Summary
Presentert her er en protokoll for å bruke CRISPR-Cas9-systemet for å redusere produksjonen av et protein i voksen honningbiehjerne for å teste antistoffspesifitet.
Abstract
Cluster Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-assosiert protein 9 (Cas9) er en genredigeringsteknikk som er mye brukt i studier av genfunksjon. Vi bruker denne metoden i denne studien for å se etter spesifisiteten av antistoffer utviklet mot insektet GABAA reseptorsubenhet Resistens mot Dieldrin (RDL) og en metabotropisk glutamatreseptor mGlutR1 (mGluRA). Antistoffene ble generert hos kaniner mot konjugerte peptider som er spesifikke for fruktfluer (Drosophila melanogaster) samt til honningbier (Apis mellifera). Vi brukte disse antistoffene i honningbiehjerneseksjoner for å studere fordelingen av reseptorene i honningbihjerner. Antistoffene ble affinitet renset mot peptidet og testet med immunoblotting og den klassiske metoden for preadsorption med peptid konjugater for å vise at antistoffene er spesifikke for tilsvarende peptid konjugater som de ble hevet mot. Her utviklet vi CRISPR-Cas9-teknikken for å teste for reduksjon av proteinmål i hjernen 48 timer etter CRISPR-Cas9 injeksjon med guide RNAs designet for tilsvarende reseptor. CRISPR-Cas9-metoden kan også brukes i atferdsanalyser i de voksne biene når ett eller flere gener må endres.
Introduction
Det nylig oppdagede CRISPR/Cas9-systemet er et kraftig verktøy som har blitt brukt til å endre genomisk DNA i ulike modellsystemer og organismer. Det har akselerert biomedisinsk forskning og store teknologiske gjennombrudd ved å gjøre genommodifikasjon mer effektiv og robust enn tidligere metoder1. Opprinnelig til S. pyogenes bakterier, systemet er avhengig av en Cas9 endonuclease, hvis aktivitet fører til dobbelt-strandet pauser (DSBs) i DNA, og en guide RNA (gRNA) som leder Cas9 protein til en bestemt, sekvensavhengig sted2. Dobbeltstrandede pauser generert av CRISPR/Cas9 kan repareres via ikke-homologende sluttsammenføyning (NHEJ), en feilutsatt prosess som kan føre til rammeskift, eller homologi direkte reparasjon når en donormal er til stede. GRNA selv består av en målspesifikk CRISPR RNA (crRNA) og en universell transaktiverende crRNA (tracrRNA) som kan kjemisk syntetiseres og leveres med renset Cas9 nuclease som et ribonucleoproteinkompleks (RNP)2,3. Fluorescerende merking av gRNA- eller Cas9-kjernen kan tillate deteksjon og intracellulær visualisering av molekylære komponenter via fluorescerende mikroskopi4.
I vårt nåværende arbeid drar vi nytte av CRISPR-Cas9-systemet for å redusere proteinnivåene i voksne honningbiehjerner. Vi studerte den metabotropiske glutamatreseptoren (mGluR) og anti-mGlutR1 reseptorantistoffer og GABAA reseptorunderenhet RDL og anti-RDL antistoffer. Vi utviklet en enkel metode for å redusere mengden protein i hjernen til den voksne honningbien og brukte den til å kjøre flere tester av antistoffene utviklet mot de tilsvarende proteinene. Overvåking av fluorescensen til CRISPR-Cas9 tillot oss å estimere områdene og cellene som er involvert i reduksjonen av proteinet.
Ved hjelp av denne metoden karakteriserte vi også anti-mGlutR1 antistoffer som ble laget i kaniner mot konjugert peptid. Honeybee genome koder en høyt bevart AmGluRA (kalt mGlutR1 i henhold til NCBI nomenklatur) metabotropisk glutamat reseptor5. Honeybee mGlutR1 genet har fire spådde skjøtevarianter i henhold til NCBI-databasen. Det har blitt rapportert at det uttrykkes i sentralnervesystemet (CNS) av både pupal og voksen bie stadier og det er involvert i langsiktig minnedannelse5. Antistoffer utviklet mot mGlutR1 kan være et viktig verktøy for å studere glutamatergic systemet i lærings- og minneprosessen i honningbier.
I våre studier karakteriserte vi også anti-RDL antistoffer utviklet hos kaniner immunisert med konjugerte peptider fra Apis mellifera RDL reseptorunderenhet. Honeybee Rdl genet, AmRdl (XM_006565102.3, NCBI database), har 14 spådde skjøtevarianter. Et delvis klonet fragment er rapportert i NCBI-databasen AF094822.1. RDL reseptorfunksjonen og dens fysiologi er godt studert iinsekter6,7,8, inkludert honningbier 9,10,11. Antistoffer utviklet mot anti-RDL kan være et viktig verktøy for å studere GABAergic-systemet i lærings- og minneprosessen i honningbier.
En tidligere studie på rollen som octopamin og tyramin reseptorer brukt RNAi injisert i hjernen med en påfølgende test av mengden protein av western blot12,13. RNAi har imidlertid noen betydelige begrensninger. Det er bare et kort tidsvindu etter RNAi injeksjon der en reduksjon av protein oppstår13. CRISPR-Cas9 ble brukt nylig i honningbieembryoer for å slette eller modifisere gener i hele dyret14,15,16. Vi rapporterte bruk av CRISPR-Cas9 for å redusere mengden protein i voksen honningbie. Vi utviklet denne tilnærmingen for honningbier på grunn av evnen til å pare den til atferdsstudier av læring og minne under kontrollerte laboratorieforhold17.
I det nåværende arbeidet utviklet vi antistoffer mot to reseptorer og testet dem på de voksne honningbiene etter at proteinet ble redusert ved CRISPR-Cas9 injeksjon. Samtidig etablerte vi en eksperimentell design som tillater bruk av metoden for atferdseksperimenter.
Protocol
Protokollen som er beskrevet her følger retningslinjene for dyrepleie ved Arizona State University.
1. Total proteinisolasjon fra hjernen til Apis mellifera
MERK: Bruk Apis mellifera New World Carniolan foragers av ukjent alder for dette eksperimentet.
- Plasser en aluminiummesh skjerm over inngangen til bikuben for å fange forager bier17. Fang hver bie i et hetteglass med et lite hull i hver hette. Plasser hetteglassene som inneholder biene i is for å senke kroppstemperaturen og immobilisere dem. La biene stå i is i ikke mer enn 3 min.
- Fest de immobiliserte biene i tidligere forberedte metallholdere. Sørg for at metallholderne er konstruert slik at bien kan sikres med små biter av duct tape, men fortsatt har ryggen thorax, vinger, og hodet utsatt.
FORSIKTIG: Pass på at biene er fullstendig immobilisert før du forsøker å plassere dem i holderne. - Mate biene med en 1 M sukroseoppløsning ved hjelp av en 5 ml sprøyte til de ikke lenger er sultne. Plasser de sikrede biene i en eske med et vått papirhåndkle for å sikre et fuktig miljø.
- Disseker ebiens hjerne raskt ved å kutte av hodet med Barraquer Iris saks (se Tabell av materialer)og bruk saksen til å åpne hodet fra forsiden.
- Klipp av hjernen fra hodekapselen, ta hjernen med #5 tang, og legg den i 100 μL kald (4-8 °C) lysisbuffer. Lysisbufferen består av 120 mM Tris-HCl, 2% natriumdodsfat (SDS), 5 % glyserol, 0,2 mM ditioytreitol, 1 % Triton X-100 og 1-5 μg/ml proteasehemmere PMSF (fenyltylsulfonyfufluorid), aprotinin, benzamidin (pH 6,8) ved 4 °C. Homogeniser hjernen i lysisoppløsningen ved å snu i en pestle i ca 2 min.
- Sentrifuge prøven på 12.000 x g i 20 min. Aspirulær 90 μL av supernatanten og kast pelleten.
