Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Étiquetage spécifique des nucléoïdes mitochondriaux pour la microscopie d’illumination structurée time-lapse

doi: 10.3791/60003 Published: June 4, 2020

Summary

Le protocole décrit l’étiquetage spécifique des nucléoïdes mitochondriaux avec une tache de gel d’ADN disponible dans le commerce, l’acquisition d’une série de time lapse de cellules étiquetées en direct par microscopie d’illumination structurée super-résolution (SR-SIM), et le suivi automatique du mouvement nucléoïde.

Abstract

Les nucléoïdes mitochondriaux sont des particules compactes formées par des molécules d’ADN mitochondrial enduites de protéines. L’ADN mitochondrial code les ARN, les ARR et plusieurs polypeptides mitochondriaux essentiels. Les nucléoïdes mitochondriaux se divisent et distribuent dans le réseau mitochondrique dynamique qui subit la fission/fusion et d’autres changements morphologiques. La microscopie à fluorescence vivante haute résolution est une technique simple pour caractériser la position et le mouvement d’un nucléoïde. Pour cette technique, les nucléoïdes sont généralement étiquetés par des étiquettes fluorescentes de leurs composants protéiques, à savoir le facteur de transcription a (TFAM). Cependant, cette stratégie a besoin d’une surexpression d’une construction fluorescente marquée par des protéines, qui peut causer des artefacts (rapportés pour TFAM), et n’est pas faisable dans de nombreux cas. Les colorants organiques liant l’ADN n’ont pas ces inconvénients. Cependant, ils montrent toujours la coloration des ADN nucléaires et mitochondriaux, manquant ainsi de spécificité aux nucléoïdes mitochondriaux. En tenant compte des propriétés physico-chimiques de ces colorants, nous avons sélectionné une tache de gel d’acide nucléique (SYBR Gold) et avons obtenu l’étiquetage préférentiel des nucléoïdes mitochondriaux dans les cellules vivantes. Les propriétés du colorant, en particulier sa grande luminosité sur la liaison à l’ADN, permettent la quantification ultérieure du mouvement nucléoïde mitochondrial à l’aide d’images d’illumination structurées super-résolution.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Les molécules circulaires d’ADN de 16,5 kbp constituent le matériel génétique des mitochondries, codant 22 tARN, 2 rARN, et 13 polypeptides nécessaires pour les complexes mitochondriaux oxydants de phosphorylation. L’ADN mitochondrial lié au facteur de transcription mitochondrial a (TFAM) et plusieurs autres protéines forment les nucléoïdes mitochondriaux1,2,3,4. Les nucléoïdes mitochondriaux se déplacent et redistribuent entre les composants du réseau mitochondrial5,6 pendant son remodelage morphologique, fission ou fusion selon la phase du cycle cellulaire, le stress, et d’autres facteurs (révisé dans Pernas et al.7). En outre, le mouvement des noyaux mitochondriaux, est impliqué dans la maladie systémique d’érythématosus de lupus8 et peut jouer un rôle dans d’autres maladies. La microscopie de fluorescence est une technique simple pour les études de cellules vivantes des organites, mais la technique a une résolution de 'gt;200 nm, qui est plus grande que la taille des nucléoïdes mitochondriaux (100 nm9,10,11,12). Cette limite a été contournée par des techniques dites de « super-résolution », telles que l’épuisement des émissions stimulées (STED) et la microscopie de localisation à une seule molécule (SMLM)13,14. Jusqu’à présent, les nucléoïdes mitochondriaux et autres ADN ont été photographiés dans des cellules vivantes par microscopie de reconstruction optique stochastique directe (dSTORM)15. Des structures sous-mitochondriales fines avec des positions corrélantes avec l’ADNmn ont été observées par STED dans les cellules vivantes16. Cependant, ces techniques de super-résolution nécessitent une intensité d’éclairage élevée, ce qui provoque des effets phototoxiques sur les cellules vivantes17. Par conséquent, l’imagerie en laps de temps des nucléoïdes mitochondriaux avec la résolution au-delà de la limite de diffraction est difficile. Pour remédier à cette situation, nous avons utilisé une microscopie d’éclairage structurée à super résolution (SR-SIM)18. SIM nécessite une dose de puissance d’éclairage beaucoup plus faible que STED et SMLM19. En outre, contrairement aux techniques STED et SMLM, SIM permet l’imagerie tridimensionnelle (3D) multicolore simple, et il ne nécessite pas de propriétés photophysiques particulières des fluorophores ou de la composition tampon d’imagerie19.

