Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att producera hepatospheres från humana pluripotenta stamceller med hjälp av ett definierat kultur system och cell Self-församling. Detta protokoll är reproducerbara i ett antal cellinjer, kostnadseffektiv och tillåter produktion av stabila mänskliga hepatospheres för biomedicinsk tillämpning.
Abstract
Utvecklingen av förnybara källor av levervävnad krävs för att förbättra cellbaserad modellering, och utveckla mänsklig vävnad för transplantation. Mänskliga embryonala stamceller (hESCs) och humana inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) representerar lovande källor till mänskliga lever sfärer. Vi har utvecklat en serum fri och definierad metod för cellulära differentiering att generera tredimensionella mänskliga lever sfärer bildas från mänskliga pluripotenta stamceller. En potentiell begränsning av tekniken är produktionen av täta sfärer med döda material inuti. För att kringgå detta har vi anställt aguppstod mikrobrunn teknik vid definierade cell tätheter för att kontrollera storleken på 3D-sfärer, vilket förhindrar generering av apoptotiska och/eller nekrotiska kärnor. Särskilt, de sfärer som genereras av vår strategi visar leverfunktion och stabil fenotyp, som representerar en värdefull resurs för grundläggande och tillämpad vetenskaplig forskning. Vi anser att vår strategi skulle kunna användas som en plattformsteknik för att utveckla ytterligare vävnader för att modellera och behandla mänskliga sjukdomar och i framtiden kan tillåta generering av mänsklig vävnad med komplex vävnads arkitektur.
Introduction
Förmågan hos humana pluripotenta stamceller (hPSCs) att själv förnya, samtidigt behålla pluripotensen, ger en möjlighet att producera mänskliga celltyper och vävnader på efterfrågan. hpscs har effektivt differentierats till hepatocyte-liknande celler (hlcs) med hjälp av tvådimensionella (2D) anhängare kultur system1,2,3,4,5,6 ,7,8,9,10. Dessa system har använts för att framgångsrikt modellera monogena sjukdomar, virusets livscykel, läkemedelsinducerad leverskada (Dili), fosterexponering för toxiner och alkoholfria fettlever (NAFLD)11,12,13 ,14,15. Men dessa modeller har vissanackdelar, som begränsar deras rutinmässig användning. Dessa inkluderar fetalt markör uttryck, instabil fenotyp och dålig vävnads arkitektur16,17,18,19, som också kan begränsa extrapolering till organfunktion in vivo.
För att övervinna dessa begränsningar, tredimensionell (3D) differentiering plattformar har utvecklats för att efterlikna in vivo vävnad arkitektur. Även om det är möjligt, dessa metoder förlitar sig på användningen av animaliska produkter och matriser för att driva vävnad Genesis20,21,22, begränsa skala upp och utbredd tillämpning.
Här, vi detaljförfaranden för att generera stora mängder 3D hepatospheres från hPSCs med definierade material och cell Self-församling. Särskilt, vävnaden som genereras av vårt förfarande förblir funktionell för mer än ett år i cellkulturen och kan stödja leverfunktionen i vivo23.
Sammanfattnings, vår definierade differentiering tillvägagångssätt möjliggör generering av stabila mänskliga hepatospheres från både mänskliga embryonala stamceller (hESCs) och inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs). Vi anser att det beskrivna förfarandet utgör ett betydande genombrott i utvecklingen av 3D-hepatosfärer för grundläggande och tillämpad vetenskaplig forskning.
Protocol
1. beredning av agaros Mikroplattformar
Anmärkning: Medier som används för dessa experiment skall vara sterila och i rumstemperatur (RT) för cellodling.
-
Förbered 2% aguppstod formar.
- Lös 2 g låg smälttemperatur aguppstod i 100 mL steriliserat destillerat vatten. Värm försiktigt i en mikrovågsugn med intervall skakningar för att lösa upp helt.
- Tillsätt 520 μL smält aguppstod till en 256-väl format mögel och låt stelna.
- Överföra varje agaros mikroplatta till en enda brunn på en 12-brunn tallrik.
