Summary
Questo protocollo descrive un approccio per produrre epatosfere da cellule staminali pluripotenti umane utilizzando un sistema di coltura definito e l'autoassemblaggio delle cellule. Questo protocollo è riproducibile in un certo numero di linee cellulari, conveniente e consente la produzione di epatosfere umane stabili per l'applicazione biomedica.
Abstract
Lo sviluppo di fonti rinnovabili di tessuto epatico è necessario per migliorare la modellazione basata sulle cellule e sviluppare il tessuto umano per il trapianto. Le cellule staminali embrionali umane (HESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) rappresentano fonti promettenti di sfere epatiche umane. Abbiamo sviluppato un metodo di differenziazione cellulare libero e definito del siero per generare sfere epatiche umane tridimensionali formate da cellule staminali pluripotenti umane. Una potenziale limitazione della tecnologia è la produzione di sfere dense con materiale morto all'interno. Per aggirare questo, abbiamo impiegato la tecnologia del microwell agarose a densità cellulari definite per controllare le dimensioni delle sfere 3D, impedendo la generazione di nuclei apoptotici e/o necrotici. In particolare, le sfere generate dal nostro approccio mostrano la funzione epatica e il fenotipo stabile, che rappresentano una risorsa preziosa per la ricerca scientifica di base e applicata. Crediamo che il nostro approccio potrebbe essere utilizzato come tecnologia di piattaforma per sviluppare ulteriori tessuti per modellare e trattare le malattie umane e in futuro potrebbe consentire la generazione di tessuto umano con architettura tissutale complessa.
Introduction
La capacità delle cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) di auto-rinnovarsi, pur mantenendo la pluripotenza, offre l'opportunità di produrre tipi di cellule umane e tessuti su richiesta. Gli hPSC sono stati differenziati in modo efficiente in celle simili a epatociti (HLC) utilizzando sistemi di coltura aderenti bidimensionali (2D)1,2,3,4,5,6 ,7,8,9,10. Questi sistemi sono stati utilizzati per modellare con successo la malattia monogenica, il ciclo di vita dei virus, le lesioni epatiche indotte dai farmaci (DILI), l'esposizione fetale alle tossine e la malattia epatica grassa non alcolica (NAFLD)11,12,13 ,14,15. Tuttavia, questi modelli possiedono alcuni inconvenienti, che limitano il loro uso di routine. Questi includono l'espressione del marcatore fetale, il fenotipo instabile e la scarsa architettura tissutale16,17,18,19, che potrebbe anche limitare l'estrapolazione alla funzione dell'organo in vivo.
Per superare questi limiti, sono state sviluppate piattaforme di differenziazione tridimensionali (3D) per simulare l'architettura dei tessuti in vivo. Pur abilitando, tali approcci si basano sull'uso di prodotti e matrici di origine animale per guidare la genesi dei tessuti20,21,22, limitando l'aprono e l'applicazione diffusa.
Qui, dettagliamo le procedure per generare grandi quantità di epatosfere 3D da hPSC utilizzando materiali definiti e auto-assemblaggio delle cellule. In particolare, il tessuto generato dalla nostra procedura rimane funzionale per più di un anno nella coltura cellulare ed è in grado di supportare la funzione epatica in vivo23.
In sintesi, il nostro approccio definito di differenziazione consente la generazione di epotosfere umane stabili sia da cellule staminali embrionali umane (hESC) che da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Riteniamo che la procedura descritta rappresenti una svolta significativa nella generazione di epatosfere 3D per la ricerca scientifica di base e applicata.
Protocol
1. Preparazione di muffe agarose micropiastra
NOT: I supporti utilizzati per questi esperimenti devono essere sterili e a temperatura ambiente (RT) per la coltura cellulare.
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Preparare 2% stampi agarose.
- Sciogliere 2 g di agarose a bassa temperatura di fusione in 100 mL di acqua distillata sterilizzata. Riscaldare con attenzione in un forno a microonde con agitazione a intervalli per sciogliersi completamente.
- Aggiungere 520 l di agarose fuso a uno stampo di formato 256-well e lasciare solidificare.
- Trasferire ogni micropiastra di agarose in un unico pozzo di una piastra di 12 pozze.
