Summary
Bu makalede farelerde miyokardiyal kriyoyaralanma sonrası kardiyak remodeling çalışma modeli göstermektedir.
Abstract
Akut koroner sendrom ve komplikasyonları için yeni tedavi stratejileri geliştirmek için hayvan modellerinin kullanımı şarttır. Bu makalede, yüksek tekrarlanabilirlik ve replikalık ile hassas infarkt boyutları üreten bir murine kriyoyaralanma infarkt modeli göstermek. Kısacası, entübasyon ve sternotomi sonra hayvan, kalp toraks kaldırılır. El sıvı azot iletim sisteminin sondası kriyoyaralanmaya neden olmak için miyokard duvarına uygulanır. Bozulmuş ventrikül fonksiyonu ve elektrikiletimi ekokardiyografi veya optik haritalama ile izlenebilir. Enfarktüs lisanlı bölgenin transmural miyokardiyal remodeling kollajen birikimi ve kardiyomiyosit kaybı ile karakterizedir. Diğer modeller (örneğin, LAD-ligation) ile karşılaştırıldığında, bu model daha düzgün enfarktüs boyutları oluşturmak için bir el sıvı azot dağıtım sistemi kullanır.
Introduction
Akut koroner sendrom (ACS) Batı dünyasında ölüm önde gelen nedenleri1,2. Koroner arterlerin akut oklüzyonu etkilenen kardiyak dokunun iskemik kaskad ve nekroz aktivasyonuna yol açar3. Hasarlı miyokardiyum yavaş yavaş non-kontraktil skar dokusu ile değiştirilir, hangi klinik bir kalp yetmezliği olarak tezahür4,5. ACS tedavisinde son gelişmelere rağmen, ACS ve ACS ile ilgili kalp yetmezliği prevalansı artıyor, ve tedavi seçenekleri sınırlıdır6,7. Bu nedenle, ACS ve komplikasyonları incelemek için hayvan modelleri geliştirmek büyük ilgi vardır.
Bugüne kadar, ACS ve ACS kaynaklı miyokardiyal remodeling çalışma için en yaygın olarak kullanılan hayvan modeli sol inen koroner arter (LAD) ligasyonu. LAD'nin ligasyonu, ACS sırasında insan miyokard dokusuna benzer miyokardin akut iskemisine yol açar. Ancak, tutarsız infarkt boyutları LAD ligation Aşil 'topuk kalır. Cerrahi varyasyon ve LAD anatomik değişkenlik tutarsız infarkt boyutları yol ve bu işlemin tekrarlanabilirlik ve çoğaltılabilirlik engel8,9,10. Buna ek olarak, LAD ligasyonu yüksek intra- ve postcerrahi mortaliteye sahiptir. Tekrarlanabilirliği artırmak ve mortaliteyi azaltmak için son çabalara rağmen11,12, hayvanların çok sayıda hala düzgün anti-remodeling tedavileri değerlendirmek için gereklidir.
ACS alternatif modeller önerilmiştir ve radyofrekansı 13dahil olmak üzere son yıllarda incelenmiştir, termal14 veya kriyojenik yaralanmalar15,16,17,18. Mevcut kriyoyaralanma yöntemleri deneğin kardiyak dokusuna zarar vermek için sıvı nitrojen önceden soğutulmuş bir metal çubuk uygulamak15,16. Ancak, yeterli bir enfarktüs boyutu oluşturmak için bu yordamın birkaç kez tekrarlanması gerekir. Çubukun dokuya göre yüksek iletkenlik ve düşük ısı kapasitesi nedeniyle sonda hızlı bir şekilde ısınır ve doku soğutularak (ve böylece enfarktüse) heterojen olarak soğutulr. Bu sınırlamaları aşmak için, burada el sıvı azot dağıtım sistemi kullanan bir kriyoinfarktüs modeli açıklayınız. Bu model çoğaltılabilir, gerçekleştirmek kolay ve hızlı ve güvenilir kurulabilir. Koroner anatomiden bağımsız tekrarlanabilir transmural infarkt lezyonu oluşturulur ve bu da sonunda kalp yetmezliğine yol açar. Bu yöntem özellikle yeni terapötik farmakolojik ve doku mühendisliği tabanlı stratejilerin değerlendirilmesi için remodeling süreci çalışmak için uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanlar, Laboratuvar Hayvan Kaynakları Enstitüsü tarafından hazırlanan ve Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanları İlkeleri Rehberi'ne uygun olarak insancıl bakım almıştır. Tüm hayvan protokolleri sorumlu yerel otorite (University of California San Francisco (UCSF) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi) tarafından onaylanmıştır.
