatige tussenpozen. Dit type experiment laat zien hoe het RNA wordt verwerkt en hoe de niveaus in de loop van de tijd veranderen. Voorbeelden hiervan zijn de vergelijking van mutant met wild-type experimenten en een Pulse-Chase experiment. De experimenten getoond in Figuur 3b, c zijn van dit type. Voor niet-continue etikettering wordt een verandering in het systeem geïnduceerd en het RNA bewaakt. Zodra de verandering is teweeggebracht, moet de cultuur worden opgesplitst in verschillende subculturen, en op bepaalde tijdstippen wordt elk voor een korte periode een thio-label genoemd. Een voorbeeld is β-est AID 4U, zoals weergegeven in Figuur 27. Dit type experiment is vooral handig voor het monitoren van het effect van een metabole verandering op RNA-verwerking (Zie figuur 3D).

Een grafische weergave van een thio-labeling-experiment wordt weergegeven in Figuur 4 en Figuur 5, en een werkblad dat de prestaties van het protocol aanzienlijk vereenvoudigt, is beschikbaar (Zie 4tu-experiment sjabloon. xlsx). Naast deze bevat de aanvullende informatie een uitgebreide probleemoplossingsgids. Zie Figuur 2 en aanvullend figuur 2voor het β-est Aid 4U-protocol dat 4tu-etikettering integreert met de auxin Surgery-depletie-protocol. Zie Barrass et al.7 voor het gedetailleerde hulp-depletie-protocol.

Protocol

1. groei en thio-etikettering

Opmerking: de tijd voor voltooiing van deze sectie van het protocol is zeer variabel, afhankelijk van de groeisnelheid van de cel. Laat 1 uur de oplossingen en apparatuur voorbereiden voorafgaand aan thio-labeling en 30 min post-labeling voor het verwerken van monsters.

  1. Zorg ervoor dat de stam S. cerevisiae een plasmide codeert een permease (tabel 1) om 4tu-import in de cel te stimuleren.
    Opmerking: zonder importeur is het onwaarschijnlijk dat een etikettering van minder dan 2 minuten succesvol is11 (Zie aanvullend figuur 1). 4tU-integratie is efficiënter als de groei in het medium is zonder uracil, dus de stam moet URA3+ zijn; verschillende plasmiden in tabel 1 dragen URA3 als marker. Als dit protocol moet worden gecombineerd met β-est-hulp depletie7, zijn aanvullende stam aanpassingen vereist.
  2. Bereid YMM uracil-vrij medium door toevoeging van 6,9 g gist stikstof basis zonder aminozuren, 20 g glucose en 1,92 g SCSM single Drop-out − Ura (tabel van materialen) tot 1 L water. Autoclaaf of filter steriliseren het groeimedium voor gebruik.
    Opmerking: filter sterilisatie heeft de voorkeur als peptide/suiker complexen geproduceerd door Autoclaveren co-precipitaat met de cellen in de methanol gebruikt in monsterverzameling.
  3. Groei van gist in YMM uracil-vrij medium naar een optische dichtheid bij 600 nm (OD600) van 0,6 − 0,8. Zorg ervoor dat de cultuur in log fase groei en is geweest voor ten minste twee doublings. Groei bij 30 °C wordt normaalgesproken aanbevolen, maar andere temperaturen kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt voor temperatuurgevoelige stammen.
    Opmerking: afhankelijk van de stam, groeiomstandigheden en RNA-opbrengst zal ongeveer 30 mL monstervolume nodig zijn. Dit bedrag wordt aangenomen in het hele protocol. 30 mL cultuur is het meest dat past in een centrifugebuis van 50 mL met 20 mL methanol, dus is een handig volume om de optimalisatie te starten. Overweeg het gebruik van meer sample volume voor vroege tijdpunten om het RNA-herstel te verhogen, tot 2000 mL is gebruikt voor langzamere groeicellen bij echt korte etiketterings tijden (< 1 min).
  4. Chill ongeveer 50 mL H2O op ijs. Voeg voor elk monster 200 μL Zirkonia kralen toe aan een 2 mL schroefdop buis en chill op ijs. Zet ook 20 mL methanol (voorzichtig) in 50 mL centrifugebuizen en leg op droogijs (Let op). De methanol moet 1/3 tot 2/3 het volume van het monster zijn.
    Let op: methanol is giftig bij inademing, contact en consumptie. Verdeel grote volumes in een rook afzuigkap en draag twee paar handschoenen, omdat methanol kan doordringen in nitril laboratorium handschoenen. Methanol is licht ontvlambaar, verwijderd van alle ontstekingsbronnen.
    Opmerking: aangezien droogijs koude brandwonden kan veroorzaken bij contact en asphixiant gas produceert, gebruikt u handschoenen bij het hanteren en gebruiken in een goed geventileerde ruimte.
    Opmerking: het toevoegen van de kralen op dit punt is gemakkelijker dan nadat het monster is toegevoegd als de buis droog is en bij het draaien van de celpellet worden de parels ook gesponnen van de buis draad die enige tijd bespaart. Bovendien kunnen de kralen afkoelen voordat het monster wordt toegevoegd.