- Aggiungete 1,5 mL di 1x salina con buffer fosfatidi (DPBS) con Ca2o/Mg2 a ciascun pozzo e rimuovete le bolle d'aria dai micropozzi pipettando delicatamente su e giù più volte utilizzando una punta di pipetta P1000. Questa operazione viene eseguita per garantire una semina uniforme delle cellule.
NOT: Le microplacche di Agarose possono essere conservate fino a 6 mesi a 4 gradi centigradi in 1x DPBS.
2. Semina cellule staminali Pluripotenti umane in piastre di microwell di Agarose
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Preparazione della sospensione cellulare
- Aspirare il mezzo da una cultura indifferenziata di hPSC come descritto in precedenza8.
NOTA: gli hPSC sono coltivati su LN-521 in mTeSR1 con il mezzo cambiato ogni 24 h, e passati regolarmente una volta che le cellule raggiungono 75% a 85% di confluenza come descritto in precedenza8. - Sciacquare le celle con 5 mL di RT 1x DPBS senza Ca2o Mg2 e rimuovere il buffer.
- Aggiungere alle cellule 5 mL di reagente di dissociazione 1x (Tabella dei materiali) e consentire la dissociazione cellulare incubando le cellule a 37 gradi centigradi per 6-8 min.
NOT: Per fermare la reazione, esaminare il distacco cellulare al microscopio. Le cellule devono essere parzialmente staccate dalla piastra. Estendere l'incubazione per un extra 1-2 min se è richiesto più tempo. - Interrompere la reazione rimuovendo il reagente di dissociazione cellulare e aggiungere 5 mL di mTe mL fresco mTeSR1 medio integrato con 10 M Rho-associated chinase (ROCK) inibitore Y27632 alle cellule. Dissociare le cellule pipettando su e giù più volte utilizzando una punta pipetta P1000.
- Contare le cellule vitali utilizzando un emocitometro e l'esclusione di colorazione blu trypan. A seguito di questo, preparare la sospensione cellulare alla concentrazione richiesta.
- Calcolare il numero totale di celle necessarie. Per la differenziazione dell'epatosfera 3D, seme 3,84 x 105 cellule per microplacca agarosa per generare sferoidi con 100-150 m di diametro.
- Trasferire il numero desiderato di cellule in uno sterile tubo centrifuga di 15 mL o 50 mL e centrifugare il tubo a 200 x g per 5 min a RT per pellet le cellule.
- Aspirare e scartare le cellule sovratallore e risospendere in mTeSR1 medio più 10 - M inibitore ROCK Y27632. Diluire il pellet cellulare nel volume appropriato di media per una concentrazione finale di 2,1 x 106 celle / mL.
- Aspirare il mezzo da una cultura indifferenziata di hPSC come descritto in precedenza8.
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Semina le cellule alle microplacche ad agarose preparate
NOTA: Se si utilizzano microplacini di agarose conservati in frigorifero, metterli nell'incubatrice cellulare a 37 gradi per almeno un'ora prima dell'uso e aspirare il DPBS 1x dal ben prima della semina cellulare.- Aggiungere 190 l della sospensione cellulare nel micropo di agarose.
- Dopo la semina, riportare le piastre all'incubatrice cellulare a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2 per 2 h per consentire alle cellule di stabilirsi.
- Dopo 2 h, aggiungere 1 mL di mTeSR1 fresco e caldo medio integrato con 10 s M inibitore ROCK Y27632 ad ogni pozzo.
- Riportare le piastre all'incubatrice cellulare a 37 e 5% di CO2 per 24 h ed esaminare la formazione di sfere il giorno successivo per consentire alle cellule di attaccarsi.
3. Differenziazione degli hPSC alle epatite 3D su Agarose Microwells
- Preparazione di pozze rivestiti in poli-idrossito (poli-HEMA)
- Sciogliere 2 g di poli-HEMA in 100 mL del 95% di etanolo. Mescolare la soluzione per una notte con una piastra calda a 55 gradi centigradi. Aggiungete 250 gradi di soluzione poli-HEMA per pozzo di una piastra da 24 pozzetti e asciugate pernottamento a 60 gradi centigradi con un forno.