- Tillsätt 1,5 mL 1x Dulbecco ' s fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) med ca2 +/mg2 + till varje brunn och ta bort luftbubblorna från mikrobrunnarna genom att försiktigt Pipettera upp och ner flera gånger med hjälp av en P1000 pipettspets. Detta utförs för att säkerställa en enhetlig cell sådd.
Anmärkning: Agaros mikroplattor kan förvaras i upp till 6 månader vid 4 ° c i 1x DPBS.
2. seedning av humana pluripotenta stamceller till Aguppkom Microwell plattor
-
Beredning av cellsuspension
- Aspirera mediet från en odifferentierad kultur av hPSCs som tidigare beskrivits8.
Anmärkning: hpscs odlas på LN-521 i mTeSR1 med mediet förändrats varje 24 h, och blint regelbundet när cellerna når 75% till 85% av confluency som tidigare beskrivits8. - Skölj cellerna med 5 mL RT 1x DPBS utan ca2 +/mg2 + och ta bort bufferten.
- Tillsätt 5 mL av 1x cell dissociation reagens (tabell över material) till cellerna och tillåta cell dissociation av inkuberande celler vid 37 ° c för 6-8 min.
Anmärkning: För att stoppa reaktionen, undersöka cell avlossning under mikroskopet. Cellerna bör delvis lossas från plattan. Förläng inkuberingen för en extra 1-2 min om längre tid krävs. - Stoppa reaktionen genom att ta bort cell dissociation reagens och tillsätt 5 mL färskt mTeSR1 medium kompletterat med 10 μM Rho-associerad Kinas (ROCK) inhibitor Y27632 till cellerna. Separera celler genom att Pipettera upp och ner flera gånger med hjälp av en P1000 pipettspets.
- Räkna de livskraftiga cellerna med hjälp av en hemocytometern och trypan Blåfärgning uteslutning. Efter detta, Förbered cellsuspensionen vid den erforderliga koncentrationen.
- Beräkna det totala antalet celler som behövs. För 3D hepatosphere differentiering, utsäde 3,84 x 105 celler per aguppstod mikroplatta att generera spheroids med 100-150 μm i diameter.
- Överför önskat antal celler till en steril 15 mL eller 50 mL Centrifugera röret och centrifugera röret på 200 x g för 5 min vid RT att pelleten cellerna.
- Aspirera och Kassera supernatanten och Omsuspendera cellerna i mTeSR1 medium plus 10 μM ROCK inhibitor Y27632. Späd ut cellpelleten i lämplig volym av medel till en slutlig koncentration av 2,1 x 106 celler/ml.
- Aspirera mediet från en odifferentierad kultur av hPSCs som tidigare beskrivits8.
-
Sådd cellerna till den beredda agaros mikroplattor
Anmärkning: om du använder kylskåp-lagrade aguppkom mikroplattor, placera dem i cellinkubatorn vid 37 ° c i minst en timme före användning och aspirera 1x DPBS från brunnen före cell sådd.- Tillsätt 190 μL av cellsuspensionen i agaros microwell.
- Efter sådd, returnera plattorna till cellinkubatorn vid 37 ° c och 5% CO2 för 2 h för att låta cellerna att bosätta sig.
- Efter 2 h, tillsätt 1 mL färskt och varmt mTeSR1 medium kompletterat med 10 μM ROCK inhibitor Y27632 till varje brunn.
- Returnera plattorna till cellinkubatorn vid 37 ° c och 5% CO2 för 24 h och undersök bildandet av sfärer nästa dag för att tillåta cellerna att fästa.
3. differentiera hPSCs till 3D Hepatospheres på Aguppkom Microwells
- Beredning av poly-2-hydroxyethyl metakrylat (poly-HEMA) belagda brunnar
- Lös 2 g Poly-HEMA i 100 mL 95% etanol. Rör om lösningen över natten med en värmeplatta vid 55 ° c. Tillsätt 250 μL Poly-HEMA lösning per brunn av en 24-brunn tallrik och torka över natten vid 60 ° c med hjälp av en ugn.
