Summary
Présenté ici est un protocole pour utiliser le système CRISPR-Cas9 pour réduire la production d'une protéine dans le cerveau adulte d'abeille de miel pour tester la spécificité d'anticorps.
Abstract
Cluster Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) est une technique d'édition génétique largement utilisée dans les études de la fonction génique. Nous utilisons cette méthode dans cette étude pour vérifier la spécificité des anticorps développés contre l'insecte GABAA récepteur sous-unité Résistance à la Dieldrin (RDL) et un récepteur du glutamate métabotropique mGlutR1 (mGluRA). Les anticorps ont été générés chez les lapins contre les peptides conjugués spécifiques aux mouches des fruits (Drosophila melanogaster) ainsi qu'aux abeilles domestiques (Apis mellifera). Nous avons utilisé ces anticorps dans les sections du cerveau des abeilles mellifères pour étudier la distribution des récepteurs dans le cerveau des abeilles mellifères. Les anticorps ont été purifiés d'affinité contre le peptide et examinés avec l'immunoblotting et la méthode classique de preadsorption avec des conjugués de peptide pour montrer que les anticorps sont spécifiques aux conjugués correspondants de peptide contre lesquels ils ont été soulevés. Ici, nous avons développé la technique CRISPR-Cas9 pour tester la réduction des cibles protéiques dans le cerveau 48 h après l'injection CRISPR-Cas9 avec guide ARN conçus pour le récepteur correspondant. La méthode CRISPR-Cas9 peut également être utilisée dans les analyses comportementales chez les abeilles adultes lorsqu'un ou plusieurs gènes doivent être modifiés.
Introduction
Le système CRISPR/Cas9 récemment découvert est un outil puissant qui a été utilisé pour modifier l'ADN génomique dans divers systèmes modèles et organismes. Il a accéléré la recherche biomédicale et les percées technologiques majeures en rendant la modification du génome plus efficace et robuste que les méthodes précédentes1. Originaire des bactéries S. pyogenes, le système repose sur une endodoucane Cas9, dont l'activité conduit à des ruptures à double brin (DSB) dans l'ADN, et un ARN guide (gRNA) qui dirige la protéine Cas9 à un endroit spécifique, dépendant de la séquence2. Les pauses à double brin générées par CRISPR/Cas9 peuvent être réparées par l'intermédiaire d'une jointure finale non homologue (NHEJ), un processus sujet aux erreurs qui peut conduire à des changements de cadre, ou à une réparation directe de l'homologie lorsqu'un modèle de donneur est présent. Le gRNA lui-même se compose d'un ARN CRISPR spécifique à la cible (crRNA) et d'un crRNA trans-activant universel (tracrRNA) qui peut être synthétisé chimiquement et livré avec la nucléase Purifiée De Cas9 comme complexe de ribonucléoprotein (RNP)2,3. L'étiquetage fluorescent de la nucléase gRNA ou Cas9 peut permettre la détection et la visualisation intracellulaire des composants moléculaires par microscopie fluorescente4.
Dans notre travail actuel, nous profitons du système CRISPR-Cas9 pour réduire les niveaux de protéines dans les cerveaux adultes d'abeilles domestiques. Nous avons étudié le récepteur du glutamate métabotropique (mGluR) et les anticorps récepteurs anti-mGlutR1 et les anticorps sous-unit DE récepteur sabre RON lett.A. et les anticorps anti-RDL. Nous avons développé une méthode simple pour réduire la quantité de protéines dans le cerveau de l'abeille domestique adulte et l'avons utilisée pour conduire des tests supplémentaires des anticorps développés contre les protéines correspondantes. La surveillance de la fluorescence de CRISPR-Cas9 nous a permis d'estimer les zones et les cellules impliquées dans la réduction de la protéine.
En utilisant cette méthode, nous avons également caractérisé les anticorps anti-mGlutR1 qui ont été fabriqués chez les lapins contre le peptide conjugué. Le génome de l'abeille mellifère code un AmGluRA très conservé (nommé mGlutR1 selon la nomenclature NCBI) récepteur du glutamate métabotropique5. Le gène mGlutR1 d'abeille de miel a quatre variantes prévues d'épissage selon la base de données de NCBI. Il a été rapporté qu'il est exprimé dans le système nerveux central (SNC) des stades d'abeille pupal et adulte et il est impliqué dans la formation de mémoire à long terme5. Les anticorps développés contre le mGlutR1 peuvent être un outil essentiel pour l'étude du système glutamatergique dans le processus d'apprentissage et de mémoire chez les abeilles.
Dans nos études, nous avons également caractérisé les anticorps anti-RDL développés chez les lapins immunisés avec des peptides conjugués de la sous-unité de récepteur apis mellifera RDL. Le gène Del d'abeille, AmRdl (XM_006565102.3, base de données NCBI), a 14 variantes d'épissage prévues. Un fragment partiellement cloné a été signalé dans la base de données NCBI AF094822.1. La fonction des récepteurs RDL et sa physiologie est bien étudiée chez les insectes6,7,8, y compris les abeilles9,10,11. Les anticorps développés contre l'anti-RDL peuvent être un outil essentiel pour étudier le système GABAergic dans le processus d'apprentissage et de mémoire chez les abeilles.
Une étude antérieure sur le rôle des récepteurs d'octopamine et de tyramine a utilisé l'ARNi injecté dans le cerveau avec un test ultérieur de la quantité de protéines par Western blot12,13. Cependant, l'ARNi a des limites importantes. Il n'y a qu'une courte fenêtre de temps après l'injection d'ARNI dans laquelle une réduction de la protéine se produit13. CRISPR-Cas9 a été utilisé très récemment dans les embryons d'abeilles mellifères pour supprimer ou modifier les gènes de l'ensemble de l'animal14,15,16. Nous avons signalé l'utilisation de CRISPR-Cas9 pour réduire la quantité de protéines dans l'abeille domestique adulte. Nous avons développé cette approche pour les abeilles en raison de la capacité de le coupler à des études comportementales de l'apprentissage et la mémoire dans des conditions de laboratoirecontrôlées 17.
Dans le présent travail, nous avons développé des anticorps contre deux récepteurs et les avons testés sur les sections adultes du cerveau des abeilles domestiques après que la protéine a été réduite par injection CRISPR-Cas9. Dans le même temps, nous avons établi une conception expérimentale qui permet l'utilisation de la méthode pour des expériences comportementales.
Protocol
Le protocole décrit ici suit les directives de soins aux animaux de l'Université d'État de l'Arizona.
1. Isolation totale des protéines des cerveaux d'Apis mellifera
REMARQUE: Utilisez Apis mellifera New World Carniolan fourrageurs d'âge inconnu pour cette expérience.
- Placez un écran en maille d'aluminium au-dessus de l'entrée de la ruche pour capturer les abeilles de forager17. Capturez chaque abeille dans une fiole avec un petit trou dans chaque bouchon. Placez les flacons contenant les abeilles dans la glace pour abaisser leur température corporelle et les immobiliser. Laisser les abeilles dans la glace pendant au plus 3 min.
- Fixer les abeilles immobilisées dans des supports métalliques préalablement préparés. Assurez-vous que les supports métalliques sont construits de sorte que l'abeille peut être fixé avec de petits morceaux de ruban adhésif, mais ont toujours son thorax arrière, ailes, et la tête exposée.
ATTENTION : Assurez-vous que les abeilles sont entièrement immobilisées avant de tenter de les placer dans les supports. - Nourrir les abeilles avec une solution de saccharose de 1 M à l'aide d'une seringue de 5 ml jusqu'à ce qu'elles n'aient plus faim. Placez les abeilles bien fixées dans une boîte avec un essuie-tout humide pour assurer un environnement humide.
- Disséquez rapidement le cerveau de l'abeille en coupant la tête avec des ciseaux Barraquer Iris (voir Tableau des matériaux)et utilisez les ciseaux pour ouvrir la tête de l'avant.
- Coupez le cerveau de la capsule de tête, prenez le cerveau avec #5 forceps, et placez-le dans 100 l de tampon de lyse froid (4-8 oC). Le tampon de lyse se compose de 120 mM Tris-HCl, 2 % de sulfate de dodécyl de sodium (SDS), 5 % de glycérol, 0,2 mM de dithiothreitol, 1 % de Triton X-100 et 1 à 5 g/mL des inhibiteurs de la protéase PMSF (phenylmethylsulphonylfluoride), aprotininin, benzamidine (pH 6,8) à 4 degrés Celsius. Homogénéiser le cerveau dans la solution de lyse en tournant dans un pilon pendant environ 2 min.
- Centrifuger l'échantillon à 12 000 x g pendant 20 min. Aspirate 90 oL du supernatant et jeter la pastille.
- Prenez 1 L du supernatant pour quantifier la protéine totale à l'aide d'un fluorimètre. La concentration approximative de la protéine totale se trouvait entre 2 et 3 mg/mL par abeille. Prendre 10 l du supernatant et ajouter 10 l de la mémoire tampon de lyse et 10 l d'un tampon 6x Laemmli18. Faire tourner brièvement et faire bouillir pendant 3 min, puis refroidir sur la glace. Faire tourner pendant 1 min à 10 000 x g pour enlever tous les débris. Un dixième d'un cerveau d'abeille contient environ 25 ng de protéines totales.
2. Blotting occidental19
- Faire 30 ml de gel de fonctionnement de 10 % contenant 12,15 ml d'eau distillée ultrapure, 7,5 mL de 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 0,3 mL de 10 % SDS, 10 mL de solution d'acrylamide-bis de 30 %, acrylamide-bis de 0,15 mL de persulfate d'ammonium (APS) et 20 l de tetramethylethynediamine (TEMED ).
- Jetez le gel entre deux plaques de verre séparées par des espaceurs.
- Faire un gel d'empilage de 20 ml contenant 12,1 ml d'eau distillée ultrapure, 5,0 ml de 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8), 0,2 mL de 10 % de SDS, 2,6 mL d'acrylide-bis, 0,1 ml de 10 % D'APS et 20 L de TEMED.
- Lorsque le gel en marche se solidifie, versez un gel d'empilement. Ajouter délicatement le séparateur en plastique pour lancer la voie de chargement, en évitant les bulles. Attendez 15-30 min, jusqu'à ce que le gel soit solidifié.
- Commencez à charger le gel à l'aide de 5 L de normes protéiques. Chargez 20 l l du mélange de lysate à partir de l'étape 1,8 par voie, ce qui correspond à 1/15 d'un cerveau d'abeille ou à 16 ng de protéines totales par voie. Exécuter les échantillons pour un total de 3,5 à 4 h à 16 mA dans le gel d'empilage et 32 mA dans le gel courant. Arrêtez lorsque le colorant quitte le gel.
- Transférer les protéines sur les membranes de nitrocellulose dans un tampon de transfert (25 mM Tris-HCl, 192 mM de glycine, 15 % de méthanol) à 0,45 mA pour 1 h 30 min à 4 oC.
- Pour évaluer l'efficacité du transfert de protéines après SDS-PAGE avant l'immunoblotting, ajouter la solution de coloration Ponceau S (ajouter 0,1 g de Ponceau S et 5 ml d'acide acétique à l'eau à un volume final de 100 ml). Conserver à 4 oC pendant 1 min et rincer rapidement à l'eau distillée.
- Étiquetez chaque voie à l'abri d'un stylo à bille, coupez la membrane contenant deux voies avec homogénéiser le cerveau et une voie avec un marqueur protéique et placez-les dans une boîte d'incubation western blot. Laver 3x pendant 5 min chacun dans du phosphate tamponné salin (PBS) contenant 0,1% Tween 20 (PBS-Tw).
- Bloquer la membrane avec 10% NGS (1 ml de sérum de chèvre normal à 10 ml de PBS-Tw) dans une boîte d'incubation western blot pendant 1 h. Faire une dilution anti-mGlutR1 (5 l d'anticorps dans 10 mL de 10% NGS). Faire des dilutions anti-RDL1 et anti-RDL2 (5 l d'anticorps dans 10 mL de 10 % de NGS chacun). Remplacer la solution de blocage dans chaque boîte par les anticorps dilués et laisser la nuit (16-24 h) à 4 oC.
- Laver la membrane 3x pendant 5 min chacun en PBS-Tw. Incuber la membrane avec des anticorps secondaires anti-lapin IgG HRP-conjugués à 1:10,000 dans 10% NGS PBS-Tw pour 2 h à température ambiante (RT). Laver les membranes 3x en PBS-Tw, puis 1x en PBS.
- Détecter les bandes à l'aide du substrat HRP chemiluminescent occidental. Mélanger deux substrats 1:1 (v/v) à RT, mettre toutes les membranes dans la même boîte et les recouvrir du mélange de substrat pendant 2 min (dans une pièce sombre avec une lumière rouge) à RT. Procéder à la détection des protéines à l'aide d'un film d'autoradiographie avec plusieurs temps d'exposition. Habituellement, un anticorps est testé sur une membrane contenant la même dilution du cerveau homogénéiser sur deux ou trois voies et une voie avec le marqueur de poids.
3. Procédures immunocytochimiques
- Pour disséquer les cerveaux d'abeilles mellifères pour l'immunocytochimie, immobiliser les abeilles dans la glace pendant 30 s. Après que les abeilles sont immobilisées, décapiter l'abeille avec des ciseaux et placer la tête dans une solution de paraformaldéhyde de 4% dans PBS. Travaillez sous le capot de fumée.
CAUTION: Le corps doit être soigneusement éliminé parce que l'abdomen peut encore piquer après la décapitation. - Enlevez soigneusement mais rapidement les antennes, les yeux composés, et coupez tout autour de l'exosquelette supérieur avec des ciseaux d'iris de Barraquer. Laisser les têtes s'asseoir dans la solution fixative pendant 10 min. Retirez le reste de l'exosquelette de la tête et coupez toutes les trachée restantes.
- Placer chaque cerveau dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml contenant au moins 1 ml de solution de paraformaldéhyde de 4 % et laisser passer la nuit à 4-8 oC.
- Faire une solution d'agarose de 7,6 % en mélangeant 3,8 g d'agarose et 50 ml d'eau distillée dans un flacon Erlenmeyer. Micro-ondes la solution jusqu'à ce que l'agarose liquéfie.
REMARQUE : Un petit morceau de papier de soie peut être placé dans l'ouverture du flacon afin d'empêcher la solution d'agarose de déborder pendant le chauffage. - Placer les cerveaux fixes d'abeilles (3-4 cerveaux) dans un plat Petri de 35 mm et enlever l'excédent de fixatif avec du papier de soie. Verser la solution d'agarose liquide sur le cerveau. Orientez les cerveaux dans l'agarose de sorte que les lobes d'antenne soient orientés vers le haut. Laisser refroidir l'agarose et solidifier.
- Après que l'agarose se sont solidifiées, découpez des blocs d'agarose contenant chacun un cerveau.
- Pour la section vibratome, préparer une plaque de 24 puits avec chaque puits contenant un panier avec un maillage hydrophobe au fond. Remplissez chaque puits avec 600 l de PBS.
- Couper chaque bloc en sections transversales de 70 m à l'aide de la machine à vibratome et placer les sections dans le panier contenant du PBS.
REMARQUE : Assurez-vous que les sections du même cerveau sont placées dans le même panier. - Laver les sections du cerveau 6x pendant 10 min chacune avec PBS-TX pour s'assurer qu'aucun fixatif ne reste dans les sections. Placez la plaque multipuits sur un shaker orbital et lavez le cerveau à 210 tr/min. Avant chaque lavage assurez-vous de remplacer la solution PBS-TX par une solution PBS-TX fraîche. Bloquer avec 1% de sérum d'âne normal pendant le dernier lavage.
- Pour tester l'anticorps primaire anti-mGlutR1, préparez une dilution de 1:112 des anticorps anti-mGlutR1 en ajoutant 9 mL de PBS-TX à 80 'L d'anticorps anti-mGlutR1 dans un tube centrifugeur de 15 mL. Vortex le tube brièvement pour bien mélanger. La dilution de travail des anticorps a été déterminée dans des expériences préliminaires.
- Pour tester l'anticorps primaire anti-RDL, préparez une dilution de 1:100 d'anticorps anti-RDL en ajoutant 30 L de peptide anti-RDL 1, 30 l de peptide anti-RDL 2, et 6 mL de PBS-TX dans un tube de centrifugeuse de 15 mL. Vortex le tube brièvement pour bien mélanger. La dilution de travail des anticorps a été déterminée dans des expériences préliminaires.
- Ajouter 800 l de solution d'anticorps à chaque puits dans la plaque. Couvrez la plaque multipuits et enveloppez-la dans du papier d'aluminium pour éviter la dégradation de l'exposition à la lumière. Placer la plaque enveloppée dans du papier d'aluminium sur un shaker orbital et secouer à 210 tr/min pendant 2 h. Puis partez toute la nuit à RT sans trembler.
- Après que les sections de cerveau ont été laissées pendant la nuit, lavez avec PBS-TX pendant 10 min. Répétez l'étape de lavage 6x.
- Préparer les anticorps secondaires (anti-lapin de l'âne) en faisant une dilution 1:225 des anticorps secondaires en ajoutant 40 L d'anticorps secondaires à 9 ml de PBS-TX.
- Ajouter 800 l de la dilution secondaire des anticorps à chaque puits. Couvrir l'assiette et l'envelopper dans du papier d'aluminium. Placer la plaque enveloppée dans du papier d'aluminium sur le shaker orbital et secouer à 210 tr/min pendant 2 h. Ensuite, laissez-le toute la nuit à RT.
- Laver les sections du cerveau 3x pendant 10 min chacune avec PBS-TX et 3x avec la solution PBS régulière.
- Pour l'intégration des sections dans les diapositives, préparer la solution d'intégration des supports de montage/glycérol modifiée à partir de Rodriguez et coll.20. Ajouter 5 g du support de montage en 20 ml de PBS et remuer pendant 16 h à l''effet d'un agitateur magnétique. Ajouter 10 ml de glycérol et remuer pendant 16 h à l'effile magnétique. Centrifugeuse pendant 15 min à 4 000 x g,prendre le supernatant homogène liquide, et aliquot dans des tubes de 1 ml. Conserver à -20 oC
- Intégrez les sections sur les diapositives avec une goutte du support de montage préparée à l'étape 3.17, en veillant à ce que chaque diapositive contienne des sections d'un cerveau.
- Contrôle de preadsorption de l'immunostaining avec les peptides conjugués
- Pour les peptides anti-RDL et conjugués, incuber la dilution de travail des anticorps anti-RDL avec le peptide correspondant conjugué pendant la nuit à RT sur le shaker : condition 1) 500 'g peptide conjugué avec l'hémocyanine de limpet de trou de serrure (KLH) par l'intermédiaire de gluldéhyde de tara ; condition 2) sans n'importe quel conjugué.
- Centrifuger chaque mélange pendant 10 min à 10 000 x g et recueillir le supernatant dans les deux conditions (étape 3.19.1).
- Incuber les sections sérielles du cerveau d'abeille de miel avec chaque supernatant et processus avec les anticorps secondaires décrits ci-dessus. Les sections en série sont des sections qui se suivent pendant les procédures de section du vibratome, de sorte que la même partie du cerveau sera exposée à des contrôles positifs et négatifs.
- Pour l'anti-mGlutR1 et le peptide conjugué, incuber la dilution de travail des anticorps anti-mGlutR1 à RT avec le peptide conjugué KLH contenant le peptide de 10-4 M (condition 1) et sans n'importe quel conjugué (condition 2).
- Centrifuger chaque mélange pendant 10 min à 10 000 x g et recueillir le supernatant des deux commandes.
- Incuber les sections sérielles du cerveau d'abeille de miel avec le supernatant des deux conditions et processus avec les anticorps secondaires (étapes 3.14-3.15).
- Intégrez des sections des deux conditions sur la diapositive à l'aide de supports d'intégration (étape 3.17).
4. Test de RDL et mGlutR1 Protein Expression par immunocytochimie (section 3) dans le cerveau d'abeille de miel après injection du système CRISPR-Cas9 correspondant
- Concevez les guides à l'aide d'un outil de conception CRISPR-Cas9 en ligne21 à l'aide des séquences d'ADN génomique d'AmRdl (XM_006565102.3) et des séquences de mGlutR1 (XM_006566244.3) (tableau 1). Commandez comme Cas9 crRNA et Cas-9 tracrRNA avec le colorant fluorescent ATTO550 à la fin 5'. Commandez la Cas9 Nuclease V3 (Voir tableau des matériaux).
- Préparer les composants pour le système CRISPR-Cas 9 en faisant un stock de 100 M de chaque guide crRNA et tracrRNA en utilisant de l'eau sans nauséade. Aliquot et magasin à -20 oC. Préparer la concentration de fonctionnement de la solution Cas-9 en ajoutant 2,5 l de Nuclease V3 Decas 9 (10 mg/mL) à 47,5 l de tampon sans nucléotide pour obtenir une concentration finale de 0,5 g/L. Faire gRNA et RNP pour l'injection.
- Préparer la formation complexe de gRNA pour chaque ARN de guide séparément (guideRNA:tracrRNAAT550)
- Étiquetez un tube à essai avec le nom du gRNA, ajoutez 92 l de tampon libre de nucléotide, 4 'L de 100 'M CRISPR-Cas9 tracrRNA- 5'ATTO550, et 4 'L de la solution crRNA guide. Mélanger délicatement et faire tourner.
REMARQUE : Exemple d'étiquetage des tubes gRNA pour RDL : GRDL1, GRDL2, GRDL3 (correspondant à l'ARN des guides RDL dans le tableau 1). Exemple d'étiquetage des tubes gRNA pour mGlutR1: GMGL1, GMGL2, GMGL3 (tableau 1). - Chauffer la solution à 95 oC pendant 5 min pour créer de l'ARNc. Refroidir le mélange à RT pendant 10 min.
- Étiquetez un tube à essai avec le nom du gRNA, ajoutez 92 l de tampon libre de nucléotide, 4 'L de 100 'M CRISPR-Cas9 tracrRNA- 5'ATTO550, et 4 'L de la solution crRNA guide. Mélanger délicatement et faire tourner.
- Préparer la formation du complexe RNP (gRNA : S.p Cas9Nuclease), les mélanges de livraison et le contrôle.
- Étiquetez un tube à essai avec le nom du RNP, ajoutez 6 l de solution gRNA et 6 L de 0,5 g/L S.p Cas9 Nuclease V3. Mélanger délicatement et incuber les solutions à 37 oC pendant 10 min avant l'injection.
REMARQUE : Exemple d'étiquettes de tube RNP : RRDL1, RRDL2, RRDL3. - Faire un RNPRDLmix. Pour préparer le mélange final utilisé pour les injections, ajouter 4 L de chaque RNP de RDL ensemble. Mélange RNP/RDL 4 'L RRDL1 '4 'L RRDL '4 'L RRDL3.
- Faire un RNPmGlutR1mix. Mélanger 4 ll de chaque RNP à partir de mGlutR1 ensemble pour préparer le mélange final utilisé pour les injections (RNPmGlutR1mix) 4 'L RMG1 '4 'L RMG2 '4 'L RMG3.
REMARQUE : Exemple d'étiquettes de tube DE RNP : RMG1, RMG2, RMG3. - Faire une solution de contrôle noguideRNA en mélangeant 4 'L de tracrRNA, 92 'L de tampon, et 4 'L d'eau au lieu de guideRNA (voir la section 4.3). Mélangez 6 l de cette solution noguideRNA et 6 'L de 0,5 g/L Cas9 Nuclease V3 (étape 4.4.1) pour produire la solution d'injection de contrôle.
- Étiquetez un tube à essai avec le nom du RNP, ajoutez 6 l de solution gRNA et 6 L de 0,5 g/L S.p Cas9 Nuclease V3. Mélanger délicatement et incuber les solutions à 37 oC pendant 10 min avant l'injection.
5. Procédure d'injection
- Immobiliser chaque abeille telle que décrite à l'étape 1.3 et les nourrir comme à l'étape 1.4. Ensuite, préparez deux ensembles de deux boîtes en bois pour libérer les abeilles après l'injection: une boîte blanche (condition expérimentale) et une boîte noire (contrôle). Chaque boîte doit contenir un petit peigne et un plat Petri d'alimentation. Un côté de chaque boîte est fait de verre pour permettre l'observation.
- Faire nourrir la vaisselle Petri. Prenez le couvercle d'un plat Petri de 35 mm, placez la cire à l'intérieur de la surface et placez la partie inférieure du plat Petri sur la cire. Fixer la plaque dans la boîte.
- À l'aide d'une seringue de 5 ml, injecter une solution de saccharose de 1 M. entre le couvercle et la partie inférieure du plat. Les abeilles peuvent rapidement mettre leurs proboscises entre les deux plaques et rester ont été sèches pendant une période d'incubation de 48 h. Mettre un plat dans chaque boîte.
- Pour préparer le système de microinjection, remplissez les capillaires d'huile minérale sans bulles d'air. Placez les capillaires dans le porte-injecteur du système de microinjection. Pour charger le capillaire avec la solution d'injection désirée, placez un film hydrophobe sur une surface plane, et pipette la solution sur elle. Injecter l'huile des capillaires et remplacer le mélange par le mélange RNP correspondant.
- À l'aide du système de microinjection, injectez 345 nL de solution de mélange RNP directement dans l'ocelli médian de chaque abeille.
- Pour l'injection RDL-CRISPR-Cas9, injectez huit abeilles avec le RNPRDLmix préparé tel que décrit à l'étape 4.4.2. Nourrissez-les 1M saccharose après l'injection. Relâchez-les dans la boîte blanche (expérimentale) avec le petit peigne et nourrissez le plat Petri pendant 48 h. Utilisez huit autres abeilles comme témoins, nourrissez-les et relâchez-les dans la boîte noire (contrôle).
- Pour mGlutR1 CRISPR-Cas9, injectez neuf abeilles avec le RNPmGlutR1mix préparé tel que décrit à l'étape 4.4.3. Pour le contrôle injecter huit abeilles avec le mélange d'ARN sans guide (RNAmix_noguide) préparé comme décrit à l'étape 4.4.4. Nourrissez-les 1M saccharose après l'injection. Relâchez les abeilles de leurs supports dans la boîte blanche (état expérimental) ou la boîte noire (contrôle) préparée comme décrit à la section 5.1.
- Placer les boîtes dans un récipient en polystyrène avec du papier humide à l'intérieur pour l'humidité. Laisser les abeilles pendant 48 h et observer 2x par jour pour s'assurer qu'elles ont assez de nourriture et une bonne humidité.
- Disséquer le cerveau de chaque abeille après 48 h (étape 3.1) et le processus pour l'immunocytochimie tel que décrit dans la section 3. Pour les immunostainings anti-mGlutR1, utilisez l'étape 3.11 et pour les immunostainings anti-RDL utilisent l'étape 3.12.
- Effectuez l'imagerie confocale pour évaluer le niveau de fluorescence dans les sections du cerveau tachées d'immunitaire.
- Pour évaluer la réduction des protéines dans les cerveaux immunolabeled, utilisez la collecte d'images confocales au même niveau de gain pour les cerveaux témoins et injectés.
6. Test de chute à base de qPCR pour évaluer l'ADN RDL génomique modifié 48 H après l'injection CRISPR Cas9 RNPRDLmix
- Concevoir les amorces, la sonde de contrôle et la sonde de débarquement pour évaluer la quantité d'ADN modifiée par injection CRISPR-Cas9. Chaque amorce est conçue de sorte qu'elle flanque au moins un guide CRISPR-Cas 9 et la taille de l'amplicon est de 132 pb. Les amorces et les sondes utilisées sont données ci-dessous :
RDL1_For: CTCGGAGTGACCACCGT
RDL1_Rev: CAACGAGGCGAACACCAT
RDL1_control_probe: /5HEX/CGA-C-G-TTT-A-CT/3IABkFQ/
RDL1_Drop-off_probe: /56-FAM/CCTA-C-G-T-CA-A-GT/3IABkFQ/- Assurez-vous que les amorces correspondent à des séquences uniques qui sont spécifiques à la zone. Assurez-vous que la sonde de dépôt est conçue pour la zone qui chevauche le guide RDL-CRISPR-Cas9.
- Pour vérifier s'il y a une modification de l'ADNc dans la zone de guidage, injecter 12 abeilles dans l'ocelli avec le mélange RNP_RDL décrit à l'étape 5.3.1 et utiliser huit abeilles non injectées comme témoins.
- Disséquer les cerveaux d'abeilles sans les lobes optiques 48 h après les injections et extraire l'ADN de chaque cerveau d'abeille injecté et contrôler (sans lobes optiques) en utilisant le kit suivant le protocole du fabricant (voir tableau des matériaux).
- Évaluer la quantité, la qualité et la pureté de l'ADN g extrait à l'aide d'un spectrophotomètre.
- Quantifier l'expression relative de l'ADNc modifié d'AmRDL à l'aide du protocole de décrochage qPCR et du cycleur PCR en temps réel.
- Resuspendre les oligos à 100 M, diluer les amorces à 10 M, et les sondes à 5 M.
- Configurez la réaction PCR dans la plaque de puits 96 comme indiqué ici pour un échantillon d'ADNc g (3 répétitions) : 10 l de mix maître (voir Tableau des matériaux),1 L d'amorce avant, 1 L d'apprêt inversé, 1 L de sonde de contrôle, 1 L de sonde de chute, 2 l de gDNA (50 ng), 4 l d'eau sans nucléane pour apporter le volume de réaction finale à 20 L.
REMARQUE : Les contrôles sont la solution au lieu des échantillons et de l'eau au lieu des sondes. - Mettre en place le programme de cyclisme comme suit pour un vélo pcR en temps réel : 95 oC pour 3 min suivi de 40 cycles de 95 oC pour 15 s, 60 oC pour 1 min.
- Évaluer la modification relative du gène à l'aide de la méthode 2-Ct, où
Et
Et
7. Quantification relative de l'ARN RDL 48 H après injection RNPRDLmix
- Pour vérifier s'il y a une réduction de l'ARNm RDL, injecter 20 abeilles dans l'ocelli avec RNP_RDL mélange tel que décrit à l'étape 5.3.1 et utiliser 12 abeilles non injectées comme contrôles. Disséquer les cerveaux d'abeilles (sans lobes optiques) 48 h après les injections, extraire l'ARNm total de chaque abeille injectée, et séparer en utilisant le protocole du fabricant (voir tableau des matériaux).
- Enlever tout résidu d'ADN restant dans l'échantillon à l'aide d'un kit sans ADN (voir tableau des matériaux).
- Évaluer la qualité et la pureté de l'ARN extrait à l'aide d'un spectrophotomètre.
- Quantifier l'expression d'AmRDL à l'aide d'un kit RT-PCR vert fluorescent disponible dans le commerce(Tableau des matériaux)sur un cycleur PCR en temps réel en utilisant le protocole du fabricant pour une plaque de puits 384.
REMARQUE : Dans cette expérience, des amorces publiées précédemment ont été utilisées. Pour AmRDL (AmRDL_F GGTCGATGGGCTACTACCTG; AmRDL_R TCGATCGACTTGACGTAGGA)22 et les amorces d'actine comme gène de référence [AmActin_F TGCCAACACTGTCCTTTTTTTGTGTG; AmActin_R GAATTGACCCATCCA]23. L'expression relative du gène a été calculée à l'aide de la méthode 2-Ct (étape 6.6).
8. QPCR Based drop-off Assay to Evaluate the Modified Genomic DNA 48 H After RNPmGlutR1mix Injection
- Concevoir les amorces, contrôler et déposer les sondes pour évaluer la quantité d'ADN modifiée par injection CRISPR-Cas9. Concevoir les amorces de sorte qu'ils flanquent au moins un guide CRISPR-Cas 9 et la taille de l'amplicon est de 96 bp.
mGlutR1_For: GGTGAAACGACGACACGGA
AmGlurR1_Rev: GGAGAGAGGGAGCGAGAA
AmGlurR1_control_probe: /5HEX/CGAGG-G-AAA-CGA-GT/3IABkFQ/
AmGlurR1_Drop-off_probe: /56-FAM/CGA-C-C-CG-TC/3IABkFQ/
REMARQUE : Assurez-vous que les amorces correspondent à des séquences uniques qui sont spécifiques à la zone qui aurait dû être modifiée. La sonde de débarquement est conçue pour la zone qui se chevauchait avec le guide CRISPR-Cas9. - Pour vérifier s'il y a une modification de l'ADNg dans la zone de guidage, injecter 12 abeilles dans l'ocelli avec RNP_ mélange GlutR1 tel que décrit à l'étape 5.3.1 et utiliser huit abeilles non injectées comme contrôles.
- Disséquer les cerveaux d'abeilles (sans lobes optiques) 48 h après les injections et extraire l'ADNg de chaque cerveau d'abeille injecté et contrôler le cerveau des abeilles (sans lobes optiques) en utilisant le protocole du fabricant (voir tableau des matériaux).
- Évaluer la quantité, la qualité et la pureté de l'ADN g extrait à l'aide d'un spectrophotomètre.
- Quantifier la modification relative de gDNA AmGlutR1 à l'aide du protocole de dépôt qPCR et pour le cycler PCR en temps réel tel que décrit à l'étape 6.5.
- Évaluer la modification relative du gène à l'aide de la méthode 2-Ct, où
Et
Et
9. Quantification de l'ARN mGlutR1 48 h Après L'injection RNPmGlutR1mix
- Pour vérifier s'il y a une réduction de l'ARNm d'ARN mGlutR1, injectez six abeilles dans l'ocelli avec le mélange de RNP_RDL tel que décrit à l'étape 5.3.2 et utilisez six abeilles non injectées comme témoins. Disséquer les cerveaux d'abeilles (sans lobes optiques) 48 h après les injections, extraire l'ARNm total de chaque abeille injectée, et séparer en utilisant le protocole du fabricant pour l'isolement de l'ARN (voir tableau des matériaux).
- Enlever tout résidu d'ADN restant dans l'échantillon à l'aide d'un kit sans ADN (voir tableau des matériaux).
- Évaluer la qualité et la pureté de l'ARN extrait à l'aide d'un spectrophotomètre.
- Quantifier l'expression de mGlutR1 à l'aide d'un kit SYBR Green RT-PCR (voir Tableau des matériaux) sur un cycleur PCR en temps réel avec le protocole prévu pour le kit de puits 384. Utilisez les amorces suivantes pour mGlutR1 (mGlut_F CCTCCTCAACGTCTCCTTCATA; mGlut_R TGCCGTTGTGTTCCGATTT) et actines comme gène de référence [AmActin_F TGCCAACACTGTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT; AmActin_R GAATTGACCCATCCA]. Calculez l'expression relative du gène à l'aide de la méthode 2-Ct (étape 8.6).
Representative Results
Tests d'anticorps anti-RDL
Les anticorps ont été produits contre les conjugués de peptides RDL comme le montre la figure 1A. La première étape dans la caractérisation des anticorps anti-RDL est de vérifier l'homogénéisation de la protéine extraite du cerveau des abeilles à l'aide d'une tache occidentale avec des anticorps anti-RDL et un anticorps secondaire igG de chèvre étiqueté HRP(figure 1A, insert). Les deux anticorps anti-RDL reconnaissaient la bande située à 50-60 kD (flèche), correspondant au poids estimé des protéines isoformes sous-uniformes de RDL. Pour démontrer que les anticorps anti-RDL reconnaissaient le peptide dans les tranches de cerveau, nous avons utilisé un contrôle de la preadsorption (Figure 1B,C). Quand les anticorps ont été préincubtés avec les peptides conjugués, la coloration sur la section était absente. Ceci a démontré que les anticorps anti-RDL ont reconnu le peptide conjugué contre lequel ils ont été soulevés. Afin de démontrer que les anticorps anti-RDL reconnaissent la protéine dans le tissu cérébral fixe, nous avons utilisé CRISPR-Cas9 pour assommer le gène RDL qui produit la protéine RDL dans les cellules. Figure 1D1-3, montre les sections de cerveau frontal d'abeille de contrôle qui ont été étiquetées avec des anticorps anti-RDL. Cette abeille n'a pas été injectée avec RDL-CRISPR-Cas9 RNP. Dans la figure 1D1, l'anti-RDL étiquette les neuropils dans la section frontale du cerveau des abeilles. La même section frontale de la figure 1D2 montre l'absence de fluorescence de l'ATTO550, parce que le complexe RDL-CRISPR-Cas9 n'a pas été injecté.
Figure 1E1-E3 montre une section du cerveau d'une abeille injectée avec RDL-CRISPR-Cas 9, puis traitée avec la même quantité d'anticorps que le cerveau témoin dans la figure 1D1-D3. La coloration anti-RDL a été significativement réduite dans l'ensemble du cerveau 48 h après l'injection, et la distribution de la coloration ATTO550 dans le cerveau (Figure 1E2) montre le succès des injections RDL-CRISPR-Cas 9 dans l'ocelli médian d'abeille. Les cellules dispersées multiples du cerveau montrent ATTO550. L'injection réussie de RDL-CRISPR-Cas 9 a réduit l'expression des protéines par rapport au contrôle (Figure 1E1-3). De huit cerveaux immunosifiés d'abeille, seulement un cerveau a eu un niveau élevé de distribution du RDL-CRISPR-Cas9 dans les cellules du corps de champignon, du protocerebrum, et du lobe d'antenne, alors que d'autres cerveaux ont eu la coloration de cellules avec ATTO550 dans le calice de corps de champignon, complexe central, mais pas lobe d'antenne. Il est important de noter que chez ces abeilles, la réduction de l'immunostaining anti-RDL n'était pas aussi dramatique que dans le cerveau montré dans la figure 1E1.
Ensuite, pour estimer le niveau de l'ADNc RDL modifié chez les abeilles 48 h après l'injection RDL-CRISPR-Cas9, nous avons effectué un test de dépôt qPCR, où la sonde de dépôt a été conçue pour correspondre à la zone de l'un des gRNAs RDL. Dans ces expériences, dans les cerveaux d'abeilles injectés avec RDL-CRISPR-Cas 9, la réduction relative de la fluorescence correspondait au nombre de l'Adn gané modifié dans les échantillons. Dans nos tests, la zone correspondant à ce guide en gDNA chez 12 abeilles injectées avec RDL-CRISPR-Cas9 était de 64 % (moyenne de 30 % SD) par rapport à l'ADNc chez les abeilles non injectées(figure 3A).
Ensuite, pour estimer le niveau de l'ARN RDL chez les abeilles 48 h après l'injection, nous avons effectué qRT-PCR dans un groupe distinct d'abeilles (Figure 3B). Nous avons comparé le niveau d'ARN RDL des abeilles injectées RDL-CRISPR-Cas 9 (n - 19) avec le niveau d'ARN chez les abeilles qui n'ont pas été injectées (n - 12). Dans ces expériences, la réduction relative de l'ARNm RDL était de 59 % (moyenne de 15 % DE SE) par rapport au niveau d'ARN chez les abeilles non injectées. Quand nous avons examiné le niveau de RDL RNA dans chaque abeille individuellement, seulement 13 abeilles sur 19 abeilles ont montré une réduction significative de l'ARN. Ces données indiquent que l'injection de RDL-CRISPR-Cas9 par l'ocelli pourrait ne pas toujours atteindre un grand nombre de cellules du cerveau, ce qui confirme les données avec RDL souillé souillant D'autres abeilles injectées RDL-CRISPR-Cas9. Dans ces préparations, une seule abeille sur 8 avait RDL CRISP-Cas9 dans de nombreuses cellules du cerveau (corps de champignon, protocerebrum, et lobe d'antenne) par rapport à d'autres cerveaux d'abeille, où la distribution du RDL-CRISPR-Cas9 a été concentrée dans les cellules dans le protocerebrum (champignon du corps calyx et complexe central) mais pas le lobe d'antenne (Figure 4A-D).
Tests d'anticorps anti-mGlutR1
Nous avons utilisé les anticorps anti-mGlutR1 produits chez le lapin contre les peptides conjugués spécifiques au melanogaster Drosophila (Figure 2A). La séquence de ce peptide montre une identité de 94% avec le peptide d'abeille (CLSDKTRFDYFARTVPPD) Figure 2A. Tout d'abord, nous avons vérifié les anticorps contre la protéine du cerveau des abeilles à l'aide d'immunoblotting. L'homogénéisme de cerveau d'abeille a été séparé par 10% SDS-PAGE et électrophorétiquement transféré d'à une membrane de nitrocellulose et souillé avec anti-mGlutR1. L'encart de la figure 2A montre deux bandes dont le poids est estimé (103 et 83 kD) correspondant à deux isoformes. Lorsque nous avons testé cet anticorps sur les cerveaux d'abeilles mellifères, nous avons constaté qu'ils étiquetent les profils neuropilaires et les cellules dans les sections du cerveau des abeilles comme illustré dans la figure 2B,D. Après la prépréorption de l'anticorps anti-mGlutR1 avec le peptide conjugué-mGlutR1, la coloration spécifique a disparu dans la tranche de cerveau d'abeille (figure 2C). Cela confirme que les anticorps anti-mGlutR1 reconnaissent le peptide (figure 2C). Ensuite, nous avons injecté un mélange de mGlutR1-CRISPR-Cas9 dans l'ocelli médian et utilisé le contrôle noguideRNA. Chez les abeilles témoins (n - 7), la fluorescence d'ATTO550 n'était pas concentrée dans les cellules. Certains cerveaux avaient la fluorescence dispersée ATTO550 étiquetage. Ainsi, la préparation de contrôle dans la figure 2D1-3 montre la coloration anti-mGlutR1 dans le cerveau, mais pas la fluorescence ATTO550. Lorsque le mGlutR1-CRISPR-Cas9 a été injecté dans l'ocelli et repris par de nombreuses cellules, le niveau de fluorescence des anticorps secondaires a été considérablement réduit dans la zone qui recèle le mGlutR1RNP fonctionnel(figure 2E1-3). Les abeilles ont été surveillées pendant 48 h, et une abeille de chaque condition expérimentale a été trouvée morte. Ainsi, dans cette expérience, nous avons vérifié sept abeilles témoins et huit abeilles CRISPR-Cas9. Toutes les abeilles injectées avec CRISPR-Cas9 avaient des cellules qui ont pris en mGlutR1-CRISPR-Cas9. La plupart de ces cellules étaient dans le calice de corps de champignon, complexe central, et protocerebrum postérieur. Seulement deux abeilles sur sept ont montré l'étiquetage ATTO550 dans beaucoup de cellules dans le corps de champignon, complexe central, et le lobe d'antenne. Un exemple de l'une de ces abeilles est illustré dans la figure 2E. La réduction du niveau de coloration mGlutR1 dans ces préparations était significative. Les cinq autres abeilles ont l'étiquetage ATTO550 correspondant à la livraison réussie du mGlutR1 CRISPR-Cas9 dans le corps des champignons et le protocerebrum postérieur, mais pas dans les lobes d'antenne.
Ensuite, pour estimer le niveau de l'ADNnm mGlutR1 modifié chez les abeilles 48 h après l'injection, nous avons effectué un test de débarquement à base de qPCR, où la sonde de débarquement a été conçue pour se siévisser dans la zone proche du guide mGlutR1. Dans ces expériences, dans les cerveaux d'abeilles injectés avec mGlutR1-CRISPR-Cas 9, la modification relative de l'ADNc chez 12 abeilles était de 59 % (moyenne de 33 % SD) comparativement à l'ADNc chez les abeilles non injectées(figure 3A).
Ces résultats ont également été confirmés par des tests qRT-PCR dans un groupe différent d'abeilles, où nous avons estimé les niveaux d'ARN mGlutR1 en utilisant qRT-PCR chez les abeilles 48 h après injections avec RNPmGlutR1mix (Figure 3B). Nous avons comparé le niveau d'ARN mGlutR1 des abeilles injectées par mGlutR1-CRISPR-Cas9 (n - 6) avec les niveaux d'ARN chez les abeilles qui n'ont pas été injectées (n - 6). Dans ces expériences, la réduction relative de l'ARNmGlutR1 chez les abeilles injectées était de 53 % (moyenne de 18 % SE) par rapport aux abeilles non injectées(figure 3B).
La section de quatre abeilles différentes qui a exprimé le RNP RDL-CRISPR-Cas9 dans la cellule De Kenyon du corps de champignon est montrée dans la figure 4A-D. L'exemple d'abeille avec la fluorescence ATTO550 dans le corps des champignons et le lobe d'antenne est montré dans la figure 4E,F.
| Guides | Séquences | gRNA (en) | Rnp |
| [guideRNA:tracrRNA] | [gRNA:Cas9 Nuclease] | ||
| RDL_Guide1 | ACCGTAACGCGACCCCCGCT | GRDL1 (en) | RRDL1 (en anglais seulement) |
| RDL_Guide2 | AACGTCGATCGACTTGACGT | GRDL2 (en) | RRDL2 (en anglais seulement) |
| RDL_Guide3 | CCATGACGAAACACGTGCCC | GRDL3 (en) | RRDL3 (en anglais seulement) |
| mGlu_Guide 1 | CGAAGTTATCTGACGGTGTGTGT | GMGL1 GMGL1 GMGL1 | RMGL1 (en) |
| mGlu_Guide 2 | TTCAACGAGAGCAAGTTCATTCAT TTCAACGagaGCAAGTTCATTCAT TTCAACGagaGCAAGT | GMGL2 GMGL2 GMGL2 | RMGL2 RMGL2 |
| mGlu_Guide 3 | GCAAACGTCGGTAGGAGTGA | GMGL3 GMGL3 | RMGL3 RMGL3 |
Tableau 1 : Séquences de guides nucléotides conçus pour RDL et mGlutR1.
Figure 1 : Caractérisation des anticorps anti-RDL. (A) Schématique de la sous-unité RDL, où les cercles roses indiquent la localisation du peptide 2 (extracellulaire CVNEKQSYFHIATTSNEFIRI-amide) dans le N-terminus et le peptide 1 (intracellulaire CVRFKVHDPKAHSKGGTL-amide) dans le C-terminus. L'encart dans A montre les bandes dans la tache occidentale des extraits de cerveau d'abeille de miel traités avec les anticorps anti-RDL correspondants (un avec le pep1 anti-RDL et le pep2 d'anti-RDL). Chaque immunoblot montre la taille apparente de la protéine de 50 à 60 kD, correspondant aux poids estimés des différents isoformes des sous-unités RDL. (B,C) Preadsorption des anticorps anti-RDL avec le peptide conjugué 1. L'image en C montre une réduction de la coloration dans la section lorsque les anticorps ont été préincubtés avec du peptide conjugué 1. Le corps en forme de ventilateur (Fb) et le corps ellipsoïde (eb) sont des structures complexes centrales dans le cerveau. M - lobe médial du corps de champignon. (D1-3) La coloration anti-RDL d'un contrôle, section non injectée de cerveau d'abeille après 48 h. Vert indique le profil positif d'anti-RDL dans le cerveau. (D2) Cette abeille n'a pas été injectée et ne contient pas de fluorescence ATTO550. (D3) Images fusionnées de D1 et D3. (E1-3) L'injection de RDL-CRISPR-Cas9 a réduit la coloration anti-RDL après 48 h. (E2) LA fluorescence ATTO550 dans les noyaux cellulaires a indiqué la livraison réussie de RDL-CRISPR-Cas9. (E3) L'image fusionnée de l'anti-RDL (vert) et ATTO550 (rouge). Barre d'échelle de 100 m (B-E). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Caractérisation des anticorps anti-mGlutR1. (A) Schématique de GCPR mGluR qui montre le peptide de melanogaster de Drosophila utilisé pour la vaccination. À titre de comparaison, le peptide Apis mellifera est montré ci-dessous. Le cercle indique la localisation du peptide dans le terminus N du domaine extracellulaire du récepteur mGlutR1. L'encart dans A montre que les anticorps anti-mGlutR1 ont reconnu deux bandes dans la tache occidentale des cerveaux d'abeille 103 kD et 83 kD qui correspondent aux poids estimés des isoformes connus. (B,C) Contrôle de preadsorption de l'anticorps anti-mGlutR1 dans deux sections consécutives du lobe d'antenne glomeruli. L'image de l'anti-mGlutR1 dans la section glomeruli d'antenne en C montre la réduction de la coloration en raison de la préincubation du peptide anti-mGlutR1 avec l'anticorps anti-mGlutR1. Cette procédure provoque l'anticorps de précipiter hors de la solution, ce qui abolit la coloration par rapport à B (contrôle, absence du peptide dans la préincubation). (D1) montre la coloration de l'anti-mGlutR1 dans une tranche de cerveau d'abeille après une injection de contrôle dans l'ocellus médian. Cette injection manquait le gRNA mGlutR1 qui permet de faire tomber les récepteurs mGlutR1 par CRISPR-Cas9, et donc la coloration de l'anticorps anti-mGlutR1 n'a pas été réduite (vert). (D2) L'absence de fluorescence ATTO550 indique l'absence de CRISPR-Cas9 fonctionnel dans le cerveau. (D3) Images fusionnées d'anti-mGlutR1 et ATTO550. (E1-E3) montrer la coloration de l'anti-mGlutR1 dans une section du cerveau où mGlutR1 a été définitivement renversé 48 h après injection avec mGlutR1-CRISPR-Cas 9 dans l'ocellus médian. Ainsi, la coloration dans ce cerveau est considérablement réduite en raison du knock-out réussi du mGlutR1 dans de nombreuses cellules. (E2) ATTO550 coloration dans de nombreux noyaux cellulaires dans le cerveau des abeilles indique que l'injection de mGlut1-CRISPR-Cas 9 a été un succès. (E3) Image fusionnée d'ATTO550 (rouge) et anti-mGlutR1 (vert). Barre d'échelle de 10 m (B,C); 100 m (D,E). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Évaluation de l'AIndn modifié et expression de l'ARNm de RDL et de mGlutR1 dans les cerveaux d'abeille 48 h après injection avec 345 nL de RPN CRISPR-Cas9 correspondant. (A) Le test d'essai de chute basé sur qPCR pour évaluer la quantité d'ADNc avec une zone de modification a été calculé à l'aide de la méthode 2-Ct et normalisé contre le contrôle, les cerveaux non injectés. Les données sont exprimées comme étant moyennes - SD. (B) Le test TheqRT-PCR a été utilisé pour évaluer la quantité d'ARNm dans les abeilles injectées et non injectées crispR-Cas9. AmActin a été utilisé comme gène de référence. L'expression relative du gène a été calculée à l'aide de 2 méthodes dect et normalisée contre le contrôle, les cerveaux non injectés. Les données sont exprimées comme moyen - SE. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Exemple de distribution de RNP CRISPR-Cas9 dans le cerveau des abeilles par fluorescence ATTO550. (A-D) Les sections de cerveau de quatre abeilles différentes qui ont exprimé le RDL-CRISPR-Cas9 de RNP dans la cellule de Kenyon du corps de champignon. (E,F) Exemple de deux cerveaux 48 h après injection avec RNPmGlutR1 CRISPR-Cas9. Barre d'échelle de 150 m (A-F). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Discussion
Caractérisation de l'anti-RDL et anti-mGlutR1
Tout d'abord, nous avons caractérisé les anticorps anti-RDL et anti-mGlutR1 par immunoblot et pré-adsorption sur les tranches des cerveaux fixes d'abeille de miel. Chaque anticorps a été fait pour reconnaître tous ses isoformes connus, et l'analyse occidentale montrent qu'ils reconnaissent les bandes qui correspondent à leur poids moléculaire prévu. Ensuite, les deux anticorps ont été bloqués par le peptide conjugué contre lequel ils ont été produits sur des sections de cerveau d'abeille de miel.
L'un des premiers objectifs de notre étude était d'établir que les anticorps produits contre le peptide conjugué spécifique sont spécifiques à sa protéine dans le tissu cérébral fixe. À cette fin, nous avons profité du système CRISPR-Cas9. Nous avons conçu des guides spécifiques pour l'abeille domestique RDL et mGlutR1 et utilisé chacun d'eux pour faire CRISPR-Cas9 étiqueté avec la sonde fluorescente ATTO550. Pour chaque récepteur, nous avons injecté un mélange de trois ribonucléoprotéines CRISPR-Cas9 différentes dans l'ocelli pour réduire la quantité de protéine ciblée dans le cerveau adulte d'abeille domestique en éliminant le gène correspondant dans les cellules qui ont pris notre système Conçu Cas9. Dans notre étude, nous avons accompli cette étape.
L'une des premières étapes cruciales pour le succès de ces expériences est la conception du guide approprié ARN. Nous vous recommandons de concevoir jusqu'à cinq ARN guides, situés au début, au milieu et à la fin de la séquence génétique. Dans le le résultat de nos travaux préliminaires, nous les avons testés dans diverses combinaisons sur trois à cinq abeilles. Nous avons également essayé différentes concentrations d'injections, ainsi que des temps après l'injection, et divers mélanges de RNP dans les injections. Nous avons disséqué les cerveaux et les avons traités à l'aide d'anticorps anti-RDL et anti-mGlutR1. Dans ces premiers tests, nous avons établi la combinaison appropriée, le temps post-injection, ainsi que la concentration et la quantité de CRISPR-Cas9 pour l'injection. Ces premiers tests ont servi de base à la mise en place des expériences que nous avons décrites en détail ici.
L'objectif était double : 1) de démontrer chez une abeille que notre coloration d'anticorps a été réduite après traitement avec CRISPR-Cas9 et 2) pour travailler par les meilleures conditions expérimentales pour des études comportementales. Ainsi, nous montrons que si de nombreux noyaux cellulaires contiennent CRISPR-Cas9 48 h après injection, la réduction de la coloration anti-RDL et anti-mGlutR1 est significative. En outre, cela démontre que les anticorps testés reconnaissent spécifiquement la protéine mGlut1 et RDL dans la préparation du cerveau des abeilles mellifères et qu'ils peuvent être utilisés pour des études de localisation dans le cerveau des abeilles.
Réglage expérimental CRISPR-Cas9 pour l'étude comportementale
Ensuite, nous avons mis en place les expériences afin que CRISPR-Cas9 puisse être utilisé dans des études comportementales. Huit ou neuf abeilles ont été recueillies pour des traitements de contrôle et expérimentaux. Ils ont été examinés comportementalement avant et après l'injection, puis leurs cerveaux ont été traités pour ATTO550 et/ou immunocytochemistry pour déterminer les régions de cerveau qui ont montré la réduction de la protéine cible. Ici, il est essentiel de noter que le nombre d'abeilles prises pour une série d'expériences a été limité à pas plus de 8-9 abeilles pour le contrôle et les conditions expérimentales. De cette façon, les deux conditions pourraient être testées le même jour. Aussi, une fois que nous avons préparé les mélanges CRISPR-Cas9 pour l'injection, nous ne les avons jamais gelés. Le mélange CRISPR-Cas9 n'a pas changé de puissance lorsqu'il est utilisé 3 jours d'affilée et maintenu à 4-8 oC. Cependant, nous ne l'avons pas testé après 3 jours.
Comme nous l'avons décrit dans la section Résultats pour les deux séries d'injections expérimentales et pour les deux anticorps, seulement trois abeilles de 16 testées ont montré une grande distribution ATTO550 dans le corps de champignon, protocerebrum, et lobes d'antenne. Dans toutes les autres abeilles, la distribution de CRISPR-Cas9 était limitée au corps des champignons, au complexe central et/ou au protocerebrum postérieur. Il est essentiel de comprendre pour toutes les études comportementales que l'utilisation de cette méthode d'injection de la réduction de la protéine cible sera limitée uniquement au corps des champignons dans la plupart des abeilles. Il ne s'étendra pas au lobe d'antenne ou au ganglion subesophageal. Ainsi, la technique d'injection que nous utilisons est appropriée pour étudier l'effet de la réduction des récepteurs dans le corps des champignons et le complexe central dans les expériences comportementales, tandis qu'une méthode différente d'introduction CRISPR-Cas9 sera plus approprié pour l'étude d'autres régions du cerveau.
En conclusion, notre étude a démontré l'application réussie de CRISPR-Cas9 comme commande pour la coloration d'anticorps dans le cerveau. Pour les deux anticorps (anti-RDL et anti-mGlutR1), lorsque l'entrée en mGlutR1-CRISPR-Cas9 ou RDL-CRISPR-Cas9 a été couronnée de succès, le niveau de coloration correspondante des anticorps a également été réduit de manière significative. En outre, il est essentiel de noter que l'injection dans l'ocelli a conduit à une distribution de CRISPR-Cas9 dans le cerveau qui n'était pas homogène. La distribution variait d'une zone minimale entourant l'ocelli et le corps des champignons à de nombreuses cellules dans l'ensemble du cerveau. La variabilité de l'apport de mGlutR1-ou de RDL-CRISPR-Cas9 par les cellules était probablement due à la variation des injections. Nos données montrent que le système CRISPR-Cas9 fonctionne chez les abeilles mellifères, mais la méthode d'injection doit être améliorée pour réduire la variabilité de l'apport de CRISPR-Cas9 dans les différents cerveaux d'abeilles. Dans le cadre de ces restrictions, il est maintenant possible d'utiliser cette technique pour manipuler des gènes chez les abeilles adultes pour des expériences comportementales.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été appuyé par les prix suivants à BHS: Human Frontiers Science Program; NIH NIGMS (R01 GM113967); NSF Ideas Lab (1556337). Le peptide et les anticorps de DmGluRA ont été conçus dans le laboratoire Dr Serge Birman (Marseille, Luminy, France) lorsque l'IS a été soutenu par le Programme d'Urgence FRM/Postdocs UFP20060306548 de la Fondation pour la Recherche Médicale. Nous sommes reconnaissants à Daniela Junqueira Marosi et Alex Hanter de Integrated DNA Technology (IDT) pour l'aide à la conception des guides RDL et qPCR essais de dépôt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283_100 mL | western blotting |
| Acrylamide-bis Acrylamide | Bio-Rad | 500 mL 1610156 | western blotting |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A0169-250g | used with distilled water to fix honey bee brain in blocks |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Research Laboratories | 711-546-152 | secondary antibody to reveal the primary antibodies from rabbit |
| Alt-R CRISPR-cas9 tracrRNA-5'ATTO | IDT | 1075934 | with desinged guide RNA, it creates gRNA |
| Alt-R S.p. Cas9 nuclease V3 | IDT | 1081058 | enzyme used to make ribonucleoprotein for CRISPR system |
| Ammonium Persulfate | Bio-RAD | 10 g 1610700 | western blotting |
| Anti-mGlutR1 antibodies | Covalab (FRANCE)/21st Century Biochemical | characterized by authors in present paper | Used for primary incubation of mGlut 1 in honey bees |
| Anti-RDL antibodies | 21st Century Biochemical | characterized by authors in present paper | Used for primary incubation of RDL in honey bees |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | Y0001154 | protease inhibitor |
| Barraquer Iris Scissors 7mm Blade Sharp point | World Precision Instruments | 14128-G | used for dissection honey bee brain |
| Benzamidine | Sigma-Aldrich | 12072 | protease inhibitor |
| Blade (breakable) for blade holder | Fine Science Tool | 10050-00 | dissection for western blotting |
| Blade holder and breaker | Fine Science Tool | 15309 | dissection for western blotting |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100 F | for injection procedure |
| Chemiluminescent western blot detection substrate | Bio-Rad | 1705062 | western blotting |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 472476-50mL | RNA isolation |
| Dithiothreitol | Bio-Rad | 1610611 | western blotting |
| DNA easy kit | QIAGEN | 69504 | DNA extractionuj |
| DNA-free kit | INVITROGEN | AM1907 | Used to remove DNA |
| Eppendorf Research plus pipette, 3-pack | Sigma-Aldrich | Z683884 | |
| Falcon 24 Well Polystyrene Multiwell | Falcon | 351147 | Multiwell |
| Flat Bottom Embedding Capsules, Polyethylene | Electron Microscopy Science | 70021 | basket for brain sections |
| Forceps Dumont #5 (pair) | Fine Science Tool | 11254-20 | for dissection of honey bee brain from the head |
| Forceps Dumont #5S (pair) | Fine Science Tool | 11252-00 | to clean up the brain from trachea befor dissection |
| Gene Expression Master Mix | Integrated DNA Technologies | 1055770 | qPCR drop off assay |
| Glutaraldehyde | EMS | 16220 | used for preparation of peptide conjugates for control peabsorption |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500 mL | western blotting, embedding media |
| Glycine | Bio-Rad | 1610718 | western blotting |
| Hydrophobic filtered nylonmesh | Spectrum Labs | 145910 | for bottom of basket for brain sections |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | I9030-50mL | RNA isolation |
| Keyhole limpet hemocyanin | Sigma-Aldrich | H7017 | used for preparation of conjugates for control |
| LSM800 cofocal microscope | Zeiss | ||
| mGlu_Guide 1 | IDT | designed guide RNA for CRISPR-Cas 9. Target mGlutR1 genome sequences | |
| mGlu_Guide 2 | IDT | designed guide RNA for CRISPR-Cas 9. Target mGlutR1 genome sequences | |
| mGlu_Guide 3 | IDT | designed guide RNA for CRISPR. Target mGlutR1 genome sequences | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | western blotting |
| 96-well PCR microplate | Applied biosystem | 4346907 | qPCR drop off assay and qRT-PCR |
| 384-well PCR microplate | Sigma-Aldrich | Z374911 | qRT-PCR |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904_500mL | for injection procedure |
| Model p87 Flaming Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Capillary Preparation | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | for embedding solution |
| Nanoliter 2000 | World Precision Instruments Nanoliter | Injection Apparatus | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Research Laboratories | AB_2337258 | blocking agent for immunocytochemistry |
| Non-immune Goat Serum | Invitrogen | 50-062Z 100 mL | blocking agent for immunoblotting |
| Nuclease-free buffer | IDT | 1072570 | Nuclease-free buffer that is used in the preparation of CRISPR-Cas9 injection |
| Nuclease-free water | IDT | AM9337 | nuclease -free water that is used in preparation of CRISPR-Cas 9 system |
| OrbitalShaker Mp4 | Genemate | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500 g | used with PBS to make fixative for bee brains |
| Phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626-250 mg | protease inhibitor |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | Used with Paraformaldehyde as fixative; buffer for antibodies |
References
- Harms, D. W., et al. Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System. Current Protocols in Human Genetics. 83 (15), 7-27 (2014).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Kouranova, E., et al. CRISPRs for Optimal Targeting: Delivery of CRISPR Components as DNA, RNA, and Protein into Cultured Cells and Single-Cell Embryos. Human Gene Therapy. 27 (6), 464-475 (2016).
- Schubert, M., et al. Fluorescently labeled tracrRNA provides efficient genome editing while allowing cellular microscopy and FACS analysis. Genome Editing. , www.idtdna.com 1-3 (2017).
- Kucharski, R., Mitri, C., Grau, Y., Maleszka, R. Characterization of a metabotropic glutamate receptor in the honeybee (Apis mellifera): implications for memory formation. Invertebrate Neuroscience. 7 (2), 99-108 (2007).
- Aronstein, K., Auld, V., Ffrench-Constant, R. Distribution of two GABA receptor-like subunits in the Drosophila CNS. Invertebrate Neuroscience. 2 (2), 115-120 (1996).
- Thompson, M., Steichen, J. C., ffrench-Constant, R. H. Conservation of cyclodiene insecticide resistance-associated mutations in insects. Insect Molecular Biology. 2 (3), 149-154 (1993).
- Chung, B. Y., Kilman, V. L., Keath, J. R., Pitman, J. L., Allada, R. The GABA(A) receptor RDL acts in peptidergic PDF neurons to promote sleep in Drosophila. Current Biology. 19 (5), 386-390 (2009).
- Taylor-Wells, J., Hawkins, J., Colombo, C., Bermudez, I., Jones, A. K. Cloning and functional expression of intracellular loop variants of the honeybee (Apis mellifera) RDL GABA receptor. Neurotoxicology. 60, 207-213 (2017).
- Jones, A. K., Sattelle, D. B. The cys-loop ligand-gated ion channel superfamily of the honeybee, Apis mellifera. Invertebrate Neuroscience. 6 (3), 123-132 (2006).
- Dupuis, J. P., et al. Homomeric RDL and heteromeric RDL/LCCH3 GABA receptors in the honeybee antennal lobes: two candidates for inhibitory transmission in olfactory processing. Journal of Neurophysiology. 103 (1), 458-468 (2010).
- Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee. Journal of Neuroscience. 23 (12), 5370-5380 (2003).
- Guo, X., Wang, Y., Sinakevitch, I., Lei, H., Smith, B. H. Comparison of RNAi knockdown effect of tyramine receptor 1 induced by dsRNA and siRNA in brains of the honeybee, Apis mellifera. Journal of Insect Physiology. 111, 47-52 (2018).
- Roth, A., et al. A genetic switch for worker nutrition-mediated traits in honeybees. PLOS Biology. 17 (3), e3000171 (2019).
- Kohno, H., Suenami, S., Takeuchi, H., Sasaki, T., Kubo, T. Production of Knockout Mutants by CRISPR/Cas9 in the European Honeybee, Apis mellifera L. Zoological Science (BIOONE). 33 (5), 505-512 (2016).
- Hu, X. F., Zhang, B., Liao, C. H., Zeng, Z. J. High-Efficiency CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing in Honeybee Apis mellifera Embryos. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (5), 1759-1766 (2019).
- Smith, B. H., Burden, C. M. A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research. Journal of Visualized Experiments. (91), e51057 (2014).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Protein Blotting Guide. , BIO-RAD. http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_2895.pdf (2019).
- Rodriguez, J., Deinhardt, F. Preparation of a semipermanent mounting medium for fluorescent antibody studies. Virology. 12, 316-317 (1960).
- Custom Alt-R® CRISPR-Cas9 guide RNA. , Integrated DNA Technologies. https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM (2019).
- Bonnafe, E., et al. Effect of a thymol application on olfactory memory and gene expression levels in the brain of the honeybee Apis mellifera. Environmental Science and Pollutant Research (International). 22 (11), 8022-8030 (2015).
- Wang, Y., et al. Regulation of behaviorally associated gene networks in worker honeybee ovaries. Journal of Experimental Biology. 215 (Pt 1), 124-134 (2012).
