Summary
Denne artikkelen demonstrerer en modell for å studere CARDIAC remodeling etter hjerteinfarkt cryoinjury i mus.
Abstract
Bruken av dyremodeller er avgjørende for å utvikle nye terapeutiske strategier for akutt koronar syndrom og dens komplikasjoner. I denne artikkelen viser vi en murine cryoinjury infarkt modell som genererer presise infarkt størrelser med høy reproduserbarhet og replicability. I korte trekk, etter intubering og sternotomy av dyret, blir hjertet løftet fra thorax. Sonden av en håndholdt flytende nitrogen leveringssystem påføres på hjerteinfarkt veggen for å indusere cryoinjury. Nedsatt ventrikkel funksjon og elektrisk ledning kan overvåkes med ekkokardiografi eller optisk kartlegging. Transmuralt hjerteinfarkt remodeling av infarcted området er preget av kollagen deponering og tap av cardiomyocytes. Sammenlignet med andre modeller (f. eks LAD-ligation), denne modellen benytter en håndholdt flytende nitrogen leveringssystem for å generere mer ensartet infarkt størrelser.
Introduction
Akutt koronar syndrom (ACS) er de viktigste årsakene til dødsfall i den vestlige verden1,2. Akutt okklusjon av koronar arterier fører til aktivering av iskemiske Cascade og nekrose av berørte CARDIAC tissue3. Skadet myokard blir gradvis erstattet av ikke-kontraktile arrvev, som manifestz klinisk som en hjertesvikt4,5. Til tross for nylige fremskritt i behandling av ACS, er utbredelsen av ACS og ACS-relatert hjertesvikt stigende, og terapeutiske alternativer er begrenset6,7. Derfor utvikler dyremodeller å studere ACS og dens komplikasjoner er av enorm interesse.
Hittil er den mest brukte dyremodell for å studere ACS og ACS-indusert hjerteinfarkt remodeling ligation av den venstre synkende koronar arterie (LAD). Ligation av LAD fører til akutte iskemi i myokard, ligner menneskelig hjerteinfarkt vev under ACS. Imidlertid forblir inkonsekvent infarkt størrelser Achilles ' hæl av LAD ligation. Kirurgisk variasjon og anatomisk variasjon av gutten fører til inkonsekvente infarkt størrelser og hindrer reproduserbarhet og replicability i denne prosedyren8,9,10. I tillegg har LAD ligation en høyt intra-og postoperative dødelighet. Til tross for nylige bestrebelser for å forbedre reproduserbarhet og redusere dødelighet11,12, er et stort antall dyr fortsatt nødvendig for å riktig vurdere anti-remodeling terapier.
Alternative modeller av ACS har blitt foreslått og studert i løpet av de siste årene, inkludert Radio-frekvens13, termisk14 eller kryogene skader15,16,17,18. Nåværende cryoinjury metoder bruke en metall stang pre-avkjølt i flytende nitrogen å skade motivet ' s CARDIAC tissue15,16. Denne prosedyren må imidlertid gjentas flere ganger for å generere en tilstrekkelig infarkt størrelse. På grunn av høy ledningsevne og lav varmekapasitet av stangen i forhold til vevet, varmes sonden raskt, og vevet er avkjølt (og dermed infarcted) heterogeneously. For å overkomme disse begrensningene beskriver vi her en cryoinfarction modell som bruker et håndholdt flytende nitrogen leveringssystem. Denne modellen er reproduserbar, enkel å utføre og kan etableres raskt og pålitelig. En reproduserbar transmuralt infarkt lesjon, uavhengig av koronar anatomi, genereres, som til slutt fører til hjertesvikt. Denne metoden er spesielt egnet til å studere remodeling prosessen for evaluering av romanen terapeutiske farmakologiske og vev engineering-baserte strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyr mottatt Human omsorg i samsvar med guide for prinsipper for laboratorium dyr, utarbeidet av Institutt for laboratorium Animal Resources, og utgitt av National Institutes of Health. Alle dyr protokoller ble godkjent av ansvarlig lokal myndighet (University of California San Francisco (UCSF) institusjonelle Animal Care og use Committee).