  5. Als een s. pombe Spike moet worden toegevoegd aan de cultuur (in plaats van later), dooi dan een hoeveelheid thioated s. pombe cellen op ijs en Vortex grondig, ten minste 30 S, dan toevoegen aan de cultuur. Indien bereid volgens de onderstaande instructies, is een S. pombe aliquot voldoende voor 400 ml cultuur (genoeg voor monsters van 12 30 ml plus een beetje om fouten in de behandeling toe te staan). Als er meer of minder cultuur wordt gebruikt, past u het volume van S. pombe aan de cultuur aan.
    1. Kweek 1 L van de s. pombe cultuur naar od600 tot 0,8 precies zoals beschreven in het protocol voor s. cerevisiae.
    2. Thio-label als stap 1,7, maar voor 10 min.
    3. Repareer alle cultuur met 400 mL methanol op droogijs, in essentie zoals beschreven in stap 1,9.
    4. Pellet de cellen door centrifugeren bij 3000 x g gedurende 3 min.
    5. Gooi het supernatant weg en regeer de celpellet in 3,3 mL H2O.
    6. Splitsen in aliquots van elk 80 μL. Bewaren bij-80 °C.
    7. Gebruik één aliquot voor een kweek van 400 mL of 10 μL per 30 mL monster.
      Opmerking: verlaag het volume van Spike naar 1/10 als rnaseq wordt uitgevoerd. Gebruik aliquots niet opnieuw; Gooi ongebruikte piek weg. Deze piek is handig om te normaliseren en resultaten vergelijken tussentijd punten en experimenten.
  6. Voor niet-continue etikettering, induceren van de vereiste metabole perturbatie (bv. groeiomstandigheden, geninductie of depletie zoals β-est AID7 (Figuur 2 en aanvullend figuur 2), vervolgens de cultuur splitsen. Zorg ervoor dat alle kolven en dragers op de gewenste temperatuur zijn en, indien mogelijk, het medium belueren voordat de cultuur wordt toegevoegd.
  7. Voeg 4tU toe aan de kweek tot een concentratie van 10 μmM en meng krachtig (1/10.000 van het kweek volume van 100 mm 4tu opgelost in 1 M NaOH). Thiol-label voor 15 s tot 5 min.
    Opmerking: dertig seconden is een goed uitgangspunt. Thio-labeling voor minder dan 20 s geeft meer variabele resultaten als gevolg van moeilijkheden bij het manipuleren van de cultuur onder tijdsdruk. De etikettering voor meer dan 1 min vermindert echter de temporele resolutie van de techniek.
  8. Als een Chase-experiment moet worden uitgevoerd; laat thio-labeling voor 20 − 30 s dan jagen door toevoeging van 1/200 kweek volume van 1 M Uridine (niet gethioleerd), tot een uiteindelijke concentratie van 5 mm.
    Opmerking: Uridine heeft de voorkeur boven uracil voor de achtervolging, als Uridine is meer oplosbaar in water waardoor een kleiner volume aan de cultuur worden toegevoegd en dus er is minder verstoring van de groei van de cellen.
  9. Neem op gezette tijden (ten minste 15 sec.) monsters van de cultuur, tot het einde van de tijdsduur. Bemonsterings intervallen korter dan dit zijn moeilijk uit te voeren betrouwbaar. Voeg het monster toe aan de methanol op droogijs, bereid in stap 1,4. Voeg voor het gemak 30 mL cultuur toe aan een tube van 50 mL met 20 mL methanol.
    Opmerking: koolstofdioxide lost op in de methanol wanneer het koud is; Dit komt uit oplossing bij toevoeging van het monster en schuim krachtig bij het mengen ― resulterend in monsterverlies. Om dit te voorkomen, de methanol te koelen tot <-70 ° c in een strak verzegelde buis tot dicht bij de tijd die nodig is, vervolgens overbrengen naar droogijs.
  10. De buis afdichten en grondig mengen door te schudden. Plaats de monsters op ijs. Controleren of geen van de monsters bevroren is geweest; Als dat zo is, zachtjes warm in de hand, constant inverteren. Dit is het best gedaan in de hand als de temperatuur van het monster kan worden beoordeeld, het moet altijd koud voelen. Plaats op ijs. Dit is geen pauze punt; Zodra het monster vloeibaar is, gaat u verder met de volgende stap.
  11. Spin bij 3000 x g gedurende 2 min (bij 4 °c indien mogelijk) om de cellen te pellet. Giet de vloeistof af en breng de pellet in minstens 1 mL ijskoud water door door voorzichtig op en neer te pipetteren.
    Opmerking: de residuele methanol in de monster pellet helpt resuspensie.
  12. Overdracht naar 2 mL schroefdop buizen zoals voorbereid in stap 1,4. Draai kort (bijv. 10 s totale tijd) bij > 13000 x g om de cellen opnieuw te pellet, plaats terug op ijs en verwijder vloeistof.
    Opmerking: de celpellet kan enkele maanden bij-70 tot-80 °C worden bewaard.