- Ta 1 μL av supernatanten for å kvantatere det totale proteinet ved hjelp av et fluorimeter. Den omtrentlige konsentrasjonen av det totale proteinet var mellom 2-3 mg/ml per bi. Ta 10 μL av supernatanten og tilsett 10 μL av lysisbufferen og 10 μL av en 6x Laemmli buffer18. Spinn kort og kok i 3 min, og avkjøl deretter på is. Spinn i 1 min på 10.000 x g for å fjerne alt rusk. En tiendedel av en bihjerne inneholder ca. 25 ng totalt protein.
2. Western Blotting19
- Lag 30 ml 10% løpegel som inneholder 12,15 ml ultrarent destillert vann, 7,5 ml 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 0,3 ml 10 % SDS, 10 ml 30 % akrylamid-bis akrylamidløsning, 0,15 ml 10 % ammoniumpersulfat (APS) og 20 μL tetramethyletylendiamin (TEMED ).
- Kast gelen mellom to glassplater atskilt med avstandsdeler.
- Lag en 20 ml stablingsgel som inneholder 12,1 ml ultrarent destillert vann, 5,0 ml akrylamid, 0,1 ml 10 % APS og 20 μL TEMED.
- Når løpegelen stivner, hell en stablegel. Legg forsiktig til plastseparatoren for å kaste lastefeltet, unngå bobler. Vent 15-30 min, til gelen er størknet.
- Begynn å laste gelen ved hjelp av 5 μL proteinstandarder. Last 20 μL av lysatblandingen fra trinn 1,8 per kjørefelt, tilsvarende ~ 1/15 av en biehjerne eller ~ 16 ng av totalt protein per kjørefelt. Kjør prøvene for 3,5-4 t totalt på 16 mA i stabling gel og 32 mA i løpegel. Stopp når syen forlater gelen.
- Overfør proteinene på nitrocellulosemembraner i overføringsbuffer (25 mM Tris-HCl, 192 mM glyc, 15 % metanol) ved 0,45 mA i 1 t 30 min ved 4 °C.
- For å evaluere effektiviteten av proteinoverføringen etter SDS-PAGE før immunblotting, legg til Ponceau S fargingsløsning (tilsett 0,1 g Ponceau S og 5 ml eddiksyre til vann til et endelig volum på 100 ml). Oppbevares ved 4 °C i 1 min og skyll raskt med destillert vann.
- Merk hvert kjørefelt med en kulepenn, kutt membranen som inneholder to baner med hjernehomogenat og ett kjørefelt med proteinmarkør og plasser hver i en vestlig flekkinkuberende boks. Vask 3x i 5 min hver i fosfat bufret saltvann (PBS) som inneholder 0,1% Tween 20 (PBS-Tw).
- Blokker membranen med 10 % NGS (1 ml normal geiteserum til 10 ml PBS-Tw) i en vestlig flekkinkuberende boks i 1 t. Lag en anti-mGlutR1 fortynning (5 μL antistoff i 10 ml 10 % NGS). Gjør anti-RDL1 og anti-RDL2 fortynninger (5 μL antistoff i 10 ml 10% NGS hver). Skift ut blokkeringsoppløsningen i hver boks med de fortynnede antistoffene og la det stå over natten (16-24 timer) ved 4 °C.
- Vask membranen 3x i 5 min hver i PBS-Tw. Inkuber membranen med anti-kanin IgG HRP-konjugerte sekundære antistoffer på 1:10,000 i 10% NGS PBS-Tw i 2 timer ved romtemperatur (RT). Vask membraner 3x i PBS-Tw, deretter 1x i PBS.
- Oppdag båndene ved hjelp av vestlig chemiluminescent HRP-substrat. Bland to substrater 1:1 (v/ v) ved RT, legg alle membraner i samme boks og dekk dem med substratblandingen i 2 min (i et mørkt rom med rødt lys) ved RT. Fortsett til proteindeteksjon ved hjelp av en autoradiografifilm med flere eksponeringstider. Vanligvis testes ett antistoff på en membran som inneholder samme fortynning av hjernehomogenat på to eller tre baner og ett kjørefelt med vektmarkøren.
3. Immuncytokjemiske prosedyrer
- For å dissekere honningbiehjerner for immuncytokjemi, immobilisere honningbiene i is i 30 s. Etter at biene er immobilisert, halshugge bien med saks og plasser hodet i en løsning på 4% paraformaldehyd i PBS. Arbeid under røykhetten.
FORSIKTIG: Kroppen må avhendes forsiktig fordi magen fortsatt kan stikke etter halshugging. - Forsiktig, men raskt fjerne antennene, sammensatte øyne, og kutte rundt toppen eksoskjelett med Barraquer Iris saks. La hodene sitte i den fikserende løsningen i 10 min. Fjern resten av eksoskjelettet på hodet og kutt alle gjenværende luftrør.
- Plasser hver hjerne i et 1,5 ml mikrocentrifugerør som inneholder minst 1 ml 4% paraformaldehydløsning og la over natten ved 4-8 °C.
- Lag en 7,6% agarose løsning ved å blande 3,8 g agarose og 50 ml destillert vann i en Erlenmeyer kolbe. Mikrobølgeovn løsningen til agarose likviderer.
MERK: Et lite stykke vevpapir kan plasseres i åpningen av kolben for å hindre at den agaroseløsningen flyter over under oppvarming. - Plasser de faste honningbihjernene (3-4 hjerner) i en 35 mm Petri-tallerken og fjern overflødig fikseringsmiddel med vevspapir. Hell væskeagaroseløsningen over hjernen. Orienthjernen i agarose slik at antenneflikene vender opp. La agarose avkjøles og stivne.
- Etter at agarose har størknet, kuttet ut blokker av agarose hver inneholder en hjerne.
- For vibratome snitting, lag en 24 brønnplate med hver brønn som inneholder en kurv med et hydrofobt nett nederst. Fyll hver brønn med 600 μL PBS.
- Skjær hver blokk i 70 μm tverrsnitt ved hjelp av vibratome maskinen og plasser seksjonene i kurven som inneholder PBS.
MERK: Kontroller at deler fra samme hjerne er plassert i samme kurv. - Vask hjerneseksjonene 6x i 10 min hver med PBS-TX for å sikre at det ikke forblir fikserende i seksjonene. Legg multiwell platen på en orbital shaker og vask hjernen på 210 rpm. Før hver vask må du bytte ut PBS-TX-løsningen med fersk PBS-TX-løsning. Blokker med 1% normalt eselserum under siste vask.
- For å teste anti-mGlutR1 primære antistoff, forberede en 1:112 fortynning av anti-mGlutR1 antistoffer ved å legge 9 ml PBS-TX til 80 μL anti-mGlutR1 antistoffer i en 15 ml sentrifuge rør. Vortex røret kort for å blande grundig. Arbeidsfortynning av antistoffer ble bestemt i foreløpige eksperimenter.
- For å teste anti-RDL primære antistoff, forberede en 1:100 fortynning av anti-RDL antistoffer ved å legge til 30 μL anti-RDL peptid 1, 30 μL anti-RDL peptid 2, og 6 ml PBS-TX i en 15 ml sentrifugerør. Vortex røret kort for å blande grundig. Arbeidsfortynning av antistoffer ble bestemt i foreløpige eksperimenter.
- Tilsett 800 μL antistoffoppløsning til hver brønn i platen. Dekk multiwell platen og pakk den i aluminiumsfolie for å hindre nedbrytning fra lyseksponering. Plasser platen innpakket i aluminiumsfolie på en orbital shaker og rist på 210 o/min i 2 timer. Deretter la over natten på RT uten å riste.
- Etter at hjerneseksjonene har blitt igjen over natten, vask med PBS-TX i 10 min. Gjenta vasketrinn 6x.
- Forbered de sekundære antistoffene (antikanin fra esel) ved å gjøre en 1:225 fortynning av sekundære antistoffer ved å legge til 40 μL sekundære antistoffer til 9 ml PBS-TX.
- Tilsett 800 μL av sekundær antistofffortynning til hver brønn. Dekk platen og pakk den i aluminiumsfolie. Plasser platen innpakket i aluminiumsfolie på orbital shaker og rist på 210 o/min i 2 timer. La det deretter ligge over natten på RT.