La stratégie conventionnelle pour l’étiquetage des nucléoïdes mitochondriaux dans les cellules vivantes est le marquage fluorescent d’une protéine nucléoïde mitochondriale, comme TFAM20. Cependant, dans de nombreux cas, cette stratégie n’est pas appropriée. En outre, la surexpression de TFAM fluorescente étiquetée par protéines produit un artefact sérieux21. L’étiquetage de l’ADN avec des colorants organiques présente des avantages par rapport à une stratégie basée sur les protéines fluorescentes (FP). Les colorants organiques sont exempts de contraintes liées au marquage FP : elles peuvent être utilisées pour n’importe quel type de cellules ou de tissus et peuvent être utilisées à tout moment d’une expérience. L’imagerie cellulaire vivante des nucléoïdes mitochondriaux a été rapportée avec plusieurs colorants de liaison d’ADN : DAPI22, SYBR Green23, Vybrant DyeCycle24, et picoGreen15,25,26. Un inconvénient substantiel de la plupart des colorants de liaison d’ADN pour l’étiquetage nucléoïde est qu’ils tachent tout l’ADN dans la cellule. Cibler un colorant uniquement à l’ADN mitochondrial est hautement souhaitable. Pour ce faire, une sélection minutieuse d’un colorant possédant des propriétés physico-chimiques appropriées est nécessaire. Les colorants lipophiles possédant la charge positive délocalisée, telle que la rhodamine 123, sont connus pour s’accumuler dans les mitochondries vivantes, qui préservent leur potentiel négatif de membrane. En outre, un colorant idéal pour l’étiquetage spécifique des nucléoïdes mitochondriaux devrait lier l’ADN avec une affinité élevée et émettre une fluorescence lumineuse sur la liaison d’ADN. Compte tenu de ces exigences, certaines cyanines sont prometteuses (par exemple, picoGreen), mais l’ADN nucléaire est abondamment souillé par ces colorants simultanément avec l’ADN mitochondrial15,25,26. Le protocole actuel décrit l’étiquetage spécifique des nucléoïdes mitochondriaux dans les cellules vivantes avec un autre colorant de cyanine, SYBR Gold (SG), et le suivi des nucléoïdes dans les vidéos SIM super-résolution en laps de temps. En outre, les cellules vivantes tachées de SG peuvent être illustrées par n’importe quel type de microscope fluorescent inversé (confocal, disque tournant, épifluorescence, etc.) adapté aux cellules vivantes et équipé d’une source lumineuse de 488 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

REMARQUE: Toutes les lignées cellulaires mentionnées ici ont été cultivées dans le milieu de l’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) de glucose élevé complété par le sérum bovin foetal (FBS), la glutamine, la pénicilline/streptomycine, et le pyruvate. Équilibrer tous les médias et suppléments à utiliser le jour de l’étiquetage et de l’imagerie en les réchauffant jusqu’à 37 oC dans un incubateur fixé à 5% de CO2. Tous les travaux de culture cellulaire, y compris l’étiquetage, se déroulent dans des conditions stériles sous un capot de flux lamineur.

