Beskrevet nedenfor er en metode til implantation af flere polymer elektrode arrays på tværs af anatomisk fjernt hjerneområder for kronisk elektrofysiologisk optagelse i frit bevægende rotter. Forberedelse og kirurgisk implantation er beskrevet i detaljer, med vægt på designprincipper for at vejlede tilpasningen af disse metoder til brug i andre arter.
Samtidige optagelser fra store populationer af individuelle neuroner på tværs af distribuerede hjerneregioner over måneder til år vil muliggøre nye muligheder for videnskabelig og klinisk udvikling. Brugen af fleksible polymer elektrode systemer kan understøtte langtidsholdbar optagelse, men de samme mekaniske egenskaber, der giver mulighed for optagelse, gør flere indsættelser og integration i et kronisk implantat til en udfordring. Her er en metode, hvormed flere polymer elektrode arrays kan målrettes mod et relativt rumligt ubegrænset sæt af hjerneområder.
Metoden udnytter tynde film polymer enheder, udvalgt til deres biokompatibilitet og evne til at opnå langsigtede og stabile elektrofysiologisk optagelse grænseflader. Det resulterende implantat muliggør præcis og fleksibel målretning af anatomisk fjerne regioner, fysisk stabilitet i månedsvis og robusthed over for elektrisk støj. Metodologien understøtter op til 16 serielt indsatte enheder på tværs af otte forskellige anatomiske mål. Som tidligere påvist, metoden er i stand til at optage fra 1024 kanaler. Af disse, de 512 kanaler i denne demonstration, der anvendes til enkelt neuron optagelse gav 375 enkelt enheder fordelt på seks optagelsessteder. Vigtigere, denne metode kan også optage enkelt enheder i mindst 160 dage.
Denne implantation strategi, herunder midlertidigt afstikning hver enhed med en løftbare silicium indsættelse shuttle, involverer tøjring af enheder på deres mål dybder til en kraniet-klæbet plastik Grundstykke, som er specialdesignet til hvert sæt af optagelse mål og stabilisering/beskyttelse af enhederne i et silikone fyldt, specialdesignet plastik etui. Også dækket er forberedelsen af anordninger til implantation, og designprincipper, der skal guide tilpasning til forskellige kombinationer af hjerneområder eller array designs.
En ideel neurale implantat ville optage fra et meget stort antal individuelle neuroner i distribuerede hjerneområder i løbet af uger til måneder. Fleksible polymer elektrode systemer giver elektrofysiologiske optagelser med lang levetid at optage i månedsvis og stabiliteten til at spore individuelle neuroner1,2,3. Men de samme mekaniske egenskaber, der reducerer klipning skader4 og giver biokompatibilitet og optagelse kapacitet2,3,5,6,7, 8 udgør en udfordring for deres indsættelse i hjernen i forhold til deres stive modparter. Tidligere arbejde opnået et maksimum på 4 32-kanal arrays, men det samlede udbytte af sorteret formodede enkelt neuroner er urapporteret2,3,9. Omvendt, silicium-baserede elektrode arrays er blevet anvendt i high-density, multi-region implantater, men disse teknologier mangler enten evnen til at optage pigge fra neuroner over måneder (levetid) eller til at spore de samme neuroner (stabilitet) på denne tidshorisont, eller tætheden at optage fra hundredvis af individuelle neuroner på tværs af flere hjerneregioner. Den metode, der præsenteres her, overvinder det lave antal indsættelser i nuværende polymer elektrode array-baserede metoder, hvorved der skabes midler til elektrofysiologisk registrering af et stort antal individuelle neuroner i flere anatomisk fjerne regioner for måneder, med den stabilitet at registrere fra de samme individuelle neuroner på tværs af mange dage.
Der er en vis debat om betydningen af at bruge et polymer substrat i stedet for mikrowire-eller silicium-baserede strategier. Som påvist af Dhawale et al.10, er mikroledninger faktisk i stand til måneder lange stabile optagelser i gnavere, selv om implantaterne var begrænset til 16 tetrodes i en enkelt region. Opskalering af størrelsen af mikrowire implantatet når en relativ høj øvre grænse, med op til 1792 implanterede kanaler opnået i en ikke-menneskelig primat11. Men konstruktionen af mikrowire arrays er uforenelig med silicium nanofabrikering processer og er derfor ekstremt tidskrævende, kræver manuel håndtering af hver kanal individuelt under konstruktionen12,13 ,14. Som sådan er det ikke klart, om denne teknologi kan støtte en størrelsesorden stigning i optagelsen kanaler.
