Summary
Этот протокол описывает подход к производству гепатосфер из человеческих плюрипотентных стволовых клеток с использованием определенной системы культуры и самосборки клеток. Этот протокол воспроизводим в ряде клеточных линий, экономически эффективен и позволяет производство стабильных гепатосфер ов для биомедицинского применения.
Abstract
Развитие возобновляемых источников тканей печени необходимо для улучшения клеточного моделирования и развития тканей человека для трансплантации. Эмбриональные стволовые клетки человека (HESCs) и индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (hiPSCs) представляют перспективные источники человеческих сфер печени. Мы разработали свободный от сыворотки и определенный метод клеточной дифференциации для генерации трехмерных сфер печени человека, образованных из плюрипотентных стволовых клеток человека. Потенциальным ограничением технологии является производство плотных сфер с мертвым материалом внутри. Для того, чтобы обойти это, мы использовали технологию микроколодца агарозы при определенных плотности клеток для контроля размера 3D-сфер, предотвращая генерацию апоптотичных и/или некротических ядер. Примечательно, что сферы, генерируемые нашим подходом, отображают функцию печени и стабильный фенотип, представляющий собой ценный ресурс для фундаментальных и прикладных научных исследований. Мы считаем, что наш подход может быть использован в качестве платформы технологии для разработки дальнейших тканей для моделирования и лечения заболеваний человека и в будущем может позволить генерации человеческих тканей со сложной архитектурой тканей.
Introduction
Способность человека плюрипотентных стволовых клеток (HPSCs) к самообновлению, сохраняя при этом плюрипотентность, дает возможность производить типы клеток человека и тканей по требованию. hPSCs были эффективно дифференцированы в гепатоцитов, как клетки (HLCs) с использованием двумерных (2D) адепт системы культуры1,2,3,4,5,6 ,7,8,9,10. Эти системы были использованы для успешной модели моногенной болезни, вирусного жизненного цикла, медикаментозной индуцированной травмы печени (DILI), воздействия токсинов плода и безалкогольных жировых заболеваний печени (NAFLD)11,12,13 ,14,15. Тем не менее, эти модели обладают некоторыми недостатками, которые ограничивают их регулярное использование. К ним относятся выражение маркера плода, нестабильный фенотип и плохая архитектура тканей16,17,18,19, которые также могут ограничить экстраполяцию функции органа in vivo.
Чтобы преодолеть эти ограничения, были разработаны трехмерные (3D) дифференциации платформ для имитации архитектуры тканей vivo. Хотя это позволяет, эти подходы опираются на использование животных производных продуктов и матриц для привода генезиса тканей20,21,22, ограничивая масштабирование и широкое применение.
Здесь мы подробно процедуры для создания больших количеств 3D гепатосферы из hPSCs с использованием определенных материалов и клеточной самосборки. Примечательно, что ткани, генерируемые нашей процедурой остается функциональным в течение более одного года в клеточной культуре и способен поддерживать функцию печени in vivo23.
Таким образом, наш определенный подход к дифференциации позволяет выражать стабильные гепатосферы человека как из эмбриональных стволовых клеток человека (HESCs), так и из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs). Мы считаем, что описанная процедура представляет собой значительный прорыв в генерации 3D гепатосфер для фундаментальных и прикладных научных исследований.
Protocol
1. Подготовка агаросы Microplate плесени
ПРИМЕЧАНИЕ: Средства массовой информации, используемые для этих экспериментов, должны быть стерильными и при комнатной температуре (RT) для клеточной культуры.
-
Подготовка 2% агарозных форм.
- Растворите 2 г агарозы низкой температуры плавления в 100 мл стерилизоватой дистиллированной воды. Тщательно нагревайте в микроволновой печи с интервалом встряхивания, чтобы полностью раствориться.
- Добавьте 520 л расплавленной агарозы в форму формата 256 колодцев и оставьте затвердеть.
- Перенесите каждую микроплиту агарозы в один колодец 12-колодца.
