Summary

Lentivirale CRISPR/Cas9-gemedieerde genoom bewerking voor de studie van hematopoietische cellen in ziekte modellen

Published: October 03, 2019
doi:

Summary

Beschreven zijn protocollen voor de zeer efficiënte genoom bewerking van muriene hematopoietische stam en voorlopercellen (HSPC) door het CRISPR/Cas9-systeem om snel muismodel systemen te ontwikkelen met hematopoietische systeemspecifieke genmodificaties.

Abstract

Het manipuleren van genen in hematopoietische stamcellen met conventionele Transgenese benaderingen kan tijdrovend, duur en uitdagend zijn. Met het voordeel van de vooruitgang in de genoom Editing technologie en lentivirusgemedieerde transgen toedieningssystemen, wordt hier een efficiënte en economische methode beschreven die muizen vastlegt waarin genen specifiek worden gemanipuleerd in hematopoietische stamcellen. Lentivirussen worden gebruikt om Cas9-uitverkorende Lineage-negatieve beenmergcellen te leiden met een RNA-gelei (gRNA) gericht op specifieke genen en een rood fluorescentie reporter-gen (RFP), waarna deze cellen worden getransplanteerd in dodelijk bestraalde C57BL/6 muizen. Muizen die worden getransplanteerd met lentivirus die niet-gerichte gRNA uitdrukken, worden gebruikt als besturingselementen. Engraftment van getransduceerde hematopoietische stamcellen wordt geëvalueerd door flowcytometrische analyse van RFP-positieve leukocyten van perifeer bloed. Met behulp van deze methode, ~ 90% transductie van myeloïde cellen en ~ 70% van lymfoïde cellen na 4 weken na transplantatie kan worden bereikt. Genomisch DNA is geïsoleerd van RFP-positieve bloedcellen, en delen van het doelwit van het DNA van de site worden versterkt door PCR om de genoom bewerking te valideren. Dit protocol biedt een evaluatie van de hoge doorvoer van Hematopoiesis-regelgevende genen en kan worden uitgebreid naar een verscheidenheid van muis ziekte modellen met hematopoietische celbetrokkenheid.

Introduction

Veel studies in hematologie en immunologie vertrouwen op de beschikbaarheid van genetisch gemodificeerde muizen, met inbegrip van conventionele en voorwaardelijke transgene/knock-out muizen die gebruik maken van hematopoietische systeemspecifieke CRE drivers zoals Mxcre, vav-CRE, en anderen 1,2,3,4,5. Deze strategieën vereisen de oprichting van nieuwe muis stammen, die tijdrovend en financieel belastend kunnen zijn. Terwijl revolutionaire ontwikkelingen in de genoom Editing technologie het genereren van nieuwe muis stammen in slechts 3-4 maanden mogelijk hebben gemaakt met de juiste technische expertise6,7,8,9 , veel meer tijd is nodig om de muis kolonie te versterken voordat experimenten worden nagestreefd. Bovendien zijn deze procedures kostbaar. Bijvoorbeeld, Jackson laboratorium vermeldt de huidige prijs van knock-out mice generatie diensten op $16.845 per stam (vanaf december 2018). Daarom zijn methodes die zuiniger en efficiënter zijn dan conventionele Murine transgene benaderingen voordeliger.

Geclusterd regelmatig intergespreide korte palindroom herhalingen/CRISPR geassocieerde proteïne 9 (CRISPR/Cas9) technologie heeft geleid tot de ontwikkeling van nieuwe tools voor snelle en efficiënte RNA-gebaseerde, sequentie-specifieke genoom bewerking. Oorspronkelijk ontdekt als een bacteriële adaptieve immuun mechanisme om het binnenvallende pathogeen DNA te vernietigen, is het CRISPR/Cas9 systeem gebruikt als een instrument om de effectiviteit van genoom bewerking in eukaryote cellen en diermodellen te verhogen. Er zijn een aantal benaderingen toegepast om CRISPR/Cas9-machines te verzenden naar hematopoietische stamcellen (d.w.z. elektroporatie, nucleofectie, lipofectie, virale levering en andere).