- Preparazione del mezzo di differenziazione
- Preparare una soluzione stock di 1.000 volte dell'attivivita A sciogliendo l'attivino a reddititta umana Una proteina liofilizzata nello sterile 0,2% di albumina di siero bovino (BSA)/DPBS ad una concentrazione finale di 100 g/mL. Conservare a -20 gradi centigradi in piccoli aliquote. Utilizzare a 1:1,000.
- Preparare una soluzione di riserva di 1.000 volte di Wnt3a sciogliendo la proteina linofilizzata Wnt3a del topo nello sterile 0,2% BSA/DPBS ad una concentrazione finale di 10 g/mL. Conservare a -20 gradi centigradi in piccoli aliquote. Utilizzare all'1:200.
- Preparare una soluzione di 1.000 x del fattore di crescita umano dell'epatocito (HGF) sciogliendo la proteina liofilizzata HGF umana nello sterile 0,2% BSA/DPBS ad una concentrazione finale di 10 g/mL. Conservare a -20 gradi centigradi in piccoli aliquote. Utilizzare a 1:1,000.
- Preparare una soluzione di stock 1.000x di oncostatinM (OSM) sciogliendo OSM in sterile 0,2% BSA/DPBS ad una concentrazione finale di 20 g/mL. Conservare a -20 gradi centigradi in piccoli aliquote. Utilizzare a 1:1,000.
- Preparare una soluzione di stock 1000x del fattore di crescita epiteliale (EGF) sciogliendo la proteina liofilizzata nello sterile 0,2% BSA/DPBS ad una concentrazione finale di 10 g/mL. Conservare a -20 gradi centigradi in piccoli aliquote. Utilizzare a 1:1,000.
- Preparare una soluzione di riserva di 1.000 volte il fattore di crescita del fibroblasto di base (bFGF) sciogliendo la proteina liofilizzata nello zerfo 0,2% BSA/DPBS ad una concentrazione finale di 10 g/mL. Conservare a -20 gradi centigradi in piccoli aliquote. Utilizzare a 1:1,000.
- Preparare una soluzione di riserva di 1.000 volte il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) sciogliendo la proteina liofilizzata nello 0,2% BSA/DPBS ad una concentrazione finale di 10 g/mL. Conservare a -20 gradi centigradi in piccoli aliquote. Utilizzare a 1:1,000.
- Rendere il mezzo di differenziazione dell'endodermico costituito da Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) mezzo basale integrato con 2% B27 supplemento (50x, senza insulina), e 1% penicillina / streptomicina (concentrazioni finali: 100 IU/mL e 100 g/mL, rispettivamente). A meno che indicato, ad ogni cambiamento medio, integrare il volume richiesto con Wnt3a e activin A ad una concentrazione finale di 50 ng/mL e 100 ng/mL, rispettivamente.
NOT: Conservare a 4 gradi centigradi e utilizzare entro due settimane. - Rendere il mezzo di differenziazione dell'epatoblasto costituito dal mezzo Eagle modificato di Dulbecco (KO-DMEM) di knockout con la sostituzione del siero da urlo del 20% (KOSR) e integrato con lo 0,5% di un integratore alternativo alla glutammina, l'1% di amminoacidi non essenziali (NEAA), 0,1 mM beta-mercaptoetanolo, 1% di solfuro dimetilo (DMSO) e 1% penicillina/streptomicina (concentrazioni finali rispettivamente a 100 IU/mL e 100 g/mL). Filtrare sotto vuoto.
NOT: Conservare a 4 gradi centigradi e utilizzare entro due settimane. - Rendere il mezzo di maturazione dell'epatocite costituito da mezzo epatocite integrato con l'1% di un integratore alternativo a L-glutamine, 10 hydrocortisone 21-emisucciato sale di sodio (HCC), 1% penicillina / streptomicina (concentrazioni finali a 100 IU/mL e rispettivamente 100 g/mL. Per ogni cambiamento medio, integrare il volume richiesto con OSM e HGF (concentrazioni finali a 20 ng/mL e 10 ng/mL, rispettivamente).
