Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Modification du génome de Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated pour l'étude des cellules hématopoïétiques dans les modèles de maladie

Published: October 3, 2019 doi: 10.3791/59977

Summary

Les protocoles décrits pour l'édition génomique très efficace des cellules hématopoïétiques et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) par le système CRISPR/Cas9 pour développer rapidement des systèmes de modèle de souris avec des modifications génétiques hématopoïétiques spécifiques au système.

Abstract

La manipulation des gènes dans les cellules souches hématopoïétiques à l'aide d'approches transgenèses conventionnelles peut prendre beaucoup de temps, être coûteuse et difficile. Bénéficiant des progrès de la technologie d'édition du génome et des systèmes d'administration de transgènes médiés par lentivirus, une méthode efficace et économique est décrite ici qui établit des souris dans lesquelles les gènes sont manipulés spécifiquement dans les cellules souches hématopoïétiques. Les lentivirus sont utilisés pour transduire les cellules de moelle osseuse cas9-exprimant esfilées par lignée avec un ARN guide (gRNA) ciblant des gènes spécifiques et un gène de reporter de fluorescence rouge (RP), puis ces cellules sont transplantées dans des souris C57BL/6 mortellement irradiées. Les souris transplantées avec le lentivirus exprimant le gRNA non-ciblage sont employées comme contrôles. L'engraftment des cellules souches hématopoïétiques transducées sont évalués par l'analyse cytométrique de flux des leucocytes RFP-positifs du sang périphérique. En utilisant cette méthode, la transduction de 90 % des cellules myéloïdes et 70 % des cellules lymphoïdes à 4 semaines après la transplantation peuvent être réalisées. L'ADN génomique est isolé des cellules sanguines RFP-positives, et des parties de l'ADN du site ciblé sont amplifiées par PCR pour valider l'édition du génome. Ce protocole fournit une évaluation à haut débit des gènes hématopoiesis-régulateurs et peut être étendu à une série de modèles de maladie de souris avec la participation hématopoietic de cellules.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Beaucoup d'études en hématologie et immunologie s'appuient sur la disponibilité de souris génétiquement modifiées, y compris les souris transgéniques/knock-out conventionnelles et conditionnelles qui utilisent des pilotes de Cre hématopoïétiques spécifiques au système tels que Mx1-Cre, Vav-Cre, et d'autres 1,2,3,4,5. Ces stratégies exigent l'établissement de nouvelles souches de souris, qui peuvent prendre beaucoup de temps et être financièrement lourdes. Alors que les progrès révolutionnaires dans la technologie d'édition du génome ont permis la génération de nouvelles souches de souris en aussi peu que 3-4 mois avec l'expertise technique appropriée6,7,8,9 , beaucoup plus de temps est nécessaire pour amplifier la colonie de souris avant que les expériences soient poursuivies. De plus, ces procédures sont coûteuses. Par exemple, Jackson Laboratory énumère le prix actuel des services de génération de souris knock-out à 16 845 $ par souche (en décembre 2018). Ainsi, les méthodes qui sont plus économiques et efficaces que les approches transgéniques murine sinais classiques sont plus avantageuses.

La technologie des protéines 9 (CRISPR/Cas9) associées à des répétitions palindromic courtes et interspatiales a conduit au développement de nouveaux outils pour une édition rapide et efficace du génome à base d'ARN et spécifique à la séquence. Découvert à l'origine comme mécanisme immunitaire adaptatif bactérien pour détruire l'ADN pathogène envahissant, le système CRISPR/Cas9 a été utilisé comme un outil pour augmenter l'efficacité de l'édition du génome dans les cellules eucaryotes et les modèles animaux. Un certain nombre d'approches ont été utilisées pour transmettre des machines CRISPR/Cas9 dans les cellules souches hématopoïétiques (c.-à-d. électropoction, nucléofection, lipofection, livraison virale, et d'autres).

Ici, un système de lentivirus est employé pour transduire des cellules en raison de sa capacité à infecter effectivement Cas9-exprimant les cellules souches hématopoïétiques murines et emballent ensemble la construction d'expression d'ARN de guide, les promoteurs, les séquences réglementaires, et les gènes qui codent protéines fluorescentes de journaliste (c.-à-d., GFP, DP). En utilisant cette méthode, l'édition de gènes ex vivo des cellules souches hématopoïétiques de souris a été réalisée, suivie d'une reconstitution réussie de la moelle osseuse chez des souris mortellement irradiées10. Le vecteur de lentivirus utilisé pour cette étude exprime les gènes de journaliste Cas9 et GFP du promoteur commun de noyau EF1a avec un site d'entrée ribosomal interne en amont du gène de journaliste. La séquence d'ARN guide est exprimée à partir d'un promoteur U6 séparé. Ce système est ensuite utilisé pour créer des mutations d'insertion et de suppression dans les gènes de pilote d'hématopoiesis clonal candidat Tet2 et Dnmt3a10. Cependant, l'efficacité de la transduction par cette méthode est relativement faible (-5%-10%) en raison de la grande taille de l'insert vectoriel (13 Kbp) qui limite l'efficacité de la transduction et réduit le taquet de virus pendant la production.

