Summary
Cet article démontre un modèle pour étudier le remodelage cardiaque après cryoinjury myocardique chez les souris.
Abstract
L'utilisation de modèles animaux est essentielle pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le syndrome coronarien aigu et ses complications. Dans cet article, nous démontrons un modèle d'infarctus de cryoblessure de murine qui génère des tailles précises d'infarctus avec la reproductibilité et la replicabilité élevées. En bref, après l'intubation et la sénotomie de l'animal, le cœur est soulevé du thorax. La sonde d'un système portatif de livraison d'azote liquide est appliquée sur la paroi myocardique pour induire la cryoblessure. La fonction ventriculaire altérée et la conduction électrique peuvent être surveillées avec l'échocardiographie ou la cartographie optique. Le remodelage myocardique transmural de la zone infarctus est caractérisé par le dépôt de collagène et la perte des cardiomyocytes. Comparativement à d'autres modèles (p. ex., la ligature laLaD), ce modèle utilise un système portatif de distribution d'azote liquide pour générer des infarctus plus uniformes.
Introduction
Le syndrome coronarien aigu (SCA) est la principale cause de décès dans le monde occidental1,2. L'occlusion aigue des artères coronaires mène à l'activation de la cascade ischémique et de la nécrose du tissu cardiaque affecté3. Le myocarde endommagé est progressivement remplacé par le tissu cicatriciel non contractile, qui se manifeste cliniquement comme une insuffisance cardiaque4,5. Malgré les progrès récents dans le traitement de l'ACS, la prévalence de l'ACS et de l'insuffisance cardiaque liée à l'ACS est en hausse, et les options thérapeutiques sont limitées6,7. Par conséquent, le développement de modèles animaux pour étudier l'ACS et ses complications est d'un immense intérêt.
À ce jour, le modèle animal le plus largement utilisé pour étudier le remodelage myocardique induit par l'ACS et l'ACS est la ligature de l'artère coronaire descendante gauche (LAD). La lignation de la LAD mène à l'ischémie aigue du myocarde, semblable au tissu myocardique humain pendant ACS. Cependant, les tailles incohérentes d'infarctus restent le talon d'Achille de la ligature de LAD. La variation chirurgicale et la variabilité anatomique de la LAD conduisent à des tailles infarctus incohérentes et entravent la reproductibilité et la reproductibilité de cette procédure8,9,10. En outre, la ligature de LAD a une mortalité intra- et post-chirurgicale élevée. Malgré les efforts récents pour améliorer la reproductibilité et réduire la mortalité11,12, un grand nombre d'animaux sont encore nécessaires pour évaluer correctement les thérapies anti-remodelage.
D'autres modèles d'ACS ont été proposés et étudiés au cours des dernières années, y compris la radiofréquence13, thermique14 ou les blessures cryogéniques15,16,17,18. Les méthodes actuelles de cryo-blessure appliquent une tige de métal pré-refroidie dans l'azote liquide pour endommager le tissu cardiaque du sujet15,16. Cependant, cette procédure doit être répétée plusieurs fois pour générer une taille infarctus suffisante. En raison de la conductivité élevée et de la faible capacité de chaleur de la tige par rapport au tissu, la sonde se réchauffe rapidement, et le tissu est refroidi (et donc infarctus) hétérogènement. Pour surmonter ces limitations, nous décrivons ici un modèle de cryoinfarction utilisant un système portatif de livraison d'azote liquide. Ce modèle est reproductible, facile à exécuter et peut être établi rapidement et de manière fiable. Une lésion infarctus transmurale reproductible indépendante de l'anatomie coronaire est produite, qui mène par la suite à l'échec cardiaque. Cette méthode est particulièrement appropriée pour étudier le processus de remodelage pour l'évaluation de nouvelles stratégies pharmacologiques thérapeutiques et basées sur l'ingénierie tissulaire.
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Protocol
Les animaux ont reçu des soins humains conformément au Guide des principes des animaux de laboratoire, préparé par l'Institut des ressources animales de laboratoire et publié par les National Institutes of Health. Tous les protocoles sur les animaux ont été approuvés par l'autorité locale responsable (University of California San Francisco (UCSF) Institutional Animal Care and Use Committee).
1. Soins aux animaux
- Obtenir des souris à l'âge de 14 semaines pesant environ 27 g (p. ex., de l'Institut des animaux de laboratoire).
REMARQUE: Les souris BALB/c sont utilisées pour cet article. - Gardez les souris dans des conditions conventionnelles dans des armoires ventilées, en leur donnant des souris standard chow et de l'eau autoclaved ad libitum.