1. Animal omsorg
- Skaff mus i en alder av 14 uker som veier ca 27 g (f. eks, fra instituttet for Laboratoriedyr).
Merk: BALB/c-mus brukes for denne artikkelen. - Hold mus under konvensjonelle forhold i ventilerte skap, fôring dem standard mus Chow og autoklaveres vann ad lib.
2. mus forberedelse
- Bruk en induksjon kammer å dop mus med isoflurane (3,5%).
- Fjern håret over brystet og nakken ved hjelp av en hår trimmer.
- Plasser musen i liggende posisjon på en oppvarmet pute og opprettholde anestesi med en ansiktsmaske som dekker munnen og nesen på musen.
- Sjekk for tilstrekkelig dybde av anestesi ved å klemme bak føttene og halen for å verifisere et fravær av reflekser.
- Injiser subkutan buprenorfin (0,03 mg/kg) for analgesi.
- Spre hind og forgrunnen lemmer og fikse sin posisjon ved hjelp av tape.
- Med povidon jod, desinfisere barberte området, etterfulgt av skrubbe med 80% etanol. Gjenta dette trinnet to ganger.
- Bruk en liten saks til å lage en midtlinjen huden snitt fra den nedre tredjedel av brystbenet til haken.
- Bruk buet tang og forsiktig skille musklene rundt halsen for å avdekke luftrøret.
- Bruk en mikro-saks for å utføre en tracheotomy mellom andre og tredje brusk ringer.
- Sett ventilatoren på en ventilasjons frekvens på 110/min med et tidevanns volum på 0,5 mL.
- Fjern ansiktsmaske og sett inn en plast kanyle (20 G), koblet til ventilatoren, i luftrøret. Ventiler dyret.
Merk: Sørg for at ventilasjons kanyle ikke er satt inn for dypt ved å bekrefte bilateral lunge ventilasjon. - Bruk cauterization å løsne høyre pectoralis muskelen fra sin sternal opprinnelse mellom den tredje og syvende ribbeina.
- Bruk side vinklet fjær saks for å kutte den fjerde til sjette ribbeina så nært som mulig til brystbenet.
- Cauterize melke arterien, hvis blødning er synlig.
- Reduser isoflurane til 2,5%.
- Analysere underliggende bindevev for å få et klart syn inn i brystet hulrom.
- Bruk stump tang for å åpne pericardium og utsett hjertet.
- Bruk en mini Goldstein retractor å spre ribbeina og holde brystet hulrom åpen.
- Løft hjertet fra bryst hulen med en stump stang.
- Reduser spenningen i retractor for å redusere bryst åpningen og for å hindre at hjertet faller tilbake.
- Forkjøle cryoprobe (3 mm diameter) i 10 s.
- Påfør cryoprobe på fremre venstre ventrikkel veggen og fryse i 10 s for å generere en venstre ventrikkel fryse-skade infarkt.
Merk: cryoprobe kan påføres på forskjellige hjerte vegger, avhengig av det vitenskapelige spørsmålet og behovet. - Skyll cryoprobe med romtemperatur saltvann for å løsne sonden fra venstre ventrikkel vegg.
- Bruk retractor for å forstørre bryst åpningen.
- Vend forsiktig hjertet mot bryst hulen med en stump stang.
- Fjern retractor og koble sternotomy med en enkelt knute ved hjelp av 6-0 Sutur.
- Lukk brystet hulrom med 6-0 kjører Sutur. Bruk en sprøyte på 10 mL for å evakuere eventuell gjenværende luft fra brystet før du knytter knuten.
- Tilpass huden ved caudal kant og Sutur den til det punktet av tracheal åpning med rennende Sutur (5-0).
- Sett isoflurane til 1,5% og vent til dyret gevinster spontan pusting.
- Fjern tracheal kateteret og påfør ansiktsmaske på dyret munn og nese for å opprettholde anestesi.
- Lukk tracheal snitt med en 8-0 Sutur.
- Omplasser den ventrale nakkemusklene tilbake til sin posisjon til å dekke luftrøret.
- Fullfør hudens Sutur.
