Summary
Protokol, mitokondriyal nükleoidlerin ticari olarak kullanılabilen DNA jeli lekesi ile özel etiketlemesini, süper çözünürlüklü yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SR-SIM) ile zaman atlamalı canlı etiketli hücrelerin zaman atlamalı serilerinin edinimini ve nükleoid hareketinin otomatik olarak izlenmesini açıklar.
Abstract
Mitokondriyal nükleoidler, proteinlerle kaplanmış mitokondriyal DNA molekülleri tarafından oluşturulan kompakt parçacıklardır. Mitokondriyal DNA, tRNA'ları, rRNA'ları ve birkaç temel mitokondriyal polipeptidi kodlar. Mitokondriyal nükleoidler, fizyon/füzyon ve diğer morfolojik değişikliklerden geçen dinamik mitokondriyal ağ içinde bölünür ve dağıtır. Yüksek çözünürlüklü canlı floresan mikroskopisi bir nükleoidin konumunu ve hareketini karakterize etmek için basit bir tekniktir. Bu teknik için, nükleoidler genellikle protein bileşenlerinin floresan etiketleri ile etiketlenir, yani transkripsiyon faktörü a (TFAM). Ancak, bu strateji, eserlere (TFAM için rapor) neden olabilecek floresan protein etiketli bir yapının aşırı ifade edilmesine ihtiyaç duyar ve birçok durumda mümkün değildir. Organik DNA bağlayıcı boyalar bu dezavantajları yok. Ancak, her zaman hem nükleer hem de mitokondriyal DNA'ların boyanmasını gösterirler, böylece mitokondriyal nükleoidlere özgüllükten yoksundurlar. Bu boyaların fiziko-kimyasal özelliklerini göz önünde bulundurarak, bir nükleik asit jel lekesi (SYBR Gold) seçtik ve canlı hücrelerdeki mitokondriyal nükleoidlerin tercihli etiketlemesini sağladık. Boyanın özellikleri, özellikle DNA'ya bağlanan yüksek parlaklığı, süper çözünürlüklü yapılandırılmış aydınlatma görüntülerinin zaman serilerini kullanarak mitokondriyal nükleoid hareketinin sonraki nicelikselleştirilmesine izin verir.
Introduction
Dairesel 16.5 kbp DNA molekülleri mitokondrigenetik malzemesini oluşturur, 22 tRNA, 2 rRNA ve 13 polipeptidleri kodlar? Mitokondriyal DNA mitokondriyal transkripsiyon faktörü a (TFAM) ve diğer bazı proteinler mitokondriyal nükleoidler1formu bağlı ,2,3,4. Mitokondriyal nükleoidler hareket ve mitokondriyal ağ bileşenleri arasında yeniden dağıtmak5,6 onun morfolojik remodeling sırasında, fisyon veya füzyon hücre döngüsü fazına bağlı olarak, stres, ve diğer faktörler (Pernas ve ark.7gözden). Buna ek olarak, mitokondriyal nükleoidlerin hareketi, sistemik lupus eritematozus hastalığı8 karıştığı ve diğer hastalıklarda rol oynayabilir. Floresan mikroskopisi organellerin canlı hücre çalışmaları için basit bir tekniktir, ancak bu teknik mitokondriyal nükleoidlerin boyutundan daha büyük olan >200 nm çözünürlüğe sahiptir (~100 nm9,10,11,12). Bu sınır, uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) ve tek molekül lokalizasyon mikroskobu (SMLM)13,14gibi sözde "süper çözünürlüklü" teknikler tarafından atlatılmıştır. Şimdiye kadar, mitokondriyal nükleoidler ve diğer DNA'lar canlı hücrelerde doğrudan stokhastik optik rekonstrüksiyon mikroskopisi (dSTORM)15ile görüntülenmiştir. Canlı hücrelerde STED tarafından mtDNA ile ilişkili pozisyonlara sahip ince alt mitokondriyal yapılar gözlenmiştir16. Ancak, bu süper çözünürlük teknikleri canlı hücreler üzerinde fototoksik etkilere neden olan yüksek aydınlatma yoğunluğu gerektirir17. Bu nedenle, kırınım sınırının ötesinde çözünürlüğe sahip mitokondriyal nükleoidlerin zaman atlamalı görüntülemesi zordur. Bu sorunu gidermek için süper çözünürlüklü yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SR-SIM)18kullandık. SIM STED ve SMLM19daha çok daha düşük bir aydınlatma güç dozu gerektirir. Ayrıca, STED ve SMLM teknikleri aksine, SIM basit çok renkli üç boyutlu (3D) görüntüleme izin verir, ve floroforlar veya görüntüleme tampon kompozisyon belirli fotofiziksel özellikleri gerektirmez19.
