Summary
Este artículo demuestra un modelo para estudiar la remodelación cardíaca después de la criolesión miocárdica en ratones.
Abstract
El uso de modelos animales es esencial para desarrollar nuevas estrategias terapéuticas para el síndrome coronario agudo y sus complicaciones. En este artículo, demostramos un modelo de infarto de criolesión murinos que genera tamaños de infarto precisos con alta reproducibilidad y replicabilidad. En resumen, después de la intubación y la esternotomía del animal, el corazón se levanta del tórax. La sonda de un sistema de administración de nitrógeno líquido portátil se aplica sobre la pared miocárdica para inducir la criolesión. La función ventricular deteriorada y la conducción eléctrica se pueden controlar con ecocardiografía o mapeo óptico. La remodelación miocárdica transmural de la zona infartada se caracteriza por la deposición de colágeno y la pérdida de cardiomiocitos. En comparación con otros modelos (por ejemplo, LAD-ligation), este modelo utiliza un sistema de entrega de nitrógeno líquido portátil para generar tamaños de infarto más uniformes.
Introduction
El síndrome coronario agudo (SCA) es la principal causa de muerte en el mundo occidental1,2. La oclusión aguda de las arterias coronarias conduce a la activación de la cascada isquémica y la necrosis del tejido cardíaco afectado3. El miocardio dañado se sustituye gradualmente por tejido cicatricial no contrácteo, que se manifiesta clínicamente como una insuficiencia cardíaca4,5. A pesar de los recientes avances en el tratamiento de la SCA, la prevalencia de la insuficiencia cardíaca relacionada con la SCA y la SCA está aumentando, y las opciones terapéuticas son limitadas6,7. Por lo tanto, el desarrollo de modelos animales para estudiar ACS y sus complicaciones son de inmenso interés.
Hasta la fecha, el modelo animal más utilizado para estudiar la remodelación miocárdica inducida por ACS y ACS es la ligadura de la arteria coronaria descendente izquierda (LAD). La ligadura del LAD conduce a la isquemia aguda del miocardio, similar al tejido miocárdico humano durante el SCA. Sin embargo, los tamaños infartos inconsistentes siguen siendo el talón de Aquiles de la ligadura LAD. La variación quirúrgica y la variabilidad anatómica del LAD conducen a tamaños infartos inconsistentes y dificultan la reproducibilidad y replicabilidad de este procedimiento8,9,10. Además, la ligadura laD tiene una alta mortalidad intra y postquirúrgica. A pesar de los esfuerzos recientes para mejorar la reproducibilidad y reducir la mortalidad11,12, todavía se necesitan un gran número de animales para evaluar adecuadamente las terapias anti-remodelación.
En los últimos años se han propuesto y estudiado modelos alternativos de ACS, incluyendo radiofrecuencia13,14 térmicas o lesiones criogénicas15,16,17,18. Los métodos actuales de criolesiones aplican una varilla metálica preenfriada en nitrógeno líquido para dañar el tejido cardíaco del sujeto15,16. Sin embargo, este procedimiento debe repetirse varias veces para generar un tamaño de infarto suficiente. Debido a la alta conductividad y baja capacidad de calor de la varilla en comparación con el tejido, la sonda se calienta rápidamente, y el tejido se enfría (y por lo tanto infarta) heterogéneamente. Para superar estas limitaciones, aquí describimos un modelo de crioinfarción utilizando un sistema de entrega de nitrógeno líquido de mano. Este modelo es reproducible, fácil de realizar y se puede establecer de forma rápida y fiable. Se genera una lesión infarto transmural reproducible independiente de la anatomía coronaria, que eventualmente conduce a una insuficiencia cardíaca. Este método es especialmente adecuado para estudiar el proceso de remodelación para la evaluación de nuevas estrategias terapéuticas farmacológicas y basadas en la ingeniería de tejidos.
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Protocol
Los animales recibieron atención humana de conformidad con la Guía para los Principios de los Animales de Laboratorio, preparada por el Instituto de Recursos Animales de Laboratorio, y publicada por los Institutos Nacionales de Salud. Todos los protocolos de animales fueron aprobados por la autoridad local responsable (el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California en San Francisco (UCSF).
1. Cuidado de animales
- Obtener ratones a la edad de 14 semanas con un peso aproximado de 27 g (por ejemplo, del Instituto de Animales de Laboratorio).