Nuværende silicium enheder kan placere hundredvis eller endda over tusind elektroder på en enkelt monolitisk enhed15,16,17,18,19. De seneste silicium fremstillingsprocesser genererer enheder med mindre tværsnits områder, uanset materialet, hvilket resulterer i mindre gliaceller aktivering20,21,22,23 ,24 og mere kompatible enheder. Der er en variation i rapporter om silicium Probe enkelt enhed optagelse levetid, med nogle tyder på, at relativt store silicium sonder kan give langsigtet optagelse25,26. Især de nyeste kommercielt tilgængelige silicium enheder17 har lang levetid til at optage i flere måneder og har tværsnits områder meget lig de skafter, der anvendes i den beskrevne metode (jun et al. 201717: 70 μm x 20 μm, enheder, der er beskrevet her og i Chung et al. 20191: 68 μm – 80 μm x 14 μm). På grund af forskellen i stabilitet, er denne sonde ikke blevet påvist at være i stand til at optage fra de samme neuroner i løbet af uger. Dette skyldes sandsynligvis en kombination af brugen af stiv silicium samt direkte tøjring til kraniet, kendt for at forårsage mikromotion, ustabilitet og gliose på array-hjerne-grænsefladen27,28. At konstruere en enhed, der kan bevæge sig med neurale væv, materialer, der er bløde5,29 og fleksibel7 er påkrævet. Mange tilgængelige polymerer (Se Geddes og Roeder30, fattahi et al.31, og weltman et al.32 for anmeldelser) har fleksibiliteten og stabiliteten af mikroledninger og er også kompatible med nanofabrikering processer, som tillader den tætte pakning af silicium enheder.
Flere neurale implantations problemer er specifikke for brugen af fleksible polymer elektrode systemer. Den første af disse er indsættelsen af array, som fleksible arrays mangler den stivhed, der skal fremføres i hjernen som silicium-eller mikrowire-baserede strategier. Størstedelen af indsættelses strategier for fleksible anordninger afhænger af en midlertidig stivhed af substratet, som det sker i denne metode (Se Weltman et al.32 til gennemgang). Der er fem bemærkelsesværdige strategier, der ikke gør brug af en stiv shuttle. For det første er der metoder, der gør brug af materialer, der overgår fra stiv til kompatibel ved implantation33,34. En ulempe ved denne strategi er, at det kræver et relativt stort tværsnitsareal for at opnå den kraft, der kræves for penetration af hjernevæv før Buckling som dikteret af Euler’s Buckling Force beregning35. Denne stigning i tværsnitsarealet vil have en negativ indvirkning på sundheden i det omgivende væv20,21,22,23,24. For det andet er brugen af en aftagelig bærende struktur over hjernen36, selv om dette kræver tidskrævende fjernelse eller opløsning af stilladser for at opretholde en minimal understøttet længde (og høj Buckling kraft). Alternativt, det ville kræve, at array skal indsættes med en længere understøttet længde, hvilket kræver en stivere array substrat eller en større array tværsnitsareal. Tredje er præ-penetration for at åbne et hul for den fleksible array, der skal indsættes i bagefter35. Dette kræver præcis justering eller relativt stor præ-penetration diameter, og elektrode array stivhed og tværsnitsareal for at tillade ikke-understøttet indsættelse. Fjerde er brugen af opløse belægninger til at stivne den fleksible enhed. Dette øger tværsnitsarealet og akutte skader forårsaget af indsættelse, selv når der træffes særlige forholdsregler for at bevare den skarpe spids af en anordning37. Femte er injektion af polymer array. Denne strategi har haft succes med at opnå implantater med op til 4 32-ch indsættelser2, men kræver at bruge en langt større tværsnitsareal til indsættelse, en 250 μm – 1,5 mm ydre diameter glas kapillar rør9, forårsager større akut skade. I modsætning hertil, ved hjælp af en aftagelig shuttle, samtidig med at tilføje tværsnitsareal til den akutte indsættelse, giver mulighed for brug af de stiveste mulige materialer, og kan derfor være den teoretiske mindste størrelse, når du indsætter en vilkårligt fleksibel enhed. Således indsættelse ved hjælp af en stiv shuttle er i øjeblikket den mest attraktive mulighed for indsættelse af fleksible enheder.