Dans d'autres études, il a été démontré que la taille plus importante de l'ARN viral affecte négativement à la fois la production de virus et l'efficacité de la transduction. Par exemple, une augmentation de 1 kb de la taille de l'insert est signalée pour diminuer la production de virus de 50%, et l'efficacité de la transduction diminuera à plus de 50% dans les cellules souches hématopoïétiques de souris11. Ainsi, il est avantageux de réduire la taille de l'insert viral autant que possible pour améliorer l'efficacité du système.

Cette lacune peut être surmontée en employant des souris transgéniques Cas9, dans lesquelles la protéine Cas9 s'exprime d'une manière constitutive ou inductible12. Les souris constitutives CRISPR/Cas9 se heurtent à l'endodocléase Cas9 et à l'EGFP du promoteur du CAG au locus Rosa26 d'une manière omniprésente. Ainsi, une construction avec sgRNA sous le contrôle du promoteur U6 et du gène journaliste de La DP sous le contrôle du promoteur DE base EF1a peut être livrée à l'aide du vecteur de lentivirus pour réaliser l'édition du génome. Avec ce système, les gènes des cellules souches hématopoïétiques ont été modifiés avec succès, montrant une efficacité de transduction de 90%. Ainsi, ce protocole fournit une méthode rapide et efficace pour créer des souris dans lesquelles des mutations génétiques ciblées sont introduites dans le système hématopoïétique. Alors que notre laboratoire utilise principalement ce type de technologie pour étudier le rôle de l'hématopoiesis clonal dans les processus de maladies cardiovasculaires13,14,15, il est également applicable aux études de l'hématologie malignité16. En outre, ce protocole peut être étendu à l'analyse de la façon dont les mutations de l'ADN dans HSPC impact d'autres maladies ou des processus de développement dans le système hématopoïétique.

Pour établir un système vectoriel de lentivirus robuste, des stocks viraux élevés de titer et des conditions optimisées pour la transduction et la transplantation des cellules hématopoïétiques sont exigés. Dans le protocole, des instructions sont fournies sur la préparation d'un stock viral de haute titer dans la section 1, l'optimisation des conditions de culture des cellules souches hématopoïétiques murines dans la section 2, les méthodes de transplantation de moelle osseuse dans la section 3, et l'évaluation l'engraftment dans la section 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Toutes les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université de Virginie.

1. Génération et purification des particules de lentivirus

REMARQUE : Les particules de lentivirus contenant l'ARN guide optimisé peuvent être produites par les protocoles détaillés fournis par Addgene : 'lt;https://media.addgene.org/cms/files/Zhang'lab-LentiCRISPR'library.protocol.pdf) Des méthodes optimisées pour la préparation et le stockage de lentivirus à haut-titer sont discutées ailleurs17,18. En bref, les lentivirus sont produits par co-transfection d'un plasmide vectoriel lentivirus, psPAX2, et pMD2.G dans les cellules HEK 293T. Le supernatant culturel est collecté à 48 h après la transfection et concentré par ultracentrifugation. Le téter lentiviral est déterminé par un jeu d'enfant disponible dans le commerce à base de qPCR. Cette procédure doit être effectuée dans un coffret de classe II de biosécurité.

  1. Préparer une solution 1:200 de collagène (0,0005%) en 1x PBS.
  2. Enrober une assiette de 6 puits avec une solution de collagène et incuber à 37 oC, 5 % de CO2 pendant 30 min.
  3. Seed 293T cellules à une densité de 1 x 106 cellules par puits et incuber à 37 oC, 5% CO2 pour 2 h.
  4. Pour préparer le mélange de trois plasmides de transfection pour un puits, combinez 0,9 g de vecteur de lentivirus, 0,6 g de psPAX2 et 0,3 g de pMD2.G, puis atteignez un volume total de 10 l en ajoutant de l'eau déionisée. Ajuster les montants en conséquence en fonction du nombre de puits. La quantité et le ratio de chaque plasmide peuvent devoir être optimisés pour répondre aux besoins des chercheurs.
  5. Ajouter délicatement 50 oL de 1 x PBS et 5 l du MAX dilué de l'Ile-du-Prince-Édouard (1,0 mg/mL) au mélange de plasmide et incuber pendant 15 min à température ambiante (RT) (tableau 1).
  6. Ajouter 1 ml de DMEM au mélange.
  7. Aspirer le support de la plaque de 6 puits, ajouter 1 ml de mélange de plasmide, et incuber à 37 oC, 5 % de CO2 pour 3 h.
  8. Remplacer les supports par 2 ml de DMEM frais et couver à 37 oC, 5 % de CO2 pour 24 h.
  9. Ajouter 1 ml de DMEM frais et incuber à 37 oC, 5 % de CO2 pour 24 h supplémentaires (temps d'incubation total de 48 h).
  10. Transférer le supernatant de culture dans un tube de 50 ml et une centrifugeuse à 3 000 x g pendant 15 min pour enlever les cellules flottantes.
  11. Filtrer le supernatant à l'intermédiaire d'un filtre de 0,45 m.
  12. Transférer le filtrate dans des tubes de centrifugeuse en polypropylène.
  13. Ultracentrifugeàeur à 4 oC et 72 100 x g à rmax pendant 3 h.
  14. Aspirez soigneusement le supernatant, en laissant derrière lui la pastille blanche.
  15. Resuspendre la pastille avec 100 l de milieu d'expansion hématopoïétique sans sérum sans aération.
  16. Conserver un aliquot de 10 l pour mesurer le titre viral et stocker tous les aliquots restants à -80 oC jusqu'à ce qu'il soit nécessaire.
  17. Titrate le virus avec un analyse qPCR-basé selon les instructions du fabricant en utilisant l'aliquot viral de 10 L.