2. bereiding van totaal RNA

Opmerking: de voltooiingstijd is 90 min.

  1. Gebruik diethyl pyrocarbonaat (DEPC)-behandelde oplossingen om het RNA tegen degradatie te beschermen. Aliquot de oplossingen met behulp van filter pipetpunten en draag handschoenen te allen tijde.
    1. Aan een oplossing toevoegen 1/1000 volume van dePC en mengen door krachtig schudden.
    2. Laat op kamertemperatuur (RT) voor 24 uur en vervolgens op autoclaaf.
    3. Oplossingen met amine groepen (zoals tris) kunnen niet worden behandeld met DEPC. Aliquot het poeder en bewaar speciaal voor RNA werk. Gebruik eerder DEPC behandeld H2O om de oplossing te maken.
      Opmerking: als de thio-groep op het RNA fotoactivatable is, minimaliseert u de blootstelling aan UV-licht vanaf dit punt. De opslag moet in het donker zijn en de incubatie wordt het best gedaan in een PCR-machine met een deksel.
  2. Als een S. pombe Spike moet worden toegevoegd aan de celpellet in plaats van de cultuur (doe niet beide), voeg het nu toe. Dooi een hoeveelheid thioated S. pombe cellen op ijs en Vortex grondig, ten minste 30 S, alvorens toe te voegen aan de pellet.
    Opmerking: indien bereid volgens stappen 1.5.1 − 1.5.7, is 10 μL van S. pombe aliquot vereist voor een pellet die is afgeleid van 30 ml cultuur.
  3. Voordat u op de dop, spin heel kort voor 1 − 2 s om ervoor te zorgen dat er geen Zirkonia kralen worden gevangen tussen de dop en de buis, die kan leiden tot monster en fenol lekken uit de buis.
  4. Respendeer de cellen in 400 μL acetaat EDTA (AE) buffer (50 mm Natriumacetaat pH 5,3, 10 mm EDTA pH 8,0) door krachtig grondig. Voeg 40 μL 10% (g/v) natriumdodecylsulfaat (SDS) toe. Niet Vortex, als SDS schuim zal.
  5. Als het β-est AID 4U-protocol moet worden gebruikt, neem dan 40 μL van de celsuspensie voor eiwitanalyse7. Voeg 40 μL AE toe om het volume terug te brengen tot 400 μL.
  6. Voeg 800 μL fenol (voorzichtigheid) toe bij lage pH en Vortex voor 10 sec.
    Let op: fenol is giftig en corrosief bij inademing en contact. Voer altijd procedures uit waarbij fenol in een rook afzuigkap zit en draag twee paar handschoenen.
  7. Lyse de cellen in een homogenisator (bijv. een tabel met materialen) voor drie 2 minuten uitbarstingen bij de laagste vermogensinstelling. Laat de monsters 2 minuten op ijs liggen tussen de pulsen van de homogenisatie.
    Opmerking: Optimaliseer de voorwaarden als u andere homogenisatoren gebruikt. Onvoldoende schudden zal resulteren in slechte opbrengsten, terwijl overmatig schudden resulteert in een schijnbare hogere opbrengst, zoals bepaald door de extinctie bij 260 nm (A260), maar het RNA kan worden afgebroken. Een homogenisator heeft de voorkeur, maar Hot fenol RNA zuivering12 kan worden gebruikt.
  8. Plaats het gelyseerd-monster gedurende 5 minuten op droogijs, totdat het stolt, waardoor het genomisch DNA wordt overgedragen naar het RNA. Niet te lang bevriezen omdat het monster niet ontdooit. Spin 5 min in microfugebuis bij > 13000 x g bij RT; Wees niet in de verleiding om dit te doen bij 4 ° c, omdat het monster/fenol mengsel gedurende de spin solide blijft als het op lage temperatuur wordt uitgevoerd.
    Opmerking: als het monster nog steeds bevroren is aan het einde van de spin, moet het opnieuw draaien voor nog eens 5 minuten totdat het monster volledig ontdooid is.
  9. Fenol/chloroform extract dan chloroform extract met een gelijk volume (ongeveer 600 μL) fenol: chloroform 5:1 dan chloroform (voorzichtigheid). Breng de bovenste fase over naar een andere buis die fenol bevat: chloroform 5:1 of chloroform. Vortex, draai dan 5 minuten in een microfugebuis bij RT. Breng vervolgens de bovenste fase over naar een nieuwe 1,5 mL Tube.
    Let op: chloroform is giftig bij inademing en contact. Voer altijd procedures in waarbij chloroform in een rook afzuigkap zit en draag twee paar handschoenen.
  10. Voeg een derde tot halve volume (ongeveer 300 μL) van 10 M LiCl toe en meng om het RNA neer te slaan. Het monster moet onmiddellijk troebel zijn, maar laat ten minste 10 min op ijs of bij 4 °C (niet bewaren beneden-20 °C als het zal bevriezen), of tot de precipitaat flocculaten.
  11. Spin voor 5 min bij > 13000 x g in een microfuge. Verwijder de vloeistof, draai kort opnieuw en verwijder de Dregs. Was pellet met 300 − 500 μL van 70% ethanol, draai kort en verwijder de resterende ethanol.
    Let op: tijdens deze wasstraten houdt u de pellet aan dezelfde kant van de buis als de eerste spin, op deze manier zal de pellet niet bewegen en breken; Als het breekt een deel van het RNA kan per ongeluk verloren.
    Opmerking: droog de pellet niet; zolang de meeste van de vloeistof is verwijderd, zal het niet interfereren met de volgende stappen. Het RNA kan ook worden opgeslagen in dit stadium bij-20 °C gedurende een paar maanden of-70 tot-80 °C voor langdurige opslag.
  12. De RNA-pellet opnieuw oplossen in 90 μL TE pH 7,0 (10 mM tris HCl pH 7,0, 1 mM EDTA pH 8,0) door TE verwarmen bij 65 °C met schudden omdat de RNA-pellet moeilijk opnieuw kan worden opgelost. Dit mag niet meer dan 5 minuten zijn, omdat RNA bij hogere temperaturen degradeert. Controleer op volledige RNA-solubilisatie en breng vervolgens over naar een 0,2 ml-buis. Pipetteer het monster op en neer; Er mogen geen "klonten" zijn en de vloeistof moet stijgen en soepel in de tip vallen. Deze oplossing is visceus, dus de laatste Pipetteer beweging moet traag zijn.
    Opmerking: het RNA kan in dit stadium bij-20 °C in het donker worden bewaard; Dit kan ook gunstig zijn voor RNA oplosbaarheid.

3. biotinylatie

Opmerking: de voltooiingstijd is 60 min. De volgende stappen zijn handig gedaan in een strook buizen met integraal doppen omdat ze minder neiging hebben om te openen op grondig dan strips met aparte doppen.

  1. Biotinylaat door toevoeging van 10 μL (1/10 Final volume) van een 5 mm hpdp-BIOTINE oplossing (MTS-Biotine kan op exact dezelfde manier worden gebruikt als hpdp-Biotine), op het RNA en meng grondig. Verwarm het RNA voor niet meer dan een paar seconden bij 65 °C voordat u het Biotine toevoegt. Inincuberen bij 65 °C gedurende 15 minuten tot een maximum van 30 min in het donker.
    Opmerking: deze verwarming is vereist omdat sommige HPDP-batches neerslaan bij RT in het RNA-monster. Een PCR-blok met een verwarmd deksel is hiervoor ideaal.
  2. Bereid een kleine harsvolume, grootte uitsluitings kolom (tabel van materialen) om het grondstof Biotine uitsluiten. Verwijder de onderste tag van de kolom en maak de dop los, plaats in een 2 mL centrifugebuis. Draai op 1500 x g gedurende 1 minuut om de buffer uit te spoelen Voeg 0,3 ml te zachtjes toe aan de bovenkant van de kolom en draai opnieuw. Herhaal de Wash en spin twee keer meer voor een totaal van 3 wases. Breng tenslotte de gewassen kolom over naar een verse 1,5 mL Tube.
  3. Zodra de monster incubatie (stap 3,1) is voltooid, voegt u het monster toe aan de bovenkant van de kolom. Spin bij 1500 x g gedurende 2 min. Het biotinyleerd RNA-monster bevindt zich nu in de bodem van de buis.
    Opmerking: een spin van 1 minuut volstaat niet om het hele monster te elzen.
  4. Voeg een derde tot halve volume (ongeveer 40 μL) van 10 M LiCl toe, meng om het RNA opnieuw neer te slaan als stap 2,10. Het monster moet onmiddellijk troebel zijn, maar gedurende ten minste 5 minuten op het ijs of bij 4 °C of tot het precipitaat flocculaten vertrekken; niet bewaren beneden-20 °C als het zal bevriezen. Centrifugeer het monster gedurende 5 minuten bij > 13000 x g in een micro Fuge.
  5. Wassen met 80% ethanol, ≤ 1 h draaiend. Volg de procedure in stap 2,11 om zo veel mogelijk van de vloeistof te verwijderen.
    Opmerking: aangezien HPDP-Biotine zeer goed oplosbaar is in 80% ethanol, is dit een extra zuiveringsstap.
  6. Herhaal de 80% ethanol spoeling om zo veel mogelijk uit de VN opgenomen Biotine te verwijderen.
    Let op: het RNA kan ook in dit stadium bij-20 °C in het donker worden bewaard.

4. zuivering van het nieuw gesynthetiseerde RNA

Opmerking: de voltooiingstijd is 2 uur.