Der er to krav til enhver indsættelse shuttle tilgang: en passende stiv substrat og en måde at koble den fleksible enhed til substratet. Indsættelse shuttle materialer er typisk silicium38,39,40,41, rustfrit stål8,42, ellerwolfram 43,44, 45, med stivere materialer, som giver mulighed for mindre tværsnits områder. Disse er typisk anbringes ved hjælp af en klæbemiddel såsom polyethylenglycol (peg)8,38,39,42,43, elektrostatiske kræfter40, eller direkte fysisk kobling45,46. I alle tilfælde er udfordringerne tilpasningen og koblingen af elektrode array og Isætnings shuttle før isætning og afkobling efter isætning. Recounted nedenfor er en forbedring af metoden introduceret af Felix et al.39 til midlertidigt at fastholde elektrode array med en silikone indsættelse shuttle, knyttet ved hjælp af pind, der fjernes efter indsættelse af matrixen til dens mål dybde.
En anden udfordring præsenteret af fleksible enheder inden for et kronisk implantat er at stabilisere enheden i hjernen, mens den stadig gør det muligt for enheden at blive integreret i et implantat, der er fastgjort til kraniet. Hjernen bevæger sig i forhold til kraniet på grund af naturlige pulsationer, post-traumatiske edematous ændringer, indvirkning, og andre årsager, og elektrode array skal derfor være i det mindste noget fri til at bevæge sig i forhold til, hvor det er fastgjort til kraniet og optage hardware. Dette opnås ved hjælp af en 3D-trykt plastik Grundstykke, specialdesignet til hvert sæt af implantat mål, der har flere funktioner: et saltvand reservoir under implantation, placering til at tøjle polymer arrays, og boliger til silikone gel. Tethering placering over kraniet og silikone gel arbejde sammen om at skabe en større krumningsradius for arrayet og dermed give mulighed for større kompressions kræfter på array. Dette giver igen mulighed for bevægelse af hjernen i forhold til ankerpunkter i matrixen (kraniet), der skal oversættes til Buckling belastning.
Yderligere udfordringer omfatter behovet for at huse flere systemer og give rigelig stamme lettelse for dyret til frit at opføre sig uden overførsel af vibrationer eller slag kræfter til elektrode arrays, som kan forårsage bevægelse i forhold til neurale væv. Ændringer til løsninger, der har været anvendt i lignende applikationer, hvor hjernen skal være stabil i forhold til en stiv optagelse vindue har taget denne udfordring. En kunstig dural fugemasse silikone gel (tabel over materialer), som tidligere har vist sig at være giftfri og forhindre CSF lækage47, giver modtryk til hjernen for at forhindre udadgående hævelse og at stabilisere array på hjerne overfladen. Et ekstra lag af beskyttelse tilsættes til enhedens bånd af medium-viskositet, kirurgisk kvalitet silikoneelastomer, tidligere påvist til brug i forsegling kronisk neurale elektrode implantater48. Endelig er silikone-Buffered implantat og headstage indkapslet med 3D-trykte stykker Custom designet til at opretholde et lavt Center for masse for minimal reduktion af dyrets normale mobilitet.
Denne protokol starter med en fleksibel polymer Micro elektrode array monteret på en silikone indsættelse shuttle. Det fortsætter med montering af array-shuttle enhed til de 3D-trykte indsættelse stykker, beskriver den kirurgiske teknik og implantat konstruktion skridt, der kræves for at kunne implantere et dyr, og er i stand til at understøtte seksten polymer multi-elektrode arrays implanteret i otte anatomisk fjerne regioner i en enkelt rotte1.