2. Préparation de la souris
- Utilisez une chambre d'induction pour anesthésier la souris avec de l'isoflurane (3,5 %).
- Enlever les cheveux sur la poitrine et le cou à l'aide d'un taille-cheveux.
- Placez la souris en position de supine sur un coussinet chauffé et maintenez l'anesthésie avec un masque couvrant la bouche et le nez de la souris.
- Vérifiez la profondeur suffisante de l'anesthésie en pinçant les pattes postérieures et la queue pour vérifier l'absence de réflexes.
- Injecter de la buprénorphine sous-cutanée (0,03 mg/kg) pour l'analgésie.
- Étendre les membres postérieurs et avant et fixer leur position à l'aide de ruban adhésif.
- Avec de l'iode de povidone, désinfecter la zone rasée, puis frotter avec 80% d'éthanol. Répétez cette étape deux fois.
- Utilisez un petit ciseaux pour faire une incision de la peau médiane du tiers inférieur du sternum au menton.
- Utilisez des forceps incurvés et séparez soigneusement les muscles autour du cou pour exposer la trachée.
- Utilisez un micro-ciseaux pour effectuer une trachéotomie entre les deuxième et troisième anneaux de cartilage.
- Régler le ventilateur à une fréquence de ventilation de 110/min avec un volume de marée de 0,5 ml.
- Retirez le masque facial et insérez une canule en plastique (20 G), reliée au ventilateur, dans la trachée. Ventiler l'animal.
REMARQUE : Assurez-vous que la canule de ventilation n'est pas insérée trop profondément en confirmant la ventilation pulmonaire bilatérale. - Utilisez la cautérisation pour détacher le muscle pectoralis droit de son origine sternale entre les troisième et septième côtes.
- Utilisez des ciseaux de ressort inclinés latéralement pour couper les quatrième à sixième côtes aussi près que possible du sternum.
- Cauteriser l'artèremammaire, si le saignement est visible.
- Diminution isoflurane à 2,5%.
- Disséquer le tissu conjonctif sous-jacent pour obtenir une vue claire dans la cavité thoracique.
- Utilisez des forceps émoussés pour ouvrir le péricarde et exposer le cœur.
- Utilisez un mini rétracteur Goldstein pour écarter les côtes et garder la cavité thoracique ouverte.
- Soulevez le cœur de la cavité thoracique à l'aide d'une tige émoussée.
- Diminuer la tension du rétracteur pour réduire l'ouverture de la poitrine et pour empêcher le cœur de retomber.
- Prérefroidir la cryosonde (3 mm de diamètre) pendant 10 s.
- Appliquer la cryosonde sur la paroi ventriculaire gauche antérieure et congeler pendant 10 s pour générer un infarctus de cryo-blessure ventriculaire gauche.
REMARQUE : La cryosonde peut être appliquée à différentes parois de coeur selon la question scientifique et le besoin. - Irriguer la cryosonde avec la saline à température ambiante pour détacher la sonde de la paroi ventriculaire gauche.
- Utilisez le rétracteur pour agrandir l'ouverture de la poitrine.
- Remettre doucement le cœur dans la cavité thoracique à l'aide d'une tige émoussée.
- Retirez le rétracteur et connectez la sténotomie avec un seul noeud en utilisant la suture 6-0.
- Fermer la cavité thoracique à l'aide de 6-0 suture en cours d'exécution. Utilisez une seringue de 10 ml pour évacuer l'air restant de la poitrine avant de lier le noeud.
- Adapter la peau au bord caudal et la suturer jusqu'au point de l'ouverture trachéale avec la suture en cours d'exécution (5-0).
- Définir isoflurane à 1,5% et attendre jusqu'à ce que l'animal gagne respiration spontanée.
- Retirez le cathéter trachéal et réappliquez le masque facial sur la bouche et le nez des animaux pour maintenir l'anesthésie.
- Fermer l'incision trachéale avec un 8-0 suture.
- Repositionnez les muscles ventral du cou à leur position pour couvrir la trachée.
- Complétez la suture de la peau.
- Ajouter le métamétzole à l'eau potable (50 mg de métamétazole par 100 ml) pour l'analgésie de la douleur pendant 3 jours et surveiller l'animal tous les jours.
REMARQUE : La période d'observation de ce modèle est de 8 semaines. Assurez-vous de suivre les directives de votre établissement concernant le régime d'analgésie.
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Representative Results
Le modèle d'infarctus de cryomutilation est approprié pour étudier ACS et ses complications. De faibles taux de mortalité et un rétablissement postchirurgical efficace sont observés dans ce modèle. Les dommages myocardiques induits de cryoblessure mènent à la fonction cardiaque réduite, au découplage électrique, et au remodelage transmural.