1. Étiquetage des cellules en direct

  1. Un jour avant la procédure d’étiquetage, culture 4 x 105 cellules HeLa dans 2 ml de milieu dans un plat Petri de 35 mm avec #1,5 fond de verre. Des diapositives à chambre multi-puits peuvent être utilisées, mais les volumes doivent être ajustés proportionnellement au volume du puits. Diluer la suspension cellulaire pour avoir environ 50.000 cellules/mL et la graine 2 ml de la suspension cellulaire dans un plat de 35 mm Petri.
  2. Préparer les dilutions suivantes de la solution de stock commercial SYBR Gold (SG) : 1:5,000. Préparer Mitotracker Deep Red (ornée rouge) ou Mitotracker CMXRos Red (tache rouge)(Tableau des matériaux; stock commercial dilué 1:2,000) dans le milieu de culture sans rouge phénol. Préparer les mêmes dilutions ensemble de picoGreen que pour SG.
    REMARQUE: Les solutions décrites à l’étape 1.2 sont les solutions d’étiquetage 2x. Protégez autant que possible toutes les solutions contenant des colorants fluorescents contre la lumière.
  3. Laver les cellules adhérentes avec 2 ml PBS une fois. Ajouter 1 ml de phénol sans milieu de culture au plat Petri de 35 mm. Pour une diapositive à 8 puits, utilisez un volume égal à 1/2 de la capacité totale du puits (p. ex., ajoutez 125 ll si la capacité totale du puits est de 250 ll).
  4. Ajouter 1 mLof la solution d’étiquetage 2x préparée dans l’étape 1,2 à 35 mm De petri plat. Pour une diapositive à 8 puits, utilisez un volume égal à 1/2 de la capacité totale du puits. Incuber les cellules pendant 30 min à 37 oC sous 5% de CO2.
    REMARQUE: N’incuberez pas les cellules avec la solution d’étiquetage DE SG pendant plus de 1 h, parce que l’incubation plus longue causera l’étiquetage de l’ADN nucléaire.
  5. Aspirez soigneusement le milieu contenant les colorants fluorescents et lavez les cellules une fois avec PBS.
  6. Ajouter le milieu de la culture cellulaire sans rouge à phénol et maintenir les cellules dans l’obscurité dans un incubateur de CO2 à 37 oC jusqu’à l’imagerie.
  7. Imagez des cellules vivantes sur un microscope SR-SIM équipé d’une unité d’incubation (voir ci-dessous).