1. Hayvan bakımı
- Yaklaşık 27 g ağırlığında 14 haftalık fareler edinin (örn. Laboratuvar Hayvanları Enstitüsü'nden).
NOT: Bu makale için BALB/c fareleri kullanılmaktadır. - Havalandırılan dolaplarda geleneksel koşullar altında fareleri tutun, onları standart fare chow ve otoklavlı su reklam libitum besleme.
2. Fare hazırlama
- Fareyi isoflurane (%3.5) ile uyuşturulmak için bir indüksiyon odası kullanın.
- Bir saç düzeltici kullanarak göğüs ve boyun üzerinde saç çıkarın.
- Fareyi ısıtılmış bir ped üzerinde supine pozisyonunda yerleştirin ve farenin ağız ve burnunu kaplayan bir yüz maskesi ile anesteziyi koruyun.
- Reflekslerin eksikliğini doğrulamak için arka ayakları ve kuyruğu çimdikleyerek yeterli anestezi derinliği olup olmadığını kontrol edin.
- Analjezi için deri altı buprenorfin (0.03 mg/kg) enjekte edin.
- Arka ve ön uzuvları yayın ve teyp kullanarak konumlarını düzeltin.
- Povison iyot ile, tıraş alanı dezenfekte, % 80 etanol ile ovma izledi. Bu adımı iki kez tekrarlayın.
- Çene göğüs alt üçte bir orta hat deri kesi yapmak için küçük bir makas kullanın.
- Kavisli forceps kullanın ve dikkatle nefes borusu ortaya çıkarmak için boyun çevresindeki kasları ayırın.
- İkinci ve üçüncü kıkırdak halkaları arasında trakeotomi yapmak için bir mikro makas kullanın.
- Ventilatör, 0,5 mL'lik gelgit hacmiyle 110/dk'lık bir havalandırma frekansına ayarlayın.
- Yüz maskesini çıkarın ve solunum cihazına bağlı plastik bir kanül (20 G) trakeaya takın. Hayvanı havalandırın.
NOT: İkili akciğer ventilasyonunu onaylayarak ventilasyon kanülasyonunun çok derine takılmadığından emin olun. - Üçüncü ve yedinci kaburga arasında sternal kökenli sağ pektoralis kas ayırmak için cautery kullanın.
- Göğüs kafesine mümkün olduğunca yakın dördüncü altıncı kaburga kesmek için yan açılı bahar makası kullanın.
- Kanamagörülebilirse meme arterini kauterize edin.
- Isoflurane%2.5'e düşürün.
- Göğüs boşluğuna net bir görünüm elde etmek için altta yatan bağ dokusunu inceleyin.
- Perikard'ı açmak ve kalbi ortaya çıkarmak için künt çözgü kullanın.
- Kaburga yaymak ve göğüs boşluğu açık tutmak için bir mini Goldstein retraktör kullanın.
- Kalbi göğüs boşluğundan künt bir çubukla kaldırın.
- Göğüs açıklığını azaltmak ve kalbin geri düşmesini engellemek için retraktörün gerginliğini azaltın.
- Kriyoprobu (3 mm çapında) 10 s için önceden soğutun.
- Ön sol ventrikül duvarına kriyoprob uygulayın ve sol ventrikül kriyo-yaralanma enfarktüsü oluşturmak için 10 s dondurun.
NOT: Kriyoprob bilimsel soru ve ihtiyaca bağlı olarak farklı kalp duvarlarına uygulanabilir. - Sol ventrikül duvarından probu ayırmak için oda sıcaklığında tuzlu ile kriyoprob sulama.
- Göğüs açıklığı büyütmek için retraktörü kullanın.
- Kalbi künt bir çubukla göğüs boşluğuna yavaşça geri döndürün.
- Retraktörü çıkarın ve sternotomiyi 6-0 dikiş kullanarak tek bir düğümle bağlayın.
- 6-0 çalışan dikiş kullanarak göğüs boşluğu kapatın. Düğüm bağlamadan önce göğüsten kalan havayı boşaltmak için 10 mL'lik bir şırınga kullanın.
- Kaudal kenardaki deriyi uyarla ve çalışan sütürle trakeal açıklık noktasına dikin (5-0).
- Set isoflurane için 1.5% ve hayvan kendiliğinden nefes alana kadar bekleyin.
- Trakeal kateteri çıkarın ve anesteziyi sürdürmek için yüz maskesini hayvanın ağzına ve burnuna tekrar uygulayın.
- Trakeal kesiyi bir 8-0 ile kapatın Dikiş.
