Summary
Эта статья демонстрирует модель для изучения сердечной ремоделирования после криотравмы миокарда у мышей.
Abstract
Использование моделей животных имеет важное значение для разработки новых терапевтических стратегий для острого коронарного синдрома и его осложнений. В этой статье мы демонстрируем модель криотравмы криотравмы, которая генерирует точные размеры инфаркта с высокой воспроизводимостью и релицируемостью. Короче говоря, после интубации и стернотомии животного сердце поднимается из грудной клетки. Зонд портативной системы доставки жидкого азота наносится на стенку миокарда, чтобы вызвать криотравму. Нарушение функции желудочков и электрической проводимости можно контролировать с помощью эхокардиографии или оптического картирования. Переуральная миокардная ремоделирование инфарктной области характеризуется осаждением коллагена и потерей кардиомиоцитов. По сравнению с другими моделями (например, LAD-ligation), эта модель использует портативную систему доставки жидкого азота для создания более однородных размеров инфаркта.
Introduction
Острый коронарный синдром (АКС) является ведущими причинами смерти в западном мире1,2. Острая окклюзия коронарных артерий приводит к активации ишемического каскада и некроза пораженной сердечной ткани3. Поврежденный миокард постепенно заменяется неконтрактной рубцовой тканью, которая клинически проявляется как сердечная недостаточность4,5. Несмотря на последние достижения в лечении ACS, распространенность ACS и ACS связанных сердечной недостаточности растет, и терапевтические варианты ограничены6,7. Поэтому разработка моделей животных для изучения ACS и его осложнений представляет огромный интерес.
На сегодняшний день наиболее широко используемой моделью животных для изучения ACS и ВЫЗВАННОй ACS миокарда ремоделирование является перевязка левой нисходящей коронарной артерии (LAD). Лигация ЛАД приводит к острой ишемии миокарда, подобно ткани миокарда человека во время АКС. Тем не менее, непоследовательные нефарктные размеры остаются ахиллесовой пятой перевязки LAD. Хирургические вариации и анатомическая изменчивость LAD приводят к несовместимым недопустимым размерам и препятствуют воспроизводимости и релицируемости этой процедуры8,9,10. Кроме того, лигация LAD имеет высокую внутрихирургическую и послеоперационную смертность. Несмотря на недавние усилия по улучшению воспроизводимости и снижению смертности11,12, большое количество животных по-прежнему необходимо правильно оценить анти-ремоделирования терапии.
Альтернативные модели ACS были предложены и изучены в течение последних лет, в том числе радиочастоты13, тепловые14 или криогенных травм15,16,17,18. Текущие методы криотравмы применяют металлический стержень, предварительно охлажденный в жидком азоте, чтобы повредить сердечную ткань субъекта15,16. Тем не менее, эта процедура должна быть повторена несколько раз, чтобы создать достаточный размер инфаркта. Из-за высокой проводимости и низкой тепловой емкости стержня по сравнению с тканью, зонд нагревается быстро, и ткань охлаждается (и, таким образом, infarcted) неоднородно. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы описываем здесь модель криоинфаркции с использованием ручной системы доставки жидкого азота. Эта модель воспроизводима, проста в исполнении и может быть установлена быстро и надежно. Генерируется воспроизводимое трансмурльное инфарктное утранжное, независимое от коронарной анатомии, что в конечном итоге приводит к сердечной недостаточности. Этот метод особенно подходит для изучения процесса реконструкции для оценки новых терапевтических фармакологических и тканевых инженерных стратегий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Звери получили гуманную помощь в соответствии с Руководством по принципам лабораторных животных, подготовленным Институтом лабораторных ресурсов животных и опубликованном Национальными институтами здравоохранения. Все протоколы животных были одобрены ответственным местным органом власти (Калифорнийский университет в Сан-Франциско (UCSF) Институциональный комитет по уходу за животными и использованию).
1. Уход за животными
- Получить мышей в возрасте 14 недель весом около 27 г (например, из Института лабораторных животных).