2. Acquisition d’images SR-SIM

  1. Installez un incubateur de scène sur la scène du microscope. Réglez la température désirée et la concentration de CO2 (p. ex., 37 oC et 5 % pour les cellules de mammifères) et restez au chaud pendant au moins 1 h avant de commencer l’acquisition d’images.
  2. Allumez tous les composants du microscope SR-SIM, y compris les lasers, et laissez-les se réchauffer pendant au moins 1 h.
  3. Choisissez un objectif d’immersion à ouverture numérique élevée (NA) (p. ex., huile 100x 1.46 NA) recommandé pour SR-SIM par le fabricant du microscope.
  4. Installez une lame chambrée ou un plat de 35 mm avec des cellules étiquetées (à partir de l’étape 1.6) au stade du microscope incubé.
  5. Localisez la zone d’intérêt sur l’échantillon, de préférence avec des oculaires. Pour obtenir la meilleure qualité d’imagerie SR-SIM, choisissez les cellules bien attachées au verre.
  6. Utilisez une caméra haute gamme haute gamme multipliante d’électron haute gamme (EM-CCD) pour acquérir des images SR-SIM.
  7. À l’aide du logiciel d’acquisition d’images, définissez un gain EM élevé recommandé pour la caméra utilisée (p. ex., 300).
  8. Avant d’acquérir la série time lapse pour le suivi nucléoïde, acquérir une image SR-SIM bicolore du même champ de vision : un canal pour la coloration mitochondriale et un autre pour SG. Réglez le premier canal de couleur approprié à la tache mitochondriale utilisée (p. ex., pour une tache mitochondriale rouge lointain, définissez l’excitation à 633 nm ou plus et un filtre d’émission de 650 nm longpass). Pour le signal SG, définissez l’excitation à 488 nm et un filtre d’émission de bandepass de 500 à 550 nm.
  9. À l’aide du logiciel, définissez la puissance laser la plus basse possible pour les lignes de tache rouge 488 nm et lointaines.
    REMARQUE: Un réglage typique est de 1% de puissance de sortie laser ajustée par un filtre à thon rouge acousto-optique (AOTF).
  10. Si le microscope SIM n’acquiert des canaux que de façon séquentielle (configuration d’une seule caméra), éteignez le canal de détection des taches rouge foncé.
  11. Définissez l’acquisition d’un seul plan focal en éteignant l’acquisition de la pile Z en cochant la boîte Z-stack dans le logiciel.
  12. Définissez le temps d’exposition de la caméra EM-CCD le plus court possible.
  13. Définissez trois rotations de la grille plutôt que cinq rotations.
  14. Pour augmenter le taux d’image, dans l’onglet Acquisition du logiciel, définissez la caméra pour lire les données uniquement à partir de la zone centrale du capteur de caméra au lieu de "Full Chip« .
    REMARQUE: Par exemple, passer de la lecture d’une zone de 1 000 x 1 000 pixels capteur complet à la lecture seulement 256 x 256 pixels permet une réduction du temps d’exposition de la caméra de 50 ms à 13,4 ms et le temps de laps total de 1,8 s à 1,2 s. Si seulement une partie centrale du capteur de la caméra est lue, alors le champ de vision sera très petit pour un objectif 63x ou 100x généralement utilisé pour SR-SIM. Un temps d’exposition plus court réduira le rapport signal-bruit des images.
  15. Optimiser la puissance laser et le temps d’exposition de la caméra : acquérir des images bidimensionnelles SR-SIM (2D) de cellules étiquetées à plusieurs valeurs de puissance laser (p. ex., 0,5 %, 1 %, 1,5 %, 2 %) et plusieurs temps d’exposition (p. ex., 13,4 ms, 25 ms, 50 ms).
  16. Traiter les jeux de données SIM bruts (voir étape 3.1).
  17. Choisissez des temps d’exposition à la puissance laser et à la caméra qui produisent des images SIM avec des taches lumineuses dans les mitochondries (c.-à-d. les nucléoïdes) avec peu ou pas d’artefacts générés par le traitement SIM. Inspecter les zones à l’extérieur des mitochondries (p. ex., 1 % de puissance du laser à état solide de 488 nm et 25 ms exposition de la caméra EM-CCD).
  18. Démarrer l’acquisition de la série time lapse en utilisant les paramètres optimisés dans les étapes 2.15-2.17.

3. Traitement et analyse des données

  1. Traiter les jeux de données SIM bruts avec le module d’éclairage structuré d’un logiciel approprié(Tableau des matériaux) : choisissez la case à cocher Automatique pour les paramètres de traitement SIM. Pour le traitement automatique de plusieurs fichiers, utilisez l’outil de traitement par lots, désélectionner le courant d’utilisation pour le lot,cliquez sur Run Batch et sélectionnez plusieurs fichiers pour le traitement SIM.
  2. Convertir les jeux de données de séries chronojudères traités par SIM en format ims avec le logiciel de convertisseur de fichiers Imaris (c’est-à-dire la version correspondant à la version du logiciel Imaris).
  3. Ouvrez un fichier converti dans le logiciel (version 8.4.1 ou plus tard) qui a une licence pour le module Lineage (ou Track).
  4. Démarrer le magicien de la création "Spots" en cliquant sur l’icône Add New Spots. Un magicien de la création sera lancé.
  5. Choisissez l’onglet Créer de l’assistant.
  6. Sur la première étape de l’assistant, cliquez sur Track Spots (au fil du temps) et passez à la deuxième étape de l’assistant.
  7. Définissez le diamètre XY estimé à 0,1-0,15 m, cliquez sur La soustraction de fond et passez à la troisième étape.
  8. Ajuster le seuil dans le filtre "Qualité" en faisant glisser la ligne verticale dans l’histogramme afin que la majorité des nucléoïdes soient détectés comme des « taches », tandis que les artefacts ne sont pas détectés (c’est-à-dire que les taches détectées sont marquées comme des boules superposées sur l’image). Vérifiez si c’est le cas sur chaque image et réajuster le seuil si nécessaire. Passez à la quatrième, puis à la cinquième étape de l’assistant.
  9. Choisissez l’algorithme Autoregressive Motion. Définir la distance maximale à 0,5 m. Définir la taille de l’écart max à 0.
  10. Regardez chaque image de la série de temps et vérifiez si de fausses pistes sont tracées et si des écarts entre les pistes sont introduits (les pistes construites par le magicien avec les paramètres actuels sont instantanément marquées comme des lignes superposées sur l’image). Ajuster "Max Distance" si nécessaire. Passez à la sixième étape de l’assistant. Choisissez le filtre Track Duration et fixez un seuil de 3 à 5 s.
  11. Si les taches ou les pistes actuellement détectées ne sont pas optimales, revenez aux étapes précédentes de l’assistant à l’aide de boutons de navigation (au bas de la fenêtre des sorciers) nécessaires pour affiner tout paramètre pour les taches ou les pistes de création.
  12. Lorsque les paramètres affinés permettent au logiciel de détecter tous les spots et de construire correctement les pistes, cliquez sur le bouton de navigation de flèche verte dans l’assistant pour confirmer la création des pistes.
  13. Extraire les statistiques des pistes en cliquant sur la fenêtre de l’icône Statistics. Choisissez les paramètres de statistiques nécessaires (ongletsvaleurs détaillées et moyennes sous statistiques) et exportez les valeurs sous forme de fichiers csv en cliquant sur l’icône Floppy Drive pour la quantification et la visualisation.
    REMARQUE: La vitesse maximale de la trajectoire, la vitesse moyenne de la trajectoire, la longueur de la piste et le déplacement de la voie sont des exemples de paramètres importants.
  14. Si le jeu de données d’image doit être présenté ou publié, créez des instantanés et/ou des fichiers vidéo représentant la série time lapse avec des pistes superposées en option à l’aide des outils Snapshot ou Animation.

