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Immunology and Infection

Lentiviral CRISPR/Cas9-मध्यस्थता जीनोम संपादन रोग मॉडल में Hematopoietic कोशिकाओं के अध्ययन के लिए

Published: October 3, 2019 doi: 10.3791/59977

Summary

CRISPR/Cas9 प्रणाली द्वारा यूरीन हेमेटोपोएटिक स्टेम और जनक कोशिकाओं (एचएसपीसी) के अत्यधिक कुशल जीनोम संपादन के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है ताकि हेमटोपोएटिक सिस्टम-विशिष्ट जीन संशोधनों के साथ माउस मॉडल सिस्टम को तेजी से विकसित किया जा सके।

Abstract

पारंपरिक ट्रांसजेनेसिस दृष्टिकोण का उपयोग कर hematopoietic स्टेम कोशिकाओं में जीन हेरफेर समय लेने वाली, महंगा, और चुनौतीपूर्ण हो सकता है. जीनोम संपादन प्रौद्योगिकी और lentivirus मध्यस्थता transgene वितरण प्रणाली में अग्रिमों से लाभ, एक कुशल और किफायती विधि यहाँ वर्णित है कि चूहों जिसमें जीन hematopoietic स्टेम कोशिकाओं में विशेष रूप से हेरफेर कर रहे हैं स्थापित करता है. Lentiviruses एक गाइड आरएनए (GRNA) विशिष्ट जीन और एक लाल फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन (RFP) को लक्षित के साथ Cas9-expressing वंश-नकारात्मक अस्थि मज्जा कोशिकाओं ट्रांसड्यूस करने के लिए उपयोग किया जाता है, तो इन कोशिकाओं घातक विकिरणC57BL/6 चूहों में प्रत्यारोपित कर रहे हैं। गैर-लक्ष्यीकृत GRNA व्यक्त lentivirus के साथ प्रत्यारोपित चूहे नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है. ट्रांसड्यूस्ड हेमेटोपोइटिक स्टेम कोशिकाओं के engraftment परिधीय रक्त के आरएफपी सकारात्मक ल्यूकोसाइट्स के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन किया जाता है। इस विधि का उपयोग करना, $90% माइलॉयड कोशिकाओं के transduction और प्रत्यारोपण के बाद 4 सप्ताह में लसीकाभ कोशिकाओं के 70% प्राप्त किया जा सकता है. जीनोमिक डीएनए आरएफपी-सकारात्मक रक्त कोशिकाओं से अलग है, और लक्षित साइट डीएनए के कुछ हिस्सों को पीसीआर द्वारा जीनोम संपादन को मान्य करने के लिए बढ़ाया जाता है। इस प्रोटोकॉल hematopoiesis-नियामक जीन के एक उच्च throughput मूल्यांकन प्रदान करता है और hematopoietic सेल भागीदारी के साथ माउस रोग मॉडल की एक किस्म के लिए बढ़ाया जा सकता है.

Introduction

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हेमेटोपोईटिक सिस्टम-विशिष्ट क्रे ड्राइवरों जैसे Mx1-Cre, Vav-Cre, और अन्य का उपयोग करने वाले पारंपरिक और सशर्त ट्रांसजेनिक/नॉक-आउट चूहों सहित आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों की उपलब्धता पर कई अध्ययन निर्भर करते हैं। 1,2,3,4,5. इन रणनीतियों के लिए नए माउस उपभेदों की स्थापना की आवश्यकता होती है, जो समय लेने वाली और आर्थिक रूप से बोझ हो सकती है। जबकि जीनोम संपादन प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में क्रांतिकारी प्रगति ने उपयुक्त तकनीकी विशेषज्ञता6,7,8,9 के साथ कम से कम 3-4 महीनों में नए माउस उपभेदों की पीढ़ी को सक्षम किया है , प्रयोगों का अनुसरण करने से पहले माउस कॉलोनी को बढ़ाना अधिक समय की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, इन प्रक्रियाओं महंगा कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, जैक्सन प्रयोगशाला दस्तक बाहर चूहों पीढ़ी सेवाओं की वर्तमान कीमत की सूची में $ 16,845 प्रति तनाव (दिसंबर 2018 के रूप में). इस प्रकार, तरीकों कि पारंपरिक murine ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण की तुलना में अधिक किफायती और कुशल हैं और अधिक लाभप्रद हैं.

क्लस्टर्ड नियमित रूप से अंतराल वाले लघु पैलिड्रोमिक दोहराता/CRISPR संबद्ध प्रोटीन 9 (CRISPR/Cas9) प्रौद्योगिकी ने तीव्र और कुशल आरएनए-आधारित, अनुक्रम-विशिष्ट जीनोम संपादन के लिए नए उपकरणों का विकास किया है। मूल रूप से हमलावर रोगज़नक़ डीएनए को नष्ट करने के लिए एक जीवाणु अनुकूली प्रतिरक्षा तंत्र के रूप में की खोज की, CRISPR/Cas9 प्रणाली एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया गया है यूकैरियोटिक कोशिकाओं और पशु मॉडल में जीनोम संपादन की प्रभावशीलता को बढ़ाने के लिए. CRISPR/Cas9 मशीनरी को हेमेटोपोएटिक स्टेम सेल (यानी, इलेक्ट्रोपोरिओशन, नाभिक, लिपोफेक्शन, वायरल डिलीवरी, और अन्य) में संचारित करने के लिए कई दृष्टिकोणों को नियोजित किया गया है।

यहाँ, एक lentivirus प्रणाली को प्रभावी ढंग से Cas9-expressing murine hematopoietic स्टेम कोशिकाओं को संक्रमित करने की क्षमता के कारण कोशिकाओं ट्रांसड्यूस करने के लिए कार्यरत है और एक साथ गाइड आरएनए अभिव्यक्ति का निर्माण पैकेज, प्रमोटरों, नियामक दृश्यों, और जीन है कि एन्कोकोड फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन (यानी, GFP, आरएफपी). इस विधि का उपयोग करते हुए, माउस हेमेटोपोएटिक स्टेम कोशिकाओं के पूर्व विवो जीन संपादन हासिल किया गया है, घातक विकिरणित चूहों में अस्थि मज्जा के सफल पुनर्गठन के बाद10. इस अध्ययन के लिए कार्यरत lenivirus वेक्टर एक आंतरिक राइबोसोमल प्रवेश साइट रिपोर्टर जीन से ऊपर के साथ आम कोर EF1a प्रमोटर से Cas9 और GFP रिपोर्टर जीन व्यक्त करता है. गाइड आरएनए अनुक्रम एक अलग U6 प्रमोटर से व्यक्त की है. इस प्रणाली तो उम्मीदवार क्लोनल hematopois ड्राइवर जीन Tet2 और Dnmt3a10में प्रविष्टि और विलोपन उत्परिवर्तन बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है . हालांकि, इस विधि द्वारा transduction दक्षता अपेक्षाकृत कम है ($5%-10%) वेक्टर डालने के बड़े आकार के कारण (13 Kbp) कि transduction दक्षता सीमा और उत्पादन के दौरान वायरस titer कम कर देता है.

