Beskrevet er protokoller for den yderst effektive genomredigering af murine hematopoietisk stamceller og progenitorcellerne (HSPC) af CRISPR/Cas9 systemet til hurtigt at udvikle musemodel systemer med hæmatopoietiske systemspecifikke genmodificeringer.
Manipulere gener i hæmatopoietiske stamceller ved hjælp af konventionelle transgenese tilgange kan være tidskrævende, dyrt, og udfordrende. Ved at drage fordel af fremskridt inden for genomredigerings teknologi og lentivirus medierede transgenleveringssystemer er en effektiv og økonomisk metode beskrevet her, der etablerer mus, hvor gener manipuleres specifikt i hæmatopoietiske stamceller. Lentivira bruges til at Trans Cas9-udtrykke Lineage-negative knoglemarvsceller med en guide RNA (gRNA) rettet mod specifikke gener og et rødt fluorescens reporter-gen (RFP), så disse celler transplanteres til letalt bestrålede C57BL/6-mus. Mus transplanteret med lentivirus udtrykker ikke-målretning gRNA anvendes som kontrol. Engraftment af transducerede hæmatopoietiske stamceller evalueres ved flow cytometrisk analyse af RFP-positive leukocytter af perifert blod. Ved hjælp af denne metode, ~ 90% transduktion af myeloide celler og ~ 70% af lymfoide celler ved 4 uger efter transplantation kan opnås. Genomisk DNA isoleres fra RFP-positive blodlegemer, og dele af det målrettede site DNA forstærkes af PCR for at validere genomredigeringen. Denne protokol giver en høj gennemløb evaluering af hæmatopoiesis-regulerende gener og kan udvides til en række muse sygdomsmodeller med hæmatopoietisk celle involvering.
Mange undersøgelser i hæmatologi og Immunologi er afhængige af tilgængeligheden af genetisk modificerede mus, herunder konventionelle og betingede transgene/knock-out mus, der udnytter hæmatopoietiske system-specifikke CRE drivere såsom Mxcre, VAV-CRE, og andre 1,2,3,4,5. Disse strategier kræver etablering af nye muse stammer, som kan være tidskrævende og økonomisk byrde. Mens revolutionerende fremskridt i genomredigerings teknologien har muliggjort generering af nye muse stammer i så få som 3-4 måneder med den relevante tekniske ekspertise6,7,8,9 , er der brug for meget mere tid til at forstærke muse kolonien, før eksperimenter forfølges. Desuden er disse procedurer dyre. For eksempel, Jackson laboratorium lister den nuværende pris på knock-out mus generation tjenester på $16.845 per stamme (pr. december 2018). Således, metoder, der er mere økonomisk og effektiv end konventionelle murine transgene tilgange er mere fordelagtige.
Grupperet jævnligt hinanden korte palindromiske gentagelser/crispr Associated protein 9 (crispr/Cas9) teknologi har ført til udvikling af nye værktøjer til hurtig og effektiv RNA-baseret, sekvens-specifik genomredigering. Det blev oprindeligt opdaget som en bakteriel adaptiv immun mekanisme til at ødelægge invaderende patogen DNA, CRISPR/Cas9-systemet er blevet brugt som et redskab til at øge effektiviteten af genomredigering i eukaryotiske celler og dyremodeller. En række tilgange har været anvendt til at overføre CRISPR/Cas9 maskiner til hæmatopoietiske stamceller (dvs., elektro poration, nukleofection, lipofection, viral levering, og andre).
Her er et lentivirus system ansat til at transduce celler på grund af dets evne til effektivt at inficere Cas9-udtrykker murine hæmatopoietiske stamceller og pakke sammen guide RNA udtryk konstruere, initiativtagere, lovgivningsmæssige sekvenser, og gener, der indkode fluorescerende reporter proteiner (dvs. GFP, RFP). Ved hjælp af denne metode, ex vivo gen redigering af mus hæmatopoietiske stamceller er blevet opnået, efterfulgt af vellykket rekonstitution af knoglemarv i letbestrålede mus10. Den lentivirus vektor, som er ansat i denne undersøgelse, udtrykker Cas9-og GFP reporter-generne fra Common Core EF1a-promotoren med et internt ribosomale indgangssted opstrøms fra reporter-genet. Guide-RNA-sekvensen udtrykkes fra en separat U6-promotor. Dette system bruges derefter til at skabe indsættelse og sletning mutationer i kandidat klonal hematopoiese driver gener Tet2 og Dnmt3a10. Imidlertid er transduktiviteten ved denne metode forholdsvis lav (~ 5%-10%) på grund af den store størrelse af vektor indsatsen (13 KBP), der begrænser transduktiviteten og reducerer virus titer under produktionen.
I andre undersøgelser, det har vist sig, at større viral RNA størrelse negativt påvirker både virus produktion og transduktivitet effektivitet. For eksempel, en 1 kb stigning i Indsæt størrelse er rapporteret at reducere virus produktion af ~ 50%, og transduktivitet effektivitet vil falde til mere end 50% i mus hæmatopoietiske stamceller11. Således er det fordelagtigt at reducere størrelsen af den virale indsats så meget som muligt for at forbedre effektiviteten af systemet.