Denne protokol antager, at udgangsmaterialerne for polymer elektrode matricer, der er fastgjort af den bioopløse lige klæbemiddel polyethylenglycol (PEG), til en silikone indsættelses shuttle, som vist i Felix et al.39, og mindst to selvstændigt bevægelige indsættelses stykker: en, som Silicon shuttle vil blive limet og en, som elektrode array-stikket vil blive overholdt. Denne protokol bruger også en tredje indsættelse brik til mere sikkert vedhæfte de to indsættelse stykker til en micron-skala micromanipulator. Alle filer til 3D-udskrivning kan findes på: https://github.com/jasonechung/PolymerProbe3DParts
Hver polymer elektrode array, der anvendes i denne metode består af to til fire optagelse skafter, et bånd, der formidler de elektriske spor, og i slutningen af båndet, en hardware-stik eller trykte kredsløb. Elektrode array og bånd er fast på toppen af Silicon shuttle med PIND. Hvert bånd har en 2 cm lang x 1 mm tyk polyimid rør fastgjort til båndet via UV helbredelig epoxy, der strækker sig vinkelret på længden af båndet. Hver enhed (elektrode array og indsættelse shuttle) skal indlæses på de 3D-trykte indsættelse stykker, der vil blive brugt til at indsætte array i hjernen og trække shuttle (figur 1). I dette design flytter den hydrauliske indsættelse micromanipulator (grøn, tabel over materialer) hele indsætnings apparatet (stykke 1, stykke 2 og retraktionen micromanipulator, orange) til dens måldybde. Når arrayet er løsrevet fra indsættelses apparatet og fikseret, trækker den anden, retraktion micromanipulator (orange) stykke 1 og den vedlagte shuttle uafhængigt af resten af indsætnings apparatet, så rumfærgen fjernes uden forskydning matrixen.
Figur 1: Inserter-komponenter.
(A) stk. 1 og 2 er midlertidigt fastgjort til hinanden med en aftagelig skrue og vil senere blive docket på retraktionen micromanipulator stempel (orange). (B) array og indsættelse shuttle er overholdt til stykke 1 og array Connector er fastgjort til stykke 2 med dobbeltsidet tape. Stykke 3 forbinder retraktionen micromanipulator og stykker 1 og 2 til indsættelse micromanipulator (grøn). Indsættelsen micromanipulator er fastgjort til en Stereotaktisk adapter til implantat positionering. Stykker 1-3 er afbilledet i deres relative størrelser. Piece 4 er et stabiliserende stykke for korrekt justering af indsættelsen shuttle. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Dette er en metode til implantation af flere polymer elektrode arrays til distribuerede hjerneområder til registrering af enkelt enheder over måneder. Denne metode repræsenterer en 8x stigning i optagelsen kanaler og 4X stigning i antallet af indsættelser fra den nærmeste storstilet polymer-array-baseret system2,3. Dette system udnyttede en polymer mesh injektion-baseret system i mus, men ikke rapportere et absolut antal af formodede enkelt enheder og dermed en sammenligning af enkelt neuron udbytte er ikke muligt.
Metoden til indsættelse af en fleksibel anordning er baseret på en tidligere protokol fra Felix et al.39, med vigtige modifikationer: et tredelt indsætnings apparat til uafhængig bevægelse af Silicon shuttle under tilbagetrækning, og tøjning af arrayet på sit mål dybde forud for tilbagetrækning af shuttle, som tilsammen eliminere behovet for hurtig tilbagetrækning beskrevet i den oprindelige protokol. Disse ændringer minimerer vævsskader og opretholder array stabilitet under tilbagetrækning af shuttle. Andre fleksible implantations strategier for enheder, såsom midlertidigt opstivende anordninger med bio-opløselige materialer, er kompatible med de efterfølgende trin i denne protokol. Sikring af enhederne inden for implantatet nødvendiggjorde integrering af tidligere validerede strategier for at dække hjernen og beskytte de sarte bånd i enheden.
På grund af deres skrøbelighed, omhu og opmærksomhed er nødvendige for at undgå direkte at kontakte eller på anden måde sende kraft til polymer elektrode arrays og silicium indsættelse Shuttles. Især når du arbejder med flere enheder, bør indsættelse være observeret under et mikroskop for at undgå interferens fra en enhed med en anden. Generelt er det muligt at håndtere en elektrode array forsigtigt med plastik tippet tang, undgå spor. En sådan strategi er passende, for eksempel, hvis polymer elektrode array begynder at trække sig tilbage med indsættelsen shuttle. Dette kan forekomme, hvis PIND ikke er helt opløst, eller på grund af overfladespænding af saltvand eller CSF mellem polymer og silicium.
En af de mest almindelige uoprettelige fejl er array løsrivelse fra indsættelsen shuttle. Dette kan ske ved indsættelse, som hjernen smilehuller og tryk på enhedens spids stiger, hvis array og shuttle er uperfekt justeret, eller hvis kondens har delvist opløst stangen. For at re-holde en array, hæve det så højt som muligt over hjernen overflade og vente på det tørre (ca. 5 min).