- Beredning av differentierings mediet
- Förbered en 1000 x stamlösning av mänsklig aktivitet A genom att lösa upp humant Activin ett frystorkat protein i sterilt 0,2% bovint serum albumin (BSA)/DPBS till en slutlig koncentration på 100 μg/mL. Förvara vid-20 ° c i små alikvoter. Använd vid 1:1000.
- Förbered en 1000 x stamlösning av Wnt3a genom att lösa mus Wnt3a frystorkat protein i sterila 0,2% BSA/DPBS till en slutlig koncentration av 10 μg/mL. Förvara vid-20 ° c i små alikvoter. Använd på 1:200.
- Förbered en 1000X stamlösning av Human hepatocyte tillväxtfaktor (HGF) genom att lösa humant HGF frystorkat protein i sterila 0,2% BSA/DPBS till en slutlig koncentration av 10 μg/mL. Förvara vid-20 ° c i små alikvoter. Använd vid 1:1000.
- Bered en 1 000 x stamlösning av onkostatin M (OSM) genom att lösa upp OSM i sterila 0,2% BSA/DPBS till en slutlig koncentration på 20 μg/mL. Förvara vid-20 ° c i små alikvoter. Använd vid 1:1000.
- Bered en 1000X stamlösning av epitelial tillväxtfaktor (EGF) genom att lösa upp det frystorkade proteinet i sterila 0,2% BSA/DPBS till en slutlig koncentration av 10 μg/mL. Förvara vid-20 ° c i små alikvoter. Använd vid 1:1000.
- Förbered en 1000X stamlösning av grundläggande fibroblasttillväxtfaktor (bFGF) genom att lösa upp det frystorkade proteinet i sterila 0,2% BSA/DPBS till en slutlig koncentration av 10 μg/mL. Förvara vid-20 ° c i små alikvoter. Använd vid 1:1000.
- Bered en 1000X stamlösning av vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF) genom att lösa upp det frystorkade proteinet i 0,2% BSA/DPBS till en slutlig koncentration på 10 μg/mL. Förvara vid-20 ° c i små alikvoter. Använd vid 1:1000.
- Gör endoderm differentiering medium bestående av Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) basal medium kompletteras med 2% B27 tillägg (50x, utan insulin), och 1% penicillin/streptomycin (slutliga koncentrationer: 100 IU/mL och 100 μg/mL, respektive). Om inte indicerat, vid varje medium förändring, komplettera den begärda volymen med Wnt3a och Activin A vid en slutlig koncentration av 50 ng/mL och 100 ng/mL, respektive.
Anmärkning: Förvaras vid 4 ° c och Använd inom två veckor. - Gör hepatoblast differentiering medium bestående av knockout Dulbecco modifierade Eagle medium (KO-DMEM) med 20% knockout serum Replacement (KOSR) och kompletteras med 0,5% av ett alternativt komplement till L-glutamin, 1% icke-essentiella aminosyror (NEAA), 0,1 mM beta-merkaptoetanol, 1% dimetylsulfoxid (DMSO) och 1% penicillin/streptomycin (slutliga koncentrationer vid 100 IU/mL respektive 100 μg/mL). Filter under vakuum.
Anmärkning: Förvaras vid 4 ° c och Använd inom två veckor. - Gör hepatocyte mognadssmedel bestående av hepatocyte medium kompletterat med 1% av ett alternativt komplement till L-glutamin, 10 μM hydrokortison 21-hemisuccinat natriumsalt (HCC), 1% penicillin/streptomycin (slutliga koncentrationer vid 100 IU/mL och 100 μg/mL). För varje medium förändring, komplettera den begärda volymen med OSM och HGF (slutliga koncentrationer vid 20 ng/mL och 10 ng/mL, respektive).
Anmärkning: Förvara beståndet vid 4 ° c och Använd inom två veckor. - Gör hepatocyte underhålls medium bestående av Williams E medium kompletteras med 10% knockout serum Replacement, bestående av 1% av ett alternativt komplement till L-glutamin, 1% penicillin/streptomycin (slutliga koncentrationer vid 100 IU/mL och 100 μg/mL, respektive). För varje medium förändring, komplettera den begärda volymen med HGF, EGF, bFGF och VEGF (slutlig koncentration av varje tillväxtfaktor vid 10 ng/mL).