Hier wordt een lentivirussysteem gebruikt om cellen te leiden als gevolg van zijn vermogen om de Cas9-uitzinnige muriene hematopoietische stamcellen effectief te infecteren en samen de RNA-expressie constructie, promoters, regelgevings sequenties en genen die coderen fluorescerende reporter eiwitten (d.w.z. GFP, RFP). Met behulp van deze methode is ex vivo genbewerking van hematopoietische stamcellen van de muis bereikt, gevolgd door een succesvolle reconstitutie van het beenmerg in dodelijk bestraalde muizen10. De lentivirus vector die voor deze studie wordt gebruikt, toont de Cas9 en GFP reporter genen van de common core EF1a Promoter met een interne ribosomale intrede site stroomopwaarts van het reporter gen. De gids RNA-sequentie wordt uitgedrukt uit een afzonderlijke U6-promotor. Dit systeem wordt vervolgens gebruikt voor het maken van inbrengen en verwijderen mutaties in de kandidaat klonale Hematopoiesis bestuurder genen Tet2 en Dnmt3a10. Echter, de transductie-efficiëntie door deze methode is relatief laag (~ 5%-10%) door het grote formaat van de vector insert (13 KBP) die de transductie-efficiëntie beperkt en de virus titer vermindert tijdens de productie.

In andere studies, het is aangetoond dat grotere virale RNA grootte negatief beïnvloedt zowel de virus productie en transductie efficiëntie. Bijvoorbeeld, een toename van 1 KB in wisselplaatgrootte wordt gerapporteerd aan de virus productie te verlagen door ~ 50%, en transductie-efficiëntie zal afnemen tot meer dan 50% in de muis hematopoietische stamcellen11. Het is dus voordelig om de grootte van de virale insert zoveel mogelijk te verminderen om de efficiëntie van het systeem te verbeteren.

Deze tekortkoming kan worden overwonnen door het gebruik van Cas9 transgene muizen, waarbij het Cas9-eiwit wordt uitgedrukt in een constitutieve of niet-industriële manier12. De constitutieve CRISPR/Cas9 knock-in muizen drukt Cas9 endonuclease en EGFP uit van de CAG-promotor op de Rosa26 locus op een alomtegenwoordige manier. Zo kan een constructie met sgRNA onder controle van de promotor en RFP reporter gene onder de controle van de core EF1a promotor worden geleverd met behulp van de lentivirus vector om genoom bewerking te bereiken. Met dit systeem, de genen van hematopoietische stamcellen zijn met succes bewerkt, tonen een ~ 90% transductie efficiëntie. Dit protocol biedt dus een snelle en effectieve methode om muizen te creëren waarin gerichte genmutaties in het hematopoietische systeem worden geïntroduceerd. Terwijl ons lab is voornamelijk met behulp van dit soort technologie te bestuderen van de rol van van klonen Hematopoiesis bij cardiovasculaire ziekteprocessen13,14,15, het is ook van toepassing op studies van hematologische maligniteiten16. Bovendien kan dit protocol worden uitgebreid tot de analyse van de invloed van DNA-mutaties in HSPC op andere ziekte-of ontwikkelingsprocessen in het hematopoietische systeem.

Om een robuust lentivirus vector systeem te vestigen, zijn hoge titer virale voorraden en geoptimaliseerde omstandigheden voor de transductie en transplantatie van hematopoietische cellen vereist. In het protocol worden instructies gegeven over de bereiding van een hoog titer-virale bestanddeel in rubriek 1, waarbij de cultuuromstandigheden van de erytrocyten hematopoietische stamcellen in rubriek 2, de methoden voor beenmergtransplantatie in rubriek 3, worden geëvalueerd en engraftment in rubriek 4.