- Vask hjernedelene 3x i 10 min hver med PBS-TX og 3x med vanlig PBS-løsning.
- For å bygge inn delene i lysbildene, klargjør monteringsmediet /glyserolinneinnbyggingsløsningen som er endret fra Rodriguez et al.20. Tilsett 5 g av monteringsmediet i 20 ml PBS og rør i 16 timer med magnetisk røre. Tilsett 10 ml glyserol og rør i ytterligere 16 timer med magnetisk røre. Sentrifuge i 15 min ved 4000 x g, ta væsken homogen supernatant, og aliquot i 1 ml rør. Hold ved -20 °C
- Bygg inn delene på lysbildene med en dråpe av monteringsmediet utarbeidet i trinn 3.17, og pass på at hvert lysbilde inneholder seksjoner fra én hjerne.
- Preadsorption kontroll av immunstaining med konjugerte peptider
- For anti-RDL og konjugerte peptider, inkuber arbeidsfortynningen av anti-RDL antistoffer med tilsvarende peptid konjugat over natten ved RT på shaker: tilstand 1) 500 μg peptid konjugert med Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) via glutaraldehyd; tilstand 2) uten konjugat.
- Sentrifuge hver blanding i 10 min ved 10.000 x g og samle supernatant fra begge forhold (trinn 3.19.1).
- Inkuber seriedelene av honningbiehjerne med hver supernatant og prosess med de sekundære antistoffene som er beskrevet ovenfor. Seriedeler er seksjoner som følger hverandre under vibratome-snittingsprosedyrene, slik at den samme delen av hjernen vil bli utsatt for positive og negative kontroller.
- For anti-mGlutR1 og konjugert peptid, inkuber arbeidsfortynningen av anti-mGlutR1 antistoffer ved RT med KLH konjugert peptid som inneholder10-4 M peptid (tilstand 1) og uten konjugering (tilstand 2).
- Sentrifuge hver blanding i 10 min på 10.000 x g og samle supernatant fra begge kontroller.
- Inkuber seriedelene av honningbiehjerne med supernatant fra begge forhold og prosess med de sekundære antistoffene (trinn 3.14-3.15).
- Bygg inn deler fra begge betingelsene på lysbildet ved hjelp av innebyggingsmedier (trinn 3.17).
4. Test av RDL og mGlutR1 proteinuttrykk ved immuncytokjemi (avsnitt 3) i honeybee hjerne etter injeksjon av tilsvarende CRISPR-Cas9-system
- Design guidene ved hjelp av et online CRISPR-Cas9 designverktøy21 ved hjelp av de genomiske DNA-sekvensene til AmRdl (XM_006565102.3) og sekvenser av mGlutR1 (XM_006566244.3) (Tabell 1). Bestill som Cas9 crRNA og Cas-9 tracrRNA med fluorescerende dye ATTO550 ved 5' slutten. Bestill Cas9 Nuclease V3 (se materialtabell).
- Forbered komponentene for CRISPR-Cas 9-systemet ved å lage et 100 μM lager av hver føringscrRNA og tracrRNA ved hjelp av kjernefritt vann. Aliquot og oppbevares ved -20 °C. Forbered arbeidskonsentrasjonen av Cas-9-oppløsning ved å tilsette 2,5 μL ca9 kjernease V3 (10 mg/ml) til 47,5 μL nukleotidfri buffer for å oppnå en endelig konsentrasjon på 0,5 μg/μL. Lag gRNA og RNP til injeksjon.
- Forbered gRNA-kompleksdannelse for hver guide RNA separat (guideRNA:tracrRNAATTO550)
- Merk et reagensrør med navnet på gRNA, tilsett 92 μL nukleotidfri buffer, 4 μL 100 μM CRISPR-Cas9 tracrRNA- 5'ATTO550 og 4 μL av ledanscrRNA-oppløsningen. Bland forsiktig og spinn.
MERK: Eksempel på merking av gRNA-rør for RDL: GRDL1, GRDL2, GRDL3 (tilsvarende RDL-førerRNA i tabell 1). Eksempel på merking av gRNA-rør for mGlutR1: GMGL1, GMGL2, GMGL3 (Tabell 1). - Varm oppløsningen til 95 °C i 5 min for å skape gRNA. Avkjøl blandingen ved RT i 10 min.
- Merk et reagensrør med navnet på gRNA, tilsett 92 μL nukleotidfri buffer, 4 μL 100 μM CRISPR-Cas9 tracrRNA- 5'ATTO550 og 4 μL av ledanscrRNA-oppløsningen. Bland forsiktig og spinn.
- Forbered RNP kompleks dannelse (gRNA: S.p Cas9Nuclease), leveringsblandinger og kontroll.
- Merk et reagensrør med navnet på RNP, tilsett 6 μL gRNA-oppløsning og 6 μL på 0,5 μg/μL S.p Cas9 Nuclease V3. Bland forsiktig og inkuber løsningene ved 37 °C i 10 min før injeksjon.
MERK: Eksempel på RNP-røretiketter: RRDL1, RRDL2, RRDL3. - Lag en RNPRDLmix. For å forberede den endelige blandingen som brukes til injeksjoner, tilsett 4 μL av hver RNP fra RDL sammen. RNP/RDL-blanding = 4 μL RRDL1 + 4 μL RRDL + 4 μL RRDL3.
- Lag en RNPmGlutR1mix. Bland 4 μL av hver RNP fra mGlutR1 sammen for å forberede den endelige blandingen som brukes til injeksjonsvæsker (RNPmGlutR1mix) = 4 μL RMG1 + 4 μL RMG2 + 4 μL RMG3.
MERK: Eksempel på RNP røretiketter: RMG1, RMG2, RMG3. - Lag en kontroll noguideRNA-oppløsning ved å blande 4 μL tracrRNA, 92 μL buffer og 4 μL vann i stedet for guideRNA (se pkt. 4.3). Bland 6 μL av denne noguideRNA-oppløsningen og 6 μL på 0,5 μg/μL Cas9 Nuclease V3 (trinn 4,4,1) for å produsere kontrollinjeksjonsoppløsningen.
- Merk et reagensrør med navnet på RNP, tilsett 6 μL gRNA-oppløsning og 6 μL på 0,5 μg/μL S.p Cas9 Nuclease V3. Bland forsiktig og inkuber løsningene ved 37 °C i 10 min før injeksjon.
5. Injeksjonprosedyre
- Immobilisere hver bie som beskrevet i trinn 1.3 og mate dem som i trinn 1.4. Deretter forberede to sett med to tre bokser for å frigjøre biene i etter injeksjon: en hvit boks (eksperimentell tilstand) og en svart boks (kontroll). Hver boks skal inneholde en liten kam og en fôring Petri parabolen. Den ene siden av hver boks er laget av glass for å tillate observasjon.
- Lag fôring Petri retter. Ta dekselet på en 35 mm Petri-tallerken, plasser voks innsiden av overflaten, og plasser den nederste delen av Petri-fatet på voksen. Fest platen i esken.
- Bruk en 5 ml sprøyte, injiser 1M sukroseoppløsning mellom dekselet og den nederste delen av parabolen. Bier kan raskt sette sine proboscises mellom de to platene og vil holde seg tørre i en 48 h inkubasjonsperiode. Legg en tallerken i hver boks.
- For å forberede mikroinjeksjonssystemet, fyll kapillærene med mineralolje uten luftbobler. Plasser kapillærene i injektorholderen i mikroinjeksjonssystemet. For å laste kapillæren med ønsket injeksjonsoppløsning, plasser en hydrofob film på en flat overflate, og pipette oppløsningen på den. Injiser oljen fra kapillærene og skift ut blandingen med den tilsvarende RNP-blandingen.
- Bruk mikroinjeksjonssystemet til å injisere 345 nL RNP-blandingsoppløsning direkte i hver bies median ocelli.