- Добавьте 1,5 мл из 1x Dulbecco в фосфат-буферный солен (DPBS) с Ca2"/Mg2" к каждой скважине и удалить пузырьки воздуха из микроколодцев, мягко пипетки вверх и вниз несколько раз с помощью P1000 пипетка отзыв. Это выполняется для обеспечения равномерного посева клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Микроплиты Агарозы могут храниться до 6 месяцев при 4 градусах По Цельсию в 1x DPBS.
2. Посев человека Плюрипотентные стволовые клетки в Агароуз Microwell пластин
-
Подготовка клеточной суспензии
- Аспирировать среды от недифференцированной культуры hPSCs, как ранее описано8.
ПРИМЕЧАНИЕ: hPSCs культивируются на LN-521 в mTeSR1 со средой изменен каждые 24 ч, и регулярно проходят, как только клетки достигают 75% до 85% от выпуклости, как ранее описано8. - Промыть клетки с 5 мл RT 1x DPBS без Ca2"/Mg2" и удалить буфер.
- Добавьте 5 мл реагента диссоциации 1x клетки(Таблицаматериалов) к клеткам и позвольте разъединению клеток путем инкубировать клетки на 37 c для 6-8 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы остановить реакцию, изучите отслоение клеток под микроскопом. Клетки должны быть частично отделены от пластины. Продлить инкубацию на дополнительные 1-2 мин, если требуется больше времени. - Остановите реакцию, удалив реагент диссоциации клеток и добавьте 5 мл свежей среды mTeSR1, дополненной ингибитором 10 мкм Rho-associated-ассоциированной киназы (ROCK) Y27632 к клеткам. Диссоциативные клетки путем pipetting вверх и вниз несколько раз с помощью P1000 пипетка отзыв.
- Подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью гемоцитометра и trypan синий окрашивания исключения. После этого подготовьте суспензию клетки в необходимой концентрации.
- Рассчитайте общее количество необходимых ячеек. Для дифференциации 3D гепатосферы, семена 3,84 х 105 клеток на микроплиту агаросы для генерации сфероидов с диаметром 100-150 мкм.
- Перенесите нужное количество клеток в стерильную 15 мл или 50 мл центрифуги трубки и центрифуги трубки на 200 х г в течение 5 минут на RT, чтобы гранулы клеток.
- Аспирировать и отбрасывать супернатант и повторного отображения клеток в mTeSR1 среды плюс 10 мкм ROCK ингибитор Y27632. Разбавить клеточные гранулы в соответствующем объеме средней до конечной концентрации 2,1 х 106 клеток/мл.
- Аспирировать среды от недифференцированной культуры hPSCs, как ранее описано8.
-
Посев клеток до подготовленных агарозных микроплит
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании холодильника хранятся агарозные микроплиты, поместите их в клеточный инкубатор на 37 градусов по Цельсию, по крайней мере за час до использования и аспирировать 1x DPBS из хорошо перед посевной клетки.- Добавьте 190 л клеточной подвески в микроскважину агарозы.
- После посева, вернуть пластины в клеточный инкубатор на 37 кв и 5% CO2 на 2 ч, чтобы клетки оседают.
- После 2 ч добавьте 1 мл свежей и теплой среды mTeSR1, дополненной 10 ингибитором Y27632.
- Вернуть пластины в клеточный инкубатор при 37 градусах По кв. м и 5% CO2 на 24 ч и изучить образование сфер на следующий день, чтобы позволить клеткам прикрепляться.
3. Дифференциирование hPSCs на 3D гепатосферы на Микроуэллах Агаросы
- Приготовление поли2-гидроксиэтил метакрилата (поли-ХЕМА) покрытых скважин
- Растворите 2 г поли-HEMA в 100 мл 95% этанола. Перемешать раствор на ночь с помощью горячей пластины при 55 градусах Цельсия. Добавьте 250 л раствора поли-HEMA на скважину 24-хорошей тарелки и высушите на ночь при температуре 60 градусов по Цельсию с помощью духовки.