2. Isolement et transduction des cellules négrées de lignée de la moelle osseuse de la souris (Figure 1A)

REMARQUE : Typiquement, pour isoler assez de cellules, des paires de tibias, de fémurs, et d'huméri sont moissonnés de chaque souris. Les os pelviens et spinaux peuvent également être récoltés comme source de cellules négrées de lignée.

  1. Isolement des cellules de moelle osseuse
    1. Euthanasier les souris mâles CRISPR/Cas9 de 8 à 10 semaines par 5 % d'isoflurane suivie d'une luxation cervicale, puis désinfecter leur peau avec 70 % d'éthanol.
    2. À l'aide de ciseaux disséquants, faire une incision transversale dans la peau juste en dessous de la cage thoracique et peler la peau distalement dans les deux sens pour exposer les jambes et les bras.
    3. Séparez soigneusement les membres inférieurs de l'os de la hanche en disloquant l'articulation de la hanche. Couper le long de la tête du fémur pour enlever le fémur complètement de la hanche. Déloger le genou et couper à l'articulation pour séparer le fémur et le tibia, tout en gardant l'épiphyse osseuse intacte. Déloger l'articulation de la cheville et éplucher le pied et le muscle supplémentaire.
    4. À l'aide de ciseaux disséquants, couper sur l'épaule pour détacher les membres supérieurs. Déloger l'épaule, puis couper à l'articulation du coude pour récolter l'os de l'humérus.
    5. Utilisez des lingettes en fibre de cellulose pour enlever soigneusement les muscles des fémurs, des tibias et des huméri. Prenez des précautions supplémentaires pour vous assurer que les os ne se cassent pas au cours de ce processus.
    6. Placez les os isolés dans un tube conique de 50 ml contenant le RPMI, et placez-les sur la glace.
      REMARQUE : Les étapes suivantes doivent être effectuées dans un cabinet de classe II de biosécurité.
    7. Transférer les os dans un plat stérile de culture de 100 mm.
    8. Saisir l'os avec des forceps émoussés, et à l'aide de ciseaux disséquants, couper soigneusement les deux épiphyses.
      REMARQUE : Une coupe insuffisante entraînera une chasse d'eau incomplète de la moelle osseuse, tandis que la coupe trop agressive entraînera une perte cellulaire.
    9. Remplissez une seringue de 10 ml de RPMI glacée et utilisez une aiguille de 22 G, rincer la moelle osseuse de l'arbre dans un nouveau plat de culture de 100 mm.
      REMARQUE : Les os deviendront blancs et translucides si l'arbre osseux a été bien rincé. Si ce n'est pas le cas, couper à nouveau les extrémités osseuses et rincer à nouveau.
    10. Après que toute la moelle osseuse a été recueillie, faire une suspension à une cellule en passant la moelle osseuse à plusieurs reprises à travers une seringue de 10 ml avec une aiguille de 18 G. Répétez 10x pour assurer une suspension à une cellule.
    11. Filtrer la suspension des cellules à travers une passoire cellulaire de 70 m dans un tube conique de 50 ml.
    12. Centrifugeuse à 310 x g pendant 10 min à 4 oC.
    13. Aspirez le supernatant et suspendez les granulés de cellules dans un volume approprié de tampon de séparation optimisé pour le processus de séparation cellulaire suivant.
  2. Transduction d'isolement et de lentivirus des cellules négrées de lignée
    REMARQUE : Les cellules négatives de lignée de souris sont isolées de la moelle osseuse des souris transgéniques Cas93, ou d'autres souches de souris, en utilisant un kit d'épuisement de lignée selon les instructions du fabricant. Typiquement, les cellules lignée-négatives représentent 2%-5% des cellules nucléées entières de moelle, et la pureté est habituellement plus grande que 90% après isolement. Les cellules lignées-négatives isolées sont cultivées dans le milieu hématopoietic d'expansion hématopoietic sérique-libre complété avec le TPO murine recombinant de 20 ng/mL et le SCF murine recombinant de 50 ng/mL, puis transduiséavec le vecteur de lentivirus pendant 16 h à une multiplicité de (MOI) 100.
    1. Pour isoler les cellules négatives de la lignée, utilisez le kit d'épuisement des cellules de lignée selon les instructions du fabricant.
    2. Après isolement resuspend les cellules lignée-négatives dans 1 ml du milieu d'expansion hématopoïétique sérique-libre.
    3. Ensemencer les cellules dans une plaque de 6 puits à une densité de 1,5 x 106 cellules/mL (5 x 10 5 cellules/souris négâtde lignée.)
    4. Ajouter le TPO murine recombinant et le SCF dans les puits à des concentrations finales de 20 ng/mL et 50 ng/mL, respectivement.
    5. Pré-incubent les cellules à 37 oC dans 5 % de CO2 pour 2 h.
    6. Ajouter le lentivirus au MOI à 100, 4 g/mL de polybrene, et la pénicilline/streptomycine aux puits et incuber à 37 oC, 5 % de CO2 pour 16-20 h (figure 1B).
    7. Le lendemain, recueillir les cellules transductrices de lentivirus dans un tube conique de 15 ml et une centrifugeuse à 300 g pendant 10 min.
    8. Aspirez soigneusement le supernatant et suspendez la pastille dans 200 L de RPMI par souris. Maintenir les cellules à RT jusqu'à la transplantation chez les souris (section 3).