अन्य अध्ययनों में, यह दिखाया गया है कि बड़ा वायरल आरएनए आकार नकारात्मक दोनों वायरस उत्पादन और transduction दक्षता को प्रभावित करता है. उदाहरण के लिए, सम्मिलित आकार में 1 केबी वृद्धि से वायरस के उत्पादन में $50% की कमी आई है, और ट्रांसडक्शन दक्षता माउस हेमेटोपोएटिक स्टेम सेल11में 50% से अधिक तक कम हो जाएगी। इस प्रकार, यह प्रणाली की दक्षता में सुधार करने के लिए संभव के रूप में ज्यादा वायरल डालने के आकार को कम करने के लिए फायदेमंद है।

इस कमी को Cas9 ट्रांसजेनिक चूहों को रोजगार देकर दूर किया जा सकता है, जिसमें Cas9 प्रोटीन या तो एक संरचक या प्रेरक तरीके से व्यक्त किया जाता है12. गठन CRISPR/Cas9 दस्तक में चूहों एक सर्वव्यापी तरीके से Rosa26 स्थानों पर कैग प्रमोटर से Cas9 endonuclease और EGFP व्यक्त करता है. इस प्रकार, कोर EF1a प्रमोटर के नियंत्रण में U6 प्रमोटर और आरएफपी रिपोर्टर जीन के नियंत्रण में sgRNA के साथ एक निर्माण जीनोम संपादन प्राप्त करने के लिए lentivirus वेक्टर का उपयोग कर वितरित किया जा सकता है. इस प्रणाली के साथ, hematopoietic स्टेम कोशिकाओं के जीन सफलतापूर्वक संपादित किया गया है, एक $90% transduction दक्षता दिखा. इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल चूहों को बनाने के लिए एक त्वरित और प्रभावी तरीका प्रदान करता है जिसमें लक्षित जीन उत्परिवर्तनों को हेमेटोपोएटिक प्रणाली में पेश किया जाता है। जबकि हमारी प्रयोगशाला मुख्य रूप से हृदय रोग प्रक्रियाओं में क्लोनहेमितोपोसिस की भूमिका का अध्ययन करने के लिए इस प्रकार की प्रौद्योगिकी का उपयोग कर रही है13,14,15, यह भी रुमटोलॉजिकल के अध्ययन के लिए लागू होता है द्रोह16| इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल कैसे HSPC में डीएनए उत्परिवर्तन ों hematopoietic प्रणाली में अन्य रोग या विकासात्मक प्रक्रियाओं को प्रभावित के विश्लेषण के लिए बढ़ाया जा सकता है.

एक मजबूत मसूरी वायरस वेक्टर सिस्टम स्थापित करने के लिए, उच्च टिटर वायरल स्टॉक और हेमेटोपोएटिक कोशिकाओं के ट्रांसडक्शन और प्रत्यारोपण के लिए अनुकूलित शर्तों की आवश्यकता है। प्रोटोकॉल में, अनुभाग 1 में एक उच्च टिटर वायरल स्टॉक की तैयारी पर निर्देश दिए गए हैं, खंड 2 में murine hematopoietic स्टेम कोशिकाओं की संस्कृति की स्थिति का अनुकूलन, खंड 3 में अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के लिए तरीके, और आकलन अनुभाग 4 में engraftment.

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Protocol

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पशु विषयों से संबंधित सभी प्रक्रियाओं को वर्जीनिया विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है।

1. lentivirus कणों की पीढ़ी और शुद्धि

नोट: अनुकूलित गाइड आरएनए युक्त Lentivirus कणों Addgene द्वारा प्रदान की विस्तृत प्रोटोकॉल द्वारा उत्पादित किया जा सकता है: और lt;https://media.addgene.org/cms/files/Zhang]lab]LentiCRISPR[library]protocol.pdf)gt;. उच्च-टिटर lentivirus तैयारी और भंडारण के लिए अनुकूलित तरीकों कहीं और चर्चा कर रहे हैं17,18. संक्षेप में, lentiviruses एक lentivirus वेक्टर प्लास्मिड, psPAX2, और PMD2.G के सह-परिवर्तन द्वारा एचईके 293T कोशिकाओं में उत्पादित कर रहे हैं। संस्कृति supernatant 48 एच के बाद संक्रमण पर एकत्र किया जाता है और ultracentrifugation द्वारा केंद्रित. Lentiviral titer एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध QPCR आधारित परख द्वारा निर्धारित किया जाता है. यह प्रक्रिया एक जैव सुरक्षा वर्ग द्वितीय कैबिनेट में किया जाना चाहिए.