- Legg metamizol til drikkevannet (50 mg metamizol per 100 mL) for smerte analgesi i 3 dager og Overvåk dyret daglig.
Merk: observasjonsperioden for denne modellen er 8 uker. Sørg for å følge institusjonens retningslinjer angående analgesi regime.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den cryoinjury infarkt modellen er egnet til å studere ACS og dens komplikasjoner. Lav dødelighet og effektiv postoperative utvinning er sett i denne modellen. Cryoinjury indusert hjerteinfarkt skade fører til redusert hjertefunksjon, elektriske frakobling, og transmuralt remodeling.
Ekkokardiografi kan brukes til å overvåke hjertefunksjon invasivt in vivo. I fryse-skadde hjerter, ekkokardiografi demonstrerer betydelig redusert utstøting brøk og Brøkdelen endring (figur 1a-c). Funksjonshemming fortsetter fra dag 7 etter operasjonen til observasjons endepunkt på 56 dager.
Detaljert hjertefunksjon kan vurderes invasivt gjennom trykk volum sløyfe (PV-loop) analyse. En 1,2 fr konduktans kateter innføres i venstre ventrikkel, og venstre ventrikkel trykket er plottet mot venstre ventrikkel volum. Hemodynamisk parametre som Slagvolum, slag arbeid, CARDIAC output, og Forhåndslast-justert maksimal effekt kan beregnes. Som vist i figur 1d-h, cryoinfarction fører til nedsatt venstre ventrikkel (LV0 funksjon, som gjenspeiles som en reduksjon i Slagvolum, hjerneslag, CARDIAC output og Forhåndslasting-justert maksimal effekt.
For å studere CARDIAC elektrofysiologi, optisk kartlegging kan utføres ex vivo. Hjerter fjernes, perfusert med Langendorff, og beiset med et fluorescerende spennings følsomt fargestoff. Cryoinjured hjerter demonstrere blokkering av elektrisk ledning på grensen av skade, indikerer lokale elektriske frakobling (figur 1i).
Histologiske farging med Masson ' s trichrome demonstrerer transmuralt antifibrotiske vev formasjon på ulykkesstedet (figur 2a). Infarkt størrelse kan beregnes ved å måle infarkt arr området eller midtlinjen arr lengde19 (figur 2b). Immunofluorescence farging mot Alpha-sarcomeric actinin (cardiomyocyte markør) og kollagen-jeg bekrefter antifibrotiske remodeling og tap av cardiomyocytes på stedet av skade (figur 2c).
Figur 1 : Funksjonell og elektrofysiologisk analyse av cryoinjured hjerte. Representative todimensjonale ekkokardiografi bilder tatt pre-operativt (D0) og på postoperativ dag 7 (D7), 28 (D28) og 56 (D56). (a) den øverste panelet viser parasternal lang-akse-visning ved ende-diastolen og den nederste panelet på slutten-Systolen. (b, c) Utstøting brøk (EF) og delvis areal Change (FAC) nedgang etter fryse infarkt og forble redusert over tid CARDIAC funksjonen ble vurdert invasivt av trykk volum kurve analyse. (d-g) Dag 56 innlegg skade Slagvolum (SV), slag arbeid (SW), CARDIAC output (CO), og Forhåndslasting justert maksimal effekt (PAMP) var betydelig lavere enn i pre-operative innfødte dyr. (h) representative PV-looper fra innfødte og 56 dager etter kirurgi dyr viste karakteristiske høyre SKIFT og nedgang i amplitude av trykk signalet følgende bryst vena cava (TVC) okklusjon. (i) Isochrone kartet av CARDIAC optiske kartlegging fra native og cryoinjured hjerter 14 dager etter operasjonen. Topp og bunn paneler viser hjerter tempoet fra Apex og base, henholdsvis. Infarkt området er merket med stiplet hvit linje. Gruppe forskjeller ble vurdert av enveis analyse av varians (ANOVA) med Bonferroni ' s post-hoc-test eller student t-test. N = 3 dyr. * indikerer p < 0,05. Feilfeltene representerer standardavviket (SD). ESPVR = ende-systolisk trykk Volumforholdet; EDPVR = forholdet mellom diastolisk trykk volum. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Histologic vurdering av innfødte og fryse-skadde hjerter. (a) Masson ' s trichrome farging viser kollagen deponering (grønn) i infarcted området. Infarcted prosent av venstre ventrikkel ble målt som (b) areal og (c) midtlinjen infarkt lengde. (d) Immunofluorescence farging demonstrerer økt kollagen-i deponering med samtidig tap av cardiomyocytes i infarcted området. LV = venstre ventrikkel; RV = høyre ventrikkel; Endo = endocardial; Epi = epicardial. N = 3 dyr. Feilfelt viser SD. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikkelen beskriver en mus cryoinjury modell for å undersøke ACS og beslektede farmakologiske og terapeutiske alternativer.