L'échocardiographie peut être utilisée pour surveiller la fonction cardiaque non invasive in vivo. Dans les cœurs cryo-blessés, l'échocardiographie démontre une réduction significative de la fraction d'éjection et du changement de zone fractionnaire(figure 1a-c). L'affaiblissement fonctionnel continue du jour 7 post-chirurgie jusqu'au point d'extrémité observationnel de 56 jours.
La fonction cardiaque détaillée peut être évaluée de façon invasive par l'analyse de la boucle de volume de pression (PV-boucle). Un cathéter de conductance de 1.2 Fr est introduit dans le ventricule gauche, et la pression ventriculaire gauche est tracée contre le volume ventriculaire gauche. Des paramètres hémodynamiques tels que le volume d'AVC, le travail d'AVC, la sortie cardiaque et la puissance maximale ajustée en fonction de la charge préchargepeuvent peuvent être calculés. Comme le montre la figure 1d-h,la cryoinfarction entraîne une altération du ventricule gauche (fonction LV0, qui se reflète comme une diminution du volume d'AVC, du travail des accidents vasculaires cérébraux, de la production cardiaque et de la puissance maximale ajustée en fonction du précharge.
Pour étudier l'électrophysiologie cardiaque, la cartographie optique peut être effectuée ex vivo. Les cœurs sont enlevés, perfusés avec la technique de perfusion Delangendorff, et tachés d'un colorant sensible à la tension fluorescente. Les cœurs cryoblessés démontrent un blocage de la conduction électrique à la limite des blessures, ce qui indique le découplage électrique local (figure 1i).
La coloration histologique avec le trichrome de Masson démontre la formation de tissu fibrotique transmural au site de la blessure (figure 2a). La taille des infarctus peut être calculée en mesurant la zone de cicatrice infarctus ou la longueur de la cicatrice médiane19 (figure 2b). La coloration d'immunofluorescence contre l'actinine alpha-sarcomérique (marqueur de cardiomyocyte) et le collagène-I confirment le remodelage fibrotique et la perte des cardiomyocytes au site des dommages (figure 2c).
Figure 1 : Analyse fonctionnelle et électrophysiologique du cœur cryoblessé. Images d'échocardiographie bidimensionnelles représentatives prises avant -opératoirement (D0) et au jour postopératoire 7 (D7), 28 (D28), et 56 (D56). (a) Le panneau supérieur montre la vue à long axe parasternal à la fin du diastole et le panneau inférieur à la fin-systole. (b, c) La fraction d'éjection (EF) et le changement de secteur fractionnel (FAC) diminuent après cryo-infarctus et sont restés diminués au fil du temps La fonction cardiaque a été évaluée invasif par l'analyse de courbe de volume de pression. (d-g) Le volume d'AVC après une blessure (SV), le travail d'AVC (SW), la production cardiaque (CO) et la puissance maximale ajustée en fonction de la charge préchargée (PAMP) étaient significativement inférieurs à ceux des animaux indigènes préopératoires. h) Les PV-loops représentatifs des animaux indigènes et de 56 jours post-chirurgicale ont montré le décalage droit caractéristique et le déclin de l'amplitude du signal de pression suivant l'occlusion thoracique de veine cava (TVC). (i) Carte isochrone de la cartographie optique cardiaque à partir de cœurs indigènes et cryoblessés 14 jours après la chirurgie. Les panneaux supérieurs et inférieurs montrent des cœurs rythmés à partir de l'apex et de la base, respectivement. La zone infarctus est marquée par une ligne blanche pointillée. Les différences entre les groupes ont été évaluées par une analyse à sens unique de la variance (ANOVA) avec le test post-hoc de Bonferroni ou le test t-del'étudiant. N - 3 animaux. indique p 'lt; 0.05. Les barres d'erreur représentent l'écart type (SD). ESPVR - relation de volume de pression fin-systolique ; EDPVR - relation de volume de pression fin-diastolique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Évaluation histologique des cœurs indigènes et cryo-blessés. (a) La coloration trichrome de Masson montre la déposition de collagène (verte) dans la zone infarctus. Le pourcentage infarctus du ventricule gauche a été mesuré comme (b) la zone et (c) la longueur de l'infarctus de la ligne médiane. (d) La coloration d'immunofluorescence démontre le dépôt accru de collagène-I avec la perte concomitante des cardiomyocytes dans la zone infarctus. LV - ventricule gauche; RV - ventricule droit; endo - endocardial; épi et épicardique. N - 3 animaux. Les barres d'erreur affichent SD. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Cet article décrit un modèle de cryomutilation de souris pour étudier ACS et les options pharmacologiques et thérapeutiques connexes.