- For injeksjon av RDL-CRISPR-Cas9 injiser åtte bier med RNPRDLmix som beskrevet i trinn 4.4.2. Mate dem 1M sukrose etter injeksjonen. Slipp dem i den hvite (eksperimentelle) boksen med den lille kammen og fôring Petri parabolen i 48 timer. Bruk ytterligere åtte bier som kontroller uten injeksjoner, mate dem, og slipp dem i den svarte (kontroll) boksen.
- For mGlutR1 CRISPR-Cas9 injiserer du ni bier med RNPmGlutR1mix som beskrevet i trinn 4.4.3. For kontroll injiser åtte bier med RNA-blanding uten føring (RNAmix_noguide) utarbeidet som beskrevet i trinn 4.4.4. Mate dem 1M sukrose etter injeksjonen. Slipp bier fra holderne sine i den hvite boksen (eksperimentell tilstand) eller den svarte boksen (kontroll) utarbeidet som beskrevet i pkt. 5.1.
- Plasser boksene i en polystyrenbeholder med vått papir inni for fuktighet. La bier stå i 48 timer og observere 2x per dag for å sikre at de har nok mat og god fuktighet.
- Disseker hjernen til hver bi etter 48 timer (trinn 3.1) og prosess for immuncytokjemi som beskrevet i avsnitt 3. For anti-mGlutR1 immunbeiseringer bruk trinn 3.11 og for anti-RDL immunbeisinger bruk trinn 3.12.
- Utfør konfokal avbildning for å evaluere nivået av fluorescens i de immunfargede hjerneseksjonene.
- For å evaluere reduksjonen av protein i immunmerkede hjerner, bruk confocal bildesamling på samme nivå av gevinst for både kontroll og injisert hjerne.
6. qPCR-basert drop-off analyse for å evaluere modifisert genomisk RDL DNA 48 H etter CRISPR Cas9 RNPRDLmix Injeksjon
- Design primere, kontroll sonde, og drop-off sonde for å evaluere mengden dna modifisert av CRISPR-Cas9 injeksjon. Hver primer er utformet slik at den flankerer minst én CRISPR-Cas 9-guide og ampliconstørrelsen er 132 bp. Primere og sonder som brukes er gitt nedenfor:
RDL1_For: CTCGGAGTGACCACCGT
RDL1_Rev: CAACGAGGCGAACACCAT
RDL1_control_probe: /5HEX/CGA+C+G+TTT+A+C+CT/3IABkFQ/
RDL1_Drop-off_probe: /56-FAM/CCTA+C+G+T+CA+A+GT/3IABkFQ/- Kontroller at primere samsvarer med unike sekvenser som er spesifikke for området. Kontroller at rulleavinsonden er utformet for området som overlapper med RDL-CRISPR-Cas9-veiledningen.
- For å teste om det er en modifikasjon av gDNA i føringsområdet, injiser 12 bier i ocelli med RNP_RDL blanding beskrevet i trinn 5.3.1 og bruk åtte uinjiserte bier som kontroller.
- Dissekere ut bihjernene uten optiske fliker 48 timer etter injeksjonene og trekk ut gDNA av hver injisert og kontroll bie hjerner (uten optiske fliker) ved hjelp av settet etter produsentens protokoll (se Tabell av materialer).
- Evaluer kvantiteten, kvaliteten og renheten til det ekstraherte gDNA-et ved hjelp av et spektrosofometmeter.
- Kvantifiser det relative uttrykket for modifisert gDNA av AmRDL ved hjelp av qPCR-basert frafallsprotokoll og PCR-syklusid i sanntid.
- Resuspender oligoene til 100 μM, fortynn primere til 10 μM, og sondene til 5 μM.
- Sett opp PCR-reaksjonen i 96-brønnplaten som vist her for en prøve av gDNA (3 repetisjoner): 10 μL mastermix (se Materialtabell),1 μL fremoverprimer, 1 μL revers, 1 μL kontrollprobe, 1 μL av drop-off probe, 2 μL gDNA (50 ng), 4 μL kjerneasefritt vann for å bringe den endelige volumreaksjonen til 20 μL.
MERK: Kontroller er løsningen i stedet for prøvene og vannet i stedet for sondene. - Sett opp sykkelprogrammet som følger for en PCR-syklus: 95 °C i 3 min etterfulgt av 40 sykluser på 95 °C for 15 s, 60 °C i 1 min.
- Evaluer den relative genendringen ved hjelp av 2-ΔΔCt-metoden, der
Og
Og
7. Relativ kvantifisering av RDL RNA 48 H etter RNPRDLmix Injeksjon
- For å teste om det er en reduksjon av RDL mRNA, injiser 20 bier i ocelli med RNP_RDL blanding som beskrevet i trinn 5.3.1 og bruk 12 uinjiserte bier som kontrollene. Dissekere ut bihjernen (uten optiske fliker) 48 timer etter injeksjonene, trekk ut den totale mRNA fra hver injisert e-bi, og atskilt ved hjelp av produsentens protokoll (se Materialtabell).
- Fjern eventuelle DNA-rester som gjenstår i prøven ved hjelp av et DNA-fritt sett (se Materialtabell).
- Evaluer kvaliteten og renheten til den ekstraherte RNA ved hjelp av et spektrometometer.
- Kvantifiser uttrykket til AmRDL ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig fluorescerende grønt RT-PCR-sett (Materialtabell) på en PCR-syklusid i sanntid ved hjelp av produsentens protokoll for en 384-brønnplate.
MERK: I dette eksperimentet ble tidligere publiserte primere brukt. For AmRDL (AmRDL_F GGTCGATGGGCTACTACCTG; AmRDL_R TCGATCGACTTGACGTAGGA)22 og actin primere som referansegen [AmActin_F TGCCAACACTGTCCTTTCTG; AmActin_R GAATTGACCCACCAATCCA]23. Det relative genuttrykket ble beregnet ved hjelp av 2-ΔΔCt-metoden (trinn 6.6).
8. qPCR basert drop-off analyse for å evaluere modifisert genomisk DNA 48 H etter RNPmGlutR1mix Injeksjon
- Design primere, kontroll og drop-off probes for å evaluere mengden DNA modifisert av CRISPR-Cas9 injeksjon. Design primere slik at de flankerer minst en CRISPR-Cas 9 guide og amplicon størrelsen er 96 bp.
mGlutR1_For: GGTGAAACGAACGACGGA
AmGlurR1_Rev: GGAGAGAGGGAGCGAGAA
AmGlurR1_control_probe: /5HEX/CGAGG+G+AAA+CGA+GT/3IAbkFQ/
AmGlurR1_Drop-off_probe: /56-FAM/CGA+C+A+C+CG+TC/3IABkFQ/
MERK: Kontroller at primere samsvarer med unike sekvenser som er spesifikke for området som skulle ha blitt endret. Rulleavinsonden er designet for området som overlappet med CRISPR-Cas9-veiledningen. - For å teste om det er en modifikasjon av gDNA i føringsområdet, injiser 12 bier i ocelli med RNP_ GlutR1-blandingen som beskrevet i trinn 5.3.1 og bruk åtte uinjiserte bier som kontroller.
- Dissekere ut bihjernen (uten optiske fliker) 48 timer etter injeksjonene og trekk ut gDNA fra hver injisert og kontroll bie hjerne (uten optiske fliker) ved hjelp av produsentens protokoll (se Tabell av materialer).
- Evaluer kvantiteten, kvaliteten og renheten til det ekstraherte gDNA-et ved hjelp av et spektrosofometmeter.
- Kvantifiser den relative endringen av gDNA AmGlutR1 ved hjelp av qPCR drop-off-protokollen og for PCR-syklusid i sanntid som beskrevet i trinn 6.5.
- Evaluer den relative genendringen ved hjelp av 2-ΔΔCt-metoden, der
Og
Og
9. Kvantifisering av mGlutR1 RNA 48 h etter RNPmGlutR1mix Injeksjon
- For å teste om det er en reduksjon i mGlutR1 RNA mRNA, injiser seks bier i ocelli med RNP_RDL blanding som beskrevet i trinn 5.3.2 og bruk seks uinjiserte bier som kontroller. Dissekere ut bihjernene (uten optiske fliker) 48 timer etter injeksjonene, trekk ut den totale mRNA fra hver injiserte bi, og atskilt ved hjelp av produsentens protokoll for RNA-isolasjon (se Materialtabell).