NOT: Conservare il brodo a 4 gradi centigradi e utilizzarlo entro due settimane. - Rendere il mezzo di manutenzione dell'epatocite costituito da Un mezzo e l'epatocite di William's E, integrato con la sostituzione del siero al 10%, costituito dall'1% di un integratore alternativo a L-glutamine, 1% di penicillina/streptomicina (concentrazioni finali a 100 IU/mL e 100 g/mL, rispettivamente). Per ogni variazione media, integrare il volume richiesto con HGF, EGF, bFGF e VEGF (concentrazione finale di ogni fattore di crescita a 10 ng/mL).
NOT: Conservare il brodo a 4 gradi centigradi e utilizzarlo entro due settimane.
- Controllare la formazione dell'epatosfera 24 h post seeding e avviare la differenziazione degli epatociti. Rimuovere con attenzione il mezzo mTeSR1 e sostituirlo con 1 mL di mezzo di differenziazione endodermi fresco integrato con 100 ng/mL activin A e 50 ng/mL Wnt3a.
- Cambio integrato endoderm priming medium ogni 24 h per 3 giorni per hESCs. Quando si lavora con hiPSC, estendere questa fase per altri 2 giorni integrando i media con activin A (100ng/mL) da solo.
- Dopo l'induzione definitiva dell'endodermi, passare al mezzo di differenziazione dell'epatoblasto per la specifica dell'epatoblasto per 5 giorni sostituendo il mezzo ogni 2 giorni ed eseguire l'ultimo cambiamento l'ultimo giorno della specifica dell'epatoblasto.
- Trasferire epatosfere nei pozze rivestite poli-HEMA.
- Lavare le cellule una volta con il mezzo di maturazione dell'epatocite senza integratori dopo aver rimosso il mezzo KSR/DMSO medio e aggiungere 1 mL di mezzo di maturazione epatite integrato con 10 ng/mL HGF e 20 ng/mL OSM.
- Utilizzando una pipetta P1000, sollevare le epatosfere dalla micropiastra agarose pipetting su e giù per la soluzione più volte.
- Trasferire il mezzo contenente le epatosfere in un pozzo poli-HEMA rivestito.
- Lavare la micropiastra di agarose utilizzando 1 mL di mezzo di maturazione dell'epatocito integrato con 10 ng/mL HGF e 20 ng/mL OSM e trasferire il mezzo al pozzo rivestito poli-HEMA.
- Ripetere il passaggio 3.6.4 più volte possibile per trasferire tutte le epatosfere dalla microplacca agarose.
NOT: È fondamentale pipetta con attenzione su e giù per la soluzione contenente le epatosfere per evitare di danneggiarle.
- Aspirare con attenzione il mezzo in eccesso senza rimuovere le epatosfere utilizzando una pipetta P100 fino a 1 mL di mezzo contenente le epatosfere rimane nel pozzo poli-HEMA rivestito.
- Cambiare il mezzo ogni 48 h per 12 giorni.
- Al giorno 20 quando si lavora con hESC o giorno 22 se si lavora con hiPSC, passare il mezzo a supporto di manutenzione epatocitico.
- Rimuovere il mezzo di maturazione dell'epatocite e lavare le cellule una volta con il mezzo di manutenzione epatocite senza gli integratori. Aggiungere 1 mL di mezzo di manutenzione epatocite integrato con 10 ng/mL di HGF, EGF, FGF e VEGF.
- Cambiare il mezzo per il mezzo di manutenzione epatocite fresco ogni 48 h.
4. Analisi funzionale delle epatie 3D coltivate a lungo termine
- Passare al mezzo di maturazione dell'epatocito integrato rispettivamente con 10 M di HCC, L-glutamine, 1% penicillina/streptomicina (concentrazioni finali a 100 IU/mL e 100g/mL, rispettivamente) e 10 ng/mL HGF 48 h prima di eseguire l'analisi funzionale.
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Analizzare la funzione metabolica dell'epatocito utilizzando i saggi citocromatici (CYP) P450.
- Sostituire il substrato medio con 1 mL di maturazione dell'epatocito fresco integrato con un substrato di etere lucidferina-6'-pentafluoro-benzyl (luciferin-PFBE) per rilevare l'attività basale CYP3A o il substrato di 100 etere luciferina-metilare (luciferin-ME) per rilevare CYP1A2 attività basale (numero di repliche n. 3). Utilizzare i media di coltura dei tessuti come controllo negativo.