NOTA: Los ratones BALB/c se utilizan para este artículo. - Mantenga a los ratones en condiciones convencionales en armarios ventilados, alimentándolos con la comida estándar de ratones y agua autoclave ad libitum.
2. Preparación del ratón
- Utilice una cámara de inducción para anestesiar el ratón con isoflurano (3,5%).
- Retire el pelo sobre el pecho y el cuello usando una recortadora de pelo.
- Coloque el ratón en posición supina sobre una almohadilla calentada y mantenga la anestesia con una máscara facial que cubre la boca y la nariz del ratón.
- Compruebe la profundidad suficiente de la anestesia pellizcando los pies traseros y la cola para verificar la ausencia de reflejos.
- Inyectar buprenorfina subcutánea (0,03 mg/kg) para analgesia.
- Extienda las extremidades traseras y delanteras y fije su posición con cinta adhesiva.
- Con yodo de povidona, desinfecte la zona de afeitado, seguido de fregar con 80% de etanol. Repita este paso dos veces.
- Usa una tijera pequeña para hacer una incisión de la piel de la línea media desde el tercio inferior del esternón hasta la barbilla.
- Usa fórceps curvos y separa cuidadosamente los músculos alrededor del cuello para exponer la tráquea.
- Utilice una microtijera para realizar una traqueotomía entre el segundo y el tercer anillo de cartílago.
- Ajuste el ventilador a una frecuencia de ventilación de 110/min con un volumen de marea de 0,5 ml.
- Retire la mascarilla e inserte una cánula de plástico (20 G), conectada al respirador, en la tráquea. Ventilar al animal.
NOTA: Asegúrese de que la cánula de ventilación no esté demasiado profunda confirmando la ventilación pulmonar bilateral. - Usa cautery para separar el músculo pectoral derecho de su origen esternal entre la tercera y la séptima costilla.
- Utilice tijeras de resorte en ángulo lateral para cortar las costillas cuarta a sexta lo más cerca posible del esternón.
- Cauterizar la arteriamamaria, si el sangrado es visible.
- Disminuir el isoflurano al 2,5%.
- Diseccionar el tejido conectivo subyacente para obtener una visión clara de la cavidad torácica.
- Use fórceps contundentes para abrir el pericardio y exponer el corazón.
- Usa un mini retractor Goldstein para esparcir las costillas y mantener la cavidad torácica abierta.
- Levante el corazón de la cavidad torácica con una varilla contundente.
- Disminuir la tensión del retractor para reducir la abertura torácica y evitar que el corazón se caiga hacia atrás.
- Preenfriar la criosonda (3 mm de diámetro) durante 10 s.
- Aplique la criosonda en la pared anterior del ventrículo izquierdo y congele durante 10 s para generar un infarto de criolesión ventricular izquierda.
NOTA: La criosonda se puede aplicar a diferentes paredes del corazón dependiendo de la pregunta científica y la necesidad. - Irrigar la criosonda con salina a temperatura ambiente para separar la sonda de la pared ventricular izquierda.
- Utilice el retractor para agrandar la abertura torácica.
- Devuelva suavemente el corazón a la cavidad torácica con una varilla contundente.
- Retire el retractor y conecte la esternotomía con un solo nudo usando sutura 6-0.
- Cierre la cavidad torácica con sutura de carrera 6-0. Utilice una jeringa de 10 ml para evacuar el aire restante del pecho antes de atar el nudo.
- Adaptar la piel en el borde caudal y suturarla hasta el punto de la abertura traqueal con sutura de carrera (5-0).
- Establezca isoflurano en 1,5% y espere hasta que el animal gane respiración espontánea.
- Retire el catéter traqueal y vuelva a aplicar la mascarilla en la boca y la nariz del animal para mantener la anestesia.
- Cierre la incisión traqueal con un 8-0 Sutura.
- Vuelva a colocar los músculos ventrales del cuello a su posición para cubrir la tráquea.
- Completa la sutura de la piel.
- Añadir metamizol al agua potable (50 mg de metamizole por 100 ml) para la analgesia del dolor durante 3 días y controlar al animal diariamente.
NOTA: El período de observación de este modelo es de 8 semanas. Asegúrese de seguir las pautas de su institución con respecto al régimen de analgesia.
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Representative Results
El modelo infarto de criolesiones es adecuado para estudiar ACS y sus complicaciones. En este modelo se ven bajas tasas de mortalidad y una recuperación postquirúrgica eficiente. El daño miocárdico inducido por criolesiones reduce la función cardíaca, el desacoplamiento eléctrico y la remodelación transmural.