Det mest avgjørende trinnet er anvendelsen av cryoprobe på CARDIAC vev. Kontaktvarigheten må være strengt kontrollert for å oppnå optimal infarkt størrelse og for å garantere reproduserbar resultat. Langvarig kjøling av myokard vil føre til overdimensjonert infarkter eller ventrikkel perforering. I kontrast, forkortet kjøle tiden genererer begrenset epicardial lesjoner og eliminerer ikke alle bosatt celler. Derfor kan dette være forvirrende når man studerer regenererende celle transplantasjon.
Sammenlignet med andre cryoinfarction metoder20, den åpne brystet tilnærmingen beskrevet i denne artikkelen har den fordelen at infarkt kan bli indusert fritt på ulike posisjoner i hjertet. Videre gjør denne tilnærmingen forenkler terapeutisk celle injeksjon eller patch programmer, som infarkt grensen er synlig, og stedet for celle transplantasjon kan velges tilsvarende.
En ulempe med denne modellen er etiologi av hjerteinfarkt skade. Cryoinjury resulterer i celle død på grunn av generering av iskrystaller forstyrre cellemembranen i stedet for en direkte iskemi. I tillegg er retningen av skaden vanligvis fra epicardium innover, mens iskemiske infarkter tendens til å spre utover fra endocardial til epicardial laget. Derfor er denne modellen begrenset til å studere patofysiologiske mekanismer av hjerteinfarkt iskemi eller å imitere iskemi-reperfusion innstillingen.
Som konklusjon, modellen er beskrevet her er billig, enkel å utføre, kan etableres raskt og pålitelig. Cardiomyocyte nekrose og påfølgende arrdannelse utvikles over tid, noe som resulterer i nedsatt pumpe funksjon og elektriske konduktans. Godt kontrollerbar infarkt størrelse, form og plassering gjør denne modellen ideell til å evaluere eksperimentelle intervensjoner som tar sikte på å gjenopprette hjertefunksjon eller hjerte gjenfødelse. Vellykket testet behandlingstilbud bør bekreftes ytterligere i store dyrestudier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Christiane Pahrmann for hennes tekniske assistanse. D.W. ble støttet av Max Kade Foundation. T.D. fikk tilskudd fra Else Kröner Fondation (2012_EKES. 04) og Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE2133/2 -1 _. S. S. mottatt forskningsstipend fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; SCHR992/3-1, SCHR992/4-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 ml Syringe | Thermo Scientific | 03-377-23 | |
| 5-0 prolene suture | Ethicon | EH7229H | |
| 6-0 prolene suture | Ethicon | 8706H | |
| 8-0 Ethilon suture | Ethicon | 2808G | |
| Absorption Spears | Fine Science Tools | 18105-01 | |
| BALB/c | The Jackson Laboratory | Stock number 000651 | |
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer | 1578675 | Eye ointment |
| Betadine Solution | Betadine Purdue Pharma | NDC:67618-152 | |
| Blunt Forceps | Fine Science Tools | 18025-10 | |
| Buprenex | Reckitt Benckiser | NDC Codes: 12496-0757-1, 12496-0757-5 | Buprenorphine |
| Cryoprobe 3mm | Brymill Cryogenic Systems | Cry-AC-3 B-800 | |
| Ethanol 70% | Th. Geyer | 2270 | |
| Forceps curved | S&T | 00284 | |
| Forceps fine | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Forceps standard | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| Gross Anatomy Probe | Fine Science Tools | 10088-15 | |
| Hair clipper | WAHL | 8786-451A ARCO SE | |
| High temperature cautery kit | Bovie | 18010-00 | |
| ISOFLURANE | Henry Schein Animal Health | 029405 | |
| IV Catheter 20G | B. Braun | 603028 | |
| Mini-Goldstein Retractor | Fine Science Tools | 17002-02 | |
| NaCl 0.9% | B.Braun | PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160 | saline |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12075-14 | |
| Needle Holder, Curved | Harvard Apparatus | 72-0146 | |
| Novaminsulfon | Ratiopharm | PZN 03530402 | Metamizole |
| Operating Board | Braintree Scientific | 39OP | |
| Replaceable Fine Tip | Bovie | H101 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Small Animal Ventilator | Kent Scientific | RV-01 | |
| Spring Scissors - Angled to Side | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Surgical microscope | Leica | M651 | |
| Transpore Surgical Tape | 3M | 1527-1 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15400-12 | |
| Vaporizer | Kent Scientific | VetFlo-1205S |
References
- Writing Group. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 38-360 (2016).
