Summary
Denne artikel viser en model til at studere hjerte remodeling efter myokardial kryoskade i mus.
Abstract
Brugen af dyremodeller er afgørende for at udvikle nye terapeutiske strategier for akut koronarsyndrom og dets komplikationer. I denne artikel viser vi en murine cryoskade infarkt model, der genererer præcise infarkt størrelser med høj reproducerbarhed og replikabilitet. Kort sagt, efter intubation og sternotomi af dyret, hjertet løftes fra brystkassen. Sonden af et håndholdt flydende nitrogen-leveringssystem påføres på Myokardie væggen for at inducere kryoskade. Nedsat ventrikelfunktion og elektrisk ledning kan overvåges med ekkokardiografi eller optisk kortlægning. Transmural myokardial remodellering af det infarkted område er karakteriseret ved kollagen deposition og tab af kardiomyocytter. Sammenlignet med andre modeller (f. eks, LAD-ligation), bruger denne model et håndholdt flydende nitrogen leveringssystem til at generere mere ensartede infarkt størrelser.
Introduction
Akut koronarsyndrom (ACS) er den førende dødsårsager i den vestlige verden1,2. Akut okklusion af kranspulsårerne fører til aktivering af iskæmisk kaskade og nekrose af det angrebne hjertevæv3. Beskadigede myokardiet er gradvist erstattet af non-contractile arvæv, som manifestz klinisk som et hjertesvigt4,5. Trods nylige fremskridt i behandlingen af ACS er forekomsten af ACS og ACS-relaterede hjertesvigt stigende, og terapeutiske muligheder er begrænset til6,7. Derfor er udvikling af dyremodeller til at studere ACS og dens komplikationer af enorm interesse.
Til dato, den mest udbredte dyremodel til at studere ACS og ACS-induceret myokardial remodeling er ligering af venstre faldende koronararterie (Lad). Ligering af drengen fører til akut iskæmi af myokardiet, svarende til humant myokardieinfarkt under ACS. Men inkonsekvente infarkt størrelser forbliver akilleshælen af LAD ligationen. Kirurgisk variation og anatomisk variabilitet af drengen fører til inkonsekvente infarkt størrelser og hindrer reproducerbarhed og replikabilitet af denne procedure8,9,10. Desuden har Lad ligering en høj intra-og postkirurgisk dødelighed. På trods af nylige bestræbelser på at forbedre reproducerbarhed og reducere dødeligheden11,12, et stort antal dyr er stadig nødvendigt at korrekt evaluere anti-remodeling behandlingsformer.
Alternative modeller af ACS er blevet foreslået og undersøgt i de seneste år, herunder radiofrekvenser13, termiske14 eller kryogene skader15,16,17,18. Nuværende kryoskade metoder anvende en metalstang forkølet i flydende kvælstof til at beskadige motivet hjertevævet15,16. Men, denne procedure skal gentages flere gange for at generere en tilstrækkelig infarkt størrelse. På grund af den høje ledningsevne og lav varmekapacitet af stangen i forhold til vævet, sonde varmer hurtigt, og vævet afkøles (og dermed infarcted) heterogene. For at overvinde disse begrænsninger beskriver vi heri en kryoinfarkt model, der udnytter et håndholdt flydende nitrogen leveringssystem. Denne model er reproducerbar, nem at udføre og kan etableres hurtigt og pålideligt. En reproducerbar transmural infarkt læsion uafhængigt af koronar anatomi genereres, hvilket i sidste ende fører til hjertesvigt. Denne metode er især egnet til at studere remodeling proces til evaluering af nye terapeutiske farmakologiske og vævs Engineering-baserede strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyr modtaget Human pleje i overensstemmelse med vejledningen for de principper for forsøgsdyr, udarbejdet af instituttet for forsøgsdyr ressourcer, og offentliggjort af National Institutes of Health. Alle dyre protokoller blev godkendt af den ansvarlige lokale myndighed (University of California San Francisco (UCSF) det institutionelle udvalg for dyrepasning og-anvendelse).
1. dyrepasning
- Få mus i en alder af 14 uger, som vejer ca. 27 g (f. eks. fra Institut for forsøgsdyr).