ПРИМЕЧАНИЕ: BALB/c мышей используются для этой статьи. - Держите мышей в обычных условиях в вентилируемых шкафах, кормя их стандартными мышами чау и autoclaved воды объявление libitum.
2. Подготовка мыши
- Используйте индукционную камеру для обезболания мыши с изофлюраном (3,5%).
- Удалите волосы на груди и шее с помощью триммера волос.
- Поместите мышь в положение на спине на подогревом площадку и поддерживать анестезию с маской, покрывающей рот и нос мыши.
- Проверьте на достаточную глубину анестезии, щипая задние ноги и хвост, чтобы проверить отсутствие рефлексов.
- Вводят подкожный бупренорфин (0,03 мг/кг) для обезболивания.
- Распространение задних и передних конечностей и исправить их положение с помощью ленты.
- С помощью повидона йода дезинфицировать бритую область, а затем очистки с 80% этанола. Повторите этот шаг дважды.
- Используйте небольшой ножница, чтобы сделать разрез кожи средней линии от нижней трети грудины до подбородка.
- Используйте изогнутые щипцы и тщательно отделить мышцы вокруг шеи, чтобы разоблачить трахеи.
- Используйте микро-ножницы для выполнения трахеотомии между вторым и третьим кольцами хряща.
- Установите вентилятор на частоту вентиляции 110/мин с приливным объемом 0,5 мл.
- Снимите маску и вставьте пластиковую канюлю (20 G), подключенную к аппарату искусственной вентиляции легких, в трахею. Вентилат животное.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вентиляционная канюля не вставляется слишком глубоко, подтверждая двустороннюю вентиляцию легких. - Используйте каутерию, чтобы отделить правую мышцу грудной клетки от ее кормового происхождения между третьим и седьмым ребрами.
- Используйте боковые пружинные ножницы, чтобы сократить четвертое-шестое ребра как можно ближе к грудине.
- При подожтении молочнойартерии, если кровотечение видно.
- Снижение изолюрани до 2,5%.
- Вскрыть основные соединительной ткани для получения четкого представления в грудной полости.
- Используйте тупые щипцы, чтобы открыть перикард и разоблачить сердце.
- Используйте мини-втягиватель Гольдштейна, чтобы распространить ребра и держать грудную полость открытой.
- Поднимите сердце из грудной полости тупым стержнем.
- Снижение напряжения втягивающего, чтобы уменьшить отверстие груди и сохранить сердце от падения назад.
- Precool криозонд (3 мм в диаметре) для 10 с.
- Применить криозонд на передней левой стенки желудочка и заморозить на 10 с для создания левого желудочкового крио-травмы инфаркта.
ПРИМЕЧАНИЕ: криозонд может быть применен к различным стенкам сердца в зависимости от научного вопроса и необходимости. - Орошайте криозонд с солевым раствором комнатной температуры, чтобы отделить зонд от левой стенки желудочка.
- Используйте ретрактор, чтобы увеличить отверстие груди.
- Аккуратно верните сердце в грудную полость тупым стержнем.
- Удалить втягиватель и соединить стернотомии с одним узелом с помощью 6-0 шов.
- Закройте грудную полость, используя 6-0 бегущий шов. Используйте 10 мл шприца для эвакуации любого оставшегося воздуха из груди, прежде чем завязывать узел.
- Адаптируйте кожу на каудальном краю и шов его до точки трахеи открытия с бегущим швом (5-0).
- Установите изолюран до 1,5% и подождите, пока животное получит спонтанное дыхание.
- Удалите трахеальный катетер и повторно нанесите маску на рот и нос животного для поддержания анестезии.
- Закройте разрез трахеи одним 8-0 Шов.
- Переложить брюшной мышцы шеи обратно в их положение, чтобы покрыть трахеи.
- Завершите шов кожи.