L'étape la plus cruciale est l'application de la cryosonde sur le tissu cardiaque. La durée du contact doit être étroitement contrôlée afin d'obtenir la taille optimale de l'infarctus et de garantir des résultats reproductibles. Un refroidissement prolongé du myocarde entraînera des infarctus surdimensionnés ou une perforation ventriculaire. En revanche, le temps de refroidissement raccourci génère des lésions épicardiques limitées et n'élimine pas toutes les cellules résidentes. Par conséquent, cela peut être déroutant lors de l'étude de la transplantation de cellules régénératives.
Comparé à d'autres méthodes de cryoinfarction20,l'approche de coffre ouvert décrite dans cet article a l'avantage que l'infarctus peut être induit librement sur différentes positions du coeur. En outre, cette approche facilite l'injection thérapeutique de cellules ou des applications de correction, car la frontière infarctus est visible, et le site de la transplantation cellulaire peut être choisi en conséquence.
Un inconvénient de ce modèle est l'étiologie des blessures myocardiques. La cryoblessure entraîne la mort cellulaire due à la génération de cristaux de glace perturbant la membrane cellulaire plutôt qu'une ischémie directe. En outre, la direction des blessures est généralement de l'épicardium vers l'intérieur, tandis que les infarctus ischémiques ont tendance à se propager vers l'extérieur de l'endocardial à la couche épicardique. Par conséquent, ce modèle est limité à étudier les mécanismes pathophysiologiques de l'ischémie myocardique ou à imiter le réglage ischémie-reperfusion.
En conclusion, le modèle décrit ici est peu coûteux, facile à exécuter, peut être établi rapidement et de façon fiable. La nécrose de cardiomyocyte et la formation suivante de cicatrice se développent au fil du temps, ayant pour résultat la fonction altérée progressive de pompe et la conductance électrique. La taille, la forme et l'emplacement des infarctus bien contrôlables font de ce modèle l'idéal pour évaluer les interventions expérimentales visant à rétablir la fonction cardiaque ou la régénération cardiaque. Les options de traitement testées avec succès devraient être confirmées dans les grandes études sur les animaux.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions Christiane Pahrmann pour son assistance technique. D.W. a été soutenu par la Fondation Max Kade. T.D. a reçu des subventions de la Fondation Else Kr'ner (2012-EKES.04) et de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE2133/2-1). S. S. a reçu des subventions de recherche de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; SCHR992/3- 1, SCHR992/4-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 ml Syringe | Thermo Scientific | 03-377-23 | |
| 5-0 prolene suture | Ethicon | EH7229H | |
| 6-0 prolene suture | Ethicon | 8706H | |
| 8-0 Ethilon suture | Ethicon | 2808G | |
| Absorption Spears | Fine Science Tools | 18105-01 | |
| BALB/c | The Jackson Laboratory | Stock number 000651 | |
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer | 1578675 | Eye ointment |
| Betadine Solution | Betadine Purdue Pharma | NDC:67618-152 | |
| Blunt Forceps | Fine Science Tools | 18025-10 | |
| Buprenex | Reckitt Benckiser | NDC Codes: 12496-0757-1, 12496-0757-5 | Buprenorphine |
| Cryoprobe 3mm | Brymill Cryogenic Systems | Cry-AC-3 B-800 | |
| Ethanol 70% | Th. Geyer | 2270 | |
| Forceps curved | S&T | 00284 | |
| Forceps fine | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Forceps standard | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| Gross Anatomy Probe | Fine Science Tools | 10088-15 | |
| Hair clipper | WAHL | 8786-451A ARCO SE | |
| High temperature cautery kit | Bovie | 18010-00 | |
| ISOFLURANE | Henry Schein Animal Health | 029405 | |
| IV Catheter 20G | B. Braun | 603028 | |
| Mini-Goldstein Retractor | Fine Science Tools | 17002-02 | |
| NaCl 0.9% | B.Braun | PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160 | saline |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12075-14 | |
| Needle Holder, Curved | Harvard Apparatus | 72-0146 | |
| Novaminsulfon | Ratiopharm | PZN 03530402 | Metamizole |
| Operating Board | Braintree Scientific | 39OP | |
| Replaceable Fine Tip | Bovie | H101 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Small Animal Ventilator | Kent Scientific | RV-01 | |
| Spring Scissors - Angled to Side | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Surgical microscope | Leica | M651 | |
| Transpore Surgical Tape | 3M | 1527-1 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15400-12 | |
| Vaporizer | Kent Scientific | VetFlo-1205S |
References
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