  1. कोलेजन का 1:200 समाधान तैयार करें (0.0005%) 1x पीबीएस में.
  2. कोलेजन समाधान के साथ एक 6 अच्छी तरह से थाली कोट और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, $ 30 मिनट के लिए 5% सीओ2।
  3. बीज 293T कोशिकाओं के घनत्व पर 1 x 106 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से और इनक्यूबेट पर 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 $ 2 के लिए ज.
  4. एक अच्छी तरह से के लिए तीन transfection प्लाज्मिड का मिश्रण तैयार करने के लिए, lentivirus वेक्टर के 0.9 डिग्री ग्राम, psPAX2 के 0.6 डिग्री ग्राम, और pMD2.G के 0.3 डिग्री ग्राम गठबंधन, तो deionized पानी जोड़कर 10 डिग्री सेल्सियस की कुल मात्रा को प्राप्त. कुओं की संख्या के आधार पर तदनुसार राशि समायोजित करें। प्रत्येक प्लाज्मिड की राशि और अनुपात को शोधकर्ताओं की जरूरतों के अनुरूप अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है।
  5. ध्यान से 1x पीबीएस के 50 डिग्री सेल्सियस और पतला पीई मैक्स के 5 डिग्री एल (1.0 मिलीग्राम/एमएल) को प्लाज्मिड मिश्रण में जोड़ें और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट (आरटी) (तालिका 1)।
  6. मिश्रण में DMEM का 1 एमएल जोड़ें।
  7. 6 अच्छी तरह से थाली से Aspirate मीडिया, प्लाज्मिड मिश्रण के 1 एमएल जोड़ें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, $ 3 एच के लिए 5% सीओ2।
  8. 24 डिग्री सेल्सियस केलिए ताजा DMEM और इनक्यूबेट के 2 एमएल के साथ मीडिया को बदलें।
  9. ताजा DMEM के 1 एमएल जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, 5% सीओ2 एक अतिरिक्त 24 एच के लिए (कुल ऊष्मायन समय 48 ज है)।
  10. किसी भी मुक्त फ्लोटिंग कोशिकाओं को हटाने के लिए 15 मिनट के लिए 3,000 x ग्राम पर एक 50 एमएल ट्यूब और अपकेंद्रित्र के लिए संस्कृति supernatant स्थानांतरण।
  11. 0.45 डिग्री मीटर फिल्टर के माध्यम से supernatant फ़िल्टर करें।
  12. छान पॉल्ट्रेट को पॉलीप्रोपाइलीन अपकेंद्रित्र ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
  13. 4 डिग्री सेल्सियस पर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज और 3 ज के लिए rअधिकतम पर 72,100 x g।
  14. सावधानी से supernatant aspirate, सफेद गोली के पीछे छोड़ने.
  15. वातन के बिना सीरम मुक्त हेमेटोपोएटिक सेल विस्तार माध्यम के 100 डिग्री सेल्सियस के साथ गोली को पुन: निलंबित करें।
  16. वायरल टिटर को मापने के लिए एक 10 डिग्री एल एलिकोट रखें और आवश्यक होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर सभी शेष alicots स्टोर करें।
  17. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक QPCR आधारित परख के साथ वायरस titrate 10 $L वायरल alicot का उपयोग कर.

2. अलगाव और माउस अस्थि मज्जा से वंश-नकारात्मक कोशिकाओं के transduction (चित्र 1A)

नोट: आमतौर पर, पर्याप्त कोशिकाओं को अलग करने के लिए, tibias, femurs, और humeri के जोड़े प्रत्येक माउस से काटा जाता है. श्रोणि और रीढ़ की हड्डी भी वंश नकारात्मक कोशिकाओं के एक स्रोत के रूप में काटा जा सकता है.

  1. अस्थि मज्जा कोशिकाओं का अलगाव
    1. यूथेनाइज़ 8-10 सप्ताह पुराने पुरुष CRISPR/Cas9 दस्तक में चूहों द्वारा 5% isoflurane गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद, तो 70% इथेनॉल के साथ उनकी त्वचा कीटाणुरहित.
    2. कैंची विच्छेदन का उपयोग करना, बस रिबकेज के नीचे त्वचा में एक अनुप्रस्थ चीरा बनाने के लिए और दोनों दिशाओं में त्वचा distally छील पैर और बाहों को बेनकाब करने के लिए.
    3. कूल्हे के जोड़ को स्थानांतरित करके कूल्हे की हड्डी से निचले अंगों को सावधानी से अलग करें। कूल्हे से पूरी तरह से फीमर को हटाने के लिए फीमर सिर के साथ कट। घुटने को अलग करना और हड्डी एपिफिसिस को बरकरार रखते हुए, फीमर और टिबिया को अलग करने के लिए संयुक्त में कटौती करें। टखने के जोड़ को अलग करें और पैर और अतिरिक्त मांसपेशियों को छील लें।
    4. कैंची को अलग करने का उपयोग करना, ऊपरी अंगों को अलग करने के लिए कंधे पर काट दिया। कंधे को अलग करें, फिर ह्यूमरस हड्डी को काटने के लिए कोहनी के जोड़ में काट लें।
    5. फीमर, टिबियास और हुमरी से मांसपेशियों को सावधानी से हटाने के लिए सेलूलोज़-फाइबर वाइप्स का उपयोग करें। यह सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त सावधानी बरतें कि इस प्रक्रिया के दौरान हड्डियां नहीं टूटती हैं।
    6. अलग हड्डियों को 50 एमएल शंकु ट्यूब में रखें जिसमें RPMI होता है, और बर्फ पर रखें।
      नोट: निम्नलिखित कदम एक जैव सुरक्षा वर्ग द्वितीय कैबिनेट में किया जाना चाहिए.
    7. एक बाँझ, 100 मिमी संस्कृति पकवान में हड्डियों स्थानांतरण.
    8. कुंद संदंश के साथ हड्डी grasp, और विच्छेदन कैंची का उपयोग कर, ध्यान से दोनों epiphyses कटौती.
      नोट: एक अपर्याप्त काटने अस्थि मज्जा का एक अधूरा फ्लश करने के लिए नेतृत्व करेंगे, जबकि अति आक्रामक काटने सेल हानि में परिणाम होगा.
    9. बर्फ ठंडा RPMI के साथ एक 10 एमएल सिरिंज भरें, और एक 22 जी सुई का उपयोग कर, एक नया 100 मिमी संस्कृति पकवान में शाफ्ट से अस्थि मज्जा फ्लश.
      नोट: हड्डी शाफ्ट अच्छी तरह से बह गया है, तो हड्डियों सफेद और पारदर्शी हो जाएगा। यदि नहीं, तो फिर से हड्डी समाप्त होता है और फिर से फ्लश काट.
    10. सभी अस्थि मज्जा एकत्र किया गया है के बाद, एक 18 जी सुई के साथ एक 10 एमएल सिरिंज के माध्यम से अस्थि मज्जा कई बार गुजर द्वारा एक एकल सेल निलंबन बनाते हैं। एक एकल सेल निलंबन सुनिश्चित करने के लिए 10x दोहराएँ.
    11. एक 50 एमएल शंकु ट्यूब में एक 70 डिग्री मीटर सेल छलनी के माध्यम से सेल निलंबन फ़िल्टर.
    12. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 310 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
    13. सुपरनेंट को प्रेरित करें और निम्नलिखित सेल पृथक्करण प्रक्रिया के लिए अनुकूलित पृथक्करण बफर की एक उपयुक्त मात्रा में सेल छर्रों को पुन: स्फूर्त करें।
  2. अलगाव और मसूरीवायरस वंश-नकारात्मक कोशिकाओं का रूपांतरण
    नोट: माउस वंश नकारात्मक कोशिकाओं Cas9 ट्रांसजेनिक चूहों की अस्थि मज्जा से अलग कर रहे हैं3, या चूहों के अन्य उपभेदों, निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वंश कमी किट का उपयोग. आमतौर पर, वंश-नकारात्मक कोशिकाओं पूरे अस्थि मज्जा नाभिकीय कोशिकाओं के 2%-5% के लिए खाते हैं, और शुद्धता आमतौर पर अलगाव के बाद 90% से अधिक है। पृथक वंश-नकारात्मक कोशिकाओं को सीरम मुक्त हेमेटोपोएटिक सेल विस्तार माध्यम में सुसंस्कृत किया जाता है, जो 20 एनजी/एमएल रिकॉमबिनेंट मौरीन टीपीओ और 50 एनजी/एमएल रिकॉमबिनेंट यूरीन एससीएफ के साथ पूरक होते हैं, फिर 16 एच के लिए मसूरवायरस वेक्टर के साथ ट्रांसड्यूस किया जाता है। संक्रमण (MOI) $ 100.
    1. वंश नकारात्मक कोशिकाओं को अलग करने के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार वंश सेल कमी किट का उपयोग करें।
    2. अलगाव के बाद सीरम मुक्त हेमेटोपोएटिक सेल विस्तार माध्यम के 1 एमएल में वंश-नकारात्मक कोशिकाओं को पुन: स्फूर्ति।
    3. कोशिकाओं को 1.5 x 106 कोशिकाओं/एमएल (5 x 105 वंश-नकारात्मक कोशिकाओं/माउस के घनत्व पर 6 अच्छी प्लेट में बीज दें।
    4. क्रमशः 20 एनजी/एमएल और 50 एनजी/एमएल की अंतिम सांद्रता में पुनः संयोजक मौरीन टीपीओ और एससीएफ को कुओं में जोड़ें।
    5. $ 2 एच के लिए 5% सीओ2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्री-इनक्यूबेट कोशिकाओं।
    6. MOI में lentivirus जोड़ें $ 100, 4 g/mL polybrene, और पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन कुओं में और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, 16-20 एच के लिए 5% सीओ2 (चित्र 1B)।
    7. अगले दिन, lentivirus ट्रांसड्यूस कोशिकाओं को 15 एमएल शंकु ट्यूब और अपकेंद्रण में 300 ग्राम के लिए 10 मिनट में एकत्र करें।
    8. ध्यान से supernatant aspirate और माउस प्रति RPMI के 200 डिग्री एल में गोली resuspend. चूहों में प्रत्यारोपण तक आरटी पर कोशिकाओं रखें (अनुभाग 3).