Anmärkning: Förvara beståndet vid 4 ° c och Använd inom två veckor.
- Kontrollera hepatosphere formation 24 h post sådd och initiera hepatocyte differentiering. Ta försiktigt bort mTeSR1 mediet och Ersätt det med 1 mL färskt endoderm differentierings medium kompletterat med 100 ng/mL Activin A och 50 ng/mL Wnt3a.
- Ändra kompletterat endoderm priming medium varje 24 h för 3 dagar för hESCs. När du arbetar med hiPSCs, förlänga detta skede för ytterligare 2 dagar komplettera media med Activin A (100ng/mL) ensam.
- Efter definitiv endoderm induktion, Byt till hepatoblast differentiering medium för hepatoblast specifikation för 5 dagar ersätter mediet varje 2 dagar och utföra den sista förändringen på den sista dagen i hepatoblast specifikationen.
- Överför hepatospheres i Poly-HEMA belagda brunnar.
- Tvätta cellerna en gång med hepatocyte mognad medium utan tillskott efter avlägsnande av KSR/DMSO medium och tillsätt 1 mL hepatocyte mognadens medium kompletteras med 10 ng/mL HGF och 20 ng/mL OSM.
- Med hjälp av en P1000 pipett, lyft upp hepatospheres från aguppen mikroplattan genom Pipettera upp och ner lösningen flera gånger.
- Överför mediet som innehåller hepatospheres till en poly-HEMA belagda väl.
- Tvätta aguppstod mikroplattan med 1 mL hepatocyte mognadens medium kompletteras med 10 ng/mL HGF och 20 ng/mL OSM och överföra mediet till Poly-HEMA belagda väl.
- Upprepa steg 3.6.4 så många gånger som möjligt för att överföra alla hepatospheres från aguppstod mikroplattan.
Anmärkning: Det är viktigt att försiktigt Pipettera upp och ner lösningen som innehåller hepatospheres för att undvika att skada dem.
- Försiktigt aspirera överskott medium utan att ta bort hepatospheres med hjälp av en P100 pipett tills ~ 1 mL medium som innehåller de hepatospheres kvar i Poly-HEMA belagda väl.
- Byt medium var 48 h i 12 dagar.
- Vid dag 20 när du arbetar med hESCs eller dag 22 om du arbetar med hiPSCs, byta medium till hepatocyte underhålls medium.
- Avlägsna hepatocyte mognad medium och tvätta celler en gång med hepatocyte underhålls medium utan kosttillskott. Tillsätt 1 mL hepatocyte underhålls medium kompletterat med 10 ng/mL HGF, EGF, FGF och VEGF.
- Ändra mediet för färskt hepatocyte underhålls medium varje 48 h.
4. funktionell analys av långsiktiga odlade 3D Hepatospheres
- Byt till hepatocyte mognadskoncentrat kompletterat med 10 μM HCC, L-glutamin, 1% penicillin/streptomycin (slutliga koncentrationer vid 100 IU/mL respektive 100 μg/mL) och 10 ng/mL HGF 48 h innan funktionell analys utförs.
-
Analysera hepatocyte metabolisk funktion med cytokrom (CYP) P450-analyser.
- Ersätt medium med 1 mL färskt hepatocyte mognads medium kompletterat med 50 μM Luciferin-6 '-pentafluoro-bensyleter (Luciferin-PFBE) substrat för att detektera CYP3A-basal aktivitet eller 100 μM Luciferin-metyleter (Luciferin-ME) substrat för att detektera CYP1A2 basal aktivitet (antal replikat = 3). Använd vävnads odlingsmedier som en negativ kontroll.
Anmärkning: För att undvika korreaktivitet, rekommenderas att inte använda samma brunnar som innehåller 3D-hepatosfärer för att testa olika CYP P450-aktiviteter utan att utföra dem i enskilda brunnar. - Inkubera celler för 24 h vid 37 ° C.