- Добавить метамизол в питьевую воду (50 мг метамизола на 100 мл) для обезболивательства в течение 3 дней и контролировать животное ежедневно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Период наблюдения для этой модели составляет 8 недель. Не забудьте следовать рекомендациям вашего учреждения в отношении режима обезболивающее.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Криотравма инфаркт модель подходит для изучения ACS и его осложнений. В этой модели наблюдается низкий уровень смертности и эффективное послеоперационное восстановление. Криотравма индуцированных повреждения миокарда приводит к снижению сердечной функции, электрическое разъединение, и трансмуральной реконструкции.
Эхокардиография может быть использована для мониторинга сердечной функции неинвазивно in vivo. В крио-поврежденных сердцах эхокардиография демонстрирует значительное снижение фракции выброса и изменения дробной области(рисунок 1a-c). Функциональное нарушение продолжается с 7-го дня послеоперационного вмешательства до наблюдательной конечной точки 56 дней.
Детальная сердечная функция может быть оценена инвазивно с помощью анализа объема давления (PV-петля). Катетер 1.2 Fr проводимости вводится в левый желудочек, а давление левого желудочка накладывается на объем левого желудочка. Можно вычислить такие гемодинамические параметры, как объем хода, работа с инсультом, выход сердца и максимальная мощность с предварительной загрузкой. Как показано на рисунке 1d-h, криоинфаркт приводит к нарушению левого желудочка (функция LV0, которая отражается как уменьшение объема инсульта, работы инсульта, сердечного выброса и преднагрузки скорректированной максимальной мощности.
Для изучения сердечной электрофизиологии, оптическое картирование может быть выполнено ex vivo. Сердца удаляются, пронизаны техникой перфузии Лангендорф, и окрашены флуоресцентным напряжением чувствительных красителя. Криоповрежденные сердца демонстрируют блокирование электрической проводимости на границе травмы, указывая на локальное электрическое разъединение(рисунок 1i).
Гистологическое окрашивание трихромом Массона демонстрирует образование трансмурфальной фиброзной ткани в месте травмы(рисунок 2a). Размер инфаркта можно вычислить путем измерять зону шрама infarct или длину шрама средней линии19 (рисунок 2b). Иммунофлуоресценция окрашивания против альфа-саркомерика актинина (кардиомиоцитный маркер) и коллагена-Я подтверждаю фиброзную ремоделирование и потерю кардиомиоцитов в месте травмы(рисунок 2с).
Рисунок 1 : Функциональный и электрофизиологический анализ криотравмысердца. Представитель двухмерных эхокардиографических снимков, сделанных до оперативно (D0) и в послеоперационный день 7 (D7), 28 (D28) и 56 (D56). () Верхняя панель показывает параштернальной длинной оси зрения на конце диастолы и нижней панели в конце систолы. (b, c) Фракция выброса (EF) и фракционная область изменения (FAC) снижение после крио-инфаркта и остается уменьшилась с течением времени Сердечная функция была оценена инвазивно анализа объема давления. (d-g) День 56 после травмы объем инсульта (SV), инсульт работы (SW), сердечного выхода (CO), и преднагрузки скорректированной максимальной мощности (PAMP) были значительно ниже, чем в предоперационных местных животных. (h) Представитель PV-петли из родной и 56 дней после операции животных показали характерный правый сдвиг и снижение амплитуды сигнала давления после грудной полы вены (TVC) окклюзии. (i) Isochrone карта сердечного оптического картирования из местных и криораненых сердец 14 дней после операции. Верхние и нижние панели показывают сердца, шагали от вершины и основания, соответственно. Инфарктная область отмечена пунктирной белой линией. Межгрупповые различия оценивались путем одностороннего анализа дисперсии (ANOVA) с пост-хок-тестом Бонферрони или студенческимt-тестом. N и 3 животных. - означает p qlt; 0.05. Бары ошибок представляют стандартное отклонение (SD). ESPVR - конечная систолическая связь объема давления; EDPVR - отношения с объемом конечных диастолического давления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Гистологическая оценка родных и крио-поврежденных сердец. ()Массон в трихромных окрашивания показывает осаждение коллагена (зеленый) в инфарктной области. Инфарктированный процент левого желудочка был измерен как(b)область и(c)длина инфаркта средней линии. (d)Иммунофлуоресценция окрашивание демонстрирует увеличение коллагена-I осаждения с сопутствующей потерей кардиомиоцитов в инфарктной области. LV - левый желудочек; Р.В. и правый желудочек; эндо эндокардиалик; эпикардиалики. N и 3 животных. Ошибки баров показать SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье описывается модель криотравмы мыши для исследования ACS и связанных с ними фармакологических и терапевтических вариантов.