La ecocardiografía se puede utilizar para controlar la función cardíaca no invasivamente in vivo. En los corazones criolesionados, la ecocardiografía demuestra una reducción significativa de la fracción de eyección y el cambio de área fraccionaria(Figura 1a-c). El deterioro funcional continúa desde el día 7 después de la cirugía hasta el punto final observacional de 56 días.
La función cardíaca detallada se puede evaluar de forma invasiva mediante el análisis del bucle de volumen de presión (PV-loop). Se introduce un catéter de conductancia de 1,2 Fr en el ventrículo izquierdo, y la presión ventricular izquierda se traza contra el volumen ventricular izquierdo. Se pueden calcular parámetros hemodinámicos como el volumen de carrera, el trabajo de carrera, la salida cardíaca y la potencia máxima ajustada previaa a la carga. Como se muestra en la Figura 1d-h,la crioinfarción conduce a un ventrículo izquierdo deteriorado (función LV0, que se refleja como una disminución en el volumen de carrera, el trabajo de accidente cerebrovascular, la salida cardíaca y la potencia máxima ajustada a precarga.
Para estudiar la electrofisiología cardíaca, se puede realizar un mapeo óptico ex vivo. Los corazones se eliminan, se perfunden con la técnica de perfusión de Langendorff y se tiñen con un tinte fluorescente sensible al voltaje. Los corazones cryoinjured demuestran bloqueo de la conducción eléctrica en el borde de la lesión, lo que indica el desacoplamiento eléctrico local(Figura 1i).
La tinción histológica con tricromo de Masson demuestra la formación de tejido fibroso transmural en el lugar de la lesión(Figura 2a). El tamaño del infarto se puede calcular midiendo el área de la cicatriz del infarto o la longitud media de la cicatriz19 (Figura 2b). La tinción de inmunofluorescencia contra la actinina alfa- sarcomerica (marcador de cardiomiocitos) y el colágeno-Confirmo la remodelación fibrosa y la pérdida de cardiomiocitos en el lugar de la lesión (Figura 2c).
Figura 1 : Análisis funcional y electrofisiológico del corazón crioinoso. Imágenes representativas de ecocardiografía bidimensional tomadas preoperatoriamente (D0) y en el día 7 postoperatorio (D7), 28 (D28) y 56 (D56). (a) El panel superior muestra la vista parasternal del eje largo en la diastole final y el panel inferior en la sistole final. (b, c) La fracción de eyección (EF) y el cambio de área fraccionaria (FAC) disminuyen después de la crioinfarción y se mantuvieron disminuidas con el tiempo La función cardíaca se evaluó de forma invasiva mediante el análisis de la curva de volumen de presión. (d-g) El día 56 después del volumen de carrera por lesión (SV), el trabajo por accidente cerebrovascular (SW), la salida cardíaca (CO) y la potencia máxima ajustada a la precarga (PAMP) fueron significativamente más bajos que en los animales nativos preoperatorios. (h) Los bucles fotovoltaicos representativos de animales nativos y 56 días después de la cirugía mostraron un cambio derecho característico y una disminución en la amplitud de la señal de presión después de la oclusión de la vena coral torácica (TVC). (i) Mapa isocrone de mapeo óptico cardíaco de corazones nativos y crioincidos 14 días después de la cirugía. Los paneles superior e inferior muestran corazones a paso desde el ápice y la base, respectivamente. El área de infarto está marcada por una línea blanca discontinua. Las diferencias entre grupos se evaluaron mediante un análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) con la prueba post-hoc de Bonferroni o la prueba t-testdel estudiante. No 3 animales. * indica p < 0.05. Las barras de error representan la desviación estándar (SD). ESPVR - relación de volumen de presión sistólica final; EDPVR - relación de volumen de presión diastólica final. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Evaluación histológica de corazones nativos y crio-lesionados. (a) La tinción tricroma de Masson muestra la deposición de colágeno (verde) en el área infartada. El porcentaje infarto del ventrículo izquierdo se midió como (b) área y (c) longitud del infarto de línea media. (d) La tinción de inmunofluorescencia demuestra un aumento de la deposición de colágeno-I con pérdida concomitante de cardiomiocitos en el área infarte. LV - ventrículo izquierdo; RV - ventrículo derecho; endo - endocardial; epicardial. No 3 animales. Las barras de error muestran SD. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este artículo describe un modelo de criolesión de ratón para investigar ACS y opciones farmacológicas y terapéuticas relacionadas.