Protocol

Alle procedures met betrekking tot dierproef personen zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) aan de Universiteit van Virginia. 1. opwekking en zuivering van lentivirusdeeltjes Opmerking: Lentivirusdeeltjes met de geoptimaliseerde handleiding RNA kunnen worden geproduceerd door de gedetailleerde protocollen die door Addgene: . De geoptimaliseerde …

Representative Results

Met behulp van het hierboven beschreven protocol zijn ongeveer 0,8-1,0 x 108 beenmergcellen per muis verkregen. Het aantal Lineage-negatieve cellen die we verkrijgen is ongeveer 3 x 106 cellen per muis. Typisch, de opbrengst van beenmerg Lineage-negatieve cellen is 4%-5% van die van totale beenmerg kern cellen. Het chimerisme van getransduceerde cellen (RFP-positief) wordt geëvalueerd door Flowcytometrie v…

Discussion

Het voordeel van dit protocol is de creatie van diermodellen die specifieke mutaties in hematopoietische cellen in een snelle en zeer kosteneffectieve manier verteren in vergelijking met conventionele muis transgene benaderingen. Bleek dat deze methodologie maakt het genereren van muizen met hematopoietische cel gen-manipulaties binnen 1 maand. Er zijn verschillende kritieke stappen in dit protocol die verder moeten worden overwogen.

Screening van de gRNA-sequentie

<p clas…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

S. S. werd gesteund door een Amerikaanse hart vereniging Postdoctoral Fellowship 17POST33670076. K. W. werd ondersteund door NIH subsidies R01 HL138014, R01 HL141256, en R01 HL139819.

Materials

1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE EXELINT 26028 general supply
293T cells ATCC CRL-3216– Cell line
APC-anti-mouse Ly6C (Clone AL-21) BD Biosciences 560599 Antibodies
APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2) BD Biosciences 552094 Antibodies
BD Luer-Lok disposable syringes, 10 ml BD 309604 general supply
BD Microtainer blood collection tubes, K2EDTA added BD Bioscience 365974 general supply
BD Precisionglide needle, 18 G BD 305195 general supply
BD Precisionglide needle, 22 G  BD 305155 general supply
BV510-anti-mouse CD8a (Clone 53-6.7) Biolegend 100752 Antibodies
BV711-anti-mouse CD3e (Clone 145-2C11) Biolegend 100349 Antibodies
Collagen from calf skin Sigma-Aldrich 9007-34-5 general supply
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 well  Millipore Sigma CLS3471 general supply
CRISPR/Cas9 knock-in mice The Jackson Laboratory 028555 mouse
DietGel 76A Clear H2O 70-01-5022 general supply
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose Sigma Aldrich D6429 Medium
eBioscience 1X RBC Lysis Buffer Thermo fisher Scientific 00-4333-57 Solution
Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish Life Sciences 353003 general supply
Falcon 5 mL round bottom polystyrene test tube Life Sciences 352054 general supply
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 352098 general supply
Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate  Life Science 353046 general supply
Fisherbrand microhematocrit capillary tubes Thermo Fisher Scientific 22-362566 general supply
Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm Fisher Scientific 22363548 general supply
FITC-anti-mouse CD4 (Clone RM4-5) Invitrogen 11-0042-85 Antibodies
Fixation Buffer BD Bioscience 554655 Solution
Guide-it Compete sgRNA Screening Systems Clontech 632636 Kit
Isothesia (Isoflurane) solution Henry Schein 29404 Solution
Lenti-X qRT-PCR Titration Kit  Takara 631235 Kit
Lineage Cell Depletion Kit, mouse Miltenyi Biotec 130-090-858 Kit
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 mm Millipore Sigma SLHV004SL general supply
PBS pH7.4 (1X) Gibco 10010023 Solution
PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98) eBioscience 25-1152-82 Antibodies
PEI MAX Polysciences 24765-1 Solution
Penicillin-Streptomycin Mixture Lonza 17-602F Solution
PerCP-Cy5.5-anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) BD Biosciences 560602 Antibodies
pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP  Addgene 57823 Plasmid
pMG2D Addgene 12259 Plasmid
Polybrene Infection/Transfection Reagent Sigma Aldrich TR-1003-G Solution
Polypropylene Centrifuge Tubes BECKMAN COULTER 326823 general supply
psPAX2  Addgene 12260 Plasmid
RadDisk – Rodent Irradiator Disk Braintree Scientific IRD-P M general supply
Recombinant Murine SCF Peprotech 250-03 Solution
Recombinant Murine TPO  Peprotech  315-14 Solution
StemSpan SFEM STEMCELL Technologies 09600 Solution
TOPO TA cloning kit for sequencing with One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli Thermo fisher Scientific K457501 Kit
Zombie Aqua Fixable Viability Kit BioLegend 423102 Solution 