NOT: Al fine di evitare la reattività incrociata, si consiglia di non utilizzare gli stessi pozzi contenenti epatosfere 3D per testare diverse attività CYP P450 ma di eseguirle in singoli pozzi. - Incubano le cellule per 24 h a 37 gradi centigradi.
- Raccogliere i supernatanti utilizzando una punta di pipetta P100 ed eseguire il saggio come da istruzioni del produttore.
- Misurare i livelli relativi di attività basale e normalizzare per proteina mg come determinato dal saggio di acido bicinchoninico (BCA).
- Sostituire il substrato medio con 1 mL di maturazione dell'epatocito fresco integrato con un substrato di etere lucidferina-6'-pentafluoro-benzyl (luciferin-PFBE) per rilevare l'attività basale CYP3A o il substrato di 100 etere luciferina-metilare (luciferin-ME) per rilevare CYP1A2 attività basale (numero di repliche n. 3). Utilizzare i media di coltura dei tessuti come controllo negativo.
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Testare la produzione di proteine del siero utilizzando un test dell'immunosorbent sfondanti enzimatico (ELISA).
- Sostituire medio con 1 mL di medio di maturazione epatocito fresco integrato con 10 ng/mL HGF e 20 ng/mL OSM (numero di repliche : 3). Utilizzare i media di coltura dei tessuti come controllo negativo.
- Incubano le cellule per 24 h a 37 gradi centigradi.
- Raccogliere il supernatante utilizzando una punta pipetta P100 e misurare i livelli relativi di produzione di proteine del siero come da istruzioni del produttore.
- Normalizzare per proteine per mg come determinato dal saggio BCA.
5. Immunocitochimica
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Preparazione di sezioni di paraffina contenenti epatosfere.
- Lavare le epatosfere tre volte con 1x DPBS.
- Fissare le epatosfere con metanolo ghiacciato per 30 min.
- Lavare tre volte con 1x DPBS.
- Incorporare le epotosfere in 300 gradi di una soluzione temperata del 2% di agarose sciolta in H2O utilizzando un pozzo vuoto di una piastra di 24 piani come stampo e lasciarla solidificare per 30 min.
- Incorporare l'agarose contenente epatosfere in paraffina.
- Sezionare il blocco di paraffina contenente epatosfere fisse in sezioni spesse 4 m utilizzando un microtoma.
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De-ceretta e reidratazione delle sezioni.
NOTA: utilizzare soluzioni fresche ogni volta che è possibile. Non utilizzare soluzioni che sono state sul trogolo di colorazione per più di una settimana.- Posizionare le sezioni in un rack di diapositive.
- Immergere il rack scorrevole contenente sezioni in una macchiatura contenente 300 mL di xilene per 5 min.
- Ripetere il passaggio 5.2.2.
- Immergiti nell'etanolo assoluto per 20 s.
- Immergiti nel 95% di etanolo per 20 s.
- Immergiti nel 90% di etanolo per 20 s.
- Immergiti nell'80% di etanolo per 20 s.
- Immergiti nel 70% di etanolo per 20 s.
- Reidratare le sezioni con acqua per 5 min.
NOT: Mantenere le diapositive nello stesso rack di diapositive e spostarlo da una barra di colorazione a quella successiva. Il volume utilizzato (in genere 300 mL) dipende dalle dimensioni della depressione di colorazione.
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Recupero di antigeni di sezioni di paraffina contenenti epatosfere.
- Le sezioni di calore decerate e reidratate in 1x soluzione cuscinetto 1x Tris-EDTA (TE) pH 9.0 per 15 minuti in un microonde a 800 W.
- Raffreddare i campioni immergendoli nell'acqua del rubinetto per 5 min.
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Immunostaining.
- Incuba diapositive con soluzione di blocco in PBS con 0,1% di polisoro20 (PBS/T)/10% BSA per 1 h a RT.
- Sostituire la soluzione di blocco con l'anticorpo primario appropriato diluito in PBS/T/1% BSA e incubare a 4 gradi centigradi con agitazione delicata durante la notte.
- Lavare le cellule con PBS/T per 5 min e ripetere tre volte.