  1. Het RNA opnieuw oplossen in 200 μL DEPC-behandelde H2O (65 °c incubatie kan worden gebruikt, vergelijkbaar met de procedure in stap 2,12).
  2. Meet de RNA-concentratie bij een260 met behulp van een spectrofotometer; het monster moet mogelijk 1/10 worden verdund om het binnen het lineaire bereik van de spectrofotometer te krijgen. Vortex deze verdunning voor ten minste 10 s om ervoor te zorgen dat het viskeuze RNA gelijkmatig wordt opgelost.
    Opmerking: de efficiëntie van biotinylation kan indien nodig worden beoordeeld door dot Blot13 .
  3. Voeg gelijke hoeveelheden RNA toe aan een frisse buis en maak tot 200 μL in met DEPC behandelde H2O. gebruik al het monster met de laagste RNA-concentratie en gebruik een geschikt volume van de andere monsters om een vergelijkbare hoeveelheid RNA voor elk te hebben.
    Opmerking: de spreadsheet 4Tu experiment template. xlsx heeft een formulier om deze berekening te helpen.
  4. Voeg bij RT een monster van 25 μL 10 x NaTM buffer (0,1 M Tris HCl pH 7,0, 2 M NaCl, 250 mM MgCl2), 25 μl van 1 m NAPI pH 6,8 (0,5 M Nah2po4 0,5 m na2HPO4) en 2,5 μL van 10% SDS. Meng grondig en draai zachtjes (< 30 s; ongeveer 100 x g).
    Opmerking: om precipitatie van het VIB en zouten te voorkomen, moeten de monsters op RT worden gehouden gedurende de volgende procedures tot en met stap 4,13.
  5. Maak de kraal buffer met 1x NaTM buffer, 0,1 M NaPi en 0,1% SDS, 2 mL per sample. Voeg de vereiste hoeveelheid H2O eerst en het VIB als laatste toe. Dit moet elke keer vers worden gemaakt als een precipitaat vormt na 24 uur.
    Opmerking: om de vorming van precipitaten te voorkomen, moet de kraal buffer bij RT worden bewaard gedurende de volgende procedures. Niet DEPC traktatie of autoclaaf.
  6. Voeg 50 μL streptavidine kralen toe aan een lage retentie 1,5 mL buis. Plaats de buis op het magnetische rek, wacht tot de parels zich vestigen en verwijder vervolgens de vloeistof
  7. Was de streptavidine kralen.
    1. Voeg 200 μL kraal buffer en Vortex toe totdat de kraal pellet volledig is geresuspendeerd. Meestal is 3 − 5 s alles wat nodig is. Voor wasstraten voordat het RNA-monster wordt toegevoegd volstaat het om de buizen rond te draaien zodat de kralen over de buis naar de andere kant reizen. Draai vervolgens de buizen terug naar de oorspronkelijke kant zodat de parels weer over de buis reizen.
    2. Draai de buis op lage snelheid (ongeveer 100 x g) voor een maximum van 5 s om de vloeistof te draaien, maar niet de kralen.
    3. Plaats in het magnetische rek om de parels te laten vangen door de magneet.
    4. Verwijder de vloeistof door aspiratie voor een klein aantal monsters; Giet de vloeistof af als er veel monsters zijn.
      Opmerking: met een groot aantal monsters kan het verwijderen van alle vloeistof puur door aspiratie problematisch zijn, omdat de kralen in het eerste monster kunnen worden gedroogd voordat het laatste monster is afgewerkt, dit verhoogt de achtergrond. Het wassen kan worden versneld door de vloeistof van alle monsters in één keer af te gieten terwijl u op de magneet zit. Ze moeten een beetje langer op de magneet worden gelaten voordat ze gaan gieten en de kleine hoeveelheid vloeistof die overblijft, moet weg worden genomen, maar over het algemeen betekent dit minder tijd op de magneet en zonder vloeistof. Op deze manier is het mogelijk om 24 of meer extracties snel te doen.
  8. Blok met 200 μL kraal buffer, 10 μL 20 mg/mL glycogeen, en 2,5 μL 5 mg/mL tRNA, 20 min draaiend eind einde bij matige snelheid bij RT. De rotatie is om de parels in suspensie te houden. Zodra de blokkering voltooid is Verwijder de vloeistof als stappen 4.7.2 − 4.7.4 en spoel opnieuw, als de stappen in paragraaf 4,7.
  9. Hervat de kralen in het voorbeeld. Incuberen bij RT met een rotatie van 30 min.
  10. Bereid tijdens de incubatie een verse 1,5 mL tube voor elk monster. Voeg 1/10 volume (ongeveer 10 ΜL) van 3 M Natriumacetaat pH 5,3 en 20 μg glycogeen toe en draai op ongeveer 100 x g voor 3 s. Bewaar in een rek totdat nodig.
  11. Verwijder het ongebonden RNA van de kralen, als stappen 4.7.2 − 4.7.4. Het ongebonden RNA kan in een frisse buis worden geperseerd, maar de zouten en SDS maken het erg moeilijk om te zuiveren. Was vervolgens de kralen, als sectie 4,7 met vortexing, voor een minimum van 3 tot een maximum van 5 keer.
  12. Na de laatste wasbeurt speciale aandacht te aspireren alle vloeistof; keer terug naar elke buis en aspireren de droesem van de buffer opnieuw.
  13. Om het RNA te elzen, voeg 50 μL vers bereide 0,7 M β-mercaptoethanol (βME) toe aan de parels (1/20 verdunning van de commercieel geleverde stamoplossing). Vortex en spin kort, als stappen 4.7.1 en 4.7.2. Plaats de slurry in het magnetische rek en Pipetteer de RNA bevattende oplossing in de 1,5 mL centrifugebuis bereid in stap 4,10.
  14. Elueer nogmaals als stap 4,13 om het resterende RNA van de kralen te herstellen en voeg het eluteerde monster toe aan de buis met de eerste elutie van deze kralen.
  15. Verwijder resterende kralen uit het geeleerde RNA door het monster in het magnetische rek te plaatsen en de vloeistof over te brengen naar een frisse, lage binding 0,5 mL centrifugebuis.
  16. Meng het monster en precipderen het nsRNA door 2,5 x volumes (280 μL) ethanol toe te voegen en nogmaals te mengen. Laat 1 uur rusten bij-20 °C. Spin in een voorgekoelde centrifuge (4 °C) gedurende 20 minuten bij de maximumsnelheid (ten minste 13.000 x g).
  17. Grondig wassen met 200 μL 70% ethanol bij-20 °C. Als residuele βme remmen downstream toepassingen, spin bij elke stap om zo veel van de droesem mogelijk te verwijderen; aan het einde moet het monster niet ruiken aan βME.
  18. Opnieuw oplossen in 10 − 20 μL DEPC-behandelde 1x TE met het equivalent van 0,005 μL RNase-remmer.
    Opmerking: alle daaropvolgende stadia moeten op ijs worden uitgevoerd.
  19. Meet de RNA-concentratie en zuiverheid.
    1. Meet de A260 en een225 in een laag monstervolume spectrofotometer.
      NB: een absorptiemaximum bij λ = 225 nm is afkomstig van een onvermijdelijke verontreiniging van de kralen. Bij afwezigheid van RNA daalt het signaal van de verontreiniging tot 35% bij λ = 260 nm. Daarom wordt de werkelijke hoeveelheid RNA benaderd door de formule: (A260-(a225* 0.35)) * 40 ng/μL.
    2. U ook het monster analyseren op een micro-fluïdica elektroforese systeem zoals een bioanalyzer.
      Opmerking: deze analyse heeft de voorkeur boven het gebruik van een spectrofotometer omdat de integriteit van RNA kan worden beoordeeld, de verontreiniging niet interfereert met de quantitatie en er minder monster nodig is.
  20. Analyseer het nsRNA.
    Opmerking: specifieke Rna's kunnen bijvoorbeeld worden gekwantificeerd door standaard reverse transcriptase qPCR-technieken. RNA bereid op deze manier is compatibel met de voorbereiding van de bibliotheek voor RNA-SEQ. verwijdering van rRNA is niet nodig voor het labelen van tijden van minder dan 5 min. het hercoderen van SLAMseq14 kan ook op dit RNA worden uitgevoerd.