3. Transplantation de cellules transductées en souris mortellement irradiées

  1. Le jour de la transplantation de moelle osseuse, placez les souris réceptrices dans une cage à tarte à huit tranches et exposez-les à deux doses d'irradiation du corps entier (550 Rad/dose, dose totale de 1100 Rad), avec environ 4 h entre chaque séance d'irradiation.
  2. Après la deuxième séance d'irradiation, injectez des cellules négrées de lignée-négatives à chaque souris bénéficiaire anesthésiée par l'intermédiaire du plexus de veine rétro-orbital (200 l au total) à l'aide d'une seringue à insuline (Figure 1C).
  3. Après l'irradiation, les souris doivent être logées dans des cages stérilisées et équipées d'un régime alimentaire doux et d'eau potable complétée par des antibiotiques pendant 14 d.
  4. À 3-4 semaines après la transplantation de moelle, analysez le sang périphérique pour vérifier l'engraftment des cellules transductrices de distributeur (section 4).

4. Évaluer le chimérisme du sang périphérique

  1. Anesthésiez les souris avec 5% d'isoflurane et obtenez un échantillon de sang à partir d'une veine rétro-orbitale à l'aide de tubes capillaires, et collectez-les en tubes K2EDTA (le volume dans un tube capillaire est suffisant pour l'analyse suivante).
  2. Transférer 20 l l de sang des tubes K2EDTA dans les tubes à essai en polystyrène à fond rond de 5 ml, et mettre sur la glace.
  3. Ajouter 1,5 ml de tampon de lyse RBC pour lyser les globules rouges. Incuber 5 min sur glace.
  4. Pour neutraliser le tampon de lyse, laver les échantillons avec un tampon FACS (1,5 mL/échantillon).
  5. Centrifugeuse à 609 x g à rmax pendant 5 min à 4 oC. Jetez le supernatant.
  6. Incuber les cellules avec un cocktail d'anticorps monoclonaux (dilués dans un tampon/échantillon FACS de 100 L) à RT pendant 20 minutes dans l'obscurité. Une liste complète des anticorps est fournie dans la section Matériaux ci-dessus.
  7. Laver les cellules une fois avec un tampon FACS (2 ml/échantillon). Centrifugeuse à 609 x g à rmax (1 800 tr/min) pendant 5 min à 4 oC. Jeter complètement le supernatant.
  8. Fixer les cellules avec du paraformaldéhyde contenant un tampon de fixation (100 l/tube) pendant 10 min à 4 oC.
  9. Laver les cellules une fois avec le tampon FACS (3 mL/échantillon). Centrifugeuse à 609 x g à rmax (1 800 tr/min) pendant 5 min à 4 oC. Jeter complètement le supernatant.
  10. Suspendre la pastille dans 400 l de tampon FACS.
  11. Conserver les échantillons à 4 oC jusqu'à ce qu'ils soient analysés par cytométrie d'écoulement.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En utilisant le protocole décrit ci-dessus, environ 0.8-1.0 x 108 cellules de moelle par souris ont été obtenues. Le nombre de cellules négatives à la lignée que nous obtenons est d'environ 3 x 106 cellules par souris. Typiquement, le rendement des cellules de lignée de moelle est 4%-5% de celui des cellules nucléaires totales de moelle.

Le chimérime des cellules transductrices (RFP-positif) est évalué par cytométrie d'écoulement du sang périphérique (Figure 2A,B). Le sang est isolé de la veine rétro-orbitale et des marqueurs appropriés sont utilisés pour déterminer l'identité de chaque population de cellules hématopoïétiques (c.-à-d. neutrophiles, monocytes, lymphocytes T, etc.) (Figure 3A,B). L'ADN génomique peut être isolé à partir de cellules sanguines rFP-positives, et des sections de l'ADN du site ciblé peuvent être amplifiées par PCR et subclod en vecteurs de clonage TA pour l'analyse de séquence. Ces plasmides sont transducés en E. coli et les séquences du site cible sont déterminées par séquençage de Sanger (figure 4). Alternativement, les séquences de sites cibles peuvent être déterminées par d'autres méthodes, telles que le séquençage de Sanger du génome mis en commun suivi par le suivi des indels par l'analyse de décomposition (TIDE)10. Pour la condition de contrôle, les souris sont typiquement transplantées avec des cellules qui sont transduced avec un lentivirus exprimant l'ARN de guide non-ciblage.