- de Alencar Neto, J. N. Morphine, Oxygen, Nitrates, and Mortality Reducing Pharmacological Treatment for Acute Coronary Syndrome: An Evidence-based Review. Cureus. 10 (1), 2114 (2018).
- Detry, J. M.
- Ertl, G., Frantz, S.
- Jugdutt, B. I. Ventricular remodeling after infarction and the extracellular collagen matrix: when is enough enough. Circulation. 108 (11), 1395-1403 (2003).
- Velagaleti, R. S., Vasan, R. S. Heart failure in the twenty-first century: is it a coronary artery disease or hypertension problem. Cardiology Clinics. 25 (4), 487-495 (2007).
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135 (10), 146-603 (2017).
- Morrissey, P. J., et al. A novel method of standardized myocardial infarction in aged rabbits. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (5), 959-967 (2017).
- Degabriele, N. M., et al. Critical appraisal of the mouse model of myocardial infarction. Experimental Physiology. 89 (4), 497-505 (2004).
- Chen, J., Ceholski, D. K., Liang, L., Fish, K., Hajjar, R. J. Variability in coronary artery anatomy affects consistency of cardiac damage after myocardial infarction in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 313 (2), 275-282 (2017).
- Reichert, K., et al. Murine Left Anterior Descending (LAD) Coronary Artery Ligation: An Improved and Simplified Model for Myocardial Infarction. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (122), e55353 (2017).
- Kim, S. C., et al. A murine closed-chest model of myocardial ischemia and reperfusion. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (65), e3896 (2012).
- Antonio, E. L., et al. Left ventricle radio-frequency ablation in the rat: a new model of heart failure due to myocardial infarction homogeneous in size and low in mortality. J Card Fail. 15 (6), 540-548 (2009).
- Ovsepyan, A. A., et al. Modeling myocardial infarction in mice: methodology, monitoring, pathomorphology. Acta Naturae. 3 (1), 107-115 (2011).
- Ciulla, M. M., et al. Left ventricular remodeling after experimental myocardial cryoinjury in rats. Journal of Surgical Research. 116 (1), 91-97 (2004).
- Grisel, P., et al. The MRL mouse repairs both cryogenic and ischemic myocardial infarcts with scar. Cardiovascular Pathology. 17 (1), 14-22 (2008).
- Duerr, G. D., et al. Comparison of myocardial remodeling between cryoinfarction and reperfused infarction in mice. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 961298 (2011).
- Ma, N., et al. Intramyocardial delivery of human CD133+ cells in a SCID mouse cryoinjury model: Bone marrow vs. cord blood-derived cells. Cardiovascular Research. 71 (1), 158-169 (2006).
- Takagawa, J., et al. Myocardial infarct size measurement in the mouse chronic infarction model: comparison of area- and length-based approaches. Journal of Applied Physiology (1985). 102 (6), 2104-2111 (2007).
- van den Bos, E. J., Mees, B. M., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: a comparison with coronary artery ligation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (3), 1291-1300 (2005).