Canlı hücrelerde mitokondriyal nükleoidlerin etiketlemisiyal strateji, TFAM20gibi bir mitokondriyal nükleoid proteinin floresan etiketlemesidir. Ancak, birçok durumda, bu strateji uygun değildir. Ayrıca, floresan protein etiketli TFAM aşırı ifade ciddi bir artifakıüretir 21. DNA'nın organik boyalarla etiketlemi floresan protein (FP) tabanlı bir stratejiye göre avantajlıdır. Organik boyalar FP etiketlemeile ilgili kısıtlardan arındırılır: her türlü hücre veya doku için kullanılabilir ler ve bir deneyin herhangi bir noktasında uygulanabilirler. Mitokondriyal nükleoidlerin canlı hücre görüntüleme si birkaç DNA bağlayıcı boyalar ile bildirilmiştir: DAPI22, SYBR Yeşil23, Vybrant Boya Döngüsü24, ve picoGreen15,25,26. Nükleoid etiketleme için DNA bağlayıcı boyaların çoğunun önemli bir dezavantajı hücre içindeki tüm DNA'yı lekelemeleridir. Boyayı sadece mitokondriyal DNA'ya yönlendirmek son derece arzu edilir. Bunu başarmak için, uygun fiziko-kimyasal özelliklere sahip bir boya dikkatli seçimi gereklidir. Rhodamine 123 gibi lokalize pozitif yüke sahip lipophilic boyaların, negatif membran potansiyelini koruyan canlı mitokondride biriktiği bilinmektedir. Buna ek olarak, mitokondriyal nükleoidlerin özel etiketleme için ideal bir boya yüksek afinite sahip DNA bağlamak ve DNA bağlama üzerine parlak floresan yontmak gerekir. Bu gereksinimleri göz önünde bulundurarak, bazı siyanürler umut verici (örneğin, picoGreen), ama nükleer DNA bol miktarda mitokondriyal DNA15,,25,26ile aynı anda bu boyalar tarafından lekeli . Bu protokol, canlı hücrelerdeki mitokondriyal nükleoidlerin başka bir siyanür boyası olan SYBR Gold (SG) ile özel etiketlemesini ve zaman atlamalı süper çözünürlüklü SIM videolarında nükleoidlerin takibini açıklamaktadır. Ayrıca, SG lekeli canlı hücreler, canlı hücreler için uygun ve 488 nm ışık kaynağı ile donatılmış ters floresan mikroskop (konfokal, iplik diski, epifloresan, vb) her türlü görüntülenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Burada bahsedilen tüm hücre hatları yüksek glikoz Dulbecco's Modifiye Kartal orta kültürlü edildi (DMEM) ile takviye 10% fetal sığır serumu (FBS), glutamin, penisilin / streptomisin, ve piruvat. Etiketleme ve görüntüleme gününde kullanılacak tüm ortam ve takviyeleri % 5 CO2olarak ayarlanmış bir kuvözde 37 °C'ye kadar ısıtarak dengeleyin. Etiketleme de dahil olmak üzere tüm hücre kültürü çalışmaları bir laminar akış başlık altında steril koşullarda gerçekleşir.
1. Canlı Hücre Etiketleme
- Etiketleme işleminden bir gün önce, kültür 4 x 105 HeLa hücreleri 2 mL orta 35 mm Petri çanak #1,5 cam alt ile. Çok kuyulu bölmeli slaytlar kullanılabilir, ancak hacimler kuyunun hacmine orantılı olarak ayarlanmalıdır. Hücre süspansiyonu yaklaşık 50.000 hücre/mL ve 35 mm Petri kabında hücre süspansiyonunun 2 mL tohumolacak şekilde seyreltin.
- SYBR Gold (SG) ticari stok çözeltisinin aşağıdaki seyreltmelerini hazırlayın: 1:5,000. Mitotracker Deep Red (çok kırmızı leke) veya Mitotracker CMXRos Kırmızı (kırmızı leke)(Malzeme Tablosu; ticari stok 1:2.000 seyreltilmiş) fenol kırmızı-free kültür orta hazırlayın. SG için olduğu gibi picoGreen aynı set seyreltme hazırlayın.
NOT: Adım 1.2'de açıklanan çözümler 2x etiketleme çözümleridir. Floresan boyalar içeren tüm çözümleri mümkün olduğunca ışıktan koruyun. - Yapışık hücreleri bir kez 2 mL PBS ile yıkayın. 35 mm Petri kabına 1 ml fenol kırmızıiçermeyen kültür ortamı ekleyin. 8 kuyulu bir kaydırma için, toplam kuyu kapasitesinin 1/2'sine eşit bir hacim kullanın (örn. toplam kuyu kapasitesi 250 μL ise 125°L ekleyin).