- Incubare con l'anticorpo secondario appropriato diluito in PBS/T/1% BSA e incubare al buio a RT per 1 h con agitazione delicata.
NOT: Gli anticorpi primari e secondari ottimizzati sono elencati in Tabella dei materiali. - Lavare le cellule con PBS/T per 5 min e ripetere tre volte.
- Aggiungere 4',6-diamidino-2-fenilitinal (DAPI) alle cellule secondo le istruzioni del produttore e posizionare delicatamente un coperchio di vetro per ridurre le bolle d'aria. Mantenere le celle fisse a 4 gradi centigradi al buio. Osservare la colorazione al microscopio con un filtro appropriato e una lampada fluorescente.
NOTA: Conservare le piastre a 4 gradi centigradi al buio fino all'imaging.
Representative Results
Gli aggregati tridimensionali della linea delle cellule staminali embrionali (H9) o della linea cellulare staminale pluripotente indotta (P106) sono stati differenziati verso il lignaggio degli epatociti utilizzando la nostra procedura definita (Figura 1). Le cellule staminali pluripotenti sono state per la prima volta orientate verso l'endoderma definitivo prima della specifica dell'epatoblasto. In seguito, gli epatoblasti sono stati maturati in epatosfere 3D che potrebbero essere mantenute in cultura fino a un anno23.
Per studiare la struttura delle sfere 3D, sono state fissate, sezionati e macchiati sfere derivate da hESC o iPSC di 30 giorni. Sono stati impiegati il fattore nucleare di epatociti 4 alfa (HNF4) e la vimentina del marcatore mesenchymal, rivelando la presenza di uno strato esterno composto da epatociti come cellule che circondano un nucleo di cellule mesenchymal (Figura 2). Abbiamo seguito questi esperimenti analizzando l'espressione delle proteine espresse negli epatociti: albumina, CYP3A ed E-cadherin. L'immunostaining ha rivelato che l'espressione di queste proteine era limitata allo strato esterno delle sfere (Figura 3).
Le analisi funzionali delle epatosfere sono state eseguite in 30 culture del giorno. CYP1A2 e CYP3A sono enzimi importanti all'interno degli epatociti funzionali. La loro attività è stata valutata utilizzando saggi stabiliti. L'attività Epatospheres derivato da H9 ha mostrato un'attività CYP3A di 220,375 x 74514 Proteina RLU/mL/mg e attività CYP1A2 di 732.440 33.330 RLU/mL/mg proteine (Figura 4A). L'attività CYP3A nelle epatosfere derivate da P106 era di 132117 : 43.391 proteina RLU/mL/mg e l'attività CYP1A2 era 409,907 121.723 proteina RLU/mL/mg (Figura4B). Rispetto a due lotti di epaticiti primari umani, le sfere epatiche 3D mostravano livelli rispettabili di attività CYP10.
L'analisi della sintesi e della secrezione di albumina e alfa-fetoproteina (AFP) ha rivelato che le epatos di origine H9 hanno secreto rispettivamente 683,9 e 159 x 20 - 20 ng/mL/24 h/mg di proteina di albumina e alfa-fetoproteina (Figura 5A). Mentre le epatosfere derivate da P106 hanno smentito rispettivamente 497 , 41 e 756 , 24 ng/mL/24 h/mg di albumina e alfa-fetoproteina (Figura 5B).