3. घातक विकिरणित चूहों में ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं का प्रत्यारोपण

  1. अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के दिन, एक आठ टुकड़ा पाई पिंजरे में प्राप्तकर्ता चूहों जगह है और उन्हें पूरे शरीर विकिरण की दो खुराक के लिए बेनकाब (550 रेड /
  2. दूसरे विकिरण सत्र के बाद, एक इंसुलिन का उपयोग करप्रत्येक एनेस्थेटाइज़्ड प्राप्तकर्ता माउस को ट्रांसड्यूस्ड वंश-नकारात्मक कोशिकाओं को इंजेक्ट करें(कुल में 200 डिग्री सेल्सियस) इंसुलिन का उपयोग करते हुए (सिरिंजचित्रा 1C)।
  3. विकिरण के बाद, चूहों बाँझ पिंजरों में रखा जाना चाहिए और एक नरम आहार और पीने के पानी के साथ प्रदान की 14 घ के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक.
  4. अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के बाद 3-4 सप्ताह में, ट्रांसड्यूसर दाता कोशिकाओं (धारा 4) के engraftment के लिए जाँच करने के लिए परिधीय रक्त का विश्लेषण।

4. परिधीय रक्त की झंकार का मूल्यांकन

  1. 5% आइसोफ्लुरेन के साथ चूहों को एनेस्थेटाइज करें और केशिका ट्यूबों का उपयोग करके रेट्रो-ऑर्बिटल नस से रक्त का नमूना प्राप्त करें, और इसे के2EDTA ट्यूबों में एकत्र करें (एक केशिका ट्यूब में मात्रा निम्नलिखित परख के लिए पर्याप्त है)।
  2. 5 एमएल गोल तल पॉलीस्टाइरीन टेस्ट ट्यूबों में K2EDTA ट्यूबों से 20 डिग्री सेल्सियस रक्त स्थानांतरित करें, और बर्फ पर डाल दिया।
  3. लाल रक्त कोशिकाओं को lyse करने के लिए आरबीसी lysis बफर के 1.5 एमएल जोड़ें। बर्फ पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  4. lysis बफर बेअसर करने के लिए, FACS बफर (1.5 एमएल/नमूना) के साथ नमूने धोने।
  5. 609 x g पर सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए rअधिकतम पर। महादलित को त्याग दें।
  6. अंधेरे में 20 मिनट के लिए आरटी में मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (100 डिग्री एल एफएसीएस बफर/नमूना में पतला) के कॉकटेल के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। एंटीबॉडी की एक पूरी सूची ऊपर सामग्री अनुभाग में प्रदान की जाती है.
  7. एफएसीएस बफर (2 एमएल/नमूना) के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें। 609 x g पर सेंट्रीफ्यूज rअधिकतम (1,800 आरपीएम) पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर। सुपरनेटेंट को पूरी तरह से छोड़ दें।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए पैराफार्मेल्डिहाइड युक्त निर्धारण बफर (100 डिग्री एल/ट्यूब) के साथ कोशिकाओं को ठीक करें।
  9. FACS बफर (3 एमएल/नमूना) के साथ एक बार कोशिकाओं को धोएं। 609 x g पर सेंट्रीफ्यूज rअधिकतम (1,800 आरपीएम) पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर। सुपरनेटेंट को पूरी तरह से छोड़ दें।
  10. FACS बफर के 400 $L में गोली निलंबित.
  11. प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण तक नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।