Bemærk: BALB/c-mus bruges til denne artikel. - Hold mus under konventionelle forhold i ventilerede kabinetter, fodre dem standard mus Chow og autoklaveres vand ad libitum.
2. forberedelse af musen
- Brug et induktions kammer til at anæstetisere mus med isofluran (3,5%).
- Fjern håret over brystet og halsen ved hjælp af en hårtrimmer.
- Placer musen i liggende position på en opvarmet pude og opretholde anæstesi med en ansigtsmaske dækker mund og næse af musen.
- Kontroller for tilstrækkelig dybde af anæstesi ved at klemme bagbenene og halen for at verificere et fravær af reflekser.
- Injicér subkutant buprenorphin (0,03 mg/kg) for analgesi.
- Sprede Hind og fore lemmer og fastsætte deres position ved hjælp af tape.
- Med povidon jod, desinficere det barberede område, efterfulgt af skrubbe med 80% ethanol. Gentag dette trin to gange.
- Brug en lille saks til at lave en mellemlinie hud indsnit fra den nedre tredjedel af brystbenet til hagen.
- Brug buede pincet og omhyggeligt adskille musklerne omkring halsen for at udsætte luftrøret.
- Brug en mikro-Scissor til at udføre en tracheotomi mellem den anden og tredje brusk ringe.
- Indstil ventilatoren til en ventilationsfrekvens på 110/min med en tidevands volumen på 0,5 mL.
- Fjern ansigtsmaske og sæt en plastik kanyle (20 G), der er forbundet med ventilatoren, ind i luftrøret. Ventilere dyret.
Bemærk: Sørg for, at ventilations kanylen ikke er sat for dybt ved at bekræfte bilateral lunge ventilation. - Brug Cautery til at løsne den højre pectoralis-muskel fra dens brystbenet oprindelse mellem den tredje og syvende ribben.
- Brug side vinklet fjeder saks til at klippe den fjerde til sjette ribben så tæt som muligt på brystbenet.
- Cauterize bryst arterien, hvis blødning er synlig.
- Nedsætte isofluran til 2,5%.
- Dissekere underliggende bindevæv for at opnå en klar visning i brysthulen.
- Brug sløv pincet til at åbne hjerte kardiet og udsætte hjertet.
- Brug en mini Goldstein retraktor til at sprede ribbenene og holde brysthulen åben.
- Løft hjertet fra brysthulen med en stump stang.
- Reducer spændingen på retractoren for at reducere bryst åbningen og for at holde hjertet fra at falde tilbage.
- Kryoprobe (3 mm diameter) forkølet i 10 s.
- Påfør cryoprobe på den forreste venstre ventrikel væg og fryse i 10 s for at generere en venstre ventrikel kryo-skade infarkt.
Bemærk: cryoprobe kan påføres forskellige hjerte vægge afhængigt af det videnskabelige spørgsmål og behov. - Skyl cryoprobe med stuetemperatur saltvand for at løsne sonden fra venstre ventrikel væg.
- Brug retraktoren til at forstørre bryst åbningen.
- Forsigtigt returnere hjertet til thorax hulrum med en stump stang.
- Fjern retraktoren og Tilslut sternotomi med en enkelt knude ved hjælp af 6-0 sutur.
- Luk brysthulen med 6-0 rindende sutur. Brug en 10 mL sprøjte til at evakuere eventuel resterende luft fra brystet, før du binder knuden.
- Tilpas huden ved den hale kant og sutur den til det punkt af trakeal åbningen med rindende sutur (5-0).
- Sæt isofluran til 1,5% og vente, indtil dyret får spontan vejrtrækning.
- Fjern trakeal kateteret og genanvende ansigtsmaske på dyrets mund og næse for at opretholde anæstesi.
- Luk trakeal indsnit med en 8-0 Sutur.
- Flyt de ventrale nakke muskler tilbage til deres position for at dække luftrøret.
- Fuldføre hudens sutur.
- Tilsæt Metamizol til drikkevandet (50 mg Metamizol pr. 100 mL) for smerte analgesi i 3 dage, og Overvåg dyret dagligt.