- Fjern eventuelle DNA-rester som gjenstår i prøven ved hjelp av et DNA-fritt sett (se Materialtabell).
- Evaluer kvaliteten og renheten til den ekstraherte RNA ved hjelp av et spektrometometer.
- Kvantifiser uttrykket for mGlutR1 ved hjelp av et SYBR Green RT-PCR-sett (se Materialtabell) på en PCR-syklusid i sanntid med protokollen som er gitt for 384-brønnsettet. Bruk følgende primere for mGlutR1 (mGlut_F CCTCCTCAACGTCTCCTTTCATA; mGlut_R TGCCGTTGTTCCGATTT) og actin primers som referansegen [AmActin_F TGCCAACACTGTCCTTTCTG; AmActin_R GAATTGACCCACCAATCCA]. Beregn det relative genuttrykket ved hjelp av 2-ΔΔCt-metoden (trinn 8,6).
Representative Results
Antistofftester mot RDL
Antistoffene ble produsert mot RDL peptid konjugater som vist i figur 1A. Det første trinnet i å karakterisere anti-RDL antistoffer er å sjekke homogenisere av proteinet ekstrahert fra biehjernen ved hjelp av en vestlig flekk med anti-RDL antistoffer og en HRP-merket geit anti-kanin IgG sekundærantistoff(Figur 1A,innsats). Begge anti-RDL antistoffer gjenkjentbandet ligger på ~ 50-60 kD (pil), tilsvarende den estimerte vekten av RDL-underenheten isoform proteiner. For å vise at anti-RDL antistoffer gjenkjente peptidet i hjerneskiver, brukte vi en preadsorption kontroll(Figur 1B, C). Når antistoffer ble preinert med konjugerte peptider, var faringen på seksjonen fraværende. Dette viste at anti-RDL antistoffer gjenkjente konjugert peptid som de ble hevet mot. For å vise at anti-RDL-antistoffene gjenkjenner proteinet i det faste hjernevevet, brukte vi CRISPR-Cas9 til å slå ut RDL-genet som produserer RDL-proteinet i cellene. Figur 1D1-3, viser kontroll frontale bie hjerneseksjoner som ble merket med anti-RDL antistoffer. Denne bien ble ikke injisert med RDL-CRISPR-Cas9 RNP. I figur 1D1merker anti-RDL neuropils i frontdelen av bihjernen. Den samme frontdelen i figur 1D2 viser fraværet av fluorescens fra ATTO550, fordi RDL-CRISPR-Cas9-komplekset ikke ble injisert.
Figur 1E1-E3 viser en hjerneseksjon fra en bie injisert med RDL-CRISPR-Cas 9 og deretter behandlet med samme mengde antistoffer som kontrollhjernen i figur 1D1-D3. Anti-RDL-fargingble signifikant redusert i hele hjernen 48 timer etter injeksjonen, og fordelingen av ATTO550-farmen i hjernen (Figur 1E2) viser suksessen til RDL-CRISPR-Cas 9 injeksjoner i bimedian ocelli. De flere spredte cellene i hjernen viser ATTO550. Den vellykkede injeksjonen av RDL-CRISPR-Cas 9 reduserte proteinuttrykket sammenlignet med kontrollen (Figur 1E1-3). Fra åtte immunfargede biehjerner hadde bare én hjerne et høyt distribusjonsnivå av RDL-CRISPR-Cas9 i cellene i soppkropp, protocerebrum og antennelobe, mens andre hjerner hadde cellefarging med ATTO550 i soppkarcalyx, sentralt kompleks, men ikke antennelobe. Det er viktig å merke seg at i disse biene var reduksjon anti-RDL immunstaining ikke så dramatisk som i hjernen vist i figur 1E1.
Deretter, for å estimere nivået på den modifiserte RDL gDNA i biene 48 timer etter RDL-CRISPR-Cas9 injeksjon, utførte vi en qPCR drop-off test, hvor drop-off probe ble designet for å matche området av en av RDL gRNAs. I disse eksperimentene, i bihjernen injisert med RDL-CRISPR-Cas 9, tilsvarte den relative reduksjonen av fluorescensen antall modifisert eDNA i prøvene. I våre tester var området som tilsvarer denne veiledningen i gDNA hos 12 bier injisert med RDL-CRISPR-Cas9 64 % ± (gjennomsnitt ± 30 %SD) sammenlignet med gDNA i ikke-injiserte bier (figur 3A).
Deretter, for å estimere nivået på RDL RNA i biene 48 timer etter injeksjon, utførte vi qRT-PCR i en egen gruppe bier (Figur 3B). Vi sammenlignet nivået av RDL RNA av RDL-CRISPR-Cas 9 injisertbier (n = 19) med nivået av RNA i bier som ikke ble injisert (n = 12). I disse eksperimentene var den relative reduksjonen av mRNA RDL 59 % ± (gjennomsnittlig ± 15 % SE) sammenlignet med nivået av RNA i ikke-injiserte bier. Da vi undersøkte nivået av RDL RNA i hver bie individuelt, viste bare 13 bier av 19 bier en betydelig reduksjon av RNA. Disse dataene indikerer at injeksjon av RDL-CRISPR-Cas9 gjennom ocelli kanskje ikke alltid når et stort antall hjerneceller, noe som bekrefter dataene med RDL immunbeiset RDL-CRISPR-Cas9 injisertbier. I disse preparatene hadde bare én bie av 8 RDL CRISP-Cas9 i mange hjerneceller (soppkropp, protocerebrum og antennelobe) sammenlignet med andre biehjerner, hvor fordelingen av RDL-CRISPR-Cas9 var konsentrert i celler i protocerebrum (soppkropp calyx og sentralt kompleks), men ikke antennelobe (Figur 4A-D).
Anti-mGlutR1 antistoffer tester
Vi brukte anti-mGlutR1 antistoffer produsert i kanin mot konjugerte peptider som er spesifikke for Drosophila melanogaster (Figur 2A). Sekvensen av dette peptidet viser en 94% identitet med biepeptid (CLSDKTRFDYFARTVPPD) Figur 2A. Først sjekket vi antistoffene mot bihjerneproteinet ved hjelp av immunoblotting. Biehjernenhomogenat ble separert med 10% SDS-PAGE og elektrofritt overført fra til en nitrocellulosemembran og farget med anti-mGlutR1. Innsatsen i figur 2A viser to bånd med estimertvekt (103 og 83 kD) som tilsvarer to isoformer. Da vi testet dette antistoffet på honningbiehjerner, fant vi ut at de merker neuropilarprofiler og celler i bihjerneseksjonene som illustrert i figur 2B, D. Etter preadsorption av anti-mGlutR1 antistoff med konjugert-mGlutR1 peptid, den spesifikke farging forsvant i bie hjerneskiven (Figur 2C). Dette bekrefter at anti-mGlutR1 antistoffer gjenkjenner peptid (Figur 2C). Deretter injiserte vi en blanding av mGlutR1-CRISPR-Cas9 i median ocelli og brukte kontrollnoguideRNA. I kontrollbier (n = 7) var fluorescensen fra ATTO550 ikke konsentrert i cellene. Noen hjerner hadde spredt fluorescens ATTO550 merking. Dermed viser kontrollpreparatet i figur 2D1-3 anti-mGlutR1 farging i hjernen, men ikke ATTO550 fluorescens. Når mGlutR1-CRISPR-Cas9 ble injisert i ocelli og tatt opp av mange celler, ble nivået av fluorescens av de sekundære antistoffene betydelig redusert i området som tar opp funksjonell mGlutR1RNP (figur 2E1-3). Biene ble overvåket i 48 timer, og en bie fra hver eksperimentelltilstand ble funnet død. Dermed, i dette eksperimentet, sjekket vi syv kontrollbier og åtte CRISPR-Cas9 bier. Alle biene injisert med CRISPR-Cas9 hadde celler som tok i mGlutR1-CRISPR-Cas9. De fleste av disse cellene var i soppkroppen calyx, sentralt kompleks, og bakre protocerebrum. Bare to bier av syv viste ATTO550 merking i mange celler i soppkroppen, sentralt kompleks, og antennelobe. Et eksempel på en av disse biene vises i figur 2E. Reduksjonen av nivået av mGlutR1 farging i disse preparatene var signifikant. De andre fem biene har ATTO550 merking tilsvarende vellykket levering av mGlutR1 CRISPR-Cas9 i soppkroppen og bakre protocerebrum, men ikke i antenneflappene.