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Representative Results

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उपरोक्त प्रोटोकॉल का उपयोग करना, लगभग 0.8-1.0 x 108 अस्थि मज्जा कोशिकाओं प्रति माउस प्राप्त किया गया है. हमारे द्वारा प्राप्त वंश-ऋणात्मक कोशिकाओं की संख्या लगभग 3 x 106 कोशिकाओं प्रति माउस है। आमतौर पर, अस्थि मज्जा वंश-नकारात्मक कोशिकाओं की उपज कुल अस्थि मज्जा परमाणु कोशिकाओं की 4%-5% है।

ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं (आरएफपी-पॉजिटिव) के चिमरिज्म का मूल्यांकन परिधीय रक्त के प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा किया जाता है (चित्र 2क,बी) । रक्त रेट्रो कक्षीय नस से अलग है और उचित मार्करों प्रत्येक hematopoietic कोशिका आबादी की पहचान निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है (यानी, न्यूट्रोफिल, monocytes, टी कोशिकाओं, आदि) (चित्र 3क,बी) जीनोमिक डीएनए आरएफपी सकारात्मक रक्त कोशिकाओं से अलग किया जा सकता है, और लक्षित साइट डीएनए के वर्गों पीसीआर द्वारा परिलक्षित किया जा सकता है और अनुक्रम विश्लेषण के लिए टीए क्लोनिंग वैक्टर में subcloned. इन प्लाज्मिडों को ई. कोलाई में ट्रांसड्यूस किया जाता है और लक्ष्य स्थल अनुक्रमे संगर अनुक्रमण द्वारा निर्धारित किएजातेहैं ( चित्र 4 )। वैकल्पिक रूप से, लक्ष्य साइट दृश्यों का निर्धारण अन्य विधियों द्वारा किया जा सकता है, जैसे पूल किए गए जीनोम का सेंगर अनुक्रमण जिसके बाद अपघटन (TIDE) विश्लेषण10द्वारा indels की ट्रैकिंग की जाती है। नियंत्रण हालत के लिए, चूहों आम तौर पर कोशिकाओं है कि एक lentivirus गैर-लक्ष्यीकरण गाइड आरएनए व्यक्त के साथ ट्रांसड्यूस कर रहे हैं के साथ प्रतिरोपित कर रहे हैं.

Figure 1
चित्र 1: इस प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध चित्रण. (क) Cas9-expressing चूहों से वंश-नकारात्मक अस्थि मज्जा कोशिकाओं का पृथक्लग्नता (अनुभाग 2.1)। (बी) वंश-नकारात्मक कोशिकाओं का लेन्टीवायरस संक्रमण (खंड 2-2)। (सी) घातक विकिरणित जंगली प्रकार चूहों में ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं के रेट्रो कक्षीय इंजेक्शन (धारा 3)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: इन विट्रो में माउस अस्थि मज्जा वंश-नकारात्मक कोशिकाओं के कुशल मसूरीवायरल रूपांतरण। (क) प्रवाह कोशिकामिति विश्लेषण वंश-ऋणात्मक कोशिकाओं के सफल रूपांतरण का पता चलता है। इन विट्रो संस्कृति के 7 दिनों के बाद विश्लेषण किया गया था। (ख) औसतन 757% कोशिकाओं को इस परख (द र् 3) में ट्रांसड्यूस किया गया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3:ट्रांसड्यूस्ड वंश-नकारात्मक कोशिकाओं द्वारा घातक विकिरणित माउस अस्थि मज्जा का पुनर्गठन। (क) हेमेटोपोएटिक स्टेम कोशिकाओं द्वारा पुनर्गठन के बाद माउस परिधीय रक्त का प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण जो (नीचे) थे या (ऊपर) आरएफपी व्यक्त करने वाले lentivirus के साथ ट्रांसड्यूसर नहीं थे। न्यूट्रोफिल को Ly6G+ और Ly6Cहाय मोनोसाइट्स के रूप में Ly6G- और Ly6C+और B कोशिकाओं को CD45R+के रूप में परिभाषित किया गया है . (ख) इन परखों में, कोशिकाओं का औसत 948%, 935%, और 827% कोशिकाओं में आरएफपी+ न्यूट्रोफिल, Ly6Cहाय मोनोसाइट, और बी सेल जनसंख्या क्रमशः (द $ 8) हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 

Figure 4
चित्र 4:ट्रांसड्यूस्ड रक्त कोशिकाओं में जीन संपादन का मूल्यांकन। (क) जीन संपादन का उदाहरण, आरपीएफ-सकारात्मक रक्त कोशिकाओं में उत्परिवर्तित Dnmt3a टिड्डी के अनुक्रमण परिणाम दर्शाता है। हटाने लाल डैश के रूप में दिखाए जाते हैं और प्रविष्टि लाल अक्षरों के साथ चिह्नित कर रहे हैं. (बी) पाए गए उत्परिवर्तनों का सारांश। (सी) 69% (11/16 क्लोन) से पता चला कि आउट-ऑफ-फ्रेम/पूर्वाचल स्टॉप उत्परिवर्तन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 

प्लास्मिड आकार (बीपी) अच्छी तरह से प्रति राशि ($g) अनुपात
pLKO5.0 7700 0.9 2
psPAX2 10668 0.6 1
पीएमडी2.जी 5822 0.3 1
PEI-अधिकतम (स्टॉक: 100 मिलीग्राम / 5 $L/अच्छी तरह से

तालिका 1: transfection के लिए उपयोग किया जाने वाला प्लाज्मिड और PEI-अधिकतम की मात्रा.