Bemærk: observationsperioden for denne model er 8 uger. Sørg for at følge din institutions retningslinjer vedrørende analgesi regime.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den kryoskade infarkt model er egnet til at studere ACS og dens komplikationer. Lav dødelighed og effektiv post kirurgisk opsving ses i denne model. Kryoskade induceret myokardieinfarkt skader fører til reduceret hjertefunktion, elektrisk frakobling, og transmural remodeling.
Ekkokardiografi kan bruges til at overvåge hjertets funktion noninvasivt in vivo. I Cryo-sårede hjerter, viser ekkokardiografi signifikant reduceret uddrivningsfraktion og fraktioneret område ændring (figur 1a-c). Funktionsnedsættelse fortsætter fra dag 7 efter operationen indtil det observations endepunkt på 56 dage.
Detaljeret kardiel funktion kan vurderes invasivt gennem tryk volumen loop (PV-loop) analyse. Et 1,2 fr ledende kateter introduceres i venstre ventrikel, og det venstre ventrikel tryk afbildes mod venstre ventrikel volumen. Hæodynamiske parametre såsom slagvolumen, slagtilfælde arbejde, kardiel udgang, og preload-justeret maksimal effekt kan beregnes. Som vist i figur 1d-h, kryoinfarkt fører til nedsat venstre ventrikel (LV0 funktion, som afspejles som et fald i slagvolumen, slagtilfælde arbejde, kardiel udgang og preload-justeret maksimal effekt.
For at studere hjertets Elektrofysiologi kan optisk kortlægning udføres ex vivo. Hjerter er fjernet, perfektbrugt med Langendorff perfusion teknik, og farvet med en fluorescerende spændings følsomt farvestof. Kryoskadede hjerter demonstrerer blokering af elektrisk ledning ved kanten af skaden, hvilket indikerer lokal elektrisk frakobling (figur 1i).
Histologisk farvning med Masson trichrome viser transmural fibrotisk vævs dannelse på stedet for skade (figur 2a). Infarkt størrelse kan beregnes ved at måle infarkt ar område eller midterlinje ar længde19 (figur 2b). Immunofluorescens farvning mod Alpha-sarcomeric actinin (kardiomyocyt markør) og kollagen-jeg bekræfter fibrotisk remodeling og tab af kardiomyocytter på stedet for skade (figur 2c).
Figur 1 : Funktionel og elektrofysiologisk analyse af cryoskadet hjerte. Repræsentative to-dimensionelle ekkokardiografi billeder taget præ-operativt (d0) og på postoperative dag 7 (D7), 28 (D28) og 56 (D56). (a) den øverste panel viser den parasternal lang-akse visning ved slutningen-diastole og det nederste panel ved slutningen-systole. (b, c) Uddrivningsfraktion (EF) og fald i fraktioneret område (FAC) efter kryo-infarkt og forblev formindsket over tid kardiel funktion blev vurderet invasivt af tryk volumen kurve analyse. (d-g) Dag 56 efter skade slagvolumen (SV), slagtilfælde arbejde (SW), kardiel udgang (CO), og preload-justeret maksimal effekt (PAMP) var betydeligt lavere end i præ-operative indfødte dyr. h) repræsentative PV-sløjfer fra indfødte og 56 dage efter operationen dyr viste karakteristisk højre Skift og nedgang i amplitude af tryk signalet efter thorax Vena cava (TVC) okklusion. (i) isochrone kort over optisk kardiel kortlægning fra indfødte og cryosårede hjerter 14 dage efter operationen. Top og bundpaneler viser hjerter tempo fra henholdsvis spids og bund. Infarkt område er markeret med stiplet hvid linje. Forskelle mellem grupper blev vurderet ved envejs analyse af variansen (ANOVA) med Bonferroni's post-hoc-test eller elevens t-test. N = 3 dyr. * Angiver p < 0,05. Fejllinjerne repræsenterer standardafvigelsen (SD). ESPVR = det endelige systoliske tryk volumen forhold; EDPVR = slut-diastolisk tryk volumen forhold. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Histologisk vurdering af indfødte og Cryo-sårede hjerter. a) Masson-farvning af trikrom viser kollagen aflejring (grøn) i det infarklede område. Den infarkne procentdel af venstre ventrikel blev målt som (b) område og (c) mellemlinie infarkt længde. d) immunofluorescens farvning viser øget kollagen-i-aflejring med samtidig tab af kardiomyocytter i infarkteret område. LV = venstre ventrikel; RV = højre ventrikel; endo = endocardial; EPI = epicardial. N = 3 dyr. Fejllinjer viser SD. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikel beskriver en muse kryoskade model til at undersøge ACS og relaterede farmakologiske og terapeutiske muligheder.