Deretter, for å estimere nivået på den modifiserte mGlutR1 gDNA i biene 48 timer etter injeksjon, utførte vi en qPCR-basert drop-off test, hvor drop-off probe ble designet for å være i området nær mGlutR1 guide. I disse eksperimentene, i bihjernen injisert med mGlutR1-CRISPR-Cas 9, var den relative modifikasjonen av gDNA hos 12 bier 59 % ± (gjennomsnitt ± 33 %SD) sammenlignet med gDNA hos ikke-injiserte bier (figur 3A).
Disse resultatene ble også bekreftet av qRT-PCR tester i en annen gruppe bier, hvor vi anslått mGlutR1 RNA nivåer ved hjelp av qRT-PCR i biene 48 timer etter injeksjoner med RNPmGlutR1mix (Figur 3B). Vi sammenlignet nivået av mGlutR1 RNA av mGlutR1-CRISPR-Cas9 injisertbier (n = 6) med RNA-nivåene i bier som ikke ble injisert (n = 6). I disse eksperimentene var den relative reduksjonen av mRNA mGlutR1 i injiserte bier 53 % ± (gjennomsnittlig ± 18 % SE) sammenlignet med uinjiserte bier (figur 3B).
Seksjonen fra fire forskjellige bier som uttrykte RNP RDL-CRISPR-Cas9 i Kenyon-cellen av soppkropp er vist i figur 4A-D. Eksempelbien med ATTO550 fluorescens i soppkroppen og antennefliken er vist i figur 4E, F.
| Guider | Sekvenser | GRNA (andre) | RNP (andre) |
| [guideRNA:tracrRNA] | -Jeg har ikke noe å si. | ||
| RDL_Guide1 | ACCGTAACGCGACCCCCGCT | Grdl1 (andre) | RRDL1 (andre) |
| RDL_Guide2 | AACGTCGATCGACTTGACGT | Grdl2 (andre) | RRDL2 (andre) |
| RDL_Guide3 | Ccatgacgaaacacgtgccc | Grdl3 (andre) | RRDL3 (andre) |
| mGlu_Guide 1 | Cgaaagttatctgacggtgt | Gmgl1 (andre) | RMGL1 (andre) |
| mGlu_Guide 2 | TTCAACGAGAGCAAGTTCAT | Gmgl2 (andre) | RMGL2 (andre) |
| mGlu_Guide 3 | GCAAACGTCGGTAGGAGTGA (Nær GCAAACGTCGGTAGGAGTGA) | Gmgl3 (andre) | RMGL3 (andre) |
Tabell 1: Nucleotide sekvenser av guider designet for RDL og mGlutR1.
Figur 1: Karakterisering av anti-RDL antistoffer. (A) Skjematisk av RDL-underenheten, hvor de rosa sirklene indikerer lokalisering av peptid 2 (ekstracellulær CVNEKQSYFHIATTSNEFIRI-amide) i N-terminus og peptid 1 (intracellulær CVRFKVHDPKAHSKGGTL-amide) i C-terminus. Innsatsen i A viser båndene i den vestlige flekken av honningbiehjerneekstrakter behandlet med tilsvarende anti-RDL antistoffer (en med anti-RDL pep1 og anti-RDL pep2). Hver immunoblot viser den tilsynelatende størrelsen på proteinet ~ 50-60 kD, tilsvarende estimerte vekter av de ulike isoform av RDL-underenhetene. - Jeg har ikke noe åsi. Preadsorption av anti-RDL antistoffer med konjugert peptid 1. Bildet i C viser en reduksjon i farging i avsnittet når antistoffene ble preinert med konjugert peptid 1. Den vifteformede kroppen (Fb) og Ellipsoid kroppen (eb) er sentrale komplekse strukturer i hjernen. M = medial lobe av sopp kroppen. - Jeg har ikke noe åsi. Anti-RDL farging av en kontroll, uinjisert bie hjerneseksjon etter 48 h. Grønn indikerer anti-RDL positiv profil i hjernen. - Jeg har ikkenoeå si. Denne bien ble ikke injisert og inneholder ikke ATTO550 fluorescens. -Jeg har ikke noe å si. Sammenslåtte bilder fra D1 og D3. - Jeg har ikke noe åsi. Injeksjonen av RDL-CRISPR-Cas9 reduserte anti-RDL-farging etter 48 timer (E2) ATTO550 fluorescens i cellekjernene indikerte vellykket RDL-CRISPR-Cas9-levering. -Jeg har ikke noe å si. Det sammenslåtte bildet av anti-RDL (grønn) og ATTO550 (rød). Skalabar = 100 μm (B-E). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Karakterisering av anti-mGlutR1 antistoffer. (A) Skjematisk av GCPR mGluR som viser Drosophila melanogaster peptid som brukes til immunisering. Til sammenligning vises Apis mellifera peptid nedenfor. Sirkelen indikerer lokalisering av peptidet i N-terminus av mGlutR1 reseptor ekstracellulær domene. Innsatsen i A viser at anti-mGlutR1 antistoffer gjenkjentto band i den vestlige blot av bie hjerner ~ 103 kD og ~ 83 kD som tilsvarer estimerte vekter av kjente isoformer. - Jeg har ikke noe åsi. Preadsorption kontroll av anti-mGlutR1 antistoff i to påfølgende deler av antennelobe glomeruli. Bilde av anti-mGlutR1 i antenneglomerulidelen i C viser reduksjonen av farging som følge av preinkubasjon av anti-mGlutR1 peptid med anti-mGlutR1 antistoff. Denne prosedyren fører til at antistoffet utløses ut av løsningen, som avskaffer farging i forhold til B (kontroll, fravær av peptid i forfallet). (D1) viser farging av anti-mGlutR1 i en bihjerneskive etter en kontrollinjeksjon i median ocellus. Denne injeksjonen manglet mGlutR1 gRNA som gjør det mulig å slå ned mGlutR1 reseptorer av CRISPR-Cas9, og dermed flekker av anti-mGlutR1 antistoff ble ikke redusert (grønn). - Jeg har ikkenoeå si. Fraværet av ATTO550 fluorescens indikerer fraværet av funksjonell CRISPR-Cas9 i hjernen. -Jeg har ikke noe å si. Sammenslåtte bilder av anti-mGlutR1 og ATTO550. (E1-E3) viser farging av anti-mGlutR1 i en hjerneseksjon hvor mGlutR1 har blitt permanent slått ned 48 timer etter injeksjon med mGlutR1-CRISPR-Cas 9 i median ocellus. Dermed er farging i denne hjernen sterkt redusert på grunn av vellykket knockout av mGlutR1 i mange celler. - Jeg har ikke noe åsi. ATTO550 farging i mange cellekjerner i bihjernen indikerer at injeksjon av mGlut1-CRISPR-Cas 9 var vellykket. -Jeg har ikke noe å si. Sammenslått bilde av ATTO550 (rød) og anti-mGlutR1 (grønn). Skala bar = 10 μm (B,C); 100 μm (D,E). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Evaluering av modifisert gDNA og uttrykk for mRNA av RDL og mGlutR1 mRNA i bihjerner 48 timer etter injeksjon med 345 nL tilsvarende RPN CRISPR-Cas9. (A) Den qPCR-baserte drop-off analyse test for å evaluere mengden av gDNA med et modifiseringsområde ble beregnet ved hjelp av 2-ΔΔCt metode og normalisert mot kontroll, uinjisert hjerne. Dataene uttrykkes som gjennomsnittlig + SD. (B) TheqRT-PCR-testen ble brukt til å evaluere mengden mRNA i CRISPR-Cas9 injiserte og uinjiserte bier. AmActin ble brukt som referansegen. Det relative genuttrykket ble beregnet ved hjelp av 2-ΔΔCt metoder og normalisert mot kontroll, uinjiserte hjerner. Dataene uttrykkes som slem + SE. Klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Eksempel på fordelingen av RNP CRISPR-Cas9 i biehjerner via ATTO550 fluorescens. - Jeg har ikkenoe å si. Hjernedelene fra fire forskjellige bier som uttrykte RNP RDL-CRISPR-Cas9 i Kenyon-cellen i soppkroppen. - Jeg har ikke noe åsi. Eksempel på to hjerner 48 timer etter injeksjon med RNPmGlutR1 CRISPR-Cas9. Skalabar = 150 μm (A-F). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Discussion
Karakterisering av anti-RDL og anti-mGlutR1
Først karakteriserte vi anti-RDL og anti-mGlutR1 antistoffer ved immunoblot og pre-adsorpsjon på skiver av faste honningbie hjerner. Hvert antistoff ble laget for å gjenkjenne alle sine kjente isoformer, og vestlig analyse viser at de gjenkjenner bånd som tilsvarer deres spådde molekylære vekter. Deretter ble begge antistoffene blokkert av det konjugerte peptidet som de ble produsert på honningbiehjerneseksjoner mot.