- Ventral boyun kaslarını nefes borusunu kapsayacak şekilde konumlarına geri döndürün.
- Deri dikişini tamamlayın.
- 3 gün boyunca ağrı analjezi için içme suyuna metamizole (100 mL başına 50 mg metamizole) ekleyin ve hayvangünlük izlemek.
NOT: Bu modelin gözlem süresi 8 haftadır. Analjezi rejimi ile ilgili kurumunuzun yönergelerine uyduğunuzdan emin olun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kriyoyaralanma enfarktüs modeli ACS ve komplikasyonlarını incelemek için uygundur. Bu modelde düşük mortalite oranları ve etkili cerrahi sonrası iyileşme görülmektedir. Kriyom neden li miyokardiyal hasar kardiyak fonksiyon azalmasına yol açar, elektriksel uncoupling, ve transmural remodeling.
Ekokardiyografi in vivo kardiyak fonksiyonu noninvaziv izlemek için kullanılabilir. Kriyo-yaralı kalplerde, ekokardiyografi önemli ölçüde azaltılmış ejeksiyon fraksiyonu ve fraksiyonel alan değişikliği gösterir(Şekil 1a-c). İşlevsel bozukluk ameliyat sonrası 7 günden 56 günlük gözlemsel bitiş noktasına kadar devam etmektedir.
Ayrıntılı kardiyak fonksiyon basınç hacmi döngüsü (PV-loop) analizi ile invaziv olarak değerlendirilebilir. Sol ventriküle 1.2 Fr iletken kateter, sol ventrikül basıncı ise sol ventrikül hacmine karşı çizilir. İnme hacmi, inme çalışması, kardiyak çıkış ve önceden ayarlanmış maksimal güç gibi hemodinamik parametreler hesaplanabilir. Şekil 1d-h'degösterildiği gibi, kriyoinfarction sol ventrikülün bozulmasına yol açar (LV0 fonksiyonu, inme hacminde azalma olarak yansıtılır, inme çalışması, kardiyak çıkış ve önceden yükayarlı maksimal güç.
Kardiyak elektrofizyolojiyi incelemek için optik haritalama ex vivo yapılabilir. Kalpler kaldırılır, Langendorff perfüzyon tekniği ile perfüzyon, ve floresan voltaj duyarlı boya ile boyanmış. Kriyoyaralı kalpler yaralanma sınırında elektrik iletiminin tıkanmış olduğunu göstererek, yerel elektrik ayrıştırmalarını gösterir (Şekil 1i).
Masson'un trikromile histolojik boyama yaralanma yerinde transmural fibrotik doku oluşumunu göstermektedir (Şekil 2a). Enfarktüs boyutu enfarktüs skar alanı veya orta hat yara uzunluğu19 (Şekil 2b)ölçülerek hesaplanabilir. İmmünofloresans alfa- sarkoerik aktin (kardiyomiyosit belirteci) ve kollajen-I fibrotik remodeling ve yaralanma yerinde kardiyomiyosit kaybı onaylamak karşı boyama(Şekil 2c).
Şekil 1 : Kriyoyaralı kalbin fonksiyonel ve elektrofizyolojik analizi. Ameliyat öncesi (D0) ve ameliyat sonrası 7 (D7), 28 (D28) ve 56 (D56) ile çekilen temsili iki boyutlu ekokardiyografi görüntüleri. (a) Üst panel, son diyastole'deki parasternal uzun eksen görünümünü ve son systole'deki alt paneli gösterir. (b, c) Kriyo-enfarktüs sonrası ejeksiyon fraksiyonu (EF) ve Fraksiyonel Alan Değişimi (FAC) azalması ve zamanla azalmış kardiyak fonksiyon basınç hacmi eğrisi analizi ile invaziv olarak değerlendirildi. (d-g) Gün 56 yaralanma sonrası inme hacmi (SV), inme çalışması (SW), kardiyak debi (CO) ve önceden ayarlanmış maksimal güç (PAMP) preoperatif yerli hayvanlara göre anlamlı olarak düşüktü. (h) Yerli ve ameliyat sonrası hayvanlardan gelen temsili PV-döngüler torasik vena kava (TVC) tıkanıklığı sonrasında basınç sinyalinin genliğinde karakteristik sağ kayma ve düşüş gösterdi. (i) Ameliyat sonrası 14 gün sonra yerli ve kriyoyaralı kalplerden kardiyak optik haritalamanın isochrone haritası. Üst ve alt paneller, sırasıyla tepe ve taban dan tempolu kalpleri göstermektedir. Enfarkt alanı kesik li beyaz çizgi ile işaretlenir. Grup içi farklılıklar, Bonferroni'nin Hoc sonrası testi veya Öğrenci t-testiile varyans (ANOVA) tek yönlü analizile değerlendirildi. N = 3 hayvan. * p < 0,05 gösterir. Hata çubukları standart sapmayı (SD) temsil eder. ESPVR = end-sistolik basınç hacmi ilişkisi; EDPVR = end-diyastolik basınç hacmi ilişkisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2 : Yerli ve kriyo yaralı kalplerin histolojik değerlendirmesi. (a) Masson'un trikrom boyama enfarktlı bölgede kollajen birikimini (yeşil) gösterir. Sol ventrikülin infarkt yüzdesi (b) alanı ve (c) orta hat enfarktüs uzunluğu olarak ölçüldü. (d) İmmünofloresan boyama, infarktlı bölgede kardiyomiyositlerin eşlik eden kaybı ile kollajen-I birikiminin arttığını göstermektedir. LV = sol ventrikül; RV = sağ ventrikül; endo = endokardiyal; epi = epikardiyal. N = 3 hayvan. Hata çubukları SD gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede, ACS ve ilgili farmakolojik ve tedavi seçeneklerini araştırmak için bir fare kriyoinjury modeli açıklanmaktadır.