Denne mangel kan overvindes ved at ansætte Cas9 Transgene mus, hvor det Cas9 protein udtrykkes i enten en konstitutiv eller inducerbar måde12. De konstitutive crispr/Cas9 Knock-in-mus udtrykker Cas9 endonuklease og egfp fra CAG-promotoren på Rosa26 locus på en allestedsnærværende måde. Således kan en konstruktion med sgrna under kontrol af U6 promoter og RFP reporter-genet under kontrol af Core EF1a Promoter leveres ved hjælp af lentivirus-vektoren for at opnå genom-redigering. Med dette system, generne af hæmatopoietiske stamceller er blevet redigeret med succes, viser en ~ 90% transduktionseffektivitet. Således, denne protokol giver en hurtig og effektiv metode til at oprette mus, hvor målrettede genmutationer indføres i det hæmatopoietiske system. Mens vores laboratorium overvejende bruger denne type teknologi til at studere rollen som klonal hematopoiese i hjerte-kar-sygdomme processer13,14,15, det gælder også for undersøgelser af hæmatologiske malignitet16. Desuden kan denne protokol udvides til at omfatte en analyse af, hvordan DNA-mutationer i HSPC påvirker andre sygdoms-eller udviklingsmæssige processer i det hæmatopoietiske system.
At etablere en robust lentivirus vektorsystem, høj titer virale bestande og optimerede betingelser for transduktion og transplantation af hæmatopoietiske celler er påkrævet. I protokollen gives der instruktioner om fremstilling af en høj titer viral bestand i afsnit 1, optimering af dyrkningsbetingelserne for murine hæmatopoietiske stamceller i afsnit 2, metoder til knoglemarvstransplantation i afsnit 3, og vurdering af i afsnit 4.
Fordelen ved denne protokol er skabelsen af dyremodeller, der harkedeligt specifikke mutationer i hæmatopoietiske celler på en hurtig og meget omkostningseffektivmåde i forhold til konventionelle mus transgene tilgange. Det blev konstateret, at denne metode muliggør generering af mus med hæmatopoietiske celle genmanipulationer inden for 1 måned. Der er flere kritiske trin i denne protokol, der kræver yderligere overvejelse.
Screening af gRNA sekvens
<p class="jove_c…The authors have nothing to disclose.
S. S. blev støttet af en amerikansk hjerte forening postdoc Fellowship 17POST33670076. K. W. blev støttet af NIH Grants R01 HL138014, R01 HL141256 og R01 HL139819.
1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | general supply |
293T cells | ATCC | CRL-3216– | Cell line |
APC-anti-mouse Ly6C (Clone AL-21) | BD Biosciences | 560599 | Antibodies |
APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2) | BD Biosciences | 552094 | Antibodies |
BD Luer-Lok disposable syringes, 10 ml | BD | 309604 | general supply |
BD Microtainer blood collection tubes, K2EDTA added | BD Bioscience | 365974 | general supply |
BD Precisionglide needle, 18 G | BD | 305195 | general supply |
BD Precisionglide needle, 22 G | BD | 305155 | general supply |
BV510-anti-mouse CD8a (Clone 53-6.7) | Biolegend | 100752 | Antibodies |
BV711-anti-mouse CD3e (Clone 145-2C11) | Biolegend | 100349 | Antibodies |
Collagen from calf skin | Sigma-Aldrich | 9007-34-5 | general supply |
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 well | Millipore Sigma | CLS3471 | general supply |
CRISPR/Cas9 knock-in mice | The Jackson Laboratory | 028555 | mouse |
DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | general supply |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose | Sigma Aldrich | D6429 | Medium |
eBioscience 1X RBC Lysis Buffer | Thermo fisher Scientific | 00-4333-57 | Solution |
Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Life Sciences | 353003 | general supply |
Falcon 5 mL round bottom polystyrene test tube | Life Sciences | 352054 | general supply |
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352098 | general supply |
Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate | Life Science | 353046 | general supply |
Fisherbrand microhematocrit capillary tubes | Thermo Fisher Scientific | 22-362566 | general supply |
Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | general supply |
FITC-anti-mouse CD4 (Clone RM4-5) | Invitrogen | 11-0042-85 | Antibodies |
Fixation Buffer | BD Bioscience | 554655 | Solution |
Guide-it Compete sgRNA Screening Systems | Clontech | 632636 | Kit |
Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein | 29404 | Solution |
Lenti-X qRT-PCR Titration Kit | Takara | 631235 | Kit |
Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | Kit |
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 mm | Millipore Sigma | SLHV004SL | general supply |
PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Solution |
PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98) | eBioscience | 25-1152-82 | Antibodies |
PEI MAX | Polysciences | 24765-1 | Solution |
Penicillin-Streptomycin Mixture | Lonza | 17-602F | Solution |
PerCP-Cy5.5-anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Biosciences | 560602 | Antibodies |
pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP | Addgene | 57823 | Plasmid |
pMG2D | Addgene | 12259 | Plasmid |
Polybrene Infection/Transfection Reagent | Sigma Aldrich | TR-1003-G | Solution |
Polypropylene Centrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 326823 | general supply |
psPAX2 | Addgene | 12260 | Plasmid |
RadDisk – Rodent Irradiator Disk | Braintree Scientific | IRD-P M | general supply |
Recombinant Murine SCF | Peprotech | 250-03 | Solution |
Recombinant Murine TPO | Peprotech | 315-14 | Solution |
StemSpan SFEM | STEMCELL Technologies | 09600 | Solution |
TOPO TA cloning kit for sequencing with One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli | Thermo fisher Scientific | K457501 | Kit |
Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend | 423102 | Solution |