Наиболее важным шагом является применение криозонда на сердечной ткани. Длительность контакта должна жестко контролироваться, чтобы получить оптимальный размер инфаркта и гарантировать воспроизводимые результаты. Длительное охлаждение миокарда приведет к негабаритным инфарктов или желудочковой перфорации. В отличие от этого, укороченные время охлаждения генерирует ограниченные поражения эпикардиальных и не устраняют все клетки-резиденты. Следовательно, это может быть смешанным при изучении регенеративной трансплантации клеток.
По сравнению с другими методами криоинфаркции20, открытый подход грудной клетки, описанный в этой статье, имеет то преимущество, что инфаркт может быть индуцирован свободно на разных положениях сердца. Кроме того, этот подход облегчает терапевтическое введение клеток или патч приложений, как инфаркт границы видна, и место трансплантации клеток могут быть выбраны соответствующим образом.
Недостатком этой модели является этиология травмы миокарда. Криотравма приводит к гибели клеток из-за генерации кристаллов льда, нарушающих клеточную мембрану, а не прямой ишемии. Кроме того, направление травмы, как правило, от эпикарда внутрь, в то время как ишемические инфаркты, как правило, распространяются наружу от эндокардиала к эпикардическому слою. Таким образом, эта модель ограничивается изучением патофизиологических механизмов ишемии миокарда или имитацией установки ишемии-реперфузии.
В заключение, модель, описанная здесь недорогой, простой в исполнении, может быть установлена быстро и надежно. Кардиомиоцитный некроз и последующее образование рубцов развиваются с течением времени, что приводит к прогрессирующей нарушению функции насоса и электрической проводимости. Хорошо управляемый размер инфаркта, форма и расположение делают эту модель идеальной для оценки экспериментальных вмешательств, направленных на восстановление сердечной функции или регенерации сердца. Успешно проверенные варианты лечения должны быть дополнительно подтверждены в крупных исследованиях на животных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Кристиану Борманн за ее техническую помощь. D.W. была поддержана Фондом Макса Кейда. Т.Д. получила гранты от Фонда Эльзе Крюнера (2012 г.) и Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE2133/2-1). S. S. получил исследовательские гранты от Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; SCHR992/3- 1, SCHR992/4-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 ml Syringe | Thermo Scientific | 03-377-23 | |
| 5-0 prolene suture | Ethicon | EH7229H | |
| 6-0 prolene suture | Ethicon | 8706H | |
| 8-0 Ethilon suture | Ethicon | 2808G | |
| Absorption Spears | Fine Science Tools | 18105-01 | |
| BALB/c | The Jackson Laboratory | Stock number 000651 | |
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer | 1578675 | Eye ointment |
| Betadine Solution | Betadine Purdue Pharma | NDC:67618-152 | |
| Blunt Forceps | Fine Science Tools | 18025-10 | |
| Buprenex | Reckitt Benckiser | NDC Codes: 12496-0757-1, 12496-0757-5 | Buprenorphine |
| Cryoprobe 3mm | Brymill Cryogenic Systems | Cry-AC-3 B-800 | |
| Ethanol 70% | Th. Geyer | 2270 | |
| Forceps curved | S&T | 00284 | |
| Forceps fine | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Forceps standard | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| Gross Anatomy Probe | Fine Science Tools | 10088-15 | |
| Hair clipper | WAHL | 8786-451A ARCO SE | |
| High temperature cautery kit | Bovie | 18010-00 | |
| ISOFLURANE | Henry Schein Animal Health | 029405 | |
| IV Catheter 20G | B. Braun | 603028 | |
| Mini-Goldstein Retractor | Fine Science Tools | 17002-02 | |
| NaCl 0.9% | B.Braun | PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160 | saline |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12075-14 | |
| Needle Holder, Curved | Harvard Apparatus | 72-0146 | |
| Novaminsulfon | Ratiopharm | PZN 03530402 | Metamizole |
| Operating Board | Braintree Scientific | 39OP | |
| Replaceable Fine Tip | Bovie | H101 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Small Animal Ventilator | Kent Scientific | RV-01 | |
| Spring Scissors - Angled to Side | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Surgical microscope | Leica | M651 | |
| Transpore Surgical Tape | 3M | 1527-1 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15400-12 | |
| Vaporizer | Kent Scientific | VetFlo-1205S |
References
- Writing Group. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 38-360 (2016).