- Подготовка среды дифференциации
- Подготовьте 1000x стоковой раствор человеческого актививина А путем растворения человеческого активибилизированного белка в стерильных 0,2% бычьего сыворотки альбумина (BSA)/DPBS до конечной концентрации 100 мкг/мл. Хранить при -20 градусов по Цельсию в небольших аликвотах. Используйте в 1:1,000.
- Подготовьте 1000x фондовый раствор Wnt3a путем растворения мыши Wnt3a лиофилизированного белка в стерильных 0,2% BSA/DPBS до конечной концентрации 10 мкг/мл. Хранить при -20 градусов по Цельсию в небольших аликвотах. Использовать в 1:200.
- Подготовьте 1000x фондовый раствор фактора роста гепатоцитов человека (HGF) путем растворения лиофилизированного белка HGF в стерильных 0,2% BSA/DPBS до конечной концентрации 10 мкг/мл. Хранить при -20 градусов по Цельсию в небольших аликвотах. Используйте в 1:1,000.
- Подготовьте 1000x биржевое решение онкостататина M (OSM) путем растворения OSM в стерильных 0,2% BSA/DPBS до конечной концентрации 20 мкг/мл. Хранить при -20 градусов по Цельсию в небольших аликвотах. Используйте в 1:1,000.
- Подготовьте 1000-x стоковой раствор фактора эпителиального роста (EGF) путем растворения лиофилизированного белка в стерильных 0,2% BSA/DPBS до конечной концентрации 10 мкг/мл. Хранить при -20 градусов по Цельсию в небольших аликвотах. Используйте в 1:1,000.
- Подготовьте 1000-x биржевое решение базового фактора роста фибробластов (bFGF) путем растворения лиофилизированного белка в стерильных 0,2% BSA/DPBS до конечной концентрации 10 мкг/мл. Хранить при -20 градусов по Цельсию в небольших аликвотах. Используйте в 1:1,000.
- Подготовьте 1000-x стоковой раствор сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) путем растворения лиофизированного белка в 0,2% BSA/DPBS до конечной концентрации 10 мкг/мл. Хранить при -20 градусов по Цельсию в небольших аликвотах. Используйте в 1:1,000.
- Сделать эндодерм дифференциации среды, состоящей из Розуэлл Парк Мемориальный институт 1640 (RPMI 1640) базальная среда дополнена 2% B27 дополнения (50x, без инсулина), и 1% пенициллин / стрептомицин (окончательные концентрации: 100 МЕ/мл и 100 мкг/мл, соответственно). Если не указано, при каждом среднем изменении, дополнить необходимый объем wnt3a и активицин А при окончательной концентрации 50 нг/мл и 100 нг/мл, соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Храните при 4 градусах Цельсия и используйте в течение двух недель. - Сделать гепатобластной дифференциации среды, состоящей из нокаута Dulbecco в модифицированных Eagle среды (KO-DMEM) с 20% нокаутом замены сыворотки (KOSR) и дополнены 0,5% альтернативной добавки к L-глутамамин, 1% несущественных аминокислот (NEAA), 0,1 мМ бета-меркаптоэтанол, 1% диметилсульксид (ДМСО) и 1% пенициллина/стрептомицина (окончательные концентрации на уровне 100 МЕ/мл и 100 мкг/мл соответственно). Фильтр под вакуумом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Храните при 4 градусах Цельсия и используйте в течение двух недель. - Сделать гепатоцитов созревания среды, состоящей из гепатоцитов среды дополняется 1% от альтернативного дополнения к L-глутамин, 10 ММ гидрокортизон 21-гемисуцина соли натрия (HCC), 1% пенициллин / стрептомицин (окончательная концентрация на 100 МЕ /мл и 100 мкг/мл, соответственно). Для каждого среднего изменения дополнить необходимый объем с OSM и HGF (окончательные концентрации на 20 нг/мл и 10 нг/мл, соответственно).