El paso más crucial es la aplicación de la criosonda en el tejido cardíaco. La duración del contacto debe estar estrechamente controlada para obtener el tamaño óptimo del infarto y garantizar resultados reproducibles. El enfriamiento prolongado del miocardio conducirá a infartos de gran tamaño o perforación ventricular. Por el contrario, el tiempo de enfriamiento acortado genera lesiones epicardiales limitadas y no elimina todas las células residentes. Por lo tanto, esto puede ser confundir cuando se estudia el trasplante de células regenerativas.
En comparación con otros métodos de crioinfarción20, el enfoque de pecho abierto descrito en este artículo tiene la ventaja de que el infarto puede ser inducido libremente en diferentes posiciones del corazón. Además, este enfoque facilita la inyección terapéutica de células o aplicaciones de parches, ya que el borde del infarto es visible, y el lugar del trasplante de células se puede elegir en consecuencia.
Un inconveniente de este modelo es la etiología de la lesión miocárdica. La criolesión resulta en la muerte celular debido a la generación de cristales de hielo que interrumpen la membrana celular en lugar de una isquemia directa. Además, la dirección de la lesión es generalmente de epicardium hacia adentro, mientras que los infartos isquémicos tienden a propagarse hacia afuera desde el endocardio a la capa epicardial. Por lo tanto, este modelo se limita a estudiar los mecanismos fisiopatológicos de la isquemia miocárdica o a imitar el entorno de isquemia-reperfusión.
En conclusión, el modelo descrito aquí es barato, fácil de realizar, se puede establecer de forma rápida y fiable. La necrosis de cardiomiocitos y la posterior formación de cicatrices se desarrollan con el tiempo, lo que resulta en una función progresiva de la bomba y una conductancia eléctrica. El tamaño, la forma y la ubicación del infarto bien controlable hacen que este modelo sea ideal para evaluar intervenciones experimentales destinadas a restaurar la función cardíaca o la regeneración cardíaca. Las opciones de tratamiento probadas con éxito deben confirmarse en estudios con animales grandes.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Christiane Pahrmann por su asistencia técnica. D.W. fue apoyado por la Fundación Max Kade. T.D. recibió subvenciones de la Fundación Else Kr'ner (2012_EKES.04) y de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE2133/2-1_. S. S. recibió becas de investigación de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; SCHR992/3- 1, SCHR992/4-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 ml Syringe | Thermo Scientific | 03-377-23 | |
| 5-0 prolene suture | Ethicon | EH7229H | |
| 6-0 prolene suture | Ethicon | 8706H | |
| 8-0 Ethilon suture | Ethicon | 2808G | |
| Absorption Spears | Fine Science Tools | 18105-01 | |
| BALB/c | The Jackson Laboratory | Stock number 000651 | |
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer | 1578675 | Eye ointment |
| Betadine Solution | Betadine Purdue Pharma | NDC:67618-152 | |
| Blunt Forceps | Fine Science Tools | 18025-10 | |
| Buprenex | Reckitt Benckiser | NDC Codes: 12496-0757-1, 12496-0757-5 | Buprenorphine |
| Cryoprobe 3mm | Brymill Cryogenic Systems | Cry-AC-3 B-800 | |
| Ethanol 70% | Th. Geyer | 2270 | |
| Forceps curved | S&T | 00284 | |
| Forceps fine | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Forceps standard | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| Gross Anatomy Probe | Fine Science Tools | 10088-15 | |
| Hair clipper | WAHL | 8786-451A ARCO SE | |
| High temperature cautery kit | Bovie | 18010-00 | |
| ISOFLURANE | Henry Schein Animal Health | 029405 | |
| IV Catheter 20G | B. Braun | 603028 | |
| Mini-Goldstein Retractor | Fine Science Tools | 17002-02 | |
| NaCl 0.9% | B.Braun | PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160 | saline |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12075-14 | |
| Needle Holder, Curved | Harvard Apparatus | 72-0146 | |
| Novaminsulfon | Ratiopharm | PZN 03530402 | Metamizole |
| Operating Board | Braintree Scientific | 39OP | |
| Replaceable Fine Tip | Bovie | H101 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Small Animal Ventilator | Kent Scientific | RV-01 | |
| Spring Scissors - Angled to Side | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Surgical microscope | Leica | M651 | |
| Transpore Surgical Tape | 3M | 1527-1 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15400-12 | |
| Vaporizer | Kent Scientific | VetFlo-1205S |
References
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