Figura 1 : procedura di differenziazione graduale per generare epatosfere 3D da hESC. Le parentesi blu rappresentano i giorni di differenziazione per hiPSC. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Riorganizzazione strutturale delle epatosferie 3D. Immagini rappresentative dell'espressione del fattore nucleare epatocite 4 alfa (HNF4 - verde) e vimentina (rosso) in (A) Epatosfere 3D derivate da H9 e (B) Epatobi 3D derivate da P106 e i corrispondenti controlli immunoglobulin G (IgG) . Le barre della scala rappresentano 60 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Valutazione dell'espressione del marcatore epatico in epatosfere 3D. Immagini rappresentative dell'espressione dei marcatori epatociti - albumina, CYP3A, E-cadherin e dei corrispondenti controlli IgG in (A) H9- e (B) P106-derivato epatospheres. Barre della scala: 60 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Funzione P450 citocromatica in epatosfere 3D. Misurazione dell'attività citocromatica P450 1A2 e 3A nell'attività 3D di derivazione di (A) e (B) epatospheres 3D derivata da P106. I dati rappresentano la media di tre repliche biologiche e le barre di errore rappresentano la deviazione standard (SD). L'attività è citata come unità di luce relativa (RLU) per mL per mg di proteine. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Analisi della secrezione proteica dell'epatosfera. La secrezione di albumina e alfa-fetoproteina (AFP) è stata analizzata in (A) H9-derivato epatospheres e (B) P106-derivato epatospheres. I dati sono rappresentativi di tre repliche biologiche, e le barre di errore rappresentano la proteina segreta è citata come nanogrammi di proteine per mL per 24 h per mg di proteine. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Lo sviluppo di sistemi definiti e xeno-free per produrre epatosfere umane in 3D è necessario sia per gli sforzi in vitro che per quelli in vivo. Attualmente la maggior parte degli approcci di differenziazione degli epatociti dalle cellule staminali pluripotenti umane viene eseguita in colture bidimensionali aderenti. Questi ambienti mancano di molti dei segnali ambientali coinvolti nella genesi dei tessuti e l'omeostasi che includono; interazioni di cellule eterotipiche, produzione di matrici e rimodellamento, con conseguente scarsa traduzione alla biologia in vivo18,19.
Di conseguenza, la ricerca si è concentrata su approcci alternativi per generare epatosfere da cellule staminali pluripotenti. Una serie di studi 3D hanno avanzato il campo, ma questi si basano su prodotti di origine animale20,22,24 per fornire supporto e/o richiedono l'uso del tessuto umano21,22 che complica scalabilità e compromissione della tecnologia e compromissione sperimentale e l'applicazione.
La procedura descritta nel nostro articolo (Figura 1) è definita, efficiente, altamente riproducibile e conveniente, consentendo la produzione di sfere epatiche funzionali, che rimangono funzionali per un anno in vitro e forniscono supporto epatico critico in vivo14. È importante sottolineare che questa piattaforma consente all'utente di controllare le dimensioni delle sfere epatiche 3D, limitando la formazione di centri necrotici densi e la perdita di fenotipo.
Il trasferimento delle epatosfere 3D alle piastre rivestite poli-HEMA rappresenta un passo critico in questo protocollo. È importante pipetta delicatamente in questa fase della procedura per evitare di danneggiare la sfera. Inoltre, i cambiamenti dei supporti devono essere eseguiti con attenzione per evitare lo stress da taglio e la distorsione della struttura della sfera.
In questi studi, le epatosfere 3D mostravano una struttura organizzata (Figura 2 e Figura 3), funzione P450 citocromatica ( Figura4) e proteine epatiche secrete, tra cui albumina e alfa-fetoproteina (Figura 5). Questa procedura è stata eseguita con successo in quattro linee di cellule staminali pluripotenti con risultati comparabili. Guardando al futuro, questa tecnologia potrebbe essere impiegata come piattaforma per sviluppare ulteriori tessuti endodermici e mesenchymicon con architetture complesse.