ПРИМЕЧАНИЕ: Храните бульон при 4 градусах по Цельсию и используйте в течение двух недель. - Сделать гепатоцитов поддержания среды, состоящей из Уильяма E среды дополняется 10% нокаутом замены сыворотки, состоящий из 1% от альтернативного дополнения к L-глутамин, 1% пенициллин / стрептомицин (окончательные концентрации на 100 МЕ /мл и 100 мкг/мл, соответственно). Для каждого среднего изменения дополнить необходимый объем hGF, EGF, bFGF и VEGF (окончательная концентрация каждого фактора роста на уровне 10 нг/мл).
ПРИМЕЧАНИЕ: Храните бульон при 4 градусах по Цельсию и используйте в течение двух недель.
- Проверьте гепатосферу формирования 24 ч после посева и инициировать дифференциации гепатоцитов. Тщательно удалите mTeSR1 среды и заменить его 1 мл свежей эндодерм дифференциации среды дополнены 100 нг / мл активицин А и 50 нг /мл Wnt3a.
- Изменение дополнено эндодерм грунтовки среды каждые 24 ч в течение 3 дней для hESCs. При работе с hiPSCs, продлить этот этап еще на 2 дня, дополняя средства массовой информации с активицином А (100ng/mL) в одиночку.
- После окончательной индукции эндодерма, переключитесь на среду дифференциации гепатобластов для спецификации гепатобластов в течение 5 дней, заменяя среду каждые 2 дня, и выполните последнее изменение в последний день спецификации гепатобластов.
- Перенос гепатосферв в поли-HEMA покрытием скважин.
- Вымойте клетки один раз с гепатоцитов созревания среды без добавок после удаления KSR / DMSO среды и добавить 1 мл гепатоцитов созревания среды дополнены 10 нг / мл HGF и 20 нг /мл OSM.
- Используя пипетку P1000, поднимите гепатосферы из микроплиты агарозы, несколько раз подняв и опуская раствор.
- Перенесите среду, содержащую гепатосферы, в поли-HEMA покрытием хорошо.
- Вымойте микроплиту агарозы с помощью 1 мл среды созревания гепатоцитов, дополненной 10 нг/мл HGF и 20 ng/mL OSM и перенесите среду на поли-HEMA с покрытием.
- Повторите шаг 3.6.4 как много времен как возможно для того чтобы перенести все hepatospheres от микроплиты агарозы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно тщательно пипетку вверх и вниз раствор, содержащий гепатосферы, чтобы избежать повреждения их.
- Тщательно аспирировать избыток среды без удаления гепатосферы с помощью пипетки P100 до 1 мл среды, содержащей гепатосферы остается в поли-HEMA покрытием хорошо.
- Изменение среды каждые 48 ч в течение 12 дней.
- На 20-й день при работе с hESCs или день 22 при работе с hiPSCs, переключить средний на гепатоцитов среднего.
- Удалить гепатоцитов созревания среды и мыть клетки один раз с гепатоцитов поддержания среды без добавок. Добавьте 1 мл средних эксплуатационных работ гепатоцитов, дополненных 10 нг/мл HGF, EGF, FGF и VEGF.
- Изменение среды для свежего гепатоцитов обслуживания среды каждые 48 ч.
4. Функциональный анализ долгосрочных культурных 3D гепатосфер
- Переключитесь на среду созревания гепатоцитов, дополненную 10 МКм HCC, L-глютамином, 1% пенициллином/стрептомицином (окончательные концентрации на уровне 100 МЕ/мл и 100 мкг/мл соответственно) и 10 нг/мл HGF 48 h до выполнения функционального анализа.
-
Анализ гепатоцитов метаболической функции с помощью цитохрома (CYP) P450 анализы.
- Замените среду с 1 мл свежего гепатоцита созревания среды дополнены 50 мкм люциферин-6'-пентафторо-бензил эфир (люциферин-ПФБЭ) субстрата для обнаружения CYP3A базальной активности или 100 мкм люциферин-метил-эфир (люциферин-ME) субстрата для обнаружения CYP12 базальной активности (количество репликатов No 3). Использование тканевой культуры средств массовой информации в качестве отрицательного контроля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание перекрестной реактивности рекомендуется не использовать те же скважины, содержащие 3D гепатосферы, для тестирования различных видов деятельности CYP P450, а выполнять их в отдельных скважинах. - Инкубировать клетки для 24 ч при 37 с.