En önemli adım kardiyak doku üzerinde kriyoprob uygulamasıdır. En uygun enfarktüs boyutunu elde etmek ve tekrarlanabilir sonuçları garanti etmek için temas süresi sıkı bir şekilde kontrol edilmelidir. Miyokardiumuzun uzun süre soğutulması büyük boy enfarktlara veya ventriküler perforasyona yol açacaktır. Buna karşılık, kısaltılmış soğutma süresi sınırlı epikardiyal lezyonlar oluşturur ve tüm yerleşik hücreleri ortadan kaldırmaz. Bu nedenle, bu rejeneratif hücre nakli okurken kafa karıştırıcı olabilir.
Diğer kriyoinfarction yöntemleri ile karşılaştırıldığında20, Bu makalede açıklanan açık göğüs yaklaşımı enfarktüs kalbin farklı pozisyonlarda serbestçe indüklenebilir avantajı vardır. Ayrıca, infarkt sınırı görünür olduğundan ve hücre nakli nin yapıldığı yer buna göre seçilebildiğinden, bu yaklaşım terapötik hücre enjeksiyonu veya yama uygulamalarını kolaylaştırır.
Bu modelin bir dezavantajı miyokardiyal yaralanma etiyolojisi. Kriyoyaralanma, doğrudan iskemi yerine hücre zarını bozan buz kristallerinin oluşmasına bağlı olarak hücre ölümüyle sonuçlanır. Buna ek olarak, yaralanma yönü genellikle epikardiyum içe doğru, iskemik enfarktlar epikardiyal tabaka için endokardiyal dışa doğru yaymak eğilimindedir ise. Bu nedenle, bu model miyokardiyal iskemi patofizyolojik mekanizmaları çalışma veya iskemi-reperfüzyon ayarı taklit etmek için sınırlıdır.
Sonuç olarak, burada açıklanan model ucuz, gerçekleştirmek kolay, hızlı ve güvenilir kurulabilir. Kardiyomiyosit nekrozu ve müteakip skar oluşumu zamanla gelişir ve bu da pompa fonksiyonunun bozulması ve elektriksel iletkenlik ile sonuçlanır. İyi kontrol edilebilen enfarktüs boyutu, şekli ve konumu, bu modeli kardiyak fonksiyon veya kardiyak rejenerasyonu geri getirmeyi amaçlayan deneysel girişimleri değerlendirmek için ideal kılabilir. Başarılı bir şekilde test edilen tedavi seçenekleri büyük hayvan çalışmalarında daha da teyit edilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Christiane Pahrmann'a teknik yardımları için teşekkür ederiz. D.W. Max Kade Vakfı tarafından desteklendi. T.D. Else Kröner Fondation (2012_EKES.04) ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE2133/2-1_) hibealdı. S. S. Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; SCHR992/3- 1, SCHR992/4-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 ml Syringe | Thermo Scientific | 03-377-23 | |
| 5-0 prolene suture | Ethicon | EH7229H | |
| 6-0 prolene suture | Ethicon | 8706H | |
| 8-0 Ethilon suture | Ethicon | 2808G | |
| Absorption Spears | Fine Science Tools | 18105-01 | |
| BALB/c | The Jackson Laboratory | Stock number 000651 | |
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer | 1578675 | Eye ointment |
| Betadine Solution | Betadine Purdue Pharma | NDC:67618-152 | |
| Blunt Forceps | Fine Science Tools | 18025-10 | |
| Buprenex | Reckitt Benckiser | NDC Codes: 12496-0757-1, 12496-0757-5 | Buprenorphine |
| Cryoprobe 3mm | Brymill Cryogenic Systems | Cry-AC-3 B-800 | |
| Ethanol 70% | Th. Geyer | 2270 | |
| Forceps curved | S&T | 00284 | |
| Forceps fine | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Forceps standard | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| Gross Anatomy Probe | Fine Science Tools | 10088-15 | |
| Hair clipper | WAHL | 8786-451A ARCO SE | |
| High temperature cautery kit | Bovie | 18010-00 | |
| ISOFLURANE | Henry Schein Animal Health | 029405 | |
| IV Catheter 20G | B. Braun | 603028 | |
| Mini-Goldstein Retractor | Fine Science Tools | 17002-02 | |
| NaCl 0.9% | B.Braun | PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160 | saline |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12075-14 | |
| Needle Holder, Curved | Harvard Apparatus | 72-0146 | |