Et av de første målene i vår studie var å fastslå at antistoffene som produseres mot det spesifikke konjugerte peptidet, er spesifikke for proteinet i fast hjernevev. For dette formålet utnyttet vi CRISPR-Cas9-systemet. Vi designet spesifikke guider for honningbie RDL og mGlutR1 og brukte hver av dem til å lage CRISPR-Cas9 merket med fluorescerende sonde ATTO550. For hver reseptor injiserte vi en blanding av tre forskjellige CRISPR-Cas9 ribonucleoproteiner i ocelli for å redusere mengden av det målrettede proteinet i den voksne honningbihjernen ved å eliminere det tilsvarende genet i celler som tok opp vårt designede Cas9-system. I vår studie oppnådde vi dette trinnet.
Et av de første avgjørende trinnene for suksessen til disse eksperimentene er å designe riktig guide RNAs. Vi anbefaler å designe opptil fem guide RNAs, som ligger i begynnelsen, midten og slutten av gensekvensen. I vårt foreløpige arbeid testet vi dem i ulike kombinasjoner på tre til fem bier. Vi prøvde også forskjellige konsentrasjoner av injeksjoner, samt tider etter injeksjon, og ulike blandinger av RNP i injeksjonene. Vi dissekerte ut hjerner og behandlet dem ved hjelp av anti-RDL og anti-mGlutR1 antistoffer. I disse første testene etablerte vi riktig kombinasjon, etter injeksjonstid, samt konsentrasjon og mengde CRISPR-Cas9 til injeksjon. Disse første testene var grunnlaget for å sette opp eksperimentene som vi beskrev i detalj her.
Målet var todelt: 1) å demonstrere i en bie at antistofffarging ble redusert etter behandling med CRISPR-Cas9 og 2) for å jobbe gjennom de beste eksperimentelle forholdene for atferdsstudier. Dermed viser vi at hvis mange cellekjerner inneholder CRISPR-Cas9 48 timer etter injeksjon, er reduksjonen av anti-RDL og anti-mGlutR1 farging signifikant. I tillegg viser det at de testede antistoffene spesifikt gjenkjenner mGlut1- og RDL-proteinet i honningbiehjernens forberedelse, og at de kan brukes til lokaliseringsstudier i honningbihjernen.
Eksperimentell innstilling CRISPR-Cas9 for atferdsstudier
Deretter setter vi opp eksperimentene slik at CRISPR-Cas9 kan brukes i atferdsstudier. Åtte eller ni honningbier ble samlet inn for kontroll og eksperimentelle behandlinger. De ble atferdstestet før og etter injeksjon, og deretter ble hjernen behandlet for ATTO550 og/eller immunytokjemi for å bestemme hjerneområdene som viste reduksjon av målproteinet. Her er det viktig å merke seg at antall bier tatt for ett sett med eksperimenter var begrenset til ikke mer enn 8-9 bier for kontroll og eksperimentelle forhold. På denne måten kunne begge forholdene testes samme dag. Også når vi forberedte CRISPR-Cas9-blandingene til injeksjon, frøs vi dem aldri. CRISPR-Cas9-blandingen endret seg ikke i styrke når den ble brukt 3 dager på rad og holdt ved 4-8 °C. Vi testet det imidlertid ikke etter 3 dager.
Som vi beskrev i Resultater-delen for begge settene med eksperimentelle injeksjoner og for begge antistoffene, viste bare tre bier fra 16 testet en stor fordeling ATTO550 i soppkroppen, protocerebrum og antennelobes. I alle andre bier var fordelingen av CRISPR-Cas9 begrenset til soppkroppen, sentralkomplekset og/eller bakre protocerebrum. Det er viktig å forstå for atferdsstudier at bruk av denne injeksjonsmetoden reduksjonen av målprotein vil bare være begrenset til soppkroppen i de fleste biene. Det vil ikke strekke seg til antennelappen eller subesophageal ganglion. Dermed er injeksjonsteknikken som vi bruker egnet til å studere effekten av reduksjon av reseptorer i soppkroppen og sentralt kompleks i atferdseksperimenter, mens en annen metode for å introdusere CRISPR-Cas9 vil være mer hensiktsmessig for å studere andre hjerneregioner.