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Discussion

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इस प्रोटोकॉल का लाभ पारंपरिक माउस ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण की तुलना में एक तेजी से और अत्यधिक लागत प्रभावी तरीके से hematopoietic कोशिकाओं में विशिष्ट उत्परिवर्तनों शरण पशु मॉडल का निर्माण है. यह पाया गया कि इस पद्धति से 1 महीने के भीतर हेमेटोपोएटिक सेल जीन-मैनीपुलेशन के साथ चूहों की पीढ़ी सक्षम हो जाती है। आगे विचार की आवश्यकता होती है जो इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं।

gRNA अनुक्रम की स्क्रीनिंग

विवो प्रयोगों में आचरण करने से पहले संपादन दक्षता का आकलन करने के लिए इन विट्रो में जीआरएनए का परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है। GRNAs की दक्षता एक सेल मुक्त इन विट्रो प्रतिलेखन और स्क्रीनिंग प्रणाली का उपयोग कर परीक्षण किया है. लिखित gRNA रिकॉमबिनेंट Cas9 प्रोटीन की उपस्थिति में टेम्पलेट डीएनए cleaving पर अपनी दक्षता को मापने के द्वारा मान्य है, agarose जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस का उपयोग कर. वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध किट इस उद्देश्य के लिए उपलब्ध हैं.

यहाँ, indel उत्परिवर्तनों संपादित क्षेत्र से परिलक्षित पीसीआर उत्पादों की टीए क्लोनिंग द्वारा विशेषता है, उन प्लाज्मिड के साथ जीवाणु कोशिकाओं को बदलने, और Sanger अनुक्रमण के लिए अलग-अलग कालोनियों उठा. हालांकि, इस विधि कठिन और समय लेने वाली है. वैकल्पिक रूप से, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) या बद्दल डीएनए अनुक्रमण TIDE विश्लेषण के बाद19किया जा सकता है। TIDE एल्गोरिथ्म जटिल नमूनों से उत्पन्न Sanger अनुक्रम निशान का विश्लेषण करने के लिए बनाया गया था. यह दिखाया गया है कि TIDE के साथ indel अनुमान आम तौर पर उन बंद लक्षित NGS20के साथ संगत कर रहे हैं. विश्लेषणात्मक सॉफ्टवेयर पर ऑनलाइन उपलब्ध है [lt;http://tide.nki.nl.nl.gt;.

उच्च-टिटर लेन्टीवायरस कणों का उत्पादन

वायरल vesicular stomatitis वायरस जी प्रोटीन, जो सेल संक्रमण के लिए आवश्यक है, अत्यधिक पीएच-संवेदी है। इस प्रकार, यह एक स्वीकार्य पीएच रेंज के भीतर संस्कृति माध्यम रखने के लिए महत्वपूर्ण है, और यह एक पीले रंग की उपस्थिति विकसित नहीं करना चाहिए. वायरस पीढ़ी के लिए कोलेजन लेपित व्यंजन कार्यरत हैं क्योंकि यह HEK293T कोशिकाओं के लगाव accelerates और कुछ ही घंटों के भीतर transfection के प्रदर्शन की अनुमति देता है, बजाय रात भर इंतज़ार कर. हालांकि, प्रयोगात्मक अनुसूची के आधार पर, रात भर ऊष्मायन पर भी विचार किया जा सकता है।

मसूरी वायरस कणों का शुद्धि

हीमाटोपोएटिक स्टेम कोशिकाओं के कुशल transduction को प्राप्त करने के लिए, यह उच्च titer lentivirus उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है। अपकेंद्रण गति का अनुकूलन एक प्रमुख विशेषता है। जबकि मसूरीवायरस की सांद्रता आमतौर पर 90,000 x gपर की जाती है , कई रिपोर्टों से पता चला है कि यदि सामग्री 20,000 x g18की निम्न गति से centrifuged है तो वायरस की वसूली बढ़ जाती है . अल्ट्रासेंट्रीफ्यूगेशन के बिना उच्च-टिटर लेन्टीवायरस तैयारी का उत्पादन भी17सुझाव दिया गया है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यह वायरस centrifugation गोली निलंबित करने के लिए महत्वपूर्ण है, जबकि जोरदार pipeting से बचने के लिए वातन को कम करने और वायरस अखंडता को बनाए रखने. उच्च-टिटर मसूरीवायरस कण हेमेटोपोएटिक स्टेम कोशिकाओं11के कुशल transduction के लिए आवश्यक हैं। पायलट प्रयोगों से पता चला है कि 100 की एक MOI transduction दक्षता और सेल व्यवहार्यता के संबंध में इष्टतम है. सेल व्यवहार्यता और ट्रांसडक्शन दक्षता के आधार पर lentivirus स्टॉक का मूल्यांकन करने की सिफारिश की जाती है।

मसूरीवायरस कणों का भंडारण

lentivirus titer तापमान के प्रति अत्यधिक संवेदनशील है, और titer काफी अनुचित भंडारण की स्थिति और दोहराया फ्रीज-थॉ चक्र द्वारा कम किया जा सकता है. यह पाया गया है कि lentivirus के transduction दक्षता तेजी से कम हो जाती है जब 4 डिग्री सेल्सियस [t(1/2) पर संग्रहीत [ 1.3 दिन] या कई फ्रीज-थॉ व चक्र के अधीन [t(1/2) [ 1.1 राउंड]. यह अनुशंसा की जाती है कि वायरस की तैयारी तरल नाइट्रोजन में स्नैप-फ्रोज़न या वायरस गोली निलंबित होने के तुरंत बाद सूखी बर्फ कुचल दी जाए। वायरल स्टॉक को 80 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना चाहिए और बर्फ पर आरटी को सिर्फ पहले समानता के लिए रखा जाना चाहिए और11का उपयोग करना चाहिए .

कई संभावित सीमाओं पर ध्यान दिया जाना चाहिए. सबसे पहले, CRISPR/Cas9 द्वारा ऑफ-लक्ष्य अदल उत्परिवर्तनों की शुरूआत की लंबे समय से सराहना की गई है। यह भी दिखाया गया है कि CRISPR/Cas9 vivo21में ऑफ-लक्ष्य उत्परिवर्तनों को प्रेरित कर सकता है। व्यवहार में, गैर-लक्ष्य indel उत्परिवर्तनों gRNA दृश्यों कि बारीकी से जीनोम साइटों को लक्षित करने के लिए मिलान कर रहे हैं और भविष्यवाणी माध्यमिक साइटों के लिए चार से अधिक बेमेल का उपयोग करके बचा जा सकता है. इस प्रकार के डिजाइन सिलिको टूल22में विद्यमान के साथ किया जा सकता है . अन्य कम्प्यूटेशनल उपकरण कम से कम बंद लक्ष्य कार्रवाई के साथ gRNA भविष्यवाणी करने के लिए उपलब्ध हैं ([lt;http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design]gt; या [http://www.benchling.com]. यह भी phenotype की पुष्टि करने के लिए दो या दो से अधिक अलग gRNAs का उपयोग कर एक पशु मॉडल का विश्लेषण करने के लिए फायदेमंद हो सकता है और संभावना है कि मनाया phenotype एक विशिष्ट gRNA के एक बंद लक्ष्य प्रभाव से मध्यस्थता है कम से कम.