Det mest afgørende skridt er anvendelsen af cryoprobe på hjertets væv. Kontakt varigheden skal være stramt kontrolleret for at opnå den optimale infarkt størrelse og for at sikre reproducerbare resultater. Langvarig afkøling af myokardiet vil føre til overdimensionerede infarkter eller ventrikel perforation. Forkortede afkølingstiden genererer derimod begrænsede epicardial-læsioner og eliminerer ikke alle residente celler. Derfor kan dette være forvirrende, når man studerer regenerativ celletransplantation.
Sammenlignet med andre kryoinfarkt metoder20, den åbne brystet tilgang, der er beskrevet i denne artikel har den fordel, at infarkt kan induceres frit på forskellige positioner i hjertet. Desuden, denne fremgangsmåde letter terapeutisk celle injektion eller patch applikationer, som infarkt grænse er synlig, og stedet for celletransplantation kan vælges i overensstemmelse hermed.
En ulempe ved denne model er etiologien af myokardieinfarkt skade. Kryoskade resulterer i celledød på grund af generering af iskrystaller forstyrre cellemembranen snarere end en direkte iskæmi. Desuden er retningen af skaden normalt fra epicardium indad, mens iskæmiske infarkter har tendens til at udbrede udad fra endocardial til epicardial lag. Derfor er denne model er begrænset til at studere patofysiologiske mekanismer af myokardieiskæmi eller at efterligne den iskæmi-reperfusion indstilling.
Afslutningsvis, den model, der er beskrevet her er billig, let at udføre, kan etableres hurtigt og pålideligt. Kardiomyocyt nekrose og efterfølgende ardannelse udvikler sig over tid, hvilket resulterer i progressiv nedsat pumpefunktion og elektrisk ledning. Godt-kontrollerbar infarkt størrelse, form og placering gør denne model ideel til at evaluere eksperimentelle interventioner med henblik på at genoprette hjertets funktion eller hjerte regenerering. Med succes testede behandlingsmuligheder bør bekræftes yderligere i store dyreforsøg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Christiane Pahrmann for hendes tekniske bistand. D.W. blev støttet af Max Kade Foundation. T.D. modtog tilskud fra Else Kröner Fondation (2012_EKES. 04) og Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE2133/2 -1 _. S. S. modtog forskningsstipendier fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; SCHR992/3-1, SCHR992/4-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 ml Syringe | Thermo Scientific | 03-377-23 | |
| 5-0 prolene suture | Ethicon | EH7229H | |
| 6-0 prolene suture | Ethicon | 8706H | |
| 8-0 Ethilon suture | Ethicon | 2808G | |
| Absorption Spears | Fine Science Tools | 18105-01 | |
| BALB/c | The Jackson Laboratory | Stock number 000651 | |
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer | 1578675 | Eye ointment |
| Betadine Solution | Betadine Purdue Pharma | NDC:67618-152 | |
| Blunt Forceps | Fine Science Tools | 18025-10 | |
| Buprenex | Reckitt Benckiser | NDC Codes: 12496-0757-1, 12496-0757-5 | Buprenorphine |
| Cryoprobe 3mm | Brymill Cryogenic Systems | Cry-AC-3 B-800 | |
| Ethanol 70% | Th. Geyer | 2270 | |
| Forceps curved | S&T | 00284 | |
| Forceps fine | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Forceps standard | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| Gross Anatomy Probe | Fine Science Tools | 10088-15 | |
| Hair clipper | WAHL | 8786-451A ARCO SE | |
| High temperature cautery kit | Bovie | 18010-00 | |
| ISOFLURANE | Henry Schein Animal Health | 029405 | |
| IV Catheter 20G | B. Braun | 603028 | |
| Mini-Goldstein Retractor | Fine Science Tools | 17002-02 | |
| NaCl 0.9% | B.Braun | PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160 | saline |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12075-14 | |
| Needle Holder, Curved | Harvard Apparatus | 72-0146 | |
| Novaminsulfon | Ratiopharm | PZN 03530402 | Metamizole |
| Operating Board | Braintree Scientific | 39OP | |
| Replaceable Fine Tip | Bovie | H101 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Small Animal Ventilator | Kent Scientific | RV-01 | |
| Spring Scissors - Angled to Side | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Surgical microscope | Leica | M651 | |
| Transpore Surgical Tape | 3M | 1527-1 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15400-12 | |
| Vaporizer | Kent Scientific | VetFlo-1205S |
References
- Writing Group. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 38-360 (2016).