Til slutt viste vår studie vellykket bruk av CRISPR-Cas9 som en kontroll for antistofffarging i hjernen. For både antistoffer (anti-RDL og anti-mGlutR1), når opptaket av mGlutR1-CRISPR-Cas9 eller RDL-CRISPR-Cas9 var vellykket, ble nivået av tilsvarende antistofffarging også redusert betydelig. Det er også viktig å merke seg at injeksjon i ocelli førte til en fordeling av CRISPR-Cas9 i hjernen som ikke var homogen. Fordelingen varierte fra et minimalt område rundt ocelli og soppkroppen til mange celler i hele hjernen. Variasjonen av mGlutR1- eller RDL-CRISPR-Cas9-opptaket av cellene var sannsynligvis på grunn av variasjon i injeksjonene. Våre data viser at CRISPR-Cas9-systemet fungerer i honningbier, men injeksjonsmetoden må forbedres for å redusere variasjonen til CRISPR-Cas9-opptaket på tvers av individuelle bihjerner. Innenfor disse restriksjonene er det nå mulig å bruke denne teknikken til å manipulere gener i voksne bier for atferdseksperimenter.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av følgende priser til BHS: Human Frontiers Science Program; NIH NIGMS (R01 GM113967); NSF Ideas Lab (1556337). Peptidog antistoffer for DmGluRA ble designet i laboratoriet Dr. Serge Birman (Marseille, Luminy, Frankrike) da IS ble støttet av Program d'Urgence FRM / Postdocs UFP20060306548 fra Fondation pour la Recherche Medicale. Vi er takknemlige for Daniela Junqueira Marosi og Alex Hanter fra Integrated DNA Technology (IDT) for hjelp med design av RDL guider og qPCR drop-off analyser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283_100 mL | western blotting |
| Acrylamide-bis Acrylamide | Bio-Rad | 500 mL 1610156 | western blotting |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A0169-250g | used with distilled water to fix honey bee brain in blocks |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Research Laboratories | 711-546-152 | secondary antibody to reveal the primary antibodies from rabbit |
| Alt-R CRISPR-cas9 tracrRNA-5'ATTO | IDT | 1075934 | with desinged guide RNA, it creates gRNA |
| Alt-R S.p. Cas9 nuclease V3 | IDT | 1081058 | enzyme used to make ribonucleoprotein for CRISPR system |
| Ammonium Persulfate | Bio-RAD | 10 g 1610700 | western blotting |
| Anti-mGlutR1 antibodies | Covalab (FRANCE)/21st Century Biochemical | characterized by authors in present paper | Used for primary incubation of mGlut 1 in honey bees |
| Anti-RDL antibodies | 21st Century Biochemical | characterized by authors in present paper | Used for primary incubation of RDL in honey bees |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | Y0001154 | protease inhibitor |
| Barraquer Iris Scissors 7mm Blade Sharp point | World Precision Instruments | 14128-G | used for dissection honey bee brain |
| Benzamidine | Sigma-Aldrich | 12072 | protease inhibitor |
| Blade (breakable) for blade holder | Fine Science Tool | 10050-00 | dissection for western blotting |
| Blade holder and breaker | Fine Science Tool | 15309 | dissection for western blotting |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100 F | for injection procedure |
| Chemiluminescent western blot detection substrate | Bio-Rad | 1705062 | western blotting |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 472476-50mL | RNA isolation |
| Dithiothreitol | Bio-Rad | 1610611 | western blotting |
| DNA easy kit | QIAGEN | 69504 | DNA extractionuj |
| DNA-free kit | INVITROGEN | AM1907 | Used to remove DNA |
| Eppendorf Research plus pipette, 3-pack | Sigma-Aldrich | Z683884 | |
| Falcon 24 Well Polystyrene Multiwell | Falcon | 351147 | Multiwell |
| Flat Bottom Embedding Capsules, Polyethylene | Electron Microscopy Science | 70021 | basket for brain sections |
| Forceps Dumont #5 (pair) | Fine Science Tool | 11254-20 | for dissection of honey bee brain from the head |
| Forceps Dumont #5S (pair) | Fine Science Tool | 11252-00 | to clean up the brain from trachea befor dissection |
| Gene Expression Master Mix | Integrated DNA Technologies | 1055770 | qPCR drop off assay |
| Glutaraldehyde | EMS | 16220 | used for preparation of peptide conjugates for control peabsorption |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500 mL | western blotting, embedding media |
| Glycine | Bio-Rad | 1610718 | western blotting |
| Hydrophobic filtered nylonmesh | Spectrum Labs | 145910 | for bottom of basket for brain sections |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | I9030-50mL | RNA isolation |
| Keyhole limpet hemocyanin | Sigma-Aldrich | H7017 | used for preparation of conjugates for control |
| LSM800 cofocal microscope | Zeiss | ||
| mGlu_Guide 1 | IDT | designed guide RNA for CRISPR-Cas 9. Target mGlutR1 genome sequences | |
| mGlu_Guide 2 | IDT | designed guide RNA for CRISPR-Cas 9. Target mGlutR1 genome sequences | |
| mGlu_Guide 3 | IDT | designed guide RNA for CRISPR. Target mGlutR1 genome sequences | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | western blotting |
| 96-well PCR microplate | Applied biosystem | 4346907 | qPCR drop off assay and qRT-PCR |
| 384-well PCR microplate | Sigma-Aldrich | Z374911 | qRT-PCR |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904_500mL | for injection procedure |
| Model p87 Flaming Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Capillary Preparation | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | for embedding solution |
| Nanoliter 2000 | World Precision Instruments Nanoliter | Injection Apparatus | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Research Laboratories | AB_2337258 | blocking agent for immunocytochemistry |
| Non-immune Goat Serum | Invitrogen | 50-062Z 100 mL | blocking agent for immunoblotting |
| Nuclease-free buffer | IDT | 1072570 | Nuclease-free buffer that is used in the preparation of CRISPR-Cas9 injection |
| Nuclease-free water | IDT | AM9337 | nuclease -free water that is used in preparation of CRISPR-Cas 9 system |
| OrbitalShaker Mp4 | Genemate | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500 g | used with PBS to make fixative for bee brains |
| Phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626-250 mg | protease inhibitor |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | Used with Paraformaldehyde as fixative; buffer for antibodies |
References
- Harms, D. W., et al. Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System. Current Protocols in Human Genetics. 83 (15), 7-27 (2014).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Kouranova, E., et al. CRISPRs for Optimal Targeting: Delivery of CRISPR Components as DNA, RNA, and Protein into Cultured Cells and Single-Cell Embryos. Human Gene Therapy. 27 (6), 464-475 (2016).
- Schubert, M., et al. Fluorescently labeled tracrRNA provides efficient genome editing while allowing cellular microscopy and FACS analysis. Genome Editing. , www.idtdna.com 1-3 (2017).
- Kucharski, R., Mitri, C., Grau, Y., Maleszka, R. Characterization of a metabotropic glutamate receptor in the honeybee (Apis mellifera): implications for memory formation. Invertebrate Neuroscience. 7 (2), 99-108 (2007).
- Aronstein, K., Auld, V., Ffrench-Constant, R. Distribution of two GABA receptor-like subunits in the Drosophila CNS. Invertebrate Neuroscience. 2 (2), 115-120 (1996).
- Thompson, M., Steichen, J. C., ffrench-Constant, R. H. Conservation of cyclodiene insecticide resistance-associated mutations in insects. Insect Molecular Biology. 2 (3), 149-154 (1993).
- Chung, B. Y., Kilman, V. L., Keath, J. R., Pitman, J. L., Allada, R. The GABA(A) receptor RDL acts in peptidergic PDF neurons to promote sleep in Drosophila. Current Biology. 19 (5), 386-390 (2009).
- Taylor-Wells, J., Hawkins, J., Colombo, C., Bermudez, I., Jones, A. K. Cloning and functional expression of intracellular loop variants of the honeybee (Apis mellifera) RDL GABA receptor. Neurotoxicology. 60, 207-213 (2017).
- Jones, A. K., Sattelle, D. B. The cys-loop ligand-gated ion channel superfamily of the honeybee, Apis mellifera. Invertebrate Neuroscience. 6 (3), 123-132 (2006).
- Dupuis, J. P., et al. Homomeric RDL and heteromeric RDL/LCCH3 GABA receptors in the honeybee antennal lobes: two candidates for inhibitory transmission in olfactory processing. Journal of Neurophysiology. 103 (1), 458-468 (2010).
- Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee. Journal of Neuroscience. 23 (12), 5370-5380 (2003).
- Guo, X., Wang, Y., Sinakevitch, I., Lei, H., Smith, B. H. Comparison of RNAi knockdown effect of tyramine receptor 1 induced by dsRNA and siRNA in brains of the honeybee, Apis mellifera. Journal of Insect Physiology. 111, 47-52 (2018).
- Roth, A., et al. A genetic switch for worker nutrition-mediated traits in honeybees. PLOS Biology. 17 (3), e3000171 (2019).
- Kohno, H., Suenami, S., Takeuchi, H., Sasaki, T., Kubo, T. Production of Knockout Mutants by CRISPR/Cas9 in the European Honeybee, Apis mellifera L. Zoological Science (BIOONE). 33 (5), 505-512 (2016).
- Hu, X. F., Zhang, B., Liao, C. H., Zeng, Z. J. High-Efficiency CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing in Honeybee Apis mellifera Embryos. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (5), 1759-1766 (2019).
- Smith, B. H., Burden, C. M. A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research. Journal of Visualized Experiments. (91), e51057 (2014).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Protein Blotting Guide. , BIO-RAD. http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_2895.pdf (2019).
- Rodriguez, J., Deinhardt, F. Preparation of a semipermanent mounting medium for fluorescent antibody studies. Virology. 12, 316-317 (1960).
- Custom Alt-R® CRISPR-Cas9 guide RNA. , Integrated DNA Technologies. https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM (2019).
- Bonnafe, E., et al. Effect of a thymol application on olfactory memory and gene expression levels in the brain of the honeybee Apis mellifera. Environmental Science and Pollutant Research (International). 22 (11), 8022-8030 (2015).
- Wang, Y., et al. Regulation of behaviorally associated gene networks in worker honeybee ovaries. Journal of Experimental Biology. 215 (Pt 1), 124-134 (2012).