Figure 1
Figure 1: Illustration schématique de ce protocole. (A) Isolement des cellules de moelle osseuse négrées par lignée des souris exprimant Cas9 (section 2.1). (B) Transduction de lentivirus des cellules négrées de lignée (section 2.2). (C) Injection rétro-orbitale de cellules transdulées en souris de type sauvage mortellement irradiées (section 3). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2: Transduction lentivirale efficace des cellules in vitro de lignée de moelle de souris in vitro. (A) L'analyse de cytométrie de flux indique la transduction réussie des cellules lignée-négatives. L'analyse a été effectuée après 7 jours de culture in vitro. (B) En moyenne, 75,7 % des cellules ont été transduisées dans cet exemple (n - 3). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3:Reconstitution de la moelle osseuse desouris mortellement irradiée par des cellules transduissées négétales négatives. (A) Analyse de cytométrie de flux du sang périphérique de souris suivant la reconstitution par les cellules souches hématopoïétiques qui étaient (en bas) ou n'étaient pas (en haut) transduisées avec le lentivirus exprimant la DP. Neutrophiles sont définis comme Ly6Get Ly6Csalut monocytes comme Ly6G- et Ly6C , et les cellules B comme CD45R. (B) Dans ces essais, une moyenne de 94,8 %, 93,5 % et 82,7 % des cellules sont d'un pnis, dans les populations de neutrophiles, de ly6Chi monocyte et de cellules B, respectivement (n - 8). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. 

Figure 4
Figure 4:Évaluation de l'édition génétique dans lescellules sanguines transductées. (A) Exemple d'édition de gène montrant des résultats de séquençage du locus muté de Dnmt3a dans les cellules sanguines RPF-positives. Les suppressions sont indiquées sous forme de tirets rouges et les insertions sont marquées par des lettres rouges. (B) Résumé des mutations qui ont été détectées. (C) 69% (11/16 clones) ont montré des mutations hors cadre/arrêt prématuré. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. 

Plasmide Taille (bp) Montant par puits (g) proportion
pLKO5.0 (en) 7700 0.9 2
psPAX2 (en) 10668 0.6 1
pMD2.G 5822 0.3 1
PEI-max (stock: 100 mg/mL) 5 l/puits

Tableau 1 : Quantités de plasmide et de plasmide-max utilisées pour la transfection.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

L'avantage de ce protocole est la création de modèles animaux abritant des mutations spécifiques dans les cellules hématopoïétiques d'une manière rapide et très rentable par rapport aux approches transgéniques classiques de souris. Il a été constaté que cette méthodologie permet la génération de souris avec des cellules hématopoïétiques gènes-manipulations dans un délai de 1 mois. Il y a plusieurs étapes critiques dans ce protocole qui nécessitent un examen plus approfondi.

Dépistage de la séquence gRNA

Il est recommandé de tester les GARN in vitro pour évaluer l'efficacité de l'édition avant de mener des expériences in vivo. L'efficacité des GARN est testée à l'aide d'un système de transcription et de dépistage in vitro sans cellules. Le gRNA transcrit est validé en mesurant son efficacité à cliquer l'ADN du modèle en présence de la protéine Recombinante Cas9, à l'aide de l'électrophoresis de gel d'agarose. Des kits disponibles dans le commerce sont disponibles à cette fin.

Ici, les mutations d'indélégue sont caractérisées par le clonage de TA des produits de PCR amplifiés de la région éditée, transformant des cellules bactériennes avec ces plasmides, et ramassant des colonies individuelles pour le séquençage de Sanger. Cependant, cette méthode est laborieuse et prend beaucoup de temps. Alternativement, le séquençage de nouvelle génération (NGS) ou le séquençage d'ADN en commun suivi d'une analyse TIDE peut être effectué19. L'algorithme TIDE a été créé pour analyser les traces de séquences Sanger générées à partir d'échantillons complexes. Il a été démontré que les estimations d'Indel avec TIDE sont généralement compatibles avec celles non ciblées NGS20. Le logiciel d'analyse est disponible en ligne à l'adresse suivante : http://tide.nki.nl.gt;.

Génération de particules de lentivirus à haut teneur en titer

La stomatétine vésiculaire virale, la protéine G, essentielle à l'infection cellulaire, est très sensible au pH. Ainsi, il est important de garder le milieu de culture dans une plage de pH acceptable, et il ne devrait pas développer un aspect jaunâtre. Des plats enrobés de collagène pour la génération de virus sont utilisés parce qu'ils accélèrent l'attachement des cellules HEK293T et permettent la performance de la transfection en quelques heures, plutôt que d'attendre toute la nuit. Cependant, selon le calendrier expérimental, l'incubation d'une nuit peut également être envisagée.