- Samla samman supernatanterna med hjälp av en P100 pipett spets och utföra analysen enligt tillverkarens anvisningar.
- Mät de relativa nivåerna av basal aktivitet och normalisera till per mg protein som bestäms av och Acid assay (BCA).
- Ersätt medium med 1 mL färskt hepatocyte mognads medium kompletterat med 50 μM Luciferin-6 '-pentafluoro-bensyleter (Luciferin-PFBE) substrat för att detektera CYP3A-basal aktivitet eller 100 μM Luciferin-metyleter (Luciferin-ME) substrat för att detektera CYP1A2 basal aktivitet (antal replikat = 3). Använd vävnads odlingsmedier som en negativ kontroll.
-
Testa produktionen av serumproteiner med hjälp av enzymkopplad immunsorbent analys (ELISA).
- Ersätt medium med 1 mL färskt hepatocytmognadmedium kompletterat med 10 ng/mL HGF och 20 ng/mL OSM (antal replikat = 3). Använd vävnads odlingsmedier som en negativ kontroll.
- Inkubera celler för 24 h vid 37 ° C.
- Samla supernatanten med hjälp av en P100 pipett spets och mäta de relativa nivåerna av serumprotein produktion enligt tillverkarens anvisningar.
- Normaliseras till protein per mg, vilket bestäms av BCA-analysen.
5. immunocytokemi
-
Beredning av paraffin avsnitt som innehåller hepatospheres.
- Tvätta hepatospheres tre gånger med 1x DPBS.
- Fixa hepatospheres med iskall metanol i 30 min.
- Tvätta tre gånger med 1x DPBS.
- Bädda in de hepatospheres i 300 μL av en tempererad lösning av 2% aguppstod upplöst i H2O med en tom brunn av en 24-brunn tallrik som en mögel och låt den stelna i 30 min.
- Bädda in aguppstod som innehåller hepatospheres i paraffin.
- Avsnitt paraffin blocket som innehåller fasta hepatospheres i 4 μm tjocka sektioner med en mikrotom.
-
De-vaxning och rehydrering av sektionerna.
Obs: Använd färska lösningar när det är möjligt. Använd inte lösningar som har legat på infärgning tråg längre än en vecka.- Placera sektioner i ett bild rack.
- Sänk ned glid stället med sektioner i en infärgnings tråg som innehåller 300 mL xylen i 5 min.
- Upprepa steg 5.2.2.
- Sänk ned i absolut etanol i 20 s.
- Sänk ned 95% etanol i 20 s.
- Sänk ned 90% etanol i 20 s.
- Sänk ned 80% etanol i 20 s.
- Sänk ned 70% etanol i 20 s.
- Rehydrera sektionerna med vatten i 5 min.
Anmärkning: Behåll bilderna i samma glid rack och flytta den från en Färgnings tråg till nästa. Volym som används (i allmänhet ~ 300 mL) beror på storleken på infärgning tråg.
-
Antigen hämtning av paraffin sektioner som innehåller hepatosfärer.
- Värmevaxade och rehydrerade sektioner i 1x Tris-EDTA (TE) pH 9,0 buffertlösning för 15 min i mikrovågsugn vid 800 W.
- Svalna proverna genom att doppa dem i kranvatten i 5 min.
-
Immun.
- Inkubera diabilder med blockerande lösning gjord av PBS med 0,1% polysorbat 20 (PBS/T)/10% BSA för 1 h vid RT.
- Ersätt blockerande lösning med lämplig primär antikropp utspädd i PBS/T/1% BSA och inkubera vid 4 ° c med skonsam agitation över natten.
- Tvätta celler med PBS/T i 5 min och upprepa tre gånger.
- Inkubera med lämplig sekundär antikropp utspädd i PBS/T/1% BSA och inkubera i mörker vid RT för 1 h med mild agitation.
Anmärkning: De optimerade primära och sekundära antikropparna listas i tabell över material. - Tvätta celler med PBS/T i 5 min och upprepa tre gånger.