- de Alencar Neto, J. N. Morphine, Oxygen, Nitrates, and Mortality Reducing Pharmacological Treatment for Acute Coronary Syndrome: An Evidence-based Review. Cureus. 10 (1), 2114 (2018).
- Detry, J. M. The pathophysiology of myocardial ischaemia. European Heart Journal. 17, Suppl G 48-52 (1996).
- Ertl, G., Frantz, S. Healing after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 66 (1), 22-32 (2005).
- Jugdutt, B. I. Ventricular remodeling after infarction and the extracellular collagen matrix: when is enough enough. Circulation. 108 (11), 1395-1403 (2003).
- Velagaleti, R. S., Vasan, R. S. Heart failure in the twenty-first century: is it a coronary artery disease or hypertension problem. Cardiology Clinics. 25 (4), 487-495 (2007).
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135 (10), 146-603 (2017).
- Morrissey, P. J., et al. A novel method of standardized myocardial infarction in aged rabbits. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (5), 959-967 (2017).
- Degabriele, N. M., et al. Critical appraisal of the mouse model of myocardial infarction. Experimental Physiology. 89 (4), 497-505 (2004).
- Chen, J., Ceholski, D. K., Liang, L., Fish, K., Hajjar, R. J. Variability in coronary artery anatomy affects consistency of cardiac damage after myocardial infarction in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 313 (2), 275-282 (2017).
- Reichert, K., et al. Murine Left Anterior Descending (LAD) Coronary Artery Ligation: An Improved and Simplified Model for Myocardial Infarction. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (122), e55353 (2017).
- Kim, S. C., et al. A murine closed-chest model of myocardial ischemia and reperfusion. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (65), e3896 (2012).
- Antonio, E. L., et al. Left ventricle radio-frequency ablation in the rat: a new model of heart failure due to myocardial infarction homogeneous in size and low in mortality. J Card Fail. 15 (6), 540-548 (2009).
- Ovsepyan, A. A., et al. Modeling myocardial infarction in mice: methodology, monitoring, pathomorphology. Acta Naturae. 3 (1), 107-115 (2011).
- Ciulla, M. M., et al. Left ventricular remodeling after experimental myocardial cryoinjury in rats. Journal of Surgical Research. 116 (1), 91-97 (2004).
- Grisel, P., et al. The MRL mouse repairs both cryogenic and ischemic myocardial infarcts with scar. Cardiovascular Pathology. 17 (1), 14-22 (2008).
- Duerr, G. D., et al. Comparison of myocardial remodeling between cryoinfarction and reperfused infarction in mice. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 961298 (2011).
- Ma, N., et al. Intramyocardial delivery of human CD133+ cells in a SCID mouse cryoinjury model: Bone marrow vs. cord blood-derived cells. Cardiovascular Research. 71 (1), 158-169 (2006).
- Takagawa, J., et al. Myocardial infarct size measurement in the mouse chronic infarction model: comparison of area- and length-based approaches. Journal of Applied Physiology (1985). 102 (6), 2104-2111 (2007).
- van den Bos, E. J., Mees, B. M., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: a comparison with coronary artery ligation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (3), 1291-1300 (2005).