Purification des particules de lentivirus

Pour parvenir à une transduction efficace des cellules souches hématopoïétiques, il est nécessaire de générer des lentivirus à haut teneur en titer. L'optimisation de la vitesse de centrifugation est une caractéristique clé. Alors que la concentration de lentivirus est généralement effectuée à 90.000 x g, plusieurs rapports ont montré que la récupération du virus augmente si le matériau est centrifugé à la vitesse inférieure de 20.000 x g18. La production de préparation de lentivirus de haut-titer sans ultracentrifugation a également étésuggérée 17. Il convient de noter qu'il est important de suspendre le granulede de centrifugation du virus tout en évitant la pipetage vigoureux pour minimiser l'aération et maintenir l'intégrité du virus. Des particules de lentivirus à haut teneur en timètre sont nécessaires pour une transduction efficace des cellules souches hématopoïétiques11. Des expériences pilotes ont révélé qu'un MOI de 100 est optimal en ce qui concerne l'efficacité de la transduction et la viabilité cellulaire. Il est recommandé d'évaluer les stocks de lentivirus sur la base de la viabilité cellulaire et de l'efficacité de la transduction.

Stockage des particules de lentivirus

Le téter lentivirus est très sensible à la température, et le tetamètre peut être considérablement réduit par des conditions de stockage inappropriées et des cycles répétés de gel-dégel. Il a été constaté que l'efficacité de la transduction du lentivirus diminue rapidement lorsqu'il est stocké à 4 oC [t(1/2) - 1,3 jour] ou soumis à de multiples cycles de gel-dégel [t(1/2) - 1,1 tours]. Il est recommandé que les préparations virales soient congelées dans de l'azote liquide ou de la glace sèche concassée peu de temps après la suspension de la pastille virale. Les stocks viraux doivent être maintenus à -80 oC et décongelés sur la glace jusqu'à RT juste avant l'équilibre et l'utilisation11.

Plusieurs limitations potentielles doivent être notées. Tout d'abord, l'introduction de mutations indéléco-indicibles hors cible par CRISPR/Cas9 a longtemps été appréciée. Il a également été démontré que CRISPR/Cas9 peut induire des mutations hors cible in vivo21. Dans la pratique, les mutations indélécosont hors cible peuvent être évitées en utilisant des séquences de gRNA qui sont étroitement appariées pour cibler les sites génomiques et qui ont plus de quatre décalages avec les sites secondaires prévus. Une telle conception peut être fait avec existant dans les outils silico22. D'autres outils informatiques pour prédire l'ARG avec des actions hors cible minimisées sont disponibles (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design-gt; ou http://www.Benchling.com.gt;). Il peut également être bénéfique d'analyser un modèle animal à l'aide de deux gARN différents ou plus pour confirmer le phénotype et minimiser la possibilité que le phénotype observé soit médié par un effet hors cible d'un gRNA spécifique.

En plus des mutations d'indel conventionnelles créées par CRISPR/Cas9, de plus grandes suppressions qui s'étendent au-delà des kilobases ont été rapportées. Cela peut confondre les études; cependant, ces suppressions plus importantes sont rapportées pour être beaucoup plus basses fréquence comparées aux indels23. Un autre problème potentiel est la compensation génétique. Il a été rapporté que l'ARN mutant avec un codon de terminaison prématurée (PTC) peut avoir comme conséquence l'upregulation des gènes relatifs avec la similitude de séquence par l'activation complexe-négociée de COMPASS de transcription24,25. Cet événement a été suggéré pour être un mécanisme qui peut mener aux différences phénotypiques entre knock-out et knockdown approches de l'ablation de gène. Étant donné que l'édition du génome à médiation CRISPR/Cas9 repose fortement sur l'introduction stochastique de mutations de changement de cadre qui mènent à la génération de PTC, la compensation génétique peut modifier le phénotype. Pour éviter la compensation génétique, des expériences peuvent être envisagées dans lesquelles les séquences réglementaires d'un gène sont ciblées par CRISPR/Cas9 ou par l'introduction de modificateurs épigénétiques utilisant Cas9 comme plate-forme de reconnaissance de l'ADN guidée par l'ARN.

Enfin, il convient de reconnaître que l'hématopoiesis des cellules greffées en souris mortellement irradiées peut différer des conditions indigènes de l'hématopoiesis. En outre, l'irradiation peut avoir des effets systémiques sur l'organisme qui peuvent confondre l'interprétation des expériences examinant les mutations génétiques des conséquences dans les cellules hématopoïétiques.

Les chercheurs ont profité des protéines Cas9 (dCas9) catalytiquement inactives comme « plate-forme de reconnaissance de l'ADN guidée par l'ARN » et ont utilisé des protéines de fusion dCas9 pour localiser les domaines effecteurs à des séquences d'ADN spécifiques pour réprimer (CRISPRi) ou activer (CRISPRa) transcription des gènes hors cible26,27. Alors que ce protocole utilise des souris transgéniques Cas9 catalytiquement actives pour introduire le clivage d'ADN dans la séquence génomique d'ADN, la modification épigénétique pour réprimer ou activer des gènes spécifiques est applicable en fusionnant dCas9 avec des domaines modificateurs de chromatine tels que dCas9-KRAB ou dCas9-VP64, respectivement. Alternativement, dCas9 peut être utilisé comme un répresseur transcriptionnel comme le sien, en bloquant les machines transcriptionnelles pour accéder au site génétique27. Plus récemment, Zhou et coll. ont établi des souris transgéniques dCas9-SunTag-p65-HSF1 (SPH) qui expriment une version modifiée d'un activateur épigénétique fusionné avec dCas9 et ont montré que ce système CRISPRa est fonctionnel in vivo28.