Disclosures
David C. Hay è co-fondatore e azionista di Stemnovate Ltd e HigherSteaks Ltd. Il resto degli autori certifica di non avere conflitti di interesse nell'argomento o nei materiali discussi in questo articolo.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto con premi dalla piattaforma britannica di medicina rigenerativa (MRC MRC MR/L022974/1) e dall'Ufficio del Chief Scientist (TCS/16/37).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture and functional assays | |||
| Agarose | Fisher Bioreagents | 10766834 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| beta-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
| DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
| Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050 | |
| HepatoZYME-SFM | Life Technologies | 17705021 | |
| Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
| Human Alpha Fetoprotein ELISA | Alpha Diagnostics | 500 | |
| Human Basic Fibrobaslt Growth Factor | Peprotech | 100-18B | |
| Human Epithelial Gropwth Factor | Peprotech | 236-EG | |
| Human Hepatocyte Growth Factor | Peprotech | 100-39 | |
| Human Oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
| Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
| Human Serum Albumin ELISA | Alpha Diagnostics | 1190 | |
| Human Vascular Growth Factor | Bio-techne | 293-VE | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H4881 | |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829 | |
| Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828 | |
| Micro-mold spheroids | Sigma-Aldrich | Z764000 | |
| mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
| Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 | |
| P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System | Promega | V8771 | |
| P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System | Promega | V8801 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
| poly-HEMA (Poly 2-hydorxyethyl methacrylate) | Sigma-Aldrich | P3932 | |
| Recombinant mouse Wnt3a | Bio-techne | 1324-WN-500/CF | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 21875 | |
| Equipment | |||
| Microwave | Bosch | ||
| Microtome | Leika | RM2125RT | |
| Oven | Thermoscientific | ||
| Antibodies | |||
| Primary antibodies | |||
| Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:100 (mouse) |
| CYP3A4 | University of Dundee | University of Dundee | 1:200 (sheep) |
| E-cadherin | Abcam | ab76055 | 1:200 (mouse) |
| HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:100 (rabbit) |
| IgG | DAKO | X0943 | 1:400 |
| Vimentin | DAKO | M0725 | 1:100 (sheep) |
References
- Hay, D. C., et al. Direct differentiation of human embryonic stem cells to hepatocyte-like cells exhibiting functional activities. Cloning and Stem Cells. 9 (1), 51-62 (2007).
- Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (34), 12301-12306 (2008).
- Hay, D. C., et al. Efficient Differentiation of Hepatocytes from Human Embryonic Stem Cells Exhibiting Markers Recapitulating Liver Development In vivo. STEM CELLS. 26 (4), 894-902 (2008).
- Hannan, N. R., Segeritz, C. -P., Touboul, T., Vallier, L. Production of hepatocyte like cells from human pluripotent stem cells. Nature protocols. 8 (2), 430-437 (2013).
- Loh, K. M., et al. Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations. Cell Stem Cell. 14 (2), 237-252 (2014).
- Sullivan, G. J., et al. Generation of Functional Human Hepatic Endoderm from Human iPS cells. Hepatology. 51 (1), 329-335 (2010).
- Si-Tayeb, K., et al. Highly Efficient Generation of Human Hepatocyte-like Cells from Induced Pluripotent Stem Cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
- Wang, Y., et al. Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (121), (2017).
- Meseguer-Ripolles, J., Lucendo-Villarin, B., Wang, Y., Hay, D. C. Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
- Cameron, K., et al. Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1250-1262 (2015).
- Zhou, X., et al. Modulating Innate Immunity Improves Hepatitis C Virus Infection and Replication in Stem Cell-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 3 (1), 204-214 (2014).
- Lyall, M. J., et al. Modelling non-alcoholic fatty liver disease in human hepatocyte-like cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170362 (2018).
- Szkolnicka, D., et al. Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs. Stem Cells Translational Medicine. 5 (6), 764-772 (2016).
- Lucendo-Villarin, B., et al. Modelling foetal exposure to maternal smoking using hepatoblasts from pluripotent stem cells. Archives of Toxicology. 91 (11), 3633-3643 (2017).
- Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 120 (9), 3127-3136 (2010).
- Godoy, P., et al. Gene networks and transcription factor motifs defining the differentiation of stem cells into hepatocyte-like cells. Journal of Hepatology. 63 (4), 934-942 (2015).
- Lucendo-Villarin, B., Rashidi, H., Cameron, K., Hay, D. C. Pluripotent stem cell derived hepatocytes: using materials to define cellular differentiation and tissue engineering. Journal of Materials Chemistry B, Materials for Biology and Medicine. 4 (20), 3433-3442 (2016).
- Fang, Y., Eglen, R. M. Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development. Slas Discovery. 22 (5), 456-472 (2017).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Gieseck, R. L., et al. Maturation of Induced Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes by 3D-Culture. PLoS ONE. 9 (1), (2014).
- Takebe, T., et al. Generation of a vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature Protocols. 9 (2), 396-409 (2014).
- Camp, J. G., et al. Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency. Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).
- Rashidi, H., et al. 3D human hepatospheres from pluripotent stem cells displays stable phenotype in vitro and supports compromised liver function in vivo. Archives of Toxicology. 92 (10), 3117-3129 (2018).
- Takebe, T., et al. Massive and Reproducible Production of Liver Buds Entirely from Human Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 21 (10), 2661-2670 (2017).