Representative Results

Typische opbrengsten voor nsRNA hersteld met behulp van dit ers4tU protocol worden weergegeven in afbeelding 1B, dit is geproduceerd door een bioanalyzer en de trace toont rendement van RNA versus grootte (nucleotiden [NT]). Opmerking, in zowel de trace bioanalyzer en de inzet grafiek, dat RNA herstel van tijdpunt 0 is een zeer klein deel van die hersteld van langere tijdpunten-ongeveer 0,3 μg RNA hersteld van ongeveer 109 cellen in vergelijking met meer dan twee keer zo veel na slechts 30 s van etikettering (0,8 μg nsRNA) uit hetzelfde aantal cellen. RNA-herstel bij 15 s is variabeler omdat kleine verschillen in het uitvoeren van de bemonstering een proportioneel groter effect hebben op RNA-herstel. In de bioanalyzer Trace, rRNA precursoren kunnen worden gezien als een piek in de buurt van 1000 NT en een Doublet van pieken om 1700 − 1800 NT. De overvloed van deze tussen producten neemt toe naarmate de thiolatie doorgaat.

Thio-labelling werd gebruikt om splicing van de ACT1 transcriptie te kwantificeren (Figuur 3). Thiolatie werd uitgevoerd en monsters genomen op 15 s intervallen vanaf het begin van thio-labeling en de verwerking van ACT1 RNA bewaakt (Figuur 3a, b). Zoals kan worden gezien, wordt Pre-mRNA gegenereerd (door transcriptie), en lariats (door de eerste stap van het splitsen van Pre-mRNA), zelfs na slechts 15 s van de etikettering. Na ongeveer 45 s tot 1 minuut komen de hoeveelheden lariats en Pre-mRNA in evenwicht met zoveel van deze RNA-soorten die door transcriptie worden gemaakt en worden verwerkt door splicing.

Om de in figuur 3c getoonde gegevens te produceren, werd de stam gepulseerd met 4tu voor 25 sec. en vervolgens achtervolgd met Uridine. De generatie van Pre-mRNA en lariats bereikt een maximum van 1 minuut. Dit vergelijkt goed met Figuur 3b; het maximum wordt bereikt na 45 s om evenwicht te bereiken plus de 25 s van de etikettering. Na de piek dalen de niveaus af naarmate de thio-gelabelde Rna's door het splicing-proces worden achtervolgd.

Figuur 3D toont uitputting van een eiwit-splicings factor en het effect ervan op het RNA-metabolisme, met behulp van het β-est Aid 4U-systeem6,7. Hier, Prp16p wordt verlaagd van de nabije fysiologische niveaus tot 5% van dit niveau na 25 min van uitputting. Prp16p is een essentiële splicing factor voor de tweede stap van splicing15. Lariats worden verwijderd tijdens de tweede stap van splicing (Figuur 3a), maar hier stijgen ze boven het niveau van Pre-mRNA als Prp16 wordt beperkt. Bij latere depletie tijden, andere factoren worden beperkt als gevolg van secundaire effecten, zodat de niveaus van Lariat verminderen, en Pre-mRNA niveaus stijgen. Het niveau van spliced mRNA daalt.