- Adım 1,2 ila 35 mm Petri kabında hazırlanan 2x etiketleme çözeltisinin 1 mL'ini ekleyin. 8 kuyulu bir kaydırma için toplam kuyu kapasitesinin 1/2'sine eşit bir hacim kullanın. Hücreleri 30 dk 37 °C'de %5 CO2'ninaltında kuluçkaya yatırın.
NOT: Daha uzun kuluçka nükleer DNA etiketleme neden olur, çünkü 1 saat daha uzun Süre SG etiketleme çözeltisi ile hücreleri kuluçkaya yatmayın. - Floresan boyaları içeren ortamı dikkatlice aspire edin ve hücreleri pbs ile bir kez yıkayın.
- Fenol kırmızıiçermeyen hücre kültürü ortamı ekleyin ve hücreleri 37 °C'de bir CO2 kuluçka makinesinde karanlıkta tutun.
- Bir kuluçka ünitesi ile donatılmış bir SR-SIM mikroskop üzerinde görüntü canlı hücreleri (aşağıya bakın).
2. SR-SIM Görüntü Edinme
- Mikroskop aşamasına bir sahne üstü kuluçka makinesi töşekilde. İstediğinsıcaklığı ve CO2 konsantrasyonu (örneğin, 37 °C ve memeli hücreleri için %5) ayarlayın ve görüntü edinimi başlamadan önce en az 1 saat sıcak tutun.
- Lazerler de dahil olmak üzere SR-SIM mikroskobun tüm bileşenlerini açın ve en az 1 saat ısınmaya bırakın.
- Mikroskop üreticisi tarafından SR-SIM için önerilen yüksek büyütme, yüksek sayısal diyafram (NA) daldırma hedefi (örn. 100x 1,46 NA yağı) seçin.
- Kuluçka mikroskop aşamasına etiketli hücrelerle (adım 1.6'dan) odacıklı bir slayt veya 35 mm çanak tökerim.
- Tercihen oküler ile, örnek üzerinde ilgi alanı bulun. En iyi SR-SIM görüntüleme kalitesini elde etmek için, cama iyi bağlanmış hücreleri seçin.
- SR-SIM görüntüleri elde etmek için arkadan renkli üst düzey elektron çarpma yükü çiftli cihaz (EM-CCD) kamera kullanın.
- Görüntü edinme yazılımını kullanarak, kullanılan kamera için önerilen yüksek EM kazancını ayarlayın (örn. 300).
- Nükleoid izleme için zaman atlamalı seri elde etmeden önce, aynı görüş alanının iki renkli SR-SIM görüntüsünü elde edin: mitokondriyal boyama için bir kanal ve SG için başka bir kanal. Kullanılan mitokondriyal lekeye uygun ilk renk kanalını ayarlayın (örn. uzak kırmızı bir mitokondriyal leke için, uyarmayı 633 nm veya daha uzun ve 650 nm longpass emisyon filtresi olarak ayarlayın). SG sinyali için uyarma 488 nm ve 500-550 nm bandpass emisyon filtresi olarak ayarlayın.
- Yazılımı kullanarak, hem 488 nm hem de uzak kırmızı leke çizgileri için mümkün olan en düşük lazer gücünü ayarlayın.
NOT: Tipik bir ayar bir acousto-optik ayarlanabilir filtre (AOTF) tarafından ayarlanmış% 1 lazer çıkış gücüdür. - SIM mikroskop kanalları yalnızca sırayla (tek kameralı kurulum) elde ederse, uzak kırmızı leke algılama kanalını kapatın.
- Yazılımdaki Z yığını kutusunu açarak Z yığını edinisini kapatarak tek bir odak düzleminin edinimi ayarlayın.
- Mümkün olan en kısa EM-CCD kamera pozlama süresini ayarlayın.
- Beş döndürme yerine ızgaranın üç dönüşünü ayarlayın.
- Çerçeve hızını artırmak için, yazılımın Edinme sekmesinde, kamerayı verileri sadece kamera sensörünün merkezi alanından "Full Chip" yerine okuyacak şekilde ayarlayın.
NOT: Örneğin, 1.000 x 1.000 piksellik bir alanın okunmasından sadece 256 x 256 pikselin okunmasına geçiş yapmak, kamera pozlama süresinin 50 ms'den 13,4 ms'e ve toplam kare süresinin 1,8 s'den 1,2 s'ye düşürülmesine olanak tanır. Kamera sensörünün yalnızca merkezi bir bölümü okunursa, görüş alanı genellikle SR-SIM için kullanılan 63x veya 100x hedefi için çok küçük olacaktır. Daha kısa bir pozlama süresi görüntülerin sinyal-gürültü oranını azaltacaktır. - Lazer gücünü ve kamera maruz kalma süresini optimize edin: çeşitli lazer güç değerlerinde etiketli hücrelerin SR-SIM iki boyutlu (2D) görüntülerini edinin (örn. %0,5, %1, %1,5, %2) ve birkaç pozlama süreleri (örn. 13.4 ms, 25 ms, 50 ms).