- Соберите супернатанты с помощью наконечника пипетки P100 и проведите ажиотажа в рамках инструкций производителя.
- Измерьте относительные уровни базальной активности и нормализуйте к протеину мг как обусловино анализом bicinchoninic кислоты (BCA).
- Замените среду с 1 мл свежего гепатоцита созревания среды дополнены 50 мкм люциферин-6'-пентафторо-бензил эфир (люциферин-ПФБЭ) субстрата для обнаружения CYP3A базальной активности или 100 мкм люциферин-метил-эфир (люциферин-ME) субстрата для обнаружения CYP12 базальной активности (количество репликатов No 3). Использование тканевой культуры средств массовой информации в качестве отрицательного контроля.
-
Проверьте выработку белка сыворотки с помощью ферментно-связанного иммуносорбента (ELISA).
- Замените среду 1 мл свежей среды созревания гепатоцитов, дополненной 10 нг/мл HGF и 20 нг/мл OSM (количество репликаций No 3). Использование тканевой культуры средств массовой информации в качестве отрицательного контроля.
- Инкубировать клетки для 24 ч при 37 с.
- Соберите супернатант с помощью наконечника пипетки P100 и измерьте относительные уровни производства белка сыворотки в рамках инструкций производителя.
- Нормализация на мг белка, как это определено BCA Анализ.
5. Иммуноцитохимия
-
Приготовление парафиновых секций, содержащих гепатосферы.
- Вымойте гепатосферы три раза с 1x DPBS.
- Зафиксните гепатосферы с ледяным метанолом в течение 30 мин.
- Вымойте три раза с 1x DPBS.
- Вставьте гепатосферы в 300 qL закаленного раствора 2% агаросы, растворенного в H2O, используя пустой колодец 24-хорошей пластины в виде плесени и оставьте ее затвердеть в течение 30 мин.
- Встраивай агароз, содержащий гепатосферы в парафин.
- Раздел парафиновый блок, содержащий фиксированные гепатосферы в 4 мкм толщиной разделов с использованием микротома.
-
Де-воще и регидратация секций.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте свежие решения, когда это возможно. Не используйте решения, которые были на окрашивание корыта дольше, чем на неделю.- Поместите секции в стеллажную стойку.
- Погрузить слайд-стойку, содержащую секции в окрашивание корыта, содержащего 300 мл ксилена в течение 5 мин.
- Повторите шаг 5.2.2.
- Погрузитесь в абсолютный этанол на 20 с.
- Погрузитесь в 95% этанола на 20 с.
- Погрузитесь в 90% этанола на 20 с.
- Погрузитесь в 80% этанола на 20 с.
- Погрузитесь в 70% этанола на 20 с.
- Увлажняй секции водой в течение 5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте слайды в той же стойке слайда и переместите ее из одного окрашивания в другой. Используемый объем (обычно 300 мл) зависит от размера окрашивания корыта.
-
Антиген азаг парафина разделы, содержащие гепатосферы.
- Тепло де-воска и регидратированных секций в 1x Tris-EDTA (TE) pH 9.0 буферный раствор в течение 15 минут в микроволновой печи на 800 Вт.
- Охладите образцы, погрузив их в водопроводную воду в течение 5 мин.
-
Иммуностоинг.
- Инкубировать слайды с блокирующим раствором из PBS с 0,1% полисорбат 20 (PBS/T)/10% BSA за 1 ч на RT.
- Замените блокирующий раствор соответствующим первичным антителом, разбавленным в PBS/T/1% BSA, и инкубация при 4 градусах Цельсия с нежным возбуждением на ночь.
- Вымойте клетки pbS/T в течение 5 мин и повторите три раза.
- Инкубировать с соответствующими вторичными антителами, разбавленными в PBS/T/1% BSA и инкубировать в темноте на RT в течение 1 ч с нежным возбуждением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизированные первичные и вторичные антитела перечислены в таблицематериалов. - Вымойте клетки pbS/T в течение 5 мин и повторите три раза.