Figure 1
Figuur 1: groei in 4tU en RNA herstel. a) 4-thiouracil beïnvloedt de groei. Verhoging van de concentratie van 4tU in YMM drop-out groeimedium zonder uracil verhoogt de verdubbelingstijd van S. cerevisiae (BY4741) het dragen van de p4FuiΔPEST plasmide. De groei van vier replicaatculturen werd gecontroleerd bij 30 °C in een Tecan Infinite Pro 200. Alle culturen waren in log fase, met OD600 tussen 0,1 en 0,6. Mock is een controlecultuur met een gelijkwaardige hoeveelheid NaOH toegevoegd, wat niet vanzelf de groeisnelheid verandert. Uit deze grafiek blijkt dat thio-labelling een compromis is tussen snelle etikettering en beschadiging van de cel. Foutbalken zijn standaardfout van 4 replicaties. (b) de nsrna-opbrengst stijgt lineair van ongeveer 15 s etikettering. De hoofdfiguur toont de bioanalysesporen van gezuiverd, nsRNA van 0 (niet-thioated) tot 2 min na toevoeging van 4tU op 15 s intervallen. Houd er rekening mee dat het monster van 15 s niet wordt weergegeven, omdat het niet te onderscheiden is van het niet-gelabelde monster. De twee grote pieken corresponderen met ribosomale Rna's (rRNAs). De voorlopers en tussen producten van rRNA zijn zichtbaar als verschillende pieken met een groter molecuulgewicht dan volwassen rrna's. Het herstel van deze precursoren en tussen producten neemt met de tijd toe. Resultaten van één representatief experiment worden weergegeven. De inzet grafiek toont het herstel van nsrna met toenemende incubatie met 4tu. De opbrengst van nsRNA neemt toe met een toenemende groeitijd met 4tU. Het herstel is opmerkelijk lineair (R2 = 0,934) gedurende de tijdschaal van dit experiment en toont een lichte stijging over de achtergrond zelfs bij 15 s etikettering met 4tu hoewel niet te onderscheiden van het ongemerkte monster met oog van de bioanalyzer Trace. Foutbalken tonen standaardfout voor drie biologische replicaten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: het grafische protocol β-est Aid 4U β-est Aid 4U. Een grafische samenvatting van het Protocol van het β-est AID 4U-protocol. β-Estradiol (β-EST) bevordert de uitdrukking van het auxin Surgery-induceerbaar degron (steun) systeem dat op zijn beurt een hulp * gelabeld doeleiwit uitput, zie Barrass et al.7 voor een gedetailleerd protocol. In dit geval wordt de expressie van het degron-systeem gestart 25 minuten voordat de eiwitafbraak begint en de thiolatie op elk tijdstip 1 min. monsters worden genomen vóór inductie en elke 2 minuten tijdens uitputting. Een geanimeerde versie verschijnt in de aanvullende figuur 2. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: precursoren en tussen producten van ACT1 RNA splicing. Het splitsen van ACT1 Pre-mRNA transcripten werd gemonitord door kwantitatieve reverse transcriptie PCR16. De niveaus van ACT1 precursor (Pre-mRNA), tussenliggende Lariat-Exon2 (Lariat) en spliced product (mRNA) zijn genormaliseerd tegen het niveau van ACT1 exon2 en steady state niveaus van deze rna's. (a) locatie van qPCR-producten op de ACT1 transcriptie. Schematische voorstelling van de locaties van de qPCR-producten die worden gebruikt voor het testen van de niveaus van precursoren, tussen producten en producten van de splicing-reactie van de ACT1 transcripten16. Exonen worden vertegenwoordigd door dozen, intron als een lijn en de qPCR-producten als lijnen met diamanten aan beide uiteinden, de kleur komt overeen met de kleuren die in de grafieken worden gebruikt. De Pre-mRNA-PCR is specifiek voor Pre-mRNA en geen tussen producten van splicing omdat dit product het vertakkingspunt overschrijdt dat wordt verstoord na de eerste stap van het splitsen. Lariat PCR detecteert het product van de eerste stap van splicing en de uitgesneden Lariat die na de tweede wordt geproduceerd. De mRNA-PCR is specifiek voor het product van splicing, mRNA. De resultaten van de Exon PCR (aanwezig in alle precursoren, tussen producten en producten, behalve de uitgesneden Lariat) worden niet weergegeven in de grafieken omdat dit werd gebruikt om de gegevens te normaliseren en is daarom altijd gelijk aan 1. b) doorlopende thiolabeling. De hoeveelheid Pre-mRNA stijgt met de tijd als 4tU is opgenomen door transcriptie en, na een korte vertraging, het splitsen converteert het naar Lariat-exon2 Intermediate en spliced producten. De niveaus van deze Pre-mRNA en Lariat soorten zijn detecteerbaar boven achtergrond na zo weinig als 15 s van groei met 4tU en bereiken een maximum na ongeveer 45 s van continue etikettering met 4tU, op welk punt hun productie wordt gebalanceerd door conversie naar spliced mRNA en/of afbraak. Waarden worden genormaliseerd naar hun Steady State (links-meest punt van de grafiek), en Exon 2 niveaus om hun verschijning en verwerking te tonen in vergelijking met transcriptie van Exon 2. Aangezien RNA splicing van ACT1 grotendeels co-transcriptional4,17 spliced mRNA snel wordt de meest voorkomende soorten, het niveau is vergelijkbaar met die van Exon 2. Standaardfout van drie biologische replicaten, elk onderzocht in drievat. (c) puls/Chase. Thiolation puls van 25 seconden gevolgd door achtervolging met Uridine. Vergeleken met de steady state niveaus van deze Rna's (linker punt), ze zijn in eerste instantie zeer overvloedig in de nieuw gesynthetiseerde pool. De niveaus dalen geleidelijk als ze worden verwerkt tot mRNA (of afgebroken), naderen van niveaus zeer vergelijkbaar met steady state niveaus door 5 min. standaardfout van drie biologische replicaten, elk in drievand. d) de uitputting van nsrna en eiwitten. Splitsen van ACT1 Pre-mRNA transcripten gecontroleerd door kwantitatieve omgekeerde transcriptie PCR als in panel (a) bij uitputting van het Prp16 eiwit met behulp van het auxin Surgery degron-systeem zoals beschreven in Figuur 2. De Prp16 eiwit niveaus worden ook weergegeven in de grafiek uitgezet tegen de tweede Y-as als percentage van de niveaus vóór de depletie van auxine. Prp16 is een essentieel onderdeel van de spliceosome, vooral belangrijk voor de tweede stap van splicing getoond in panel (a), waarna lariats gedegradeerd zijn. Wanneer deze stap wordt beperkt lariats accumuleren in eerste instantie. Op latere tijdstippen gaat splicing volledig door, lariats worden niet meer geproduceerd en de Pre-mRNA-niveaus stijgen. Foutbalken zijn standaardfout van drie biologische replicaten, elk in drievand. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: grafische samenvatting van het Protocol van de afdelingen 1 tot en met 3. De cellen zijn met 4tU samengevoegd en mogen groeien om de gemodificeerde nucleotide in het RNA op te nemen. Een thiolated S. pombe spike kan worden toegevoegd om normalisering tussentijd punten en experimenten mogelijk te maken. De puls van 4tU kan worden achtervolgd met behulp van un-thiolated Uridine. Etikettering kan worden uitgevoerd continu van 4tU optellen of van een verandering in de groeiomstandigheden, de cultuur Split en 4tU toegevoegd aan culturen in toenemende mate van de groei conditie verandering, maar elke etikettering slechts voor een korte tijd. De cellen worden verzameld, en RNA bereid uit de cellen, bij voorkeur met behulp van een homogenisator en fenol gebaseerde methoden. Het RNA is biotinyleerd en vervolgens de biotinyleerd RNA gezuiverd van het onzuivere Biotine met behulp van een grootte uitsluitings kolom. Het nsRNA is nu klaar voor zuivering met streptavidine kralen (rubriek 4, Figuur 5). Getallen in rood komen overeen met de Stapnummers in het protocol. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: grafische samenvatting van het protocol sectie 4. Na de secties 1 tot en met 3 (Figuur 4) worden de streptavidine-parels geblokkeerd en wordt het biotinyleerd RNA-monster toegevoegd aan de bereide kralen. De biotinyleerd RNA bindt aan de streptavidine kralen en de un-biotinyleerd RNA verwijderd en gewassen. De biotinyleerd RNA wordt uit de parels geeleerd met behulp van βme en neergeprecipiteerd klaar voor verder onderzoek. Getallen in rood komen overeen met de Stapnummers in het protocol. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullend figuur 1: verbetering van het nsRNA-herstel van gistcellen met en zonder extra kopieën van de importeur op 1 en 3 minuten van thio-labelling. Merk op dat Fui1 de eigen promotor van de gist is, uitgedrukt in een plasmide van 2 μm. De genomische kopie van dit gen is aanwezig in beide stammen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend figuur 2: geanimeerde versie van het grafische protocol β-est Aid 4U β-est Aid 4U. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 1:4tU_experiment_template. xltx. Klik hier om dit bestand te downloaden. 