- Ham SIM veri kümelerini işleme (bkz. adım 3.1).
- SIM işleme tarafından üretilen çok az veya hiç yapıtla mitokondride (yani nükleoidlerde) parlak noktalara sahip SIM görüntüler sağlayan lazer gücü ve kamera pozlama sürelerini seçin. Mitokondri dışındaki alanları inceleyin (örn. 488 nm katı hal lazerin %1 gücü ve EM-CCD kameranın 25 ms maruz ilerlediği).
- 2.15-2.17 adımlarında optimize edilen ayarları kullanarak zaman atlamalı serinin edinimini başlatın.
3. Veri İşleme ve Analizi
- Uygun bir yazılımın yapılandırılmış aydınlatma modülü(Tablo Malzemeler)ile ham SIM veri kümelerini işleme: SIM işleme parametreleri için Otomatik onay kutusunu seçin. Birden çok dosyanın otomatik olarak işlenmesi için toplu işleme aracını kullanın, Toplu İşlem için Akımı Kullan'ıseçin, Toplu İşİ Çalıştır'ı tıklatın ve SIM işleme için birden çok dosya seçin.
- SIM işlenmiş zaman serisi veri kümelerini Imaris dosya dönüştürücü yazılımı (yani Imaris yazılımının sürümüne karşılık gelen sürüm) ile IMS biçimine dönüştürün.
- Lineage (veya Track) modülü için lisansa sahip yazılımda (sürüm 8.4.1 veya sonraki sürüm) dönüştürülmüş bir dosya açın.
- Yeni Noktalar Ekle simgesini tıklatarak "Noktalar" oluşturma sihirbazını başlatın. Oluşturma sihirbazı başlatılacaktır.
- Sihirbazın Oluştur sekmesini seçin.
- Sihirbazın ilk adımında, Spotları İzleme'yi (zaman içinde) tıklatın ve sihirbazın ikinci adımına geçin.
- Tahmini XY Çapını 0,1-0,15 m'ye ayarlayın, Arka Plan Çıkarma'yı tıklatın ve üçüncü adıma geçin.
- Nükleoidlerin büyük bir kısmının "noktalar" olarak algılanması için histogramdaki dikey çizgiyi sürükleyerek filtredeki "Kalite" eşiğini ayarlayın, böylece yapılar algılanmaz (örn. algılanan noktalar görüntünün üzerine top olarak işaretlenir). Her karede böyle olup olmadığını kontrol edin ve gerekirse eşiği yeniden yeniden hazırlanın. Dördüncü ve sonra sihirbazın beşinci adıma geçin.
- Otomatik Regressif Hareket algoritmasını seçin. Max Mesafeyi 0,5 μm.'ye ayarlayın.
- Zaman serisindeki her çerçeveye bakın ve herhangi bir yanlış parça çizilip çizilmeip çizilmeip kullanılmadığını ve parçalar arasında herhangi bir boşluk açılıp kullanılmadığını kontrol edin (sihirbaz tarafından geçerli ayarlara sahip parçalar görüntünün üzerine konan çizgiler olarak anında işaretlenir). Gerekirse "Max Distance" ı ayarlayın. Büyücünün altıncı basamak devam edin. İzleme Süresi filtresini seçin ve 3-5 s'lik bir eşik ayarlayın.
- Şu anda algılanan noktalar veya parçalar en uygun değilse, noktalar veya parça oluşturma için herhangi bir parametreye ince ayar yapmak için gereken gezinti düğmelerini (sihirbaz penceresinin alt kısmında) kullanarak sihirbazın önceki adımlarına geri dön.
- İnce ayarlı parametreler yazılımın tüm noktaları algılamasına ve parçaları doğru bir şekilde oluşturmasına izin verdiğinde, parçaların oluşturulmasını onaylamak için sihirbazdaki yeşil ok gezinti düğmesini tıklatın.
- İstatistikler simgesi penceresini tıklatarak parçaların istatistiklerini ayıklayın. Gerekli istatistik parametrelerini (İstatistikleraltındaAyrıntılı ve Ortalama Değerler sekmeleri) seçin ve sayısallaştırma ve görselleştirme için Disket Sürücü simgesine tıklayarak değerleri csv dosyaları olarak dışa aktarın.
NOT: Maksimum pist hızı, ortalama pist hızı, parça uzunluğu ve parça deplasmanı önemli parametrelere örnektir. - Görüntü veri kümesinin sunulması veya yayınlanması gerekiyorsa, Anlık Görüntü veya Animasyon araçlarını kullanarak isteğe bağlı olarak yer alan parçalarla zaman atlamalı serisini temsil eden anlık görüntüler ve/veya video dosyaları oluşturun.
4. Konfokal Görüntü Edinimi
- Mikroskop aşamasına bir sahne üstü kuluçka makinesi takın, istenilen sıcaklığı ve CO2 konsantrasyonu (memeli hücreleri için 37 °C ve %5) ayarlayın ve görüntü edinmeye başlamadan önce en az 1 saat sıcak tutun.
- Lazerler de dahil olmak üzere bir konfokal lazer tarama mikroskobun tüm bileşenlerini açın ve en az 1 saat ısınmak için bırakın.
- Nyquist kriterlerine göre istenilen orta ve yüksek büyütme hedefi ve mekansal örnekleme seçin.
- SG kanalı için uyarma 488 nm ve 500-550 nm algılama aralığı ayarlayın. Mitokondriyal leke kanalı için, kırmızı boya için 561 nm ve 570-630 nm emisyon veya 633 nm uyarma ve uzak kırmızı boya için >650 nm emisyon ayarlayın.
- 700 mV PMT dedektör kazançları ile sinyallerin edinimi sağlayan mümkün olan en düşük lazer gücünü (genellikle %1 veya daha az) ayarlayın.
- Mitokondriyal nükleoidlerin "SG kanalında" tespit edildiği ve mitokondrilerin "kırmızı" veya "uzak kırmızı" kanalda algılandığı hücrelerin iki renkli konfokal görüntülerini edinin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Canlı hücre etiketlemesinin SG ile karakterizasyonu
İlk olarak, çeşitli seyreltmelerde boya ile kuluçka üzerine hücrelerde SG dağılımı konfokal mikroskopi ile karakterize edildi. SG veya picoGreen yüksek konsantrasyonlarda kuluçka sonra, her iki boya çoğunlukla çekirdekleri etiketli ve sitoplazmada bir punctate boyama gösterdi (Şekil 1), benzer başka bir pozitif yüklü siyanin boyası için yayınlanan veriler (yani, picoGreen)15. Ancak, 1:10.000 seyreltme de SG ile kuluçka üzerine, zayıf boyama çekirdekleri ortaya çıktı, sitoplazmada ise, parlak noktalar bir desen gözlendi(Şekil 1). Öte yandan, picoGreen boya ile kuluçka seyreltilmiş 1:10,000 çoğunlukla nükleer boyama verdi. SG sinyali aynı konsantrasyonda picoGreen'den çok daha parlaktı. Veriler, SG'nin mitokondriyal DNA'yı görüntülemeye diğer benzer DNA bağlayıcı boyalara göre daha uygun olduğunu göstermiştir.
Parlak noktaların mitokondride lokalize olduğunu doğrulamak için, canlı hücreleri aynı anda SG ve çok kırmızı mitokondriyal leke ile eşleştirdik. İkincisi canlı hücrelerin mitokondri birikir pozitif yüklü hücre geçirilebilir organik boya olduğunu. 1:10.000 ve 1:50.000 seyreltmelerde SG ile kuluçka üzerine, neredeyse tüm SG boyama mitokondri oluştu, etiketleme üzerine 1:500 ve 1:1,000 seyreltme, çekirdek ve sitoplazma önemli boyama oluştu(Şekil 2).
Ayrıca, zaman atlamalı mikroskopi ile SG ile canlı hücrelerin boyanma zaman seyri karakterize(Şekil 3). Mitokondri vs zaman SG floresan yoğunluğu nun çizimleri(Şekil 3B) 45 dk sonra, nükleoid boyama doygunluğa yakın olduğunu ileri sürdü. Bu nedenle~ 30-60 dk kuluçka süreleri öneririz.
SG hücre içi dağılımın fiksasyon ve/veya hücrelerin permeabilizasyonu üzerine nasıl değiştiğini test ettik. Canlı lekeli hücrelerin fiksasyonu (%2 paraformaldehit [PFA]) boyanın çekirdeğe hafif çehresine yeniden dağıtılmasına neden olur(Şekil 4A,B). Sabit hücrelerin permeabilizasyonu (%0.1 Triton X100) mitokondride SG noktalı deseni ortadan kaldırmış ve çekirdeklerin boyanması baskındı(Şekil 4C). Fiksasyon ve permeabilizasyondan sonra hücrelere SG eklenmişse, sitoplazma ve çekirdekler arasında düzgün bir şekilde dağıtılır(Şekil 4D). Bu nedenle, SG etiketli hücreler gerekirse sabitlenebilir, ancak boya permeabilizasyon gerektiren protokoller için uygun değildir.
Canlı hücre SR-SIM ve mitokondriyal nükleoidler izleme
SG ile çalışan canlı hücreler ve çok kırmızı bir mitokondriyal leke(Malzeme Tablosu)süper çözünürlüklü SIM tekniği ile 3Boyutlu olarak görüntülenmiştir. Konfokal görüntülerde olduğu gibi(Şekil 2), mitokondriyal nükleoidler mitokondri içinde parlak noktalar olarak ortaya çıkmıştır (Şekil 5A). Ayrıca, 2D SIM görüntülerden oluşan bir zaman serisi elde ettik ve nükleoidlerin konumlarını kırınım sınırının ötesinde bir çözünürlükte takip ettik. Zaman serisine başlamadan hemen önce SG'de SIM 3D yığınları ve mitokondriyal leke kanalları satın aldık. Sonra sadece SG kanalında bir zaman serisi elde ettik ve hareketlerini ölçmek için mitokondriyal nükleoidleri takip ettik. Pist in hızı 0.042 μm/s, pistin maksimum anlık hızı 0.078 ± 0.012 μm/s idi. Nükleoidlerin çoğunluğu orijinal konumlarından çok uzak bir yerde değildi, ancak mitokondriyal görüntülerdeki parçaların bir yer kaplaması olarak muhtemelen mitokondriyal ağla sınırlı olan kısa mesafeli rastgele hareketler gösterdiler (Şekil 5B). Tipik bir zaman serisi sırasında birkaç hızlı yön değiştirmeleri meydana geldi (Film 1).
Şekil 1: PicoGreen ve SG canlı hücre etiketlemekarşılaştırılması. A549 hücreleri belirtilen seyreltmelerde picoGreen veya SG ile inküveted ve görüntülendi. Yeşil kanaldaki etiketli hücrelerin görüntü alanlarını temsil eder. LSM880 Airyscan FAST, 20x/air objective, Scale bar = 50 μm. Tek optik kesitler. Beyaz kareler, 423 x 423 μm görüş alanlarının tamamının sağında daha yüksek bir büyütmede gösterilen alanları işaretler. 1:1.000 ve 1:2.000 seyreltmeiçin aynı görüntüler iki parlaklık ayarı ile gösterilir: 1:10.000 seyreltme için optimize edilmiş "varsayılan" parlaklık ayarları ve dedektör doygunluğunu önlemek için ayarlanan "azaltılmış parlaklık" ayarları. Bu rakam Jevtic ve ark.27'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Farklı konsantrasyonlarda etiketleme üzerine canlı hücrelerde SG lokalizasyonu. HeLa hücreleri 0.25 μM Mitotracker CMXRos Kırmızı ve belirtilen SG seyreltme karışımı ile 30 dakika kuluçkaya yatırıldı. Çözüm DMEM ile değiştirildi ve görüntüler lsm880 Airyscan mikroskobu, 63x 1.4 yağ hedefi, renk kanallarının ardışık edinimi ile elde edildi. Tek optik dilimler Ölçek çubuğu = 10 μm) gösterilir. Bu rakam Jevtic ve ark.27'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: SYBR Gold (SG) ile etiketleme sırasında HeLa hücreleri. İlk olarak, canlı HeLa hücreleri Mitotracker CMXRos Kırmızı ile etiketlendi ve yıkandı. SG (DMEM'de son seyreltme 1:10.000) hücrelere eklendi ve zaman atlamalı seri elde edildi. LSM880 mikroskop, 63x 1.4 Yağ hedefi, sıralı edinim. Z-yığınları her zaman noktasında elde edildi. Maksimum yoğunluk projeksiyonları gösterilir. (A) SG floresanının zaman içinde ilgi çekici çeşitli bölgelerde ki ortalama yoğunlukları. (B) SG floresanının ölçüldüğü ilgi alanlarını gösteren temsili görüş alanları (renkli dikdörtgenler). (C) SG ile kuluçka sırasında birkaç zaman noktalarında bir görüş alanı. Sağ sütunda daha yüksek bir büyütme de beyaz çizgi ile işaretlenmiş bir kare bölge gösterilir. Bu rakam Jevtic ve ark.27'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Fiksasyon ve permeabilizasyonun hücrelerdeki SG lokalizasyonu üzerine etkisi. HeLa hücreleri SG (stok seyreltilmiş 1:10.000) ve Mitotracker CMXRos Kırmızı (0.25 μM) ile 30 dakika boyunca boyandı. sıralı edinim; ölçek çubuğu = 10 μm. (A) SG ile boyanmış Canlı HeLa hücreleri. (B) Canlı HeLa hücreleri SG ile boyanmış ve daha sonra 30 dakika PBS% 2 PFA ile sabit (C) Live HeLa hücreleri SG ile boyanmış, daha sonra 30 dakika pbs% 2 PFA ile sabit ve 15 dakika için% 0.1 Triton X100 ile permeabilize. Alt panelde, aynı görüntü gösterilir, ancak yeşil kanaldaki parlaklık daha yüksek olarak ayarlanır. (D) HeLa hücreleri % 2 PFA ile sabit, 15 dakika için% 0.1 Triton X100 ile permeabilized ve daha sonra SG ve Mitotracker CMXRos Kırmızı ile boyanmış. (D)içinde gösterilen görüntüleri elde etmek için, yeşil kanal için kameranın EMCCD kazancı aşırı pozlamayı önlemek için A-C'ye kıyasla 12 kat azaltıldı. Bu rakam Jevtic ve ark.27'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Canlı SIM görüntülerde nükleoid izleme. SG lekeli hücrelerin görüş alanının temsili görüntüleri. Alt: zaman atlamalı serisinin edinimi önce alınan iki renkli SIM görüntü. Yeşil = SG kanalı; macenta = mitotracker kanal. Üst: SG kanalında 50 kareLIK SIM zaman serisi nükleoid parça (Film 1); çerçeve süresi = 1.8 s; Imaris 8.4.1 yazılımı tarafından izleniyor. Parçalar maksimum parça hızına (μm/s) göre renk kodlur; Elyra PS.1, SIM modu, 100x/1.46 Yağ hedefi; Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu rakam Jevtic ve ark.27'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Film 1: Sim zaman atlamalı serisi temsilcisi SG lekeli hücreleri gösteren. Ölçek çubuğu = 5 μm. Tespit edilen mitokondriyal nükleoidler beyaz küreler olarak işaretlenir. Parçalar "Dragon tails" (8 kare uzunluğunda) olarak görselleştirilir ve maksimum anlık hızlarına göre renk kodlanır (sağ alttaki renk çubuğu μm/s hızlarını gösterir). Mitokondriyal nükleoidler Imaris 8.4.1 yazılımı ile izleme ve görselleştirme. Bu video Jevtic ve ark.27içinde yayınlandı. Bu videoyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklayın).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokolün birkaç kritik bileşeni vardır: Mitokondriyal DNA'nın tercihli etiketlemesini sağlamak için, kuluçka sırasında DNA bağlayıcı boyakonsantrasyonu çok düşük tutulmalıdır (örn. tipik bir ticari stoğun 1:10.000 seyreltilmesi) ve kuluçka süresi 30 dakika olmalıdır. Kuluçka süresi asla 1 h.'yi geçmemelidir. diğer DNA bağlayıcı boyalar düşük konsantrasyonda etiketleme üzerine güçlü bir sinyal oluşturmak için yeterince parlak değildir.
Protokolümüzün sınırlaması, boyanın permeabilizasyon adımı sırasında mitokondriyal nükleoidlerden silinmesidir. Bu nedenle, açıklanan prosedür konvansiyonel immünoresans protokolleri için uygun değildir. Bu durumda, sabit hücrelerdeki nükleoidler, DNA'ya karşı antikorlar veya mitokondriyal transkripsiyon faktörleri (TFAM) gibi diğer tekniklerle etkin bir şekilde etiketlenebilir.
Mitokondriyal nükleoidlerin DNA bağlayıcı organik boya ile doğrudan etiketleminin floresan protein etiketlemesine göre avantajları vardır: her türlü hücre floresan protein etiketli yapılarda geçici veya diğer konsülsler olmaksızın <1 h içinde etiketlenebilir. Ayrıca, mevcut protokollerde, TFAM konvansiyonel floresan protein etiketleme eserler neden olduğu bildirilmiştir. Ayrıca, SG nükleoidleri ancak mitokondriyal membran potansiyeli sağlamsa verimli bir şekilde lekeler. Bu fp tabanlı boyama ile önlenemez biyolojik alakasız "hasta" ve ölü hücrelerin görüntü edinimi önler. Son olarak, DNA bağlayıcı boyalara dayalı daha önce yayınlanmış protokoller mitokondriyal DNA'nın tercihli boyanmasını sağlayamadı.
Önerilen protokol hızlı ve basittir, bu nedenle mitokondriyal nükleoidlerin çeşitli floresan teknikleri ile canlı görüntülemesi için yaygın olarak kullanılacağını varsayıyoruz, hem kırınım sınırlı (örneğin, lazer tarama konfokal, TIRF, vb) hem de süper çözünürlüklü SIM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar Asifa Akhtar ve Angelika Rambold (hem Max Planck Enstitüsü İmmünobiyoloji ve Epigenetik için) HeLa hücreleri sağlamak için kabul.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Elyra PS1 | Carl Zeiss | multi-modal super-resolution microscope containing module for super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM) | |
| High glucose DMEM | GIBCO/ThermoFisher | 31966021 | |
| ibidi 35 mm dish, glass bottom | Ibidi Gmbh | 81158 | |
| ibidi 8-well microSlide, glass bottom | Ibidi Gmbh | 80827 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane/Oxford Instruments | image porcessing and visualisation software package | |
| iXon 885 | Andor Technologies | EMCCD camera with back-illuminated sensor | |
| LSM880 Airyscan | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope with array detector | |
| Mitotracker CMXRos Red | ThermoFischer | M7512 | red live cell mitochondrial stain |
| Mitotracker Deep Red FM | ThermoFischer | M22426 | far red live cell mitochondrial stain |
| picoGreen | ThermoFischer | P7581 | cell permeant DNA stain |
| Plan Apochromat 100x/1.46 Oil objective | Carl Zeiss | ||
| SYBR Gold | ThermoFischer | S11494 | cell permeant DNA stain |
| Zen Black 2012 software | Carl Zeiss | image acquisition and processing software |
References
- Kaufman, B. A., et al. The mitochondrial transcription factor TFAM coordinates the assembly of multiple DNA molecules into nucleoid-like structures. Molecular Biology of the Cell. 18 (9), 3225-3236 (2007).
- Farge, G., et al. Protein sliding and DNA denaturation are essential for DNA organization by human mitochondrial transcription factor A. Nature Communications. 3, 1013 (2012).
- Bogenhagen, D. F. Mitochondrial DNA nucleoid structure. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 914-920 (2012).
- Kang, D., Kim, S. H., Hamasaki, N. Mitochondrial transcription factor A (TFAM): roles in maintenance of mtDNA and cellular functions. Mitochondrion. 7 (1-2), 39-44 (2007).
- Tauber, J., et al. Distribution of mitochondrial nucleoids upon mitochondrial network fragmentation and network reintegration in HEPG2 cells. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (3), 593-603 (2013).
- Garrido, N., et al. Composition and dynamics of human mitochondrial nucleoids. Molecular Biology of the Cell. 14 (4), 1583-1596 (2003).
- Pernas, L., Scorrano, L. Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function. Annual Review of Physiology. 78, 505-531 (2016).
- Caielli, S., et al. Oxidized mitochondrial nucleoids released by neutrophils drive type I interferon production in human lupus. Journal of Experimental Medicine. 213 (5), 697-713 (2016).
- Okayama, S., Ohta, K., Higashi, R., Nakamura, K. Correlative light and electron microscopic observation of mitochondrial DNA in mammalian cells by using focused-ion beam scanning electron microscopy. Microscopy (Oxf). 63 (Suppl 1), i35 (2014).
- Alan, L., Spacek, T., Jezek, P. Delaunay algorithm and principal component analysis for 3D visualization of mitochondrial DNA nucleoids by Biplane FPALM/dSTORM. European Biophysics Journal. 45 (5), 443-461 (2016).
- Kukat, C., et al. Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).
- Kukat, C., Larsson, N. G. mtDNA makes a U-turn for the mitochondrial nucleoid. Trends in Cell Biology. 23 (9), 457-463 (2013).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Benke, A., Manley, S. Live-cell dSTORM of cellular DNA based on direct DNA labeling. ChemBioChem. 13 (2), 298-301 (2012).
- Ishigaki, M., et al. STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells. Mitochondrion. 28, 79-87 (2016).
- Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
- Gustafsson, M. G., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Hirano, Y., Matsuda, A., Hiraoka, Y. Recent advancements in structured-illumination microscopy toward live-cell imaging. Microscopy (Oxf). 64 (4), 237-249 (2015).
- Brown, T. A., et al. Superresolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Molecular and Cellular Biology. 31 (24), 4994-5010 (2011).
- Lewis, S. C., Uchiyama, L. F., Nunnari, J. ER-mitochondria contacts couple mtDNA synthesis with mitochondrial division in human cells. Science. 353 (6296), aaf5549 (2016).
- Dellinger, M., Geze, M. Detection of mitochondrial DNA in living animal cells with fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 204 (Pt 3), 196-202 (2001).
- Ban-Ishihara, R., Ishihara, T., Sasaki, N., Mihara, K., Ishihara, N. Dynamics of nucleoid structure regulated by mitochondrial fission contributes to cristae reformation and release of cytochrome c. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11863-11868 (2013).
- Zurek-Biesiada, D., et al. Localization microscopy of DNA in situ using Vybrant((R)) DyeCycle Violet fluorescent probe: A new approach to study nuclear nanostructure at single molecule resolution. Experimental Cell Research. 343 (2), 97-106 (2016).
- He, J. Y., et al. The AAA(+) protein ATAD3 has displacement loop binding properties and is involved in mitochondrial nucleoid organization. Journal of Cell Biology. 176 (2), 141-146 (2007).
- Ashley, N., Harris, D., Poulton, J. Detection of mitochondrial DNA depletion in living human cells using PicoGreen staining. Experimental Cell Research. 303 (2), 432-446 (2005).
- Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S. V. SYBR Gold dye enables preferential labeling of mitochondrial nucleoids and their time-lapse imaging by structured illumination microscopy. PLoS One. 13 (9), e0203956 (2018).