Notre laboratoire utilise principalement cette technologie pour étudier le rôle de l'hématopoiesis clonal dans les processus de maladies cardiovasculaires. Dans le tissu proliférant, les mutations somatiques dans les gènes de conducteur de cancer peuvent conférer un avantage de croissance cellulaire et mener aux expansions clonales aberrantes. Dans le système hématopoïétique, ce processus est connu sous le nom d'hématopoiesis clonal, et il en résulte des situations dans lesquelles une fraction substantielle des leucocytes d'un individu sont remplacés par des clones mutants. Il y a une appréciation croissante que les expansions clonales aberrantes accélèrent la maladie cardio-vasculaire, telle que l'athérosclérose et l'insuffisance cardiaque, et contribuent à la morbidité et à la mortalité de toutes causes15,29.

Récemment, un lien de causalité entre plusieurs de ces mutations somatiques et les maladies cardiovasculaires a été documenté, et des aspects des mécanismes sous-jacents ont été élucidés10,13,14. Cependant, ces mutations somatiques représentent probablement la « pointe de l'iceberg », car des études épidémiologiques ont montré que de nombreux gènes candidats supplémentaires sont associés à l'hématopoiesis clonale et, potentiellement, à une augmentation de la mortalité des maladies cardiovasculaires. Ainsi, une évaluation systématique et plus élevée du débit des gènes du conducteur de l'hématopoiesis clonale est nécessaire. Les études actuelles du lien causal de l'hématopoiesis clonal et de la maladie cardio-vasculaire sont basées sur l'analyse des souris avec le transgénique conditionnel hématopoietic système-spécifique (Mx1-Cre, Vav-Cre, etc.) ou des souris après greffe de moelle. Ces stratégies, cependant, doivent établir de nouvelles colonies de souris et peuvent devenir un fardeau financier et physique pour les chercheurs. Ainsi, une méthode moins coûteuse et plus rapide que l'approche transgénique murine conventionnelle et knock-out utilisée dans le passé est justifiée. Les vecteurs lentiviraux pour transduire les technologies HSPC et CRISPR pour concevoir des mutations, comme décrit dans ce manuscrit, facilitent l'étude de l'hématopoiesis clonale et des maladies cardio-vasculaires.

En plus de générer des locus knock-out conventionnels, cette méthode est applicable à la production de protéines mutées tronquées. Par exemple, les chercheurs ont réussi à générer une troncation hématopoïétique-Ppm1d, qui est fréquemment vu chez les patients atteints d'hématopoiesis clonal, en introduisant des mutations frameshift avec un gRNA ciblant exon 6 du gène Ppm1d30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