References

  1. Sasaki, Y., et al. Defective immune responses in mice lacking LUBAC-mediated linear ubiquitination in B cells. EMBO Journal. 32, 2463-2476 (2013).
  2. Ogilvy, S., et al. Transcriptional regulation of vav, a gene expressed throughout the hematopoietic compartment. Blood. 91, 419-430 (1998).
  3. Meyer, S. E., et al. DNMT3A Haploinsufficiency Transforms FLT3ITD Myeloproliferative Disease into a Rapid, Spontaneous, and Fully Penetrant Acute Myeloid Leukemia. Cancer Discovery. 6, 501-515 (2016).
  4. Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269, 1427-1429 (1995).
  5. Cole, C. B., et al. PML-RARA requires DNA methyltransferase 3A to initiate acute promyelocytic leukemia. Journal of Clinical Investigation. 126, 85-98 (2016).
  6. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, 1370-1379 (2013).
  7. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
  8. Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18, 92 (2017).
  9. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knock-out mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13, 195-215 (2018).
  10. Sano, S., et al. CRISPR-Mediated Gene Editing to Assess the Roles of Tet2 and Dnmt3a in Clonal Hematopoiesis and Cardiovascular Disease. Circulation Research. 123, 335-341 (2018).
  11. Cante-Barrett, K., et al. Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: size matters. BMC Research Notes. 9 (312), (2016).
  12. Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 12514-12519 (2016).
  13. Fuster, J. J., et al. Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice. Science. 355, 842-847 (2017).
  14. Sano, S., et al. Tet2-Mediated Clonal Hematopoiesis Accelerates Heart Failure Through a Mechanism Involving the IL-1beta/NLRP3 Inflammasome. Journal of the American College of Cardiology. 71, 875-886 (2018).
  15. Sano, S., Wang, Y., Walsh, K. Clonal Hematopoiesis and Its Impact on Cardiovascular Disease. Circulatory Journal. 71, 875-886 (2018).
  16. Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Biotechnology. 32, 941-946 (2014).
  17. Jiang, W., et al. An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation. Scientific Reports. 5, 13875 (2015).
  18. Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnology. 13, 98 (2013).
  19. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42, e168 (2014).
  20. Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
  21. Akcakaya, P., et al. In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations. Nature. 561, 416-419 (2018).
  22. Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30, 1473-1475 (2014).
  23. Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology. 36, 765-771 (2018).
  24. El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568, 193-197 (2019).
  25. Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568, 259-263 (2019).
  26. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154, 442-451 (2013).
  27. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152, 1173-1183 (2013).
  28. Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21, 440-446 (2018).
  29. Fuster, J. J., Walsh, K. Somatic Mutations and Clonal Hematopoiesis: Unexpected Potential New Drivers of Age-Related Cardiovascular Disease. Circulatory Research. 122, 523-532 (2018).
  30. Kahn, J. D., et al. PPM1D truncating mutations confer resistance to chemotherapy and sensitivity to PPM1D inhibition in hematopoietic cells. Blood. , (2018).

Play Video

Cite This Article
Sano, S., Wang, Y., Evans, M. A., Yura, Y., Sano, M., Ogawa, H., Horitani, K., Doviak, H., Walsh, K. Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models. J. Vis. Exp. (152), e59977, doi:10.3791/59977 (2019).

View Video