CRISPR/Cas9 द्वारा बनाए गए पारंपरिक अदल उत्परिवर्तनों के अतिरिक्त, बड़े विलोपन जो किलोबेस से परे हैं, सूचित किए गए हैं। यह अध्ययनको भ्रमित कर सकता है; तथापि, उन बड़े विलोपन indels23की तुलना में बहुत कम आवृत्ति होने की सूचना है. एक अन्य संभावित समस्या आनुवंशिक मुआवजा है. यह सूचित किया गया है कि उत्परिवर्ती आरएनए समय से पहले समाप्ति कोडोन (पीटीसी) के साथ संबंधित जीनों के अपविनियमन का परिणाम हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप प्रतिलेखन24,25के प्रतिलेखन के जटिल-मध्यस्थ सक्रियण द्वारा अनुक्रम समानता के साथ संबंधित जीनों का विनियमन हो सकता है। इस घटना के लिए एक तंत्र है कि नॉक आउट और जीन ablation के knockdown दृष्टिकोण के बीच phenotypic मतभेद के लिए नेतृत्व कर सकते हैं होने का सुझाव दिया गया है. क्योंकि CRISPR/Cas9-मध्यस्थ जीनोम संपादन भारी फ्रेम पारी उत्परिवर्तनों कि PTC की पीढ़ी के लिए नेतृत्व के stochastic परिचय पर निर्भर करता है, आनुवंशिक मुआवजा phenotype संशोधित कर सकते हैं. आनुवंशिक मुआवजे से बचने के लिए, प्रयोगों पर विचार किया जा सकता है जिसमें एक जीन के नियामक दृश्यों CRISPR/Cas9 द्वारा लक्षित कर रहे हैं या एक आरएनए निर्देशित डीएनए मान्यता मंच के रूप में Cas9 का उपयोग कर epigenetic संशोधक की शुरूआत द्वारा.

अंत में, यह स्वीकार किया जाना चाहिए कि घातक विकिरणित चूहों में engrafted कोशिकाओं से हीमाटोपोइसिस हीमाटोपोइसिस की मूल स्थितियों से अलग हो सकता है। इसके अलावा, विकिरण जीव है कि hematopoietic कोशिकाओं में परिणामों जीन उत्परिवर्तनों की जांच प्रयोगों की व्याख्या उलझन हो सकता है पर प्रणालीगत प्रभाव हो सकता है.

शोधकर्ताओं ने एक "RNA निर्देशित डीएनए मान्यता मंच" के रूप में उत्प्रेरक निष्क्रिय Cas9 (dCas9) प्रोटीन का लाभ उठाया है और dCas9 संलयन प्रोटीन का इस्तेमाल किया विशिष्ट डीएनए दृश्यों के लिए प्रभावक डोमेन स्थानीयकरण करने के लिए या तो दमन (CRISPRi) या सक्रिय (CRISPRa) प्रतिलेखन ऑफ-लक्ष्य जीन26,27. जबकि इस प्रोटोकॉल उत्प्रेरक सक्रिय Cas9 ट्रांसजेनिक चूहों जीनोमिक डीएनए अनुक्रम में dsDNA दरार परिचय का उपयोग करता है, epigenetic संशोधन को दबाने या विशिष्ट जीन को सक्रिय करने के लिए chromatin संशोधक डोमेन के साथ fusing dCas9 द्वारा लागू है जैसे dCas9-KRAB या dCas9-VP64, क्रमशः. वैकल्पिक रूप से, dCas9 जीन साइट27के लिए उपयोग करने के लिए ट्रांसक्रिप्शनल मशीनरी अवरुद्ध द्वारा, अपने स्वयं के रूप में एक प्रतिलेखनीय दमनकारी के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। हाल ही में, झोउ एट अल स्थापित dCas9-SunTag-p65-HSF1 (SPH) transgenic चूहों कि एक epigenetic उत्प्रेरक के एक संशोधित संस्करण व्यक्त dCas9 के साथ जुड़े और पता चला कि इस CRISPRa प्रणाली vivo में कार्यात्मक है28.

हमारी प्रयोगशाला मुख्य रूप से हृदय रोग प्रक्रियाओं में क्लोनहेमितेटोपोइसिस की भूमिका का अध्ययन करने के लिए इस तकनीक का उपयोग करता है। ऊतक में वृद्धि, कैंसर चालक जीन में दैहिक उत्परिवर्तनों एक सेलुलर विकास लाभ प्रदान कर सकते हैं और aberant clonal विस्तार करने के लिए नेतृत्व. hematopoietic प्रणाली में, इस प्रक्रिया को "क्लोनल हेमेटोपोइसिस" के रूप में जाना जाता है, और इसके परिणामस्वरूप ऐसी स्थितियों में एक व्यक्ति के ल्यूकोसाइट्स का एक बड़ा अंश उत्परिवर्ती क्लोन द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है। वहाँ एक बढ़ती सराहना की है कि aberant clonal विस्तार हृदय रोग में तेजी लाने, इस तरह के atherosclerosis और दिल की विफलता के रूप में, और रुग्णता और सभी कारण मृत्यु दर15,29के लिए योगदान .