Et kritisk aspekt af planlægningen af en multi-array implantation kirurgi er designet af grundstykket til at rumme alle implantat mål og sidde uden huller mod konturen af kraniet. Grundstykket er et lille plastik stykke, der er fastgjort til kraniet efter kranie rensning, skrue placering og partielle kraniectomies, forud for indsættelse af matricer. Det har tre funktioner: 1) at holde saltvand for at opløse pind efter array indsættelse, men før silicium shuttle tilbagetrækning, 2) at give en placering over kraniet overflade, som matricer kan fastgøres af polyimid vinger, hvilket gør det muligt for stamme relief langs båndet over indsættelsespunktet i hjernen, og 3) for at holde kunstig dural fugemasse, som stabiliserer og beskytter matricer og hjernen. Grundstykket kan være formet i hånden eller 3D-printet. Det blev observeret, at dræning og tørring af basis stykket af saltvand er meget vigtigt forud enhed indsættelse. Disse trin forhindre kondensation og adskillelse af array og indsættelse shuttle. Tørring af grundstykket er også afgørende for at fylde grundstykket med kunstig dural fugemasse. Det er også vigtigt, at grundstykket ikke lække, som en film af silikone gel er vanskeligt at fjerne fra kraniet og vil forhindre vedhæftning af dental akryl for pålidelig kronisk fastgørelse af implantatet til kraniet. Det forventes, at enhver lav-viskositet, biokompatibel silikoneelastomer kunne bruges til at fylde craniectomies og Grundstykke, med en højere viskositet silikoneelastomer omkring det og de udsatte polymer array bånd.
Fremskridt i polymer nanofabrikering vil oversætte til polymer-baserede elektrode arrays, reducere funktions størrelser og øge det mulige antal elektroder i et array tættere på dem af silicium enheder15,16,17 ,18,19. Tilsvarende vil tværsnits arealerne af polymer enheder skrumpe sammen med funktions størrelser, hvilket giver endnu bedre biokompatibilitet8. Igen, som det er ved at blive udført med Silicon Devices, integration med forstærkende, digitaliserende, og multiplexing chips17 vil yderligere muliggøre større-skala neurale optagelse.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NINDS Grant U01NS090537 til L. M. F og V.M.T., NIMH Grant F30MH109292 til J. E. C, og NIMH Grant F30MH115582 til H.R.J. J.E.C. og H.R.J. støttes også af NIGMS MSTP Grant #T32GM007618. Flatiron instituttet er en division af Simons Foundation.
3D Printed Stereotax Adapter Parts (3) and Base Piece (1) | N/A | N/A | 3d print parts, suggest <30 μm resolution for minimal hand finishing of parts. Files available at: |
https://github.com/jasonechung/PolymerProbe3dParts | |||
Dental Acrylic (Hygenic Repair Resin, Coltene type II quick set) | Colten/Whaledent | 8886784, 8881627 | Dental acrylic for use during implant construction |
Hydraulic Micromanipulator (x2) | Narishige Group | MO-10 | 1-axis micromanipulator |
Kapton Polyimide Tape | Bertech | PPTDE-1/2 | Double-sided tape |
Kopf Stereotax Arm | Kopf Instruments | 103088R, 103088L | Standard rodent stereotax |
Light Curable Dental Acrylic, Vivid Flow | Coltene/Whaledent | D33-01-00 | Light curable dental acrylic for use during implant construction |
Loctite Gel Control | Henkel Corp. | 234790 1364076 1735574 1752699 | Cyanoacrylate for adhering silicon shuttle to corresponding 3d printed part |
Metabond Quick Cement | Parkell | S380 | For direct application to skull to create strong connection between skull and implant |
Polymer Electrode Arrays and Silicon Insertion Shuttles | Lawrence-Livermore National Laboratory | N/A | Fabricated at Lawrence-Livermore National Laboratory, polyimide electrode arrays, silicon insertion shuttle |
Silicone Gel Kit, Low Viscosity | Dow Corning | 03/80 | Low-viscosity silicone gel for filling of 3d printed base piece |
Silicone, Medium-Viscosity Kit | World Precision Instruments | Kwik-Sil | Medium-viscosity silicone gel for protection of polymer electrode arrays |