- Добавьте 4',6-diamidino-2-penylindole (DAPI) в клетки в соответствии с инструкциями производителя и поместите стеклянный покрывало мягко, чтобы уменьшить пузырьки воздуха. Держите фиксированные клетки при 4 градусах по Цельсию в темноте. Наблюдайте за окрашиванием под микроскопом с соответствующим фильтром и люминесцентной лампой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Храните тарелки при 4 градусах по цельсию в темноте до визуализации.
Representative Results
Трехмерные агрегаты из эмбриональной линии стволовых клеток (H9) или индуцированной плюрипотентной линии стволовых клеток (P106) были дифференцированы по отношению к линии гепатоцитов с помощью нашей определенной процедуры (Рисунок 1). Плюрипотентные стволовые клетки были впервые загрунточены к окончательному эндодерму до спецификации гепатобластов. После этого, гепатобласты созрели в 3D гепатосферы, которые могут быть сохранены в культуре до одного года23.
Для изучения структуры 3D сфер были зафиксированы, разделены и окрашены 30 дневные сферы hESC или iPSC, чтобы обнаружить наличие белков, выраженных в гепатоцитах и мезенхимальных клетках. Гепатоциты ядерного фактора 4 альфа (HNF4 ) и мезенхимальный маркер vimentin были использованы, выявление наличия внешнего слоя, состоящего из гепатоцитов, как клетки, окружающие ядро мезенхимальных клеток (Рисунок 2). Мы следили за этими экспериментами, анализируя экспрессию белков, выраженных в гепатоцитах: альбумин, CYP3A и E-кадерин. Иммуностоинг показал, что экспрессия этих белков была ограничена внешним слоем сфер(рисунок 3).
Функциональный анализ гепатосфер были проведены в 30 культурах дня. CYP1A2 и CYP3A являются важными ферментами в функциональных гепатоцитах. Их деятельность оценивалась с помощью установленных анализов. H9-производных гепатосферы выставлены cyP3A активность 220,375 74514 RLU/mL/мл белка и CYP1A2 деятельности 732,440 и 33,330 RLU/mL/мл белка (Рисунок 4A). Активность CYP3A в гепатосферах P106 составила 132117 и 43 391 RLU/mL/мм белка и активность CYP1A2 составила 409 907 ю 121 723 RLU/mL/мм белка(рисунок 4B). По сравнению с двумя партиями первичных гепатоцитов человека, 3D сферы печени отображаются респектабельные уровни активности CYP10.
Анализ синтеза и секреции альбумина и альфа-фетопротеина (АФП) показал, что H9-производные гепатосферы выделяются 683,9 и 159 и 20 нг/мл/24 ч/мг белка альбумина и альфа-фетопротеина, соответственно(рисунок 5A). В то время как P106-полученных гепатосферы выделяются 497 41 и 756 24 нг /мл/24 ч/мг белка альбумина и альфа-фетопротеина, соответственно(рисунок 5B).
Рисунок 1 : Пошаговая процедура дифференциации для генерации 3D гепатосфер из hESCs. Синие скобки представляют собой дни дифференциации для hiPSCs. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Структурная реорганизация 3D гепатосфер. Репрезентативные изображения выражения гепатоцитов ядерного фактора 4 альфа (HNF4 - зеленый) и vimentin (красный) в (A) H9 полученных 3D гепатосферы и ( B ) P106 полученных 3D гепатосферы и их соответствующие иммуноглобулин G (IgG) управления . Шкала баров представляют 60 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : Оценка экспрессии печеночного маркера в 3D гепатосферах. Репрезентативные изображения выражения маркеров гепатоцитов - альбумин, CYP3A, E-cadherin и их соответствующие igG управления в (A) H9- и (B) P106 полученных 3D гепатосферы. Шкала баров 60 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 : Цитохром P450 функции в 3D гепатосферы. Измерение активности цитохрома P450 1A2 и 3A в (A) H9-производных 3D гепатосферах и (B)P106-полученных 3D гепатоспах. Данные представляют собой среднее значение трех биологических репликаций, а бары ошибок представляют стандартное отклонение (SD). Активность приводится в качестве относительных единиц света (RLU) на мл на мг белка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5 : Анализ секреции белка гепатосферы. Секреция альбумина и альфа-фетопротеина (AFP) была проанализирована в (A) H9-производных 3D гепатосфери и (B) P106 полученных 3D гепатосфер. Данные репрезентативны трех биологических репликаций, а бары ошибок представляют SD. Засекреченный белок котируется как нанограммы белка на мл на 24 ч на мг белка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Discussion
Разработка определенных и ксено-свободных систем для производства гепатосфер в 3D требуется как для in vitro, так и для in vivo. В настоящее время большинство подходов к дифференциации гепатоцитов из пурипотентных стволовых клеток человека выполняются в двухмерных культурах адептов. Эти среды отсутствие многих экологических сигналов, участвующих в генезис тканей и гомеостаза, которые включают в себя; гетеротипические взаимодействия клеток, производство матрицы и ремоделирование, в результате плохого перевода в in vivo биологии18,19.