Plasmide naam Importeur/permease Markering Commentaar
p4Fui S. cerevisiae Fui1 URA3 Fui1 importeert uracil en Uridine, waardoor het ideaal is voor pulserende/Chase-experimenten.
pAT2 S. cerevisiae Fui1 LEU2
p4Fui-ΔPEST S. cerevisiae Fui1 URA3 Het PLAAG motief van Fui1 is gedeactiveerd, zodat de permease niet wordt afgebroken wanneer er voldoende intracellulaire uracil is voor de behoeften van de cel. Werkt goed in etiketterings experimenten en verbetert de puls/Chase-prestaties.
p4Fur S. cerevisiae Fur4 URA3 Uracil permease
YEpEBI311 H. sapiens ENT1 LEU2 Miller et al.11. Bevat ook een HSV thymidine kinase-gen.
(equilibratieve nucleoside Transporter)
Alle plasmiden zijn 2 μm gebaseerd. Alle P4 plasmiden en pAT zijn gebaseerd op de pRS16 serie plasmiden. FUI1 en FUR4 worden uitgedrukt uit hun eigen, endogene promotors.

Tabel 1: plasmiden die met dit protocol worden gebruikt.

Discussion

Dit artikel presenteert een protocol voor zeer snelle en specifieke 4tU-etikettering, voor herstel van ontluikende, nieuw gesynthetiseerde RNA van S. cerevisiae na slechts 15 S van de etikettering, met zeer lage verontreiniging door niet-gelabelde RNA.

De gebruiker moet altijd zorg dragen voor het behoud van de integriteit van het RNA door het gebruik van koude temperaturen en DEPC-behandelde reagentia. Streptavidin kraal zuivering is over het algemeen betrouwbaar; echter, de kraal buffer is moeilijk te hanteren; het moet vers worden gemaakt, met de onderdelen toegevoegd in de juiste volgorde, en niet gekoeld of autoclaved. Veelvoorkomende tekortkomingen zijn dat het RNA niet volledig is opgelost na de neerslag stappen, en dus ofwel niet biotinyated of anderszins verloren is gegaan tijdens de verwerkingsstappen. Er is uitgebreide hulp bij het oplossen van problemen in het aanvullende materiaal.

Er zijn enkele beperkingen om op te letten in ers4tU. Een reeds genoemde is dat 4tU de groei van de gist vertraagt (Figuur 1a). Naast endogeen gethioleerd RNAs9kunnen alleen rna's die tijdens de etiketterings periode zijn getranscribeerd, met deze methode worden gezuiverd. Polymerasen die tijdens de thiolatie tijd op genen zijn onderbroken, produceren geen gethioleerde transcripten die kunnen worden gezuiverd, hoewel transcripten die gedeeltelijk zijn gelabeld als gevolg van polymerasen die tijdens het thiolatie een onderbroken toestand binnenkomen of verlaten, kunnen worden hersteld. Stammen die slecht transcriberen, hetzij vanwege mutatie-of groeiomstandigheden, produceren weinig nsRNA, hoewel de hier gebruikte technieken niettemin het herstel van nsRNA in vergelijking met andere methoden zullen verbeteren. In deze stammen en omstandigheden kan het nodig zijn langere tijden en meer kweek volumes te hebben. Merk op dat uracil een goede bron van stikstof is en dus deze methode moet worden proefgedraaid voordat het wordt gebruikt voor studies waarbij stikstof verhongering.

Het ers4tU-protocol is vooral nuttig voor de analyse van kortstondige Rna's, waarvan er vele zo snel zijn aangetast dat ze niet kunnen worden geïdentificeerd zonder de afbraak machines te verlammen. Voorbeelden zijn cryptische instabiele transcripten (CUTs)4en korte transcripten die worden geproduceerd door vroegtijdige beëindiging of Promoter proximale onderbreken18 en antisense transcriptie "upstream" van een organisator (PROMPTs)19. De tussen producten die worden geproduceerd tijdens de verwerking van stabiele RNA-soorten zijn ook van voorbijgaande aard, maar kunnen worden verrijkt met ers4tU transcriptie4. Het ers4tU-protocol is daarom uitzonderlijk in het toestaan van zeer voorbijgaande RNA-soorten die moeten worden geanalyseerd en gevangen onder in de buurt van fysiologische omstandigheden, wat een enorm voordeel is ten opzichte van andere methoden. Deze techniek is gebruikt om transcriptie en downstream RNA-verwerkings kinetiek te bestuderen in RNA-polymerase mutanten die sneller of langzamer dan normaal20verlengen.