4. Acquisition d’image confocale

  1. Installez un incubateur en phase sur le microscope, définissez la température désirée et la concentration de CO2 (c.-à-d. 37 oC et 5 % pour les cellules de mammifères) et restez au chaud pendant au moins 1 h avant de commencer l’acquisition d’images.
  2. Allumez tous les composants d’un microscope à balayage laser confocal, y compris les lasers, et laissez-les se réchauffer pendant au moins 1 h.
  3. Choisissez un objectif de grossissement moyen à élevé souhaité et un échantillonnage spatial selon les critères nyquist.
  4. Pour le canal SG, définissez l’excitation à 488 nm et une portée de détection de 500 à 550 nm. Pour le canal de tache mitochondrial, réglé à 561 nm et 570-630 nm émission pour un colorant rouge, ou 633 nm excitation et 'gt;650 nm émission pour un colorant rouge lointain.
  5. Réglez la puissance laser la plus basse possible (généralement 1 % ou moins) qui permet l’acquisition des signaux avec des gains de détecteurs de PGP de 700 mV.
  6. Acquérir des images confocales bicolores des cellules, où les nucléoïdes mitochondriaux sont détectés dans le « canal SG » et les mitochondries sont détectées dans le canal « rouge » ou « rouge lointain ».

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Caractérisation de l’étiquetage des cellules vivantes avec SG
Tout d’abord, la distribution de SG dans les cellules lors de l’incubation avec le colorant à diverses dilutions a été caractérisée par microscopie confocienne. Après l’incubation avec des concentrations élevées de SG ou picoGreen, les deux colorants ont principalement étiqueté les noyaux et ont montré une coloration piquante dans le cytoplasme(figure 1), de même que les données publiées pour un autre colorant cyanine positivement chargé (c.-à-d., picoGreen)15. Cependant, lors de l’incubation avec SG à 1:10,000 dilution, coloration faible est apparu dans les noyaux, tandis que dans le cytoplasme, nous avons observé un modèle de taches lumineuses (figure 1). D’autre part, l’incubation avec le colorant picoGreen dilué 1:10,000 a donné la plupart du temps la coloration nucléaire. Le signal SG était beaucoup plus lumineux que celui de picoGreen à la même concentration. Les données ont montré que SG est plus approprié pour l’imagerie de l’ADN mitochondrial que d’autres colorants similaires de liaison d’ADN.