- de Alencar Neto, J. N. Morphine, Oxygen, Nitrates, and Mortality Reducing Pharmacological Treatment for Acute Coronary Syndrome: An Evidence-based Review. Cureus. 10 (1), 2114 (2018).
- Detry, J. M. The pathophysiology of myocardial ischaemia. European Heart Journal. 17, Suppl G 48-52 (1996).
- Ertl, G., Frantz, S. Healing after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 66 (1), 22-32 (2005).
- Jugdutt, B. I. Ventricular remodeling after infarction and the extracellular collagen matrix: when is enough enough. Circulation. 108 (11), 1395-1403 (2003).
- Velagaleti, R. S., Vasan, R. S. Heart failure in the twenty-first century: is it a coronary artery disease or hypertension problem. Cardiology Clinics. 25 (4), 487-495 (2007).
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135 (10), 146-603 (2017).
- Morrissey, P. J., et al. A novel method of standardized myocardial infarction in aged rabbits. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (5), 959-967 (2017).
- Degabriele, N. M., et al. Critical appraisal of the mouse model of myocardial infarction. Experimental Physiology. 89 (4), 497-505 (2004).
- Chen, J., Ceholski, D. K., Liang, L., Fish, K., Hajjar, R. J. Variability in coronary artery anatomy affects consistency of cardiac damage after myocardial infarction in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 313 (2), 275-282 (2017).
- Reichert, K., et al. Murine Left Anterior Descending (LAD) Coronary Artery Ligation: An Improved and Simplified Model for Myocardial Infarction. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (122), e55353 (2017).
- Kim, S. C., et al. A murine closed-chest model of myocardial ischemia and reperfusion. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (65), e3896 (2012).
- Antonio, E. L., et al. Left ventricle radio-frequency ablation in the rat: a new model of heart failure due to myocardial infarction homogeneous in size and low in mortality. J Card Fail. 15 (6), 540-548 (2009).
- Ovsepyan, A. A., et al. Modeling myocardial infarction in mice: methodology, monitoring, pathomorphology. Acta Naturae. 3 (1), 107-115 (2011).
- Ciulla, M. M., et al. Left ventricular remodeling after experimental myocardial cryoinjury in rats. Journal of Surgical Research. 116 (1), 91-97 (2004).
- Grisel, P., et al. The MRL mouse repairs both cryogenic and ischemic myocardial infarcts with scar. Cardiovascular Pathology. 17 (1), 14-22 (2008).
- Duerr, G. D., et al. Comparison of myocardial remodeling between cryoinfarction and reperfused infarction in mice. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 961298 (2011).
- Ma, N., et al. Intramyocardial delivery of human CD133+ cells in a SCID mouse cryoinjury model: Bone marrow vs. cord blood-derived cells. Cardiovascular Research. 71 (1), 158-169 (2006).
- Takagawa, J., et al. Myocardial infarct size measurement in the mouse chronic infarction model: comparison of area- and length-based approaches. Journal of Applied Physiology (1985). 102 (6), 2104-2111 (2007).
- van den Bos, E. J., Mees, B. M., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: a comparison with coronary artery ligation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (3), 1291-1300 (2005).