В результате, исследования были сосредоточены на альтернативных подходах к генерации гепатосфер из плюрипотентных стволовых клеток. Ряд 3D-исследований продвинулись области, но те зависят от продуктов животного происхождения20,22,24 для обеспечения поддержки и / или требуют использования человеческих тканей21,22, что усложняет масштабирование технологий и компрометирует экспериментальную воспроизводимость и применение.
Процедура, описанная в нашей статье(Рисунок 1) определена, эффективна, высоко воспроизводима и экономически эффективна, что позволяет производство функциональных сфер печени, которые остаются функциональными в течение года в пробирке и обеспечивают критическую поддержку печени в vivo14. Важно отметить, что эта платформа позволяет пользователю контролировать размер 3D печенок, ограничивая образование плотных некротических центров и потерю фенотипа.
Передача 3D гепатосфер в поли-HEMA покрытием пластин представляет собой критический шаг в этом протоколе. Важно, чтобы пипетка мягко на данном этапе в процедуре, чтобы избежать повреждения сферы. Кроме того, изменения мультимедиа должны быть выполнены тщательно, чтобы избежать напряжения сдвига и искажения структуры сферы.
В этих исследованиях, 3D гепатосферы отображается организованная структура(Рисунок 2 и Рисунок 3), цитохром P450 функции (Рисунок4) и выделяется печени белков, в том числе альбумин и альфа-фетопротеин (Рисунок 5). Эта процедура была успешно выполнена в четырех плюрипотентных линий стволовых клеток с сопоставимыми исходами. Заглядывая в будущее, эта технология может быть использована в качестве платформы для разработки дальнейших эндодермальных и мезенхимальных тканей со сложными архитектурами.
Disclosures
Дэвид С. Хэй является соучредителем и акционером Stemnovate Ltd и HigherSteaks Ltd. Остальные авторы удостоверяют, что у них нет конфликта интересов в предмете или материалах, обсуждаемых в этой статье.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано наградами от Платформы регенеративной медицины Великобритании (MRC MR/L022974/1) и Главного научного управления (TCS/16/37).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture and functional assays | |||
| Agarose | Fisher Bioreagents | 10766834 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| beta-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
| DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
| Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050 | |
| HepatoZYME-SFM | Life Technologies | 17705021 | |
| Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
| Human Alpha Fetoprotein ELISA | Alpha Diagnostics | 500 | |
| Human Basic Fibrobaslt Growth Factor | Peprotech | 100-18B | |
| Human Epithelial Gropwth Factor | Peprotech | 236-EG | |
| Human Hepatocyte Growth Factor | Peprotech | 100-39 | |
| Human Oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
| Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
| Human Serum Albumin ELISA | Alpha Diagnostics | 1190 | |
| Human Vascular Growth Factor | Bio-techne | 293-VE | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H4881 | |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829 | |
| Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828 | |
| Micro-mold spheroids | Sigma-Aldrich | Z764000 | |
| mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
| Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 | |
| P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System | Promega | V8771 | |
| P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System | Promega | V8801 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
| poly-HEMA (Poly 2-hydorxyethyl methacrylate) | Sigma-Aldrich | P3932 | |
| Recombinant mouse Wnt3a | Bio-techne | 1324-WN-500/CF | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 21875 | |
| Equipment | |||
| Microwave | Bosch | ||
| Microtome | Leika | RM2125RT | |
| Oven | Thermoscientific | ||
| Antibodies | |||
| Primary antibodies | |||
| Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:100 (mouse) |
| CYP3A4 | University of Dundee | University of Dundee | 1:200 (sheep) |
| E-cadherin | Abcam | ab76055 | 1:200 (mouse) |
| HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:100 (rabbit) |
| IgG | DAKO | X0943 | 1:400 |
| Vimentin | DAKO | M0725 | 1:100 (sheep) |
References
- Hay, D. C., et al. Direct differentiation of human embryonic stem cells to hepatocyte-like cells exhibiting functional activities. Cloning and Stem Cells. 9 (1), 51-62 (2007).
- Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (34), 12301-12306 (2008).
- Hay, D. C., et al. Efficient Differentiation of Hepatocytes from Human Embryonic Stem Cells Exhibiting Markers Recapitulating Liver Development In vivo. STEM CELLS. 26 (4), 894-902 (2008).
- Hannan, N. R., Segeritz, C. -P., Touboul, T., Vallier, L. Production of hepatocyte like cells from human pluripotent stem cells. Nature protocols. 8 (2), 430-437 (2013).
- Loh, K. M., et al. Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations. Cell Stem Cell. 14 (2), 237-252 (2014).
- Sullivan, G. J., et al. Generation of Functional Human Hepatic Endoderm from Human iPS cells. Hepatology. 51 (1), 329-335 (2010).
- Si-Tayeb, K., et al. Highly Efficient Generation of Human Hepatocyte-like Cells from Induced Pluripotent Stem Cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
- Wang, Y., et al. Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (121), (2017).
- Meseguer-Ripolles, J., Lucendo-Villarin, B., Wang, Y., Hay, D. C. Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
- Cameron, K., et al. Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1250-1262 (2015).
- Zhou, X., et al. Modulating Innate Immunity Improves Hepatitis C Virus Infection and Replication in Stem Cell-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 3 (1), 204-214 (2014).
- Lyall, M. J., et al. Modelling non-alcoholic fatty liver disease in human hepatocyte-like cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170362 (2018).
- Szkolnicka, D., et al. Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs. Stem Cells Translational Medicine. 5 (6), 764-772 (2016).
- Lucendo-Villarin, B., et al. Modelling foetal exposure to maternal smoking using hepatoblasts from pluripotent stem cells. Archives of Toxicology. 91 (11), 3633-3643 (2017).
- Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 120 (9), 3127-3136 (2010).
- Godoy, P., et al. Gene networks and transcription factor motifs defining the differentiation of stem cells into hepatocyte-like cells. Journal of Hepatology. 63 (4), 934-942 (2015).
- Lucendo-Villarin, B., Rashidi, H., Cameron, K., Hay, D. C. Pluripotent stem cell derived hepatocytes: using materials to define cellular differentiation and tissue engineering. Journal of Materials Chemistry B, Materials for Biology and Medicine. 4 (20), 3433-3442 (2016).
- Fang, Y., Eglen, R. M. Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development. Slas Discovery. 22 (5), 456-472 (2017).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Gieseck, R. L., et al. Maturation of Induced Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes by 3D-Culture. PLoS ONE. 9 (1), (2014).
- Takebe, T., et al. Generation of a vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature Protocols. 9 (2), 396-409 (2014).
- Camp, J. G., et al. Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency. Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).
- Rashidi, H., et al. 3D human hepatospheres from pluripotent stem cells displays stable phenotype in vitro and supports compromised liver function in vivo. Archives of Toxicology. 92 (10), 3117-3129 (2018).
- Takebe, T., et al. Massive and Reproducible Production of Liver Buds Entirely from Human Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 21 (10), 2661-2670 (2017).