S. S. a été soutenu par une bourse postdoctorale de l'American Heart Association 17POST33670076. K. W. a reçu l'appui des NIH pour les subventions R01 HL138014, R01 HL141256 et R01 HL139819.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI Medium 1640 (1X) Gibco 11875-093 Medium
Sulfamethoxazole and Trimethoprim injection TEVA 0703-9526-01
1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE EXELINT 26028 general supply
293T cells ATCC CRL-3216-- Cell line
APC-anti-mouse Ly6C (Clone AL-21) BD Biosciences 560599 Antibodies
APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2) BD Biosciences 552094 Antibodies
BD Luer-Lok disposable syringes, 10 ml BD 309604 general supply
BD Microtainer blood collection tubes, K2EDTA added BD Bioscience 365974 general supply
BD Precisionglide needle, 18 G BD 305195 general supply
BD Precisionglide needle, 22 G  BD 305155 general supply
BV510-anti-mouse CD8a (Clone 53-6.7) Biolegend 100752 Antibodies
BV711-anti-mouse CD3e (Clone 145-2C11) Biolegend 100349 Antibodies
Collagen from calf skin Sigma-Aldrich 9007-34-5 general supply
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 well  Millipore Sigma CLS3471 general supply
CRISPR/Cas9 knock-in mice The Jackson Laboratory 028555 mouse
DietGel 76A Clear H2O 70-01-5022 general supply
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucose Sigma Aldrich D6429 Medium
eBioscience 1X RBC Lysis Buffer Thermo fisher Scientific 00-4333-57 Solution
Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish Life Sciences 353003 general supply
Falcon 5 mL round bottom polystyrene test tube Life Sciences 352054 general supply
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 352098 general supply
Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate  Life Science 353046 general supply
Fisherbrand microhematocrit capillary tubes Thermo Fisher Scientific 22-362566 general supply
Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm Fisher Scientific 22363548 general supply
FITC-anti-mouse CD4 (Clone RM4-5) Invitrogen 11-0042-85 Antibodies
Fixation Buffer BD Bioscience 554655 Solution
Guide-it Compete sgRNA Screening Systems Clontech 632636 Kit
Isothesia (Isoflurane) solution Henry Schein 29404 Solution
Lenti-X qRT-PCR Titration Kit  Takara 631235 Kit
Lineage Cell Depletion Kit, mouse Miltenyi Biotec 130-090-858 Kit
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 mm Millipore Sigma SLHV004SL general supply
PBS pH7.4 (1X) Gibco 10010023 Solution
PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98) eBioscience 25-1152-82 Antibodies
PEI MAX Polysciences 24765-1 Solution
Penicillin-Streptomycin Mixture Lonza 17-602F Solution
PerCP-Cy5.5-anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) BD Biosciences 560602 Antibodies
pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP  Addgene 57823 Plasmid
pMG2D Addgene 12259 Plasmid
Polybrene Infection/Transfection Reagent Sigma Aldrich TR-1003-G Solution
Polypropylene Centrifuge Tubes BECKMAN COULTER 326823 general supply
psPAX2  Addgene 12260 Plasmid
RadDisk – Rodent Irradiator Disk Braintree Scientific IRD-P M general supply
Recombinant Murine SCF Peprotech 250-03 Solution
Recombinant Murine TPO  Peprotech  315-14 Solution
StemSpan SFEM STEMCELL Technologies 09600 Solution
TOPO TA cloning kit for sequencing with One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli Thermo fisher Scientific K457501 Kit
Zombie Aqua Fixable Viability Kit BioLegend 423102 Solution 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sasaki, Y., et al. Defective immune responses in mice lacking LUBAC-mediated linear ubiquitination in B cells. EMBO Journal. 32, 2463-2476 (2013).
  2. Ogilvy, S., et al. Transcriptional regulation of vav, a gene expressed throughout the hematopoietic compartment. Blood. 91, 419-430 (1998).
  3. Meyer, S. E., et al. DNMT3A Haploinsufficiency Transforms FLT3ITD Myeloproliferative Disease into a Rapid, Spontaneous, and Fully Penetrant Acute Myeloid Leukemia. Cancer Discovery. 6, 501-515 (2016).
  4. Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269, 1427-1429 (1995).
  5. Cole, C. B., et al. PML-RARA requires DNA methyltransferase 3A to initiate acute promyelocytic leukemia. Journal of Clinical Investigation. 126, 85-98 (2016).
  6. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, 1370-1379 (2013).
  7. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
  8. Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18, 92 (2017).
  9. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knock-out mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13, 195-215 (2018).
  10. Sano, S., et al. CRISPR-Mediated Gene Editing to Assess the Roles of Tet2 and Dnmt3a in Clonal Hematopoiesis and Cardiovascular Disease. Circulation Research. 123, 335-341 (2018).
  11. Cante-Barrett, K., et al. Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: size matters. BMC Research Notes. 9, (312), (2016).
  12. Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 12514-12519 (2016).
  13. Fuster, J. J., et al. Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice. Science. 355, 842-847 (2017).
  14. Sano, S., et al. Tet2-Mediated Clonal Hematopoiesis Accelerates Heart Failure Through a Mechanism Involving the IL-1beta/NLRP3 Inflammasome. Journal of the American College of Cardiology. 71, 875-886 (2018).
  15. Sano, S., Wang, Y., Walsh, K. Clonal Hematopoiesis and Its Impact on Cardiovascular Disease. Circulatory Journal. 71, 875-886 (2018).
  16. Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Biotechnology. 32, 941-946 (2014).
  17. Jiang, W., et al. An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation. Scientific Reports. 5, 13875 (2015).
  18. Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnology. 13, 98 (2013).
  19. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42, e168 (2014).
  20. Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
  21. Akcakaya, P., et al. In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations. Nature. 561, 416-419 (2018).
  22. Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30, 1473-1475 (2014).
  23. Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology. 36, 765-771 (2018).
  24. El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568, 193-197 (2019).
  25. Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568, 259-263 (2019).
  26. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154, 442-451 (2013).
  27. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152, 1173-1183 (2013).
  28. Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21, 440-446 (2018).
  29. Fuster, J. J., Walsh, K. Somatic Mutations and Clonal Hematopoiesis: Unexpected Potential New Drivers of Age-Related Cardiovascular Disease. Circulatory Research. 122, 523-532 (2018).
  30. Kahn, J. D., et al. PPM1D truncating mutations confer resistance to chemotherapy and sensitivity to PPM1D inhibition in hematopoietic cells. Blood. (2018).
Modification du génome de Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated pour l'étude des cellules hématopoïétiques dans les modèles de maladie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sano, S., Wang, Y., Evans, M. A., Yura, Y., Sano, M., Ogawa, H., Horitani, K., Doviak, H., Walsh, K. Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models. J. Vis. Exp. (152), e59977, doi:10.3791/59977 (2019).More

Sano, S., Wang, Y., Evans, M. A., Yura, Y., Sano, M., Ogawa, H., Horitani, K., Doviak, H., Walsh, K. Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models. J. Vis. Exp. (152), e59977, doi:10.3791/59977 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter