Протокол описывает специфическую маркировку митохондриальных нуклеоидов с коммерчески доступным пятном геля ДНК, приобретение временной промежутки серии живых помеченных клеток с помощью сверх-разрешения структурированной иллюминаторной микроскопии (SR-SIM) и автоматическое отслеживание движения нуклеоидов.
Митохондриальные нуклеоиды – это компактные частицы, образованные молекулами митохондриальной ДНК, покрытыми белками. Митохондриальная ДНК кодирует тРНК, рРНК и несколько основных митохондриальных полипептидов. Митохондриальные нуклеоиды делятся и распределяются в динамической митохондриальной сети, которая подвергается делению/слиянию и другим морфологическим изменениям. Высокое разрешение живой флуоресценции микроскопии является простой метод, чтобы охарактеризовать положение и движение нуклеоидов. Для этого метода, нуклеоиды обычно помечены через флуоресцентные метки их белковых компонентов, а именно транскрипционный фактор a (TFAM). Тем не менее, эта стратегия нуждается в переэкспрессии флуоресцентного белка помечены построить, что может привести к артефактов (сообщил и для TFAM), и не представляется возможным во многих случаях. Органические ДНК-связывающие красители не имеют этих недостатков. Тем не менее, они всегда показывают окрашивание как ядерных, так и митохондриальных ДНС, при этом не хватает специфичности митохондриальных нуклеоидов. Принимая во внимание физико-химические свойства таких красителей, мы выбрали пятно геля нуклеиновой кислоты (SYBR Gold) и добились преференциальной маркировки митохондриальных нуклетодов в живых клетках. Свойства красителя, в частности его высокая яркость при привязке к ДНК, позволяют последующую количественную оценку движения митохондриальных нуклеоидов с использованием временных рядов структурированных изображений освещения супер-разрешения.
Циркулярные молекулы ДНК 16,5 кбит/с составляют генетический материал митохондрий, кодирующих 22 тРНК, 2 РНК и 13 полипептидов, необходимых для митохондриальных окислительных фосфорилированных комплексов. Митохондриальная ДНК связана с митохондриальным транскрипционным фактором а (TFAM) и несколькими другими белками, образующих митохондриальные нуклеоиды1,,2,,3,4. Митохондриальные нуклеоиды перемещаются и перераспределяются между компонентами митохондриальной сети5,,6 во время его морфологической реконструкции, деления или синтеза в зависимости от фазы клеточного цикла, стресса и других факторов (рассмотрено в Pernas et al.7). Кроме того, движение митохондриальных нуклеоидов, замешано в системной волчанке эритематосовой болезни8 и может играть определенную роль в других заболеваниях. Флуоресценция микроскопия является простой метод для живых клеток исследования органелл, но техника имеет разрешение йgt;200 нм, который больше, чем размер митохондриальных нуклеоидов (100 нм9,10,11,12). Этот предел был обойден так называемыми методами «суперразрешения», такими как стимулируемое истощение выбросов (STED) и микроскопия локализации одной молекулы (SMLM)13,14. До сих пор митохондриальные нуклеоиды и другие ДНК были изображены в живых клетках прямой стохастической оптической реконструкцией микроскопии (dSTORM)15. Тонкие субмитохондриальные структуры с позициями, коррелирующие с мтДНК, наблюдались STED в живых клетках16. Тем не менее, эти супер-разрешение методы требуют высокой интенсивности освещения, что вызывает фототоксическое воздействие на живые клетки17. Таким образом, промежуток времени изображения митохондриальных нуклеоидов с разрешением за пределы дифракции является сложной задачей. Для решения этой проблемы мы использовали сверхразрешение структурированной иллюминаторной микроскопии (SR-SIM)18. SIM требует гораздо более низкой дозы энергии освещения, чем STED и SMLM19. Кроме того, в отличие от методов STED и SMLM, SIM позволяет простой многоцветной трехмерной (3D) визуализации, и это не требует особых фотофизических свойств флюорофоров или изображения буфера состава19.
Традиционной стратегией маркировки митохондриальных нуклеоидов в живых клетках является флуоресцентная маркировка митохондриального нуклеоидного белка, такого как TFAM20. Однако во многих случаях эта стратегия не подходит. Кроме того, переэкспрессия флуоресцентного белка помечены TFAM производит серьезный артефакт21. Маркировка ДНК органическими красителями имеет преимущества по сравнению со стратегией на основе флуоресцентного белка (FP). Органические красители не имеют ограничений, связанных с пометкой FP: они могут быть использованы для любого типа клеток или тканей, которые могут быть применены в любой момент эксперимента. Изображения клеток живых клеток митохондриальных нуклеоидов было сообщено с несколькими ДНК-связывающих красителей: DAPI22, SYBR Зеленый23, Vybrant DyeCycle24, и picoGreen15,25,26. Существенным недостатком большинства ДНК-связывающих красителей для обозначения нуклеоидов является то, что они окрашивают всю ДНК в клетку. Ориентация на краситель исключительно на митохондриальную ДНК очень желательна. Для этого необходим тщательный отбор красителя, обладающего подходящими физико-химическими свойствами. Липобильные красители, обладающие делокализованным положительным зарядом, такие как родамин 123, как известно, накапливаются в живых митохондриях, которые сохраняют их отрицательный мембранный потенциал. Кроме того, идеальный краситель для специфической маркировки митохондриальных нуклеоидов должен связывать ДНК с высоким сродством и излучать яркую флуоресценцию при связывании ДНК. Учитывая эти требования, некоторые цианины являются перспективными (например, picoGreen), но ядерная ДНК обильно окрашенных этими красителей одновременно с митохондриальной ДНК15,25,26. Настоящий протокол описывает специфическую маркировку митохондриальных нуклеоидов в живых клетках другим цианиновой красителем, SYBR Gold (SG), и отслеживание нуклеоидов в промежуток времени супер-разрешение SIM-видео. Кроме того, Окрашенные SG живые клетки могут быть изображены любым типом перевернутого флуоресцентного микроскопа (конфокальный, вращающийся диск, эпифлюоресценция и т.д.), подходящих для живых клеток и оснащенных источником света 488 нм.
Есть несколько важнейших компонентов протокола: Для достижения преференциальной маркировки митохондриальной ДНК, концентрация ДНК связывающего красителя во время инкубации должна быть очень низкой (например, 1:10,000 разбавления типичного коммерческого запаса), а инкубационное время д?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы признают Асифу Ахтар и Анжелику Рамболд (оба Института иммунобиологии и эпигенетики Макса Планка) за предоставление клеток HeLa.
Elyra PS1 | Carl Zeiss | multi-modal super-resolution microscope containing module for super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM) | |
high glucose DMEM | GIBCO/ThermoFisher | 31966021 | |
ibidi 35-mm dish, glass bottom | Ibidi Gmbh | 81158 | |
ibidi 8-well microSlide, glass bottom | Ibidi Gmbh | 80827 | |
Imaris 8.4.1 | Bitplane/Oxford Instruments | image porcessing and visualisation software package | |
iXon 885 | Andor Technologies | EMCCD camera with back-illuminated sensor | |
LSM880 Airyscan | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope with array detector | |
Mitotracker CMXRos Red | ThermoFischer | M7512 | red live cell mitochondrial stain |
Mitotracker Deep Red FM | ThermoFischer | M22426 | far red live cell mitochondrial stain |
picoGreen | ThermoFischer | P7581 | cell permeant DNA stain |
Plan Apochromat 100x/1.46 Oil objective | Carl Zeiss | ||
SYBR Gold | ThermoFischer | S11494 | cell permeant DNA stain |
Zen Black 2012 software | Carl Zeiss | image acquisition and processing software |