| Novaminsulfon | Ratiopharm | PZN 03530402 | Metamizole |
| Operating Board | Braintree Scientific | 39OP | |
| Replaceable Fine Tip | Bovie | H101 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Small Animal Ventilator | Kent Scientific | RV-01 | |
| Spring Scissors - Angled to Side | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Surgical microscope | Leica | M651 | |
| Transpore Surgical Tape | 3M | 1527-1 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15400-12 | |
| Vaporizer | Kent Scientific | VetFlo-1205S |
References
- Writing Group. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 38-360 (2016).
- de Alencar Neto, J. N. Morphine, Oxygen, Nitrates, and Mortality Reducing Pharmacological Treatment for Acute Coronary Syndrome: An Evidence-based Review. Cureus. 10 (1), 2114 (2018).
- Detry, J. M.
- Ertl, G., Frantz, S.
- Jugdutt, B. I. Ventricular remodeling after infarction and the extracellular collagen matrix: when is enough enough. Circulation. 108 (11), 1395-1403 (2003).
- Velagaleti, R. S., Vasan, R. S. Heart failure in the twenty-first century: is it a coronary artery disease or hypertension problem. Cardiology Clinics. 25 (4), 487-495 (2007).
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135 (10), 146-603 (2017).
- Morrissey, P. J., et al. A novel method of standardized myocardial infarction in aged rabbits. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (5), 959-967 (2017).
- Degabriele, N. M., et al. Critical appraisal of the mouse model of myocardial infarction. Experimental Physiology. 89 (4), 497-505 (2004).
- Chen, J., Ceholski, D. K., Liang, L., Fish, K., Hajjar, R. J. Variability in coronary artery anatomy affects consistency of cardiac damage after myocardial infarction in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 313 (2), 275-282 (2017).
- Reichert, K., et al. Murine Left Anterior Descending (LAD) Coronary Artery Ligation: An Improved and Simplified Model for Myocardial Infarction. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (122), e55353 (2017).
- Kim, S. C., et al. A murine closed-chest model of myocardial ischemia and reperfusion. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (65), e3896 (2012).
- Antonio, E. L., et al. Left ventricle radio-frequency ablation in the rat: a new model of heart failure due to myocardial infarction homogeneous in size and low in mortality. J Card Fail. 15 (6), 540-548 (2009).
- Ovsepyan, A. A., et al. Modeling myocardial infarction in mice: methodology, monitoring, pathomorphology. Acta Naturae. 3 (1), 107-115 (2011).
- Ciulla, M. M., et al. Left ventricular remodeling after experimental myocardial cryoinjury in rats. Journal of Surgical Research. 116 (1), 91-97 (2004).
- Grisel, P., et al. The MRL mouse repairs both cryogenic and ischemic myocardial infarcts with scar. Cardiovascular Pathology. 17 (1), 14-22 (2008).
- Duerr, G. D., et al. Comparison of myocardial remodeling between cryoinfarction and reperfused infarction in mice. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 961298 (2011).
- Ma, N., et al. Intramyocardial delivery of human CD133+ cells in a SCID mouse cryoinjury model: Bone marrow vs. cord blood-derived cells. Cardiovascular Research. 71 (1), 158-169 (2006).
- Takagawa, J., et al. Myocardial infarct size measurement in the mouse chronic infarction model: comparison of area- and length-based approaches. Journal of Applied Physiology (1985). 102 (6), 2104-2111 (2007).
- van den Bos, E. J., Mees, B. M., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: a comparison with coronary artery ligation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (3), 1291-1300 (2005).