- Tillsätt 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) till cellerna enligt tillverkarens anvisningar och placera en glastäckslip försiktigt för att minska luftbubblor. Hållfasta celler vid 4 ° c i mörker. Observera färgning i Mikroskop med lämplig filter-och lysrörslampa.
Obs: Förvara plattorna vid 4 ° c i mörker tills bilden har
Representative Results
Tredimensionella aggregat från den embryonala stamcells linjen (H9) eller den inducerade pluripotenta stamcells linjen (P106) differentierades mot hepatocytelinjen med hjälp av vårt definierade förfarande (figur 1). Pluripotenta stamceller först primade mot definitiv endoderm före hepatoblast specifikation. Efter detta, hepatoblaster mognat till 3D hepatospheres som skulle kunna upprätthållas i kulturen för upp till ett år23.
För att studera strukturen av 3D-sfärer, 30 dag gamla hESC-eller iPSC-härledda sfärer fastställdes, sektioneras och färgas för att upptäcka närvaron av proteiner som uttrycks i hepatocyter och mesenkymala celler. Hepatocyte nukleär faktor 4 alfa (HNF4α) och mesenkymala markör vimentin var anställda, avslöjar närvaron av ett yttre skikt bestående av hepatocyte som celler som omger en kärna av mesenkymala celler (figur 2). Vi följde dessa experiment analysera uttrycket av proteiner uttrycks i hepatocyter: albumin, CYP3A och E-cadherin. Immunofärgning visade att uttrycket av dessa proteiner begränsades till det yttre lagret av sfärerna (figur 3).
Funktionella analyser av hepatospheres utfördes i dag 30 kulturer. CYP1A2 och CYP3A är viktiga enzymer inom funktionella hepatocyter. Deras verksamhet bedömdes med hjälp av etablerade analyser. H9-härledda hepatosfärer uppvisade CYP3A-aktivitet på 220 375 ± 74514 RLU/mL/mg protein och CYP1A2-aktivitet på 732 440 ± 33 330 RLU/mL/mg protein (figur 4A). CYP3A-aktivitet i P106-härledda hepatosfärer var 132117 ± 43 391 RLU/mL/mg protein och CYP1A2-aktivitet var 409 907 ± 121 723 RLU/mL/mg protein (figur 4B). Jämfört med två partier av humana primära hepatocyter, 3D lever sfärer visas respektabel nivåer av CYP aktivitet10.
Analys av syntesen och utsöndringen av albumin och alfa-fetoprotein (AFP) visade att H9-härledda hepatospheres utsöndrat 683,9 ± 84 och 159 ± 20 ng/mL/24 h/mg protein av albumin och alfa-fetoprotein, respektive (figur 5A). P106-härledda hepatosfärer utsöndrat 497 ± 41 och 756 ± 24 ng/mL/24 h/mg protein av albumin respektive alfa-fetoprotein (figur 5B).
Figur 1 : Stepwise differentiering förfarande för att generera 3D hepatospheres från hESCs. Blå parentes representerar dagar av differentiering för hiPSCs. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Strukturell omorganisering av 3D hepatospheres. Representativa bilder av uttrycket av hepatocyte nukleär faktor 4 alfa (HNF4α-grön) och vimentin (röd) i (a) H9-härledda 3D-hepatosfärer och (B) P106-härledda 3D-hepatosfärer och deras motsvarande immunglobulin G (IgG) kontroller . Skalstreck representerar 60 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Utvärdering av hepatisk markör uttryck i 3D hepatospheres. Representativa bilder av uttrycket av hepatocyte markörer-albumin, CYP3A, E-cadherin och deras motsvarande IgG-kontroller i (a) H9-och (B) P106-härledda 3D-hepatosfärer. Skalstreck = 60 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Cytokrom P450-funktion i 3D-hepatosfärer. Mätning av cytokrom P450 1A2 och 3A aktivitet i (A) H9-härledda 3D-hepatosfärer och (B) P106-härledda 3D-hepatosfärer. Data representerar medelvärdet av tre biologiska replikat och felstaplar representerar standardavvikelsen (SD). Aktivitet anges som relativ ljusenheter (RLU) per mL per mg protein. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Analys av hepatosphere protein sekretion. Utsöndringen av albumin och alfa-fetoprotein (AFP) analyserades i (A) H9-härledda 3D-hepatosfärer och (B) P106-härledda 3D-hepatosfärer. Data är representativa för tre biologiska replikat och felstaplar representerar SD. utsöndras protein citeras som nanogram protein per mL per 24 h per mg protein. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Utvecklingen av definierade och Xeno-fria system för att producera mänskliga hepatospheres i 3D krävs för både in vitro-och in vivo strävanden. För närvarande de flesta hepatocyte differentiering metoder från mänskliga pluripotenta stamceller utförs i två dimensionella anhängare kulturer. Dessa miljöer saknar många av de miljömässiga signaler inblandade i vävnad Genesis och homeostas som inkluderar; heterotypic cell interaktioner, matris produktion och Remodeling, vilket resulterar i dålig översättning till in vivo biologi18,19.