हाल ही में, इनमें से कई दैहिक उत्परिवर्तनों और हृदय रोग के बीच एक कारण संबंध का प्रलेखन किया गया है , और अंतर्निहित तंत्र ों के पहलुओं को10,13,14स्पष्ट किया गया है . हालांकि, इन दैहिक उत्परिवर्तनों शायद "आइसबर्ग के टिप" का प्रतिनिधित्व करते हैं, के रूप में महामारी विज्ञान के अध्ययन से पता चला है कि कई अतिरिक्त उम्मीदवार जीन क्लोनल hematopoiesis के साथ जुड़े रहे हैं और, संभावित रूप से, हृदय रोग मृत्यु दर में वृद्धि हुई. इस प्रकार, क्लोनल हेमेटोपोइसिस ड्राइवर जीन के एक व्यवस्थित, उच्च थ्रूपुट मूल्यांकन की आवश्यकता है। क्लोन हेमेटोपोइसिस और हृदय रोग के कारण कनेक्शन के वर्तमान अध्ययन हेमाटोपोईटिक प्रणाली-विशिष्ट सशर्त ट्रांसजेनिक (Mx1-Cre, Vav-Cre, आदि) या अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के बाद चूहों के विश्लेषण पर आधारित हैं। इन रणनीतियों, तथापि, नए माउस कालोनियों की स्थापना की जरूरत है और शोधकर्ताओं के लिए एक वित्तीय और शारीरिक बोझ बन सकता है. इस प्रकार, अतीत में नियोजित पारंपरिक murine ट्रांसजेनिक /नॉक-आउट दृष्टिकोण की तुलना में एक सस्ता और अधिक तेजी से तरीका warranted है। Lentiviral वेक्टर्स HSPC और CRISPR प्रौद्योगिकियों को स्थानांतरित करने के लिए उत्परिवर्तन इंजीनियर, के रूप में इस पांडुलिपि में वर्णित, क्लोनल हेमेटोपोइसिस और हृदय रोग के अध्ययन की सुविधा.

पारंपरिक नॉक-आउट टिड्डी पैदा करने के अलावा, यह विधि काट दिया उत्परिवर्तित प्रोटीन के उत्पादन के लिए लागू है। उदाहरण के लिए, शोधकर्ताओं ने सफलतापूर्वक एक hematopoietic-Ppm1d truncation उत्पन्न किया है, जो अक्सर क्लोनल हेमेटोपोइसिस के साथ रोगियों में देखा जाता है, एक gRNA लक्ष्य के साथ frameshift उत्परिवर्तनों शुरू करने से Ppm1d जीन30.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

एस एस एक अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन postdoctoral फैलोशिप 17POST33670076 द्वारा समर्थित किया गया था. के डब्ल्यू NIH अनुदान R01 HL138014, R01 HL141256, और R01 HL139819 द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI Medium 1640 (1X) Gibco 11875-093 Medium
Sulfamethoxazole and Trimethoprim injection TEVA 0703-9526-01
1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE EXELINT 26028 general supply
293T cells ATCC CRL-3216-- Cell line
APC-anti-mouse Ly6C (Clone AL-21) BD Biosciences 560599 Antibodies
APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2) BD Biosciences 552094 Antibodies
BD Luer-Lok disposable syringes, 10 ml BD 309604 general supply
BD Microtainer blood collection tubes, K2EDTA added BD Bioscience 365974 general supply
BD Precisionglide needle, 18 G BD 305195 general supply
BD Precisionglide needle, 22 G  BD 305155 general supply
BV510-anti-mouse CD8a (Clone 53-6.7) Biolegend 100752 Antibodies
BV711-anti-mouse CD3e (Clone 145-2C11) Biolegend 100349 Antibodies
Collagen from calf skin Sigma-Aldrich 9007-34-5 general supply
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 well  Millipore Sigma CLS3471 general supply
CRISPR/Cas9 knock-in mice The Jackson Laboratory 028555 mouse
DietGel 76A Clear H2O 70-01-5022 general supply
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucose Sigma Aldrich D6429 Medium
eBioscience 1X RBC Lysis Buffer Thermo fisher Scientific 00-4333-57 Solution
Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish Life Sciences 353003 general supply
Falcon 5 mL round bottom polystyrene test tube Life Sciences 352054 general supply
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 352098 general supply
Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate  Life Science 353046 general supply
Fisherbrand microhematocrit capillary tubes Thermo Fisher Scientific 22-362566 general supply
Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm Fisher Scientific 22363548 general supply
FITC-anti-mouse CD4 (Clone RM4-5) Invitrogen 11-0042-85 Antibodies
Fixation Buffer BD Bioscience 554655 Solution
Guide-it Compete sgRNA Screening Systems Clontech 632636 Kit
Isothesia (Isoflurane) solution Henry Schein 29404 Solution
Lenti-X qRT-PCR Titration Kit  Takara 631235 Kit
Lineage Cell Depletion Kit, mouse Miltenyi Biotec 130-090-858 Kit
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 mm Millipore Sigma SLHV004SL general supply
PBS pH7.4 (1X) Gibco 10010023 Solution
PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98) eBioscience 25-1152-82 Antibodies
PEI MAX Polysciences 24765-1 Solution
Penicillin-Streptomycin Mixture Lonza 17-602F Solution
PerCP-Cy5.5-anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) BD Biosciences 560602 Antibodies
pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP  Addgene 57823 Plasmid
pMG2D Addgene 12259 Plasmid
Polybrene Infection/Transfection Reagent Sigma Aldrich TR-1003-G Solution
Polypropylene Centrifuge Tubes BECKMAN COULTER 326823 general supply
psPAX2  Addgene 12260 Plasmid
RadDisk – Rodent Irradiator Disk Braintree Scientific IRD-P M general supply
Recombinant Murine SCF Peprotech 250-03 Solution
Recombinant Murine TPO  Peprotech  315-14 Solution
StemSpan SFEM STEMCELL Technologies 09600 Solution
TOPO TA cloning kit for sequencing with One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli Thermo fisher Scientific K457501 Kit
Zombie Aqua Fixable Viability Kit BioLegend 423102 Solution 

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References

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Lentiviral CRISPR/Cas9-मध्यस्थता जीनोम संपादन रोग मॉडल में Hematopoietic कोशिकाओं के अध्ययन के लिए
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Sano, S., Wang, Y., Evans, M. A., Yura, Y., Sano, M., Ogawa, H., Horitani, K., Doviak, H., Walsh, K. Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models. J. Vis. Exp. (152), e59977, doi:10.3791/59977 (2019).More

Sano, S., Wang, Y., Evans, M. A., Yura, Y., Sano, M., Ogawa, H., Horitani, K., Doviak, H., Walsh, K. Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models. J. Vis. Exp. (152), e59977, doi:10.3791/59977 (2019).

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