Pour confirmer que les points lumineux sont localisés dans les mitochondries, nous avons taché des cellules vivantes simultanément avec SG et la tache mitochondriale rouge lointain. Ce dernier est une cellule positivement chargée perméable colorant organique qui s’accumule dans les mitochondries des cellules vivantes. Lors de l’incubation avec SG à 1:10,000 et 1:50,000 dilutions, presque toutes les taches SG ont eu lieu dans les mitochondries, tandis que lors de l’étiquetage à 1:500 et 1:1,000 dilutions, la coloration significative des noyaux et du cytoplasme s’est produite(figure 2).

De plus, nous avons caractérisé le cours de temps de coloration des cellules vivantes avec SG par microscopie time lapse(figure 3). Les parcelles de l’intensité de fluorescence SG dans les mitochondries par rapport au temps(figure 3B) ont suggéré qu’après 45 min, la coloration nucléoïde était proche de la saturation. Ainsi, nous recommandons des temps d’incubation de 30 à 60 min.

Nous avons testé comment la distribution intracellulaire SG change lors de la fixation et/ou de la perméabilisation des cellules. La fixation (2 % de paraformaldéhyde [PFA]) des cellules tachées vivantes a provoqué une légère redistribution du colorant au noyau(figure 4A,B). La perméabilisation des cellules fixes (0,1 % de Triton X100) a éliminé le modèle pointillé de SG dans les mitochondries, et la coloration des noyaux était dominante(figure 4C). Si le SG a été ajouté aux cellules après fixation et perméabilisation, il a distribué uniformément à travers le cytoplasme et les noyaux (figure 4D). Ainsi, les cellules étiquetées SG peuvent être fixées si nécessaire, mais le colorant n’est pas adapté aux protocoles qui nécessitent une perméabilisation.

Live cell SR-SIM et les nucléoïdes mitochondriaux suivi
Les cellules vivantes costained avec SG et une tache mitochondriale loin rouge (tableau des matériaux) ont été 3D imaged par une technique sim de super-résolution. Comme dans les images confocales (figure 2), les nucléoïdes mitochondriaux sont apparus comme des taches lumineuses dans les mitochondries(figure 5A). En outre, nous avons acquis une série de fois d’images SIM 2D et suivi les positions des nucléoïdes à une résolution au-delà de la limite de diffraction. Immédiatement avant de commencer la série de temps, nous avons acquis des piles SIM 3D dans le SG et les canaux de tache mitochondrial. Ensuite, nous avons acquis une série de temps dans le canal SG seulement et suivi les nucléoïdes mitochondriaux afin de quantifier leurs mouvements. La vitesse moyenne de la voie était de 0,042 m/s, et la vitesse instantanée maximale de la voie était de 0,078 à 0,012 m/s. La majorité des nucléoïdes n’ont pas déplacé loin de leurs positions initiales, mais ont montré des mouvements aléatoires à courte distance qui étaient probablement confinés au réseau mitochondrial, comme le suggère une superposition de pistes sur les images mitochondriales(figure 5B). Peu de déplacements directionnels rapides se sont produits au cours d’une série temporelle typique (Film 1).

Figure 1
Figure 1 : Comparaison de l’étiquetage des cellules vivantes picoGreen et SG. Les cellules A549 ont été incubées avec picoGreen ou SG aux dilutions indiquées et image. Champs de vision représentatifs des cellules étiquetées dans le canal vert. LSM880 Airyscan FAST, objectif 20x/air, Barre d’échelle 50 m. Sections optiques simples. Les carrés blancs marquent les zones montrées à un grossissement plus élevé à droite de l’ensemble des champs de vue de 423 x 423 m. Pour 1:1,000 et 1:2,000 dilutions, les mêmes images sont montrées à deux réglages de luminosité: les paramètres de luminosité « par défaut » optimisés pour 1:10.000 dilution, et les paramètres de « luminosité réduite » ajustés pour éviter la saturation du détecteur. Ce chiffre a été modifié à partir de Jevtic et al.