Thiolation is ook compatibel met RNA-SEQ en SLAM-SEQ21, waardoor alle RNA geproduceerd binnen een zeer korte tijdvenster om te worden gekenmerkt in exquise details.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door Wellcome-financiering aan JB [104648]. Het werk in het Wellcome Center for Cell Biology wordt ondersteund door Wellcome kernfinanciering [092076]. De auteurs erkennen leden van het lab voor hun hulp: Bella Maudlin, Emanuela Sani, Susanna de Lucas-Arias en shiney George. De schrijvers willen ook Patrick Cramer bedanken voor de plasmide YEpEBI31111.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
β-mercaptoethanol (βME) Sigma-Aldrich M3148 CAUTION toxic. Stock solutions are aproximatly 14 M, make at 1/20 dilution for use
Chloroform Sigma-Aldrich 25668 CAUTION toxic
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich D5758 add 1/1000 volume to a solution, leave at room temperature for 24 h, then autoclave
DMF (N,N-dimethylformamide)  Sigma-Aldrich 227056 CAUTION toxic
EDTA Sigma-Aldrich 3609 Make 0.5 M and pH to 8.0 with sodium hydroxide
Ethanol Sigma-Aldrich 29221
EZ-link HPDP Biotin Thermo scientific 21341 Store protected from light. Disolve all the vial contents in 22.7 mL DMF (to make a 4 mM stock solution). Store away from water, in the dark & at -20 °C. Check the solution before using, as some batches of HPDP precipitate in storage; heat at 42 °C to resuspend.
Glucose Fisher Scientific  G/0500/60
Glycogen [20 mg/mL] Sigma-Aldrich 10901393001 Store at -20 °C
Immobilised TCEP Disulfide Reducing Gel Thermo Scientific 77712 Optional
LiCl Sigma-Aldrich 793620 10 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the LiCl crystals to the water slowly.
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich 63033 1 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the MgCl2 crystals to the water slowly.
Methanol Fisher Scientific M/4000/PC17 CAUTION Toxic and flammable
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S3139 Make 1 M solutions of each and mix in equal amount to obtain a solution of the appropriate pH
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S3264
NaCl Sigma-Aldrich S9888-M 5 M solution
Phenol, low pH.   Sigma-Aldrich P4682 Store in the dark at 4 °C. CAUTION toxic
Phenol Chloroform 5:1 (125:24:1) low pH.  Sigma-Aldrich P1944 Store in the dark at 4 °C. CAUTION toxic
Pierce Spin Columns Thermo Scientific 69702 Optional
SCSM single drop-out –ura Formedium  DSCS101
Sodium Acetate Sigma-Aldrich 32318-M Make a 3 M solution and pH to 5.3 with acetic acid
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429 CAUTION corrosive
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Sigma-Aldrich 436143 CAUTION irritant, do not inhale
Streptavidin Magnetic beads NEB 1420S Store at 4°C 
SUPERase-In, RNase inhibitor Life technologies  AM2696 Store at -20°C
Thiolated Schizosaccharomyces pombe for spike See section 1.7 of the protocol
4-thiouracil (4tU)  ACROS ORGANICS 359930010 Store in the dark. Make 100 mM Stock in 1M NaOH, store solutions at -20°C. 
Tris base Sigma-Aldrich 93362 1 M solutions at various pH
tRNA Sigma-Aldrich 10109541001 5mg/ml, store at -20°C
Uridine Sigma-Aldrich U3750 Make 1 M solution in H2O. Split into 2 mL aliquots and store at -20 C.
Yeast nitrogen base without amino acids  with amonium sulphate Formedium CYN0410
Zeba Columns 0.5ml Thermo Scientific 89882 Store at 4 °C 
Zirconia beads Thistle Scientific 110791052
Equipment and Consumables
Beadbeater Biospec 112011EUR Other homogenisers can be used; the correct conditions for each homogeniser and strain must be established.
Bioanalyser (Agilent) or similar to assess RNA quality. If this is not important a spectrophotometer is useful to quantify the RNA.
Centrifuge: capable of spinning cultures at 4 °C and at least 3000 g. Pre-chill if possible.
Centrifuge: capable of spinning up to 2 mL tubes at variable speeds upto 13,000 g and down to 1000 g 
Magnetic rack for separating the beads from the sample. The one used in the paper is 3D printed, available from Thingiverse (thing:3562952). Comercially available racks exist 
PCR machine with a heated lid that will allow incubation in the dark.
Rotating wheel to rotate 1.5 mL tubes end over end 
Shaking heating block (such as Eppendorf Thermomixer) is recomended 
Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 0.5mL Eppendorf H179467N
Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 1.5mL Ambion AM12350
Tubes, centrifuge, 50 mL  Sarstedt 62.547.004 Other centrifuge tubes are not gas proof allowing CO2 to disolve in the methanol, this comes out of solution vigorously on adding warm culture, leading to sample loss
Tubes, centrifuge, 15 mL  Sarstedt 62.554.001
Tubes, 2 mL, screw cap Greiner 723361
Tubes 0.2 mL strip of 8 with integral lids Brand 781332

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Duffy, E. E., Schofield, J. A., Simon, M. D. Gaining insight into transcriptome-wide RNA population dynamics through the chemistry of 4-thiouridine. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10, (1), e1513 (2018).
  2. Windhager, L., et al. Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Research. 22, 2031-2042 (2012).
  3. Baptista, T., Devys, D. Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity. Journal of Visualized Experiments. (140), e57982 (2018).
  4. Barrass, J. D., et al. Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling. Genome Biology. 16, 282 (2015).
  5. Burger, K., et al. 4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response. RNA Biology. 10, 1623-1630 (2013).
  6. Mendoza-Ochoa, G. I., et al. A fast and tuneable auxin-inducible degron for depletion of target proteins in budding yeast. Yeast (Chichester England). 36, (1), 75-81 (2018).
  7. Barrass, J. D., Mendoza-Ochoa, G. I., Maudlin, I. E., Sani, E., Beggs, J. D. Tuning degradation to achieve specific and efficient protein depletion. Journal of Visualized Experiments. (2019).
  8. Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
  9. Gustilo, E. M., Vendeix, F. A. P., Agris, P. F. tRNA's Modifications Bring Order to Gene Expression. Current Opinion in Microbiology. 11, 134-140 (2008).
  10. Dolken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14, 1959-1972 (2008).
  11. Miller, C., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Molecular Systems Biology. 7, 458 (2011).
  12. Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 18, 3091-3092 (1990).
  13. Rädle, B., et al. Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (78), e50195 (2013).
  14. Herzog, V. A., et al. Thiol-linked alkylation of RNA to assess expression dynamics. Nature Methods. 14, 1198-1204 (2017).
  15. Ohrt, T., et al. Molecular dissection of step 2 catalysis of yeast pre-mRNA splicing investigated in a purified system. RNA. 19, 902-915 (2013).
  16. Alexander, R. D., et al. RiboSys, a high-resolution, quantitative approach to measure the in vivo kinetics of pre-mRNA splicing and 3′-end processing in Saccharomyces cerevisiae. RNA. 16, 2570-2580 (2010).
  17. Wallace, E. W. J., Beggs, J. D. Extremely fast and incredibly close: cotranscriptional splicing in budding yeast. RNA. 23, 601-610 (2017).
  18. Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews Genetics. 13, 720-731 (2012).
  19. Preker, P., et al. RNA Exosome Depletion Reveals Transcription Upstream of Active Human Promoters. Science. 322, 1851-1854 (2008).
  20. Aslanzadeh, V., Huang, Y., Sanguinetti, G., Beggs, J. D. Transcription rate strongly affects splicing fidelity and cotranscriptionality in budding yeast. Genome Research. 28, 203-213 (2018).
  21. Schofield, J. A., Duffy, E. E., Kiefer, L., Sullivan, M. C., Simon, M. D. TimeLapse-seq: adding a temporal dimension to RNA sequencing through nucleoside recoding. Nature Methods. 15, 221-225 (2018).
Zeer snelle en specifieke metabolische etikettering van RNA in vivo met 4-thiouracil (Ers4tU)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barrass, J. D., Beggs, J. D. Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU). J. Vis. Exp. (150), e59952, doi:10.3791/59952 (2019).More

Barrass, J. D., Beggs, J. D. Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU). J. Vis. Exp. (150), e59952, doi:10.3791/59952 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter