Summary
يصف البروتوكول وضع علامات محددة على النيوكليويدات الميتوكوندريا مع وصمة عار هلام الحمض النووي المتاحة تجاريًا ، واكتساب سلسلة مرور الوقت من الخلايا الحية المسماة بواسطة المجهر المجهري للإضاءة المهيكلة (SR-SIM) ، والتتبع التلقائي لحركة النيوكليويد.
Abstract
النيوكليويدات الميتوكوندريا هي جزيئات مدمجة تشكلت من جزيئات الحمض النووي الميتوكوندريا المغلفة بالبروتينات. الحمض النووي الميتوكوندريا ترميز tRNAs, rRNAs, والعديد من البولي ببتيدات الميتوكوندريا الأساسية. النيوكليويدات الميتوكوندريا تقسيم وتوزيع داخل شبكة الميتوكوندريا الديناميكية التي تخضع للانشطار / الانصهار وغيرها من التغيرات المورفولوجية. عالية الدقة المجهر الفلوري الحي هو تقنية مباشرة لتوصيف موقف النيوكليويد والحركة. لهذه التقنية، يتم عادة تسمية النيوكليويدات من خلال العلامات الفلورية من مكونات البروتين الخاصة بهم، وهي عامل النسخ أ (TFAM). ومع ذلك، تحتاج هذه الاستراتيجية إلى تعبير مفرط عن بنية فلورية معلمة بالبروتين، والتي قد تسبب القطع الأثرية (المبلغ عنها لـ TFAM)، وغير ممكنة في كثير من الحالات. الأصباغ العضوية الملزمة للحمض النووي ليس لديها هذه العيوب. ومع ذلك، فإنها تظهر دائما تلطيخ من كل من DNAs النووية والميتوكوندريا، وبالتالي تفتقر إلى خصوصية النيوكليويدات الميتوكوندريا. من خلال الأخذ في الاعتبار الخصائص الفيزيائية والكيميائية لهذه الأصباغ ، اخترنا وصمة عار هلام الحمض النووي (SYBR Gold) وحققنا وضع علامات تفضيلية على النيوكليويدات الميتوكوندريا في الخلايا الحية. خصائص الصبغة ، وخاصة سطوعها العالي عند الربط بالحمض النووي ، تسمح بالقياس الكمي اللاحق لحركة النيوكليويد الميتوكوندريا باستخدام سلسلة زمنية من صور الإضاءة المنظمة فائقة الدقة.
Introduction
تشكل جزيئات الحمض النووي الدائرية 16.5 كيلوبت في الثانية المادة الوراثية للالميتوكوندريا، وترميز 22 tRNAs، و2 rRNAs، و 13 polypeptides اللازمة لمجمعات الفوسفور التأكسدي الميتوكوندريا. الميتوكوندريا الحمض النووي ملزمة لالميتوكوندريا عامل النسخ أ (TFAM) والعديد من البروتينات الأخرى تشكل النيوكليويدات الميتوكوندريا1,2,3,4. نقل النيوكليودات الميتوكوندريا وإعادة توزيعها بين مكونات شبكة الميتوكوندريا5,6 خلال إعادة عرض مورفولوجية, الانشطار أو الانصهار اعتمادا على مرحلة دورة الخلية, الإجهاد, وعوامل أخرى (استعرضت في Pernas وآخرون7). بالإضافة إلى ذلك ، فإن حركة النيوكليويدات الميتوكوندريا ، متورطة في مرض الذئبة الليفي ةالجهازية 8 وقد تلعب دورًا في أمراض أخرى. المجهر الفلوري هو تقنية مباشرة لدراسات الخلايا الحية من العضيات ، ولكن هذه التقنية لديها قرار من > 200 نانومتر ، وهو أكبر من حجم النيوكليويدات الميتوكوندريا (~ 100 نانومتر9،10،11،12). وقد تم التحايل على هذا الحد من قبل ما يسمى "فائقة الدقة" تقنيات، مثل تحفيز استنفاد الانبعاثات (STED) والمجهر توطين جزيء واحد (SMLM)13،14. حتى الآن، تم تصوير النيوكليويدات الميتوكوندريا وغيرها من DNAs في الخلايا الحية عن طريق المجهر المباشر إعادة بناء بصري ستوكاستيك (dSTORM)15. لوحظت الهياكل الدقيقة شبه الميتوكوندريا مع مواقف ربط مع mtDNA من قبل STED في الخلايا الحية16. ومع ذلك ، تتطلب هذه التقنيات فائقة الدقة كثافة إضاءة عالية ، مما يسبب تأثيرات سامة ضوئية على الخلايا الحية17. ولذلك، مرور الوقت التصوير من النيوكليويدات الميتوكوندريا مع قرار وراء حد الحيود هو التحدي. لمعالجة هذا، استخدمنا فائقة الدقة المجهر الإضاءة منظم (SR-SIM)18. SIM يتطلب جرعة طاقة الإضاءة أقل بكثير من STED و SMLM19. وعلاوة على ذلك، وعلى النقيض من تقنيات STED وSMLM، SIM يسمح مباشرة متعددة الألوان ثلاثية الأبعاد (3D) التصوير، وأنه لا يتطلب خصائص الفيزياء الضوئية خاصة من الفلوروفوريات أو تكوين عازلة التصوير19.
الاستراتيجية التقليدية لتسمية النيوكليويدات الميتوكوندريا في الخلايا الحية هي وضع علامات الفلورسنت على بروتين النيوكليويد الميتوكوندريا ، مثل TFAM20. ومع ذلك، في كثير من الحالات، هذه الاستراتيجية غير مناسبة. وعلاوة على ذلك، الإفراط في التعبير عن البروتين الفلوري الموسومة TFAM تنتج قطعة أثرية خطيرة21. وضع العلامات على الحمض النووي مع الأصباغ العضوية له مزايا على البروتين الفلوري (FP) القائم على استراتيجية. الأصباغ العضوية خالية من القيود المتعلقة بوضع علامات FP: يمكن استخدامها لأي نوع من الخلايا أو الأنسجة ويمكن تطبيقها في أي وقت من التجربة. وقد تم الإبلاغ عن تصوير الخلايا الحية من النيوكليويدات الميتوكوندريا مع العديد من الأصباغ الملزمة للحمض النووي: DAPI22، SYBR الأخضر23، Vybrant DyeCycle24، وبيكوغرين15،25،26. عيب كبير من معظم الأصباغ الملزمة للحمض النووي لعلامات النوكلويد هو أنها تلطخ كل الحمض النووي داخل الخلية. استهداف صبغة فقط إلى الحمض النووي الميتوكوندريا أمر مرغوب فيه للغاية. لتحقيق ذلك، واختيار دقيق لصبغة تمتلك خصائص فيزيائية كيميائية مناسبة أمر ضروري. ومن المعروف أن الأصباغ الدهنية التي تمتلك شحنة إيجابية غير موضعية ، مثل rhodamine 123 ، تتراكم في الميتوكوندريا الحية ، والتي تحافظ على إمكاناتها السلبية للأغشية. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تربط صبغة مثالية لعلامات محددة من النيوكليويدات الميتوكوندريا الحمض النووي مع تقارب عال وتنبعث منها الفلورسال الساطع على ربط الحمض النووي. وبالنظر إلى هذه المتطلبات، فإن بعض السماويين واعدة (على سبيل المثال، بيكوغرين)، ولكن الحمض النووي ملطخ بوفرة بهذه الأصباغ في وقت واحد مع الحمض النووي الميتوكوندريا15،25،26. يصف هذا البروتوكول وضع علامات محددة على النيوكليويدات الميتوكوندريا في الخلايا الحية مع صبغة سمين أخرى ، SYBR Gold (SG) ، وتتبع النيوكليويدات في الوقت الفاصل فوق الدقة مقاطع فيديو SIM. وعلاوة على ذلك، يمكن تصوير الخلايا الحية الملطخة بـ SG بأي نوع من المجهر الفلوري المقلوب (الكونستبك، قرص الغزل، epifluorescence، وما إلى ذلك) مناسبة للخلايا الحية ومجهزة بمصدر ضوء 488 نانومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: جميع خطوط الخلية المذكورة هنا كانت مثقفة في جلوكوز عالي جلولتكو المعدلة النسر المتوسطة (DMEM) تكملها مع 10٪ مصل البقر الجنين (FBS)، الجلوتامين، البنسلين / العقديات، وبيروفات. معادلة جميع وسائل الإعلام والمكملات الغذائية لاستخدامها في يوم وضع العلامات والتصوير عن طريق الاحترار لهم تصل إلى 37 درجة مئوية في حاضنة تعيين إلى 5٪ CO2. جميع العمل ثقافة الخلية بما في ذلك وضع العلامات تجري في ظروف معقمة تحت غطاء تدفق لامي.
1. يعيش خلية وضع العلامات
- قبل يوم واحد من إجراء وضع العلامات، والثقافة 4 × 105 خلايا هيلا في 2 مل من المتوسط في طبق بيتري 35 ملم مع #1.5 قاع الزجاج. يمكن استخدام الشرائح ذات الغرف المتعددة، ولكن يجب تعديل وحدات التخزين بشكل متناسب مع حجم البئر. تمييع تعليق الخلية إلى ما يقرب من 50،000 خلية / مل والبذور 2 مل من تعليق الخلية في طبق بيتري 35 ملم.
- إعداد التخفيفات التالية من SYBR الذهب (SG) حل الأسهم التجارية: 1:5,000. إعداد Mitotracker الأحمر العميق (بقعة حمراء بعيدة) أو Mitotracker CMXRos الأحمر (وصمة عار حمراء)(جدول المواد؛الأسهم التجارية المخفف1:2000) في المتوسط ثقافة خالية من الحمراء الفينول. إعداد نفس مجموعة تخفيف بيكوغرين كما لSG.
ملاحظة: الحلول الموضحة في الخطوة 1.2 هي حلول وضع العلامات 2x. حماية جميع الحلول التي تحتوي على الأصباغ الفلورية من الضوء قدر الإمكان. - غسل الخلايا الملتصقة مع 2 مل PBS مرة واحدة. أضف 1 مل من الثقافة الخالية من الفينول الحمراء إلى طبق بيتري 35 مم. بالنسبة للشريحة ذات 8 غرف ذات الغرف بشكل جيد، استخدم وحدة تخزين تساوي 1/2 من إجمالي سعة البئر (على سبيل المثال، أضف 125 ميكرولتر إذا كانت القدرة الإجمالية للبئر 250 ميكرولتر).
- أضف 1 مل من محلول وضع العلامات 2x الذي تم إعداده في الخطوة 1.2 إلى 35 مم طبق بيتري. بالنسبة لشريحة ذات 8 غرف جيدة، استخدم وحدة تخزين تساوي 1/2 من إجمالي سعة البئر. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.
ملاحظة: لا تحتضن الخلايا مع حل تسمية SG لفترة أطول من 1 ساعة، لأن أطول الحضانة سوف يسبب وضع العلامات من الحمض النووي. - يستنشق بعناية المتوسطة التي تحتوي على الأصباغ الفلورية وغسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
- أضف متوسط ثقافة الخلايا الخالية من الفينول الحمراء والحفاظ على الخلايا في الظلام في حاضنة CO2 عند 37 درجة مئوية حتى التصوير.
- صورة الخلايا الحية على المجهر SR-SIM مجهزة بوحدة حضانة (انظر أدناه).
2. SR-SIM صورة اقتناء
- تثبيت حاضنة المرحلة الأعلى على مرحلة المجهر. تعيين درجة الحرارة المطلوبة وتركيز ثاني أكسيد الكربون2 (على سبيل المثال، 37 درجة مئوية و 5٪ لخلايا الثدييات) والحفاظ على الدفء لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل البدء في الحصول على الصورة.
- قم بتشغيل جميع مكونات مجهر SR-SIM، بما في ذلك الليزر، واتركها للإحماء لمدة ساعة واحدة على الأقل.
- اختيار التكبير عالية، فتحة رقمية عالية (NA) هدف الغمر (على سبيل المثال، 100x 1.46 زيت NA) الموصى بها لSR-SIM من قبل الشركة المصنعة المجهر.
- قم بتثبيت شريحة مغرفة أو طبق 35 مم مع خلايا تحمل علامة (من الخطوة 1.6) على مرحلة المجهر المحتضن.
- تحديد موقع المنطقة ذات الاهتمام على العينة، ويفضل أن يكون ذلك مع oculars. لتحقيق أفضل جودة تصوير SR-SIM، اختر الخلايا التي ترتبط بشكل جيد بالزجاج.
- استخدم كاميرا إلكترونية عالية المنتثة ذات التكلفة الخلفية تضاعف الجهاز المقترن بالشحن (EM-CCD) للحصول على صور SR-SIM.
- باستخدام برنامج الحصول على الصور، قم بتعيين مكسب EM مرتفع موصى به للكاميرا المستخدمة (على سبيل المثال، 300).
- قبل الحصول على سلسلة الفاصل الزمني لتتبع النيوكليويد، والحصول على صورة ذات لونين SR-SIM من نفس مجال الرؤية: قناة واحدة لتلطيخ الميتوكوندريا وآخر لSG. تعيين قناة اللون الأول المناسب لوصمة عار الميتوكوندريا المستخدمة (على سبيل المثال، لبقعة الميتوكوندريا الحمراء البعيدة، تعيين الإثارة في 633 نانومتر أو أكثر ومرشح الانبعاثات longpass 650 نانومتر). بالنسبة لإشارة SG، قم بتعيين الإثارة على 488 نانومتر وفلتر انبعاثات بانباس 500-550 نانومتر.
- باستخدام البرنامج، تعيين أدنى قوة ليزر ممكن لكلا 488 نانومتر وخطوط وصمة عار حمراء بعيدة.
ملاحظة: الإعداد النموذجي هو 1٪ ليزر انتاج الطاقة المعدلة من قبل acousto البصرية القابلة للتبضع مرشح (AOTF). - إذا كان مجهر SIM يكتسب القنوات بشكل تسلسلي فقط (إعداد كاميرا واحدة)، فقم بإيقاف تشغيل قناة اكتشاف البقع الحمراء البعيدة.
- تعيين الحصول على مستوى بؤري واحد عن طريق إيقاف تشغيل اقتناء Z-stack عن طريق إلغاء تحديد مربع Z-Stack في البرنامج.
- تعيين أقصر وقت ممكن التعرض الكاميرا EM-CCD.
- تعيين ثلاثة دوران للشبكة بدلا من خمسة دوران.
- لزيادة معدل الإطار، في علامة التبويب اقتناء البرنامج، تعيين الكاميرا لقراءة البيانات فقط من المنطقة المركزية من استشعار الكاميرا بدلا من"رقاقة كاملة".
ملاحظة: على سبيل المثال، يسمح التحول من قراءة مساحة 1000 × 1000 بكسل بمستشعر كامل إلى قراءة 256 × 256 بكسل فقط بتقليل وقت التعرض للكاميرا من 50 مللي ثانية إلى 13.4 مللي ثانية ووقت الإطار الإجمالي من 1.8 ثانية إلى 1.2 ثانية. إذا تم قراءة جزء مركزي فقط من مستشعر الكاميرا ، فسيكون مجال الرؤية صغيرًا جدًا لهدف 63x أو 100x المستخدم عادةً لـ SR-SIM. وسيؤدي قصر وقت التعرض إلى تقليل نسبة الإشارة إلى الضوضاء في الصور. - تحسين طاقة الليزر ووقت التعرض للكاميرا: احصل على صور ذات أبعاد ثنائية (2D) لخلايا تحمل علامة SR-SIM (2D) في العديد من قيم طاقة الليزر (على سبيل المثال، 0.5٪، 1٪، 1.5٪، 2٪) وعدة مرات التعرض (على سبيل المثال، 13.4 مللي ثانية، 25 مللي ثانية، 50 مللي ثانية).
- معالجة مجموعات بيانات SIM الخام (انظر الخطوة 3.1).
- اختر أوقات تعرض طاقة الليزر والكاميرا التي تنتج صور SIM مع نقاط مضيئة في الميتوكوندريا (أي النيوكليويدات) مع القليل من القطع الأثرية الناتجة عن معالجة SIM أو عدم وجودها. فحص المناطق خارج الميتوكوندريا (على سبيل المثال، 1٪ قوة ليزر الحالة الصلبة 488 نانومتر والتعرض 25 مللي ثانية من كاميرا EM-CCD).
- ابدأ في الحصول على سلسلة الفاصل الزمني باستخدام الإعدادات المحسنة في الخطوات 2.15-2.17.
3- معالجة البيانات وتحليلها
- معالجة مجموعات بيانات SIM الخام مع وحدة الإضاءة المنظمة من برنامج مناسب(جدول المواد):اختر خانة الاختيار التلقائية لمعلمات معالجة SIM. للمعالجة التلقائية لملفات متعددة، استخدم أداة معالجة الدُفعات، وفك تحديد استخدام التيار للدفعة،وانقر فوق تشغيل الدفعي وحدد ملفات متعددة لمعالجة بطاقة SIM.
- تحويل مجموعات البيانات سلسلة زمنية معالجة SIM إلى تنسيق ims مع برنامج محول الملفات Imaris (أي الإصدار المطابق لإصدار برنامج Imaris).
- افتح ملفًا محولًا في البرنامج (الإصدار 8.4.1 أو أحدث) يحتوي على ترخيص لوحدة النسب (أو المسار).
- بدء"البقع"إنشاء المعالج بالنقر فوق إضافة بقع جديدة رمز. سيتم تشغيل معالج للإنشاء.
- اختر علامة التبويب إنشاء المعالج.
- في الخطوة الأولى من المعالج، انقر فوق نقاط المسار (مع مرور الوقت) ثم انتقل إلى الخطوة الثانية من المعالج.
- تعيين قطر XY المقدر إلى 0.1-0.15 ميكرون، انقر فوق طرح الخلفية والمتابعة إلى الخطوة الثالثة.
- ضبط عتبة في مرشح"الجودة"عن طريق سحب الخط الرأسي في الرسم البياني بحيث يتم الكشف عن غالبية النيوكليويدات كـ "بقع"، في حين لا يتم الكشف عن القطع الأثرية (أي يتم وضع علامة على البقع المكتشفة ككرات متراكبة على الصورة). تحقق مما إذا كان هذا هو الحال على كل إطار وإعادة تعديل العتبة إذا لزم الأمر. انتقل إلى الرابع ثم إلى الخطوة الخامسة من المعالج.
- اختر خوارزمية الحركة التلقائية. تعيين المسافة القصوى إلى 0.5 ميكرون. تعيين حجم الفجوة القصوى إلى 0.
- ننظر في كل إطار في السلسلة الزمنية والتحقق مما إذا كان يتم رسمها أي مسارات كاذبة وإذا تم تقديم أي ثغرات بين المسارات (يتم وضع علامة على المسارات التي بناها المعالج مع الإعدادات الحالية على الفور كخطوط متراكبة على الصورة). ضبط"المسافة القصوى"إذا لزم الأمر. انتقل إلى الخطوة السادسة من المعالج. اختر عامل تصفية مدة المسار وحدد عتبة 3-5 s.
- إذا لم تكن البقع أو المسارات المكتشفة حاليًا مثالية، فعد إلى الخطوات السابقة للمعالج باستخدام أزرار التنقل (في أسفل إطار المعالج) اللازمة لضبط أي معلمة لإنشاء البقع أو المسارات.
- عندما تسمح المعلمات الدقيقة للبرنامج بالكشف عن جميع البقع وبناء المسارات بشكل صحيح، انقر فوق زر التنقل في السهم الأخضر في المعالج لتأكيد إنشاء المسارات.
- استخراج إحصائيات المسارات بالنقر فوق إطار رمز الإحصائيات. اختر معلمات الإحصائيات المطلوبة (علامات تبويب القيم التفصيلية والمتوسط تحت الإحصائيات)وقم بتصدير القيم كملفات CSV بالنقر فوق رمز محرك الأقراص المرن للقياس الكمي والتصور.
ملاحظة: الحد الأقصى لسرعة المسار ، وسرعة المسار المتوسط ، وطول المسار ، وإزاحة المسار هي أمثلة على المعلمات المهمة. - إذا كانت مجموعة بيانات الصور تحتاج إلى تقديم أو نشر، فقم بإنشاء لقطات و/أو ملفات فيديو تمثل سلسلة الفاصل الزمني مع مسارات متراكبة اختياريًا باستخدام أدوات اللقطة أو الرسوم المتحركة.
4. الحصول على صورة Confocal
- قم بتركيب حاضنة على خشبة المسرح على مرحلة المجهر، وحدد درجة الحرارة المطلوبة وتركيز ثاني أكسيد الكربون2 (أي 37 درجة مئوية و5٪ لخلايا الثدييات) والحفاظ على الدفء لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل البدء في الحصول على الصورة.
- قم بتشغيل جميع مكونات مجهر المسح بالليزر البؤري، بما في ذلك الليزر، واتركه للإحماء لمدة ساعة واحدة على الأقل.
- اختيار الهدف المطلوب من منتصف إلى ارتفاع التكبير وأخذ العينات المكانية وفقا لمعايير Nyquist.
- بالنسبة لقناة SG، حدد الإثارة على 488 نانومتر ونطاق كشف يتراوح بين 500 و550 نانومترًا. لقناة البقعة الميتوكوندريا، تعيين إلى 561 نانومتر و 570-630 نانومتر الانبعاثات لصبغة حمراء، أو 633 نانومتر الإثارة و > 650 نانومتر الانبعاثات لصبغة حمراء بعيدة.
- تعيين أدنى طاقة ليزر ممكنة (عادة 1٪ أو أقل) التي تسمح بالحصول على الإشارات مع مكاسب كاشف PMT من 700 mV.
- الحصول على صور بؤرية لونين من الخلايا، حيث يتم الكشف عن النيوكليويدات الميتوكوندريا في "قناة SG" ويتم الكشف عن الميتوكوندريا في قناة "الأحمر" أو "الأحمر الأقصى".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
توصيف تسمية الخلايا الحية مع SG
أولاً ، تميز توزيع SG في الخلايا عند الحضانة مع الصبغة عند تخفيفات مختلفة بالمجهر المحوري. بعد الحضانة مع تركيزات عالية من SG أو بيكوغرين، كل من الأصباغ وصفت في الغالب النوى وأظهرت تلطيخ punctate في السيتوبلازم(الشكل 1)،وبالمثل البيانات المنشورة لصبغة أخرى السيانين مشحونة بشكل إيجابي (أي بيكوغرين)15. ومع ذلك ، عند الحضانة مع SG في 1:10،000 تخفيف ، ظهر تلطيخ خافت في النوى ، بينما في السيتوبلازم ، لاحظنا نمطًا من النقاط المضيئة(الشكل 1). من ناحية أخرى ، فإن الحضانة مع صبغة بيكوغرين المخففة 1:10،000 أسفرت في الغالب عن تلطيخ نووي. كانت إشارة SG أكثر إشراقًا بكثير من إشارة بيكوغرين بنفس التركيز. وأظهرت البيانات أن SG هو أكثر ملاءمة لتصوير الحمض النووي الميتوكوندريا من غيرها من الأصباغ الملزمة الحمض النووي مماثلة.
للتأكد من أن النقاط الزاهية مترجمة في الميتوكوندريا ، قمنا بتلوين الخلايا الحية في وقت واحد مع SG وبقعة الميتوكوندريا الحمراء البعيدة. هذا الأخير هو صبغة عضوية قابلة للنفاذية خلية مشحونة بشكل إيجابي التي تتراكم في الميتوكوندريا من الخلايا الحية. عند الحضانة مع SG في 1:10،000 و 1:50،000 التخفيف ، حدث ما يقرب من جميع تلطيخ SG في الميتوكوندريا ، بينما عند وضع العلامات في 1:500 و 1:000 تخفيف ، حدث تلطيخ كبير للنواة والسيتوبلازم(الشكل 2).
علاوة على ذلك ، تميزنا بالمسار الزمني لتلطيخ الخلايا الحية مع SG عن طريق المجهر الفاصل الزمني(الشكل 3). المؤامرات من كثافة الفلورسال SG في الميتوكوندريا مقابل الوقت(الشكل 3B)اقترح أنه بعد 45 دقيقة، وتلطيخ النيوكليويد كان على مقربة من التشبع. وهكذا، نوصي مرات الحضانة من ~ 30-60 دقيقة.
اختبرنا كيف يتغير توزيع SG داخل الخلايا عند التثبيت و / أو permeabilization من الخلايا. تسبب التثبيت (2٪ من بارافورماديهايد [PFA]) للخلايا الملطخة بالهواء الحي في إعادة توزيع طفيفة للصبغة على النواة(الشكل 4A, B). Permeabilization من الخلايا الثابتة (0.1٪ تريتون X100) القضاء على نمط SG منقط في الميتوكوندريا، وتلطيخ النوى كانت مهيمنة(الشكل 4C). إذا تمت إضافة SG إلى الخلايا بعد التثبيت والبسمة ، فقد تم توزيعها بشكل موحد عبر السيتوبلازم والنوى(الشكل 4D). وبالتالي ، يمكن إصلاح الخلايا المسماة SG إذا لزم الأمر ، ولكن الصبغة ليست مناسبة للبروتوكولات التي تتطلب التبرّب.
خلية حية SR-SIM وتتبع النيوكليويدات الميتوكوندريا
الخلايا الحية كوستامع SG وبقعة الميتوكوندريا الحمراء البعيدة(جدول المواد)تم صورة 3D من قبل تقنية SIM فائقة الدقة. كما هو الحال في الصور المحورية(الشكل 2)، ظهرت النيوكليويدات الميتوكوندريا كنقاط مضيئة داخل الميتوكوندريا(الشكل 5A). علاوة على ذلك ، حصلنا على سلسلة زمنية من صور SIM 2D وتتبعنا مواضع النيوكليويدات بدقة تتجاوز حد الحيود. مباشرة قبل البدء في سلسلة الوقت حصلنا على أكوام SIM 3D في SG وقنوات وصمة عار الميتوكوندريا. ثم حصلنا على سلسلة زمنية في قناة SG فقط وتتبع ناوكليويدات الميتوكوندريا من أجل تحديد تحركاتها. وكان متوسط سرعة المسار 0.042 ميكرومتر/سنة، وكانت السرعة الفورية القصوى للمسار 0.078 ± 0.012 ميكرومتر/سنة. لم معظم النيوكليويدات لا تشريد بعيدا عن مواقعها الأصلية ولكن أظهرت حركات عشوائية قصيرة المسافة التي ربما كانت تقتصر على شبكة الميتوكوندريا، كما يشير تراكب المسارات على الصور الميتوكوندريا(الشكل 5B). حدث عدد قليل من عمليات الإزاحة السريعة خلال سلسلة زمنية نموذجية(فيلم 1).
الشكل 1: مقارنة بين بيكوغرين وSG تسمية الخلايا الحية. تم احتضان الخلايا A549 مع بيكوغرين أو SG في التخفيفات المشار لها والصورة. حقول عرض تمثيلية للخلايا المسماة في القناة الخضراء. LSM880 Airyscan FAST، 20x/الهواء الهدف، شريط مقياس = 50 ميكرون. أقسام بصرية واحدة. المربعات البيضاء علامة على المناطق المعروضة في التكبير أعلى إلى يمين حقول العرض 423 × 423 ميكرومتر بأكملها. بالنسبة إلى 1:1000 و1:2000 تم عرض نفس الصور في ضبطين للسطوع: إعدادات السطوع "الافتراضية" المحسنة للتخفيف 1:10,000، وضبط إعدادات "تقليل السطوع" التي تم ضبطها لتجنب تشبع الكاشف. وقد عُدِّل هذا الرقم من جيفتيك وآخرون27. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: توطين SG في الخلايا الحية عند وضع العلامات بتركيزات مختلفة. وقد احتضنت خلايا هيلا لمدة 30 دقيقة مع خليط من 0.25 ميكرون ميتوتراكر CMXRos الأحمر والتخفيف المشار SG. تم استبدال الحل بـ DMEM ، وتم الحصول على الصور على مجهر LSM880 Airyscan ، هدف 63x 1.4 النفطي ، مع اكتساب تسلسلي للقنوات الملونة. وتظهر شرائح بصرية واحدة شريط مقياس = 10 ميكرون). وقد عُدِّل هذا الرقم من جيفتيك وآخرون27. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: خلايا هيلا أثناء وضع العلامات مع الذهب SYBR (SG). أولا، وصفت خلايا هيلا الحية مع MItotracker CMXRos الأحمر وغسلها. تم إضافة SG (التخفيف النهائي 1:10,000 في DMEM) إلى الخلايا وتم الحصول على سلسلة مرور زمني. LSM880 المجهر، 63x 1.4 هدف النفط، اقتناء متتابعة. تم الحصول على أكوام Z في كل نقطة زمنية. يتم عرض إسقاطات الحد الأقصى للكثافة. (أ)متوسط كثافة الفلورسال SG مع مرور الوقت في عدة مناطق ذات أهمية. (ب)مجالات عرض تمثيلية تبين المناطق ذات الاهتمام حيث تم قياس مفلورة SG (مستطيلات ملونة). (ج)مجال الرؤية في عدة نقاط زمنية أثناء الحضانة مع SG. تظهر منطقة مربعة تحمل خط ًا أبيض ًا عند تكبير أعلى في العمود الأيمن. وقد عُدِّل هذا الرقم من جيفتيك وآخرون27. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تأثير التثبيت والتطفل على توطين SG في الخلايا. كانت خلايا HeLa ملطخة بـ SG (الأسهم المخففة 1:10,000) وMitotracker CMXRos Red (0.25 ميكرومتر) لمدة 30 دقيقة. تم الحصول على شرائح بصرية واحدة على مجهر قرص الغزل. اقتناء متتابع؛ شريط مقياس = 10 ميكرون . (أ) خلايا هيلا الحية الملطخة SG. (ب)يعيش خلايا هيلا ملطخة SG ومن ثم ثابتة مع 2٪ PFA في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة.(C)يعيش هيلا الخلايا الملطخة SG، ثم ثابتة مع 2٪ PFA في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة وpermeabilized مع 0.1٪ تريتون X100 لمدة 15 دقيقة. على اللوحة السفلية، يتم عرض نفس الصورة، ولكن يتم تعيين السطوع في القناة الخضراء أعلى. (D)خلايا هيلا ثابتة مع 2٪ PFA، permeabilized مع 0.1٪ تريتون X100 لمدة 15 دقيقة، ومن ثم ملطخة SG وMitotracker CMXRos الأحمر. للحصول على الصور المعروضة في (D) ، تم تقليل مكسب EMCCD للكاميرا للقناة الخضراء بعامل 12 بالمقارنة مع A-C لتجنب التعرض المفرط. وقد عُدِّل هذا الرقم من جيفتيك وآخرون27. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تتبع نوكلويد على صور SIM الحية. صور تمثيلية لحقل رؤية الخلايا الملونة SG. أسفل: صورة SIM ذات لونين تم التقاطها قبل الحصول على سلسلة الفاصل الزمني. الأخضر = قناة SG؛ أرجواني = قناة mitotracker. الأعلى: مسارات النيوكليويد من سلسلة زمنية SIM 50 إطارًا في قناة SG(الفيلم 1)؛ إطار الوقت = 1.8 s; تتبع من قبل Imaris 8.4.1 البرمجيات. المسارات مشفرة بالألوان بواسطة أقصى سرعة مسار (μm/s)؛ Elyra PS.1، وضع SIM، 100x/1.46 هدف النفط؛ شريط المقياس = 10 ميكرومتر. وقد عُدِّل هذا الرقم من جيفتيك وآخرون27. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الفيلم 1: سلسلة الفاصل الزمني SIM تظهر الخلايا G-الملونة الممثل. شريط مقياس = 5 ميكرون. تم وضع علامة على النيوكليويدات الميتوكوندريا المكتشفة كمجالات بيضاء. يتم تصور المسارات على أنها "ذيول التنين" (8 إطارات طول) وترميز اللون وفقا لسرعاتها الفورية القصوى (شريط اللون في أسفل اليمين يظهر سرعات في μm / s). تتبع النيوكليودات الميتوكوندريا والتصور من قبل Imaris 8.4.1 البرمجيات. وقد نشر هذا الفيديو في جيفتيك وآخرون27. يرجى الضغط هنا لمشاهدة هذا الفيديو (انقر على الحق للتحميل).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هناك العديد من المكونات الحاسمة للبروتوكول: لتحقيق وضع العلامات التفضيلية للحمض النووي الميتوكوندريا ، يجب أن يبقى تركيز صبغة الحمض النووي الملزمة أثناء الحضانة منخفضًا جدًا (على سبيل المثال ، تمييع 1:10000 من مخزون تجاري نموذجي) ، وينبغي أن يكون وقت الحضانة 30 دقيقة. يجب ألا يتجاوز وقت الحضانة 1 ح. يجب استخدام صبغة الذهب SYBR؛ الأصباغ الأخرى الملزمة للحمض النووي ليست مشرقة بما يكفي لتوليد إشارة قوية عند وضع العلامات على تركيز منخفض.
الحد من بروتوكول لدينا هو أن يتم غسلها من الصبغة الميتوكوندريا النيوكليويدات خلال خطوة permeabilization. لذلك ، فإن الإجراء الموصوف غير مناسب لبروتوكولات الفلور المناعة التقليدية. في هذه الحالة، يمكن تسمية النيوكليويدات في الخلايا الثابتة بكفاءة مع تقنيات أخرى، مثل الأجسام المضادة ضد الحمض النووي أو عوامل النسخ الميتوكوندريا (TFAM).
وضع العلامات المباشرة للنيوكليويدات الميتوكوندريا مع صبغة الحمض النووي العضوية ملزمة له مزايا على تسمية البروتين الفلوري: أي نوع من الخلايا يمكن أن توصف داخل <1 ح, دون قيود الزمنية أو غيرها من التعبير عابرة أو مستقرة من البنى الفلورسنت الموسومة البروتين. أيضا، في البروتوكولات الحالية، تم الإبلاغ التقليدية الفلورسنت البروتين العلامات من TFAM ليسبب القطع الأثرية. وعلاوة على ذلك، SG بكفاءة البقع النيوكليويدات فقط إذا كان احتمال غشاء الميتوكوندريا سليمة. وهذا يمنع الحصول على صورة من الخلايا "المريضة" والميتة غير ذات الصلة بيولوجيا، والتي لا يمكن تجنبها مع تلطيخ المستندة إلى FP. وأخيرا، لم تحقق البروتوكولات المنشورة سابقا على أساس الأصباغ الملزمة للحمض النووي تلطيخ تفضيلية للحمض النووي الميتوكوندريا.
البروتوكول المقترح سريع وبسيط ، وبالتالي نفترض أنه سيتم استخدامه على نطاق واسع للتصوير الحي من النيوكليويدات الميتوكوندريا من خلال تقنيات الفلورسينس المختلفة ، وكلاهما محدود التيود (على سبيل المثال ، مركز المسح بالليزر ، TIRF ، إلخ) وكذلك SIM فائقة الدقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
يعترف المؤلفان بأسيفا أختار وأنجيليكا رامبولد (كل من معهد ماكس بلانك لعلم المناعة وعلم الوراثة اللاجينية) لتوفير خلايا هيلا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Elyra PS1 | Carl Zeiss | multi-modal super-resolution microscope containing module for super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM) | |
| High glucose DMEM | GIBCO/ThermoFisher | 31966021 | |
| ibidi 35 mm dish, glass bottom | Ibidi Gmbh | 81158 | |
| ibidi 8-well microSlide, glass bottom | Ibidi Gmbh | 80827 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane/Oxford Instruments | image porcessing and visualisation software package | |
| iXon 885 | Andor Technologies | EMCCD camera with back-illuminated sensor | |
| LSM880 Airyscan | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope with array detector | |
| Mitotracker CMXRos Red | ThermoFischer | M7512 | red live cell mitochondrial stain |
| Mitotracker Deep Red FM | ThermoFischer | M22426 | far red live cell mitochondrial stain |
| picoGreen | ThermoFischer | P7581 | cell permeant DNA stain |
| Plan Apochromat 100x/1.46 Oil objective | Carl Zeiss | ||
| SYBR Gold | ThermoFischer | S11494 | cell permeant DNA stain |
| Zen Black 2012 software | Carl Zeiss | image acquisition and processing software |
References
- Kaufman, B. A., et al. The mitochondrial transcription factor TFAM coordinates the assembly of multiple DNA molecules into nucleoid-like structures. Molecular Biology of the Cell. 18 (9), 3225-3236 (2007).
- Farge, G., et al. Protein sliding and DNA denaturation are essential for DNA organization by human mitochondrial transcription factor A. Nature Communications. 3, 1013 (2012).
- Bogenhagen, D. F. Mitochondrial DNA nucleoid structure. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 914-920 (2012).
- Kang, D., Kim, S. H., Hamasaki, N. Mitochondrial transcription factor A (TFAM): roles in maintenance of mtDNA and cellular functions. Mitochondrion. 7 (1-2), 39-44 (2007).
- Tauber, J., et al. Distribution of mitochondrial nucleoids upon mitochondrial network fragmentation and network reintegration in HEPG2 cells. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (3), 593-603 (2013).
- Garrido, N., et al. Composition and dynamics of human mitochondrial nucleoids. Molecular Biology of the Cell. 14 (4), 1583-1596 (2003).
- Pernas, L., Scorrano, L. Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function. Annual Review of Physiology. 78, 505-531 (2016).
- Caielli, S., et al. Oxidized mitochondrial nucleoids released by neutrophils drive type I interferon production in human lupus. Journal of Experimental Medicine. 213 (5), 697-713 (2016).
- Okayama, S., Ohta, K., Higashi, R., Nakamura, K. Correlative light and electron microscopic observation of mitochondrial DNA in mammalian cells by using focused-ion beam scanning electron microscopy. Microscopy (Oxf). 63 (Suppl 1), i35 (2014).
- Alan, L., Spacek, T., Jezek, P. Delaunay algorithm and principal component analysis for 3D visualization of mitochondrial DNA nucleoids by Biplane FPALM/dSTORM. European Biophysics Journal. 45 (5), 443-461 (2016).
- Kukat, C., et al. Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).
- Kukat, C., Larsson, N. G. mtDNA makes a U-turn for the mitochondrial nucleoid. Trends in Cell Biology. 23 (9), 457-463 (2013).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Benke, A., Manley, S. Live-cell dSTORM of cellular DNA based on direct DNA labeling. ChemBioChem. 13 (2), 298-301 (2012).
- Ishigaki, M., et al. STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells. Mitochondrion. 28, 79-87 (2016).
- Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
- Gustafsson, M. G., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Hirano, Y., Matsuda, A., Hiraoka, Y. Recent advancements in structured-illumination microscopy toward live-cell imaging. Microscopy (Oxf). 64 (4), 237-249 (2015).
- Brown, T. A., et al. Superresolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Molecular and Cellular Biology. 31 (24), 4994-5010 (2011).
- Lewis, S. C., Uchiyama, L. F., Nunnari, J. ER-mitochondria contacts couple mtDNA synthesis with mitochondrial division in human cells. Science. 353 (6296), aaf5549 (2016).
- Dellinger, M., Geze, M. Detection of mitochondrial DNA in living animal cells with fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 204 (Pt 3), 196-202 (2001).
- Ban-Ishihara, R., Ishihara, T., Sasaki, N., Mihara, K., Ishihara, N. Dynamics of nucleoid structure regulated by mitochondrial fission contributes to cristae reformation and release of cytochrome c. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11863-11868 (2013).
- Zurek-Biesiada, D., et al. Localization microscopy of DNA in situ using Vybrant((R)) DyeCycle Violet fluorescent probe: A new approach to study nuclear nanostructure at single molecule resolution. Experimental Cell Research. 343 (2), 97-106 (2016).
- He, J. Y., et al. The AAA(+) protein ATAD3 has displacement loop binding properties and is involved in mitochondrial nucleoid organization. Journal of Cell Biology. 176 (2), 141-146 (2007).
- Ashley, N., Harris, D., Poulton, J. Detection of mitochondrial DNA depletion in living human cells using PicoGreen staining. Experimental Cell Research. 303 (2), 432-446 (2005).
- Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S. V. SYBR Gold dye enables preferential labeling of mitochondrial nucleoids and their time-lapse imaging by structured illumination microscopy. PLoS One. 13 (9), e0203956 (2018).