Som ett resultat, forskning har fokuserat på alternativa metoder för att generera hepatospheres från pluripotenta stamceller. Ett antal 3D-studier har avancerat området, men de är beroende av animaliska produkter20,22,24 för att ge stöd och/eller kräva användning av mänsklig vävnad21,22 som komplierar teknik skala upp och äventyrar experimentell reproducerbarhet och tillämpning.
Det förfarande som beskrivs i vår artikel (figur 1) är definierad, effektiv, mycket reproducerbar och kostnadseffektiv, vilket möjliggör produktion av funktionella lever sfärer, som förblir funktionella över ett år in vitro och ge kritisk leverstöd i vivo14. Viktigare, denna plattform tillåter användaren att kontrollera storleken på 3D-levern sfärer, begränsa bildandet av täta nekrotiska centra och förlust av fenotyp.
Överföringen av 3D hepatospheres till Poly-HEMA belagda plattorna utgör ett kritiskt steg i detta protokoll. Det är viktigt att Pipettera försiktigt i detta skede i förfarandet för att undvika att skada sfären. Dessutom måste media förändringar utföras noggrant för att undvika skjuvning stress och snedvridning av sfär struktur.
I dessa studier, 3D-hepatosfärer visas en organiserad struktur (figur 2 och figur 3), cytokrom P450-funktionen (figur 4) och utsöndrat lever proteiner, inklusive albumin och alfa-fetoprotein (figur 5). Detta förfarande har framgångsrikt utförts i fyra pluripotenta stamcellslinjer med jämförbara resultat. Framöver skulle denna teknik kunna användas som en plattform för att utveckla ytterligare endodermala och mesenkymala vävnader med komplexa arkitekturer.
Disclosures
David C. Hay är en av grundarna och aktieägare i Stemnovate Ltd och Higherbiffar Ltd. Resten av författarna intygar att de inte har några intressekonflikter i ämnet eller material som diskuteras i denna artikel.
Acknowledgments
Denna studie stöddes med utmärkelser från den brittiska regenerativ medicin plattform (MRC MR/L022974/1) och Chief Scientist ' s Office (TCS/16/37).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture and functional assays | |||
| Agarose | Fisher Bioreagents | 10766834 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| beta-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
| DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
| Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050 | |
| HepatoZYME-SFM | Life Technologies | 17705021 | |
| Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
| Human Alpha Fetoprotein ELISA | Alpha Diagnostics | 500 | |
| Human Basic Fibrobaslt Growth Factor | Peprotech | 100-18B | |
| Human Epithelial Gropwth Factor | Peprotech | 236-EG | |
| Human Hepatocyte Growth Factor | Peprotech | 100-39 | |
| Human Oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
| Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
| Human Serum Albumin ELISA | Alpha Diagnostics | 1190 | |
| Human Vascular Growth Factor | Bio-techne | 293-VE | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H4881 | |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829 | |
| Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828 | |
| Micro-mold spheroids | Sigma-Aldrich | Z764000 | |
| mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
| Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 | |
| P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System | Promega | V8771 | |
| P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System | Promega | V8801 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
| poly-HEMA (Poly 2-hydorxyethyl methacrylate) | Sigma-Aldrich | P3932 | |
| Recombinant mouse Wnt3a | Bio-techne | 1324-WN-500/CF | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 21875 | |
| Equipment | |||
| Microwave | Bosch | ||
| Microtome | Leika | RM2125RT | |
| Oven | Thermoscientific | ||
| Antibodies | |||
| Primary antibodies | |||
| Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:100 (mouse) |
| CYP3A4 | University of Dundee | University of Dundee | 1:200 (sheep) |
| E-cadherin | Abcam | ab76055 | 1:200 (mouse) |
| HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:100 (rabbit) |
| IgG | DAKO | X0943 | 1:400 |
| Vimentin | DAKO | M0725 | 1:100 (sheep) |
References
- Hay, D. C., et al. Direct differentiation of human embryonic stem cells to hepatocyte-like cells exhibiting functional activities. Cloning and Stem Cells. 9 (1), 51-62 (2007).
- Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (34), 12301-12306 (2008).
- Hay, D. C., et al. Efficient Differentiation of Hepatocytes from Human Embryonic Stem Cells Exhibiting Markers Recapitulating Liver Development In vivo. STEM CELLS. 26 (4), 894-902 (2008).
- Hannan, N. R., Segeritz, C. -P., Touboul, T., Vallier, L. Production of hepatocyte like cells from human pluripotent stem cells. Nature protocols. 8 (2), 430-437 (2013).
- Loh, K. M., et al. Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations. Cell Stem Cell. 14 (2), 237-252 (2014).
- Sullivan, G. J., et al. Generation of Functional Human Hepatic Endoderm from Human iPS cells. Hepatology. 51 (1), 329-335 (2010).
- Si-Tayeb, K., et al. Highly Efficient Generation of Human Hepatocyte-like Cells from Induced Pluripotent Stem Cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
- Wang, Y., et al. Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (121), (2017).
- Meseguer-Ripolles, J., Lucendo-Villarin, B., Wang, Y., Hay, D. C. Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
- Cameron, K., et al. Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1250-1262 (2015).
- Zhou, X., et al. Modulating Innate Immunity Improves Hepatitis C Virus Infection and Replication in Stem Cell-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 3 (1), 204-214 (2014).
- Lyall, M. J., et al. Modelling non-alcoholic fatty liver disease in human hepatocyte-like cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170362 (2018).
- Szkolnicka, D., et al. Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs. Stem Cells Translational Medicine. 5 (6), 764-772 (2016).
- Lucendo-Villarin, B., et al. Modelling foetal exposure to maternal smoking using hepatoblasts from pluripotent stem cells. Archives of Toxicology. 91 (11), 3633-3643 (2017).
- Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 120 (9), 3127-3136 (2010).
- Godoy, P., et al. Gene networks and transcription factor motifs defining the differentiation of stem cells into hepatocyte-like cells. Journal of Hepatology. 63 (4), 934-942 (2015).
- Lucendo-Villarin, B., Rashidi, H., Cameron, K., Hay, D. C. Pluripotent stem cell derived hepatocytes: using materials to define cellular differentiation and tissue engineering. Journal of Materials Chemistry B, Materials for Biology and Medicine. 4 (20), 3433-3442 (2016).
- Fang, Y., Eglen, R. M. Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development. Slas Discovery. 22 (5), 456-472 (2017).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Gieseck, R. L., et al. Maturation of Induced Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes by 3D-Culture. PLoS ONE. 9 (1), (2014).
- Takebe, T., et al. Generation of a vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature Protocols. 9 (2), 396-409 (2014).
- Camp, J. G., et al. Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency. Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).
- Rashidi, H., et al. 3D human hepatospheres from pluripotent stem cells displays stable phenotype in vitro and supports compromised liver function in vivo. Archives of Toxicology. 92 (10), 3117-3129 (2018).
- Takebe, T., et al. Massive and Reproducible Production of Liver Buds Entirely from Human Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 21 (10), 2661-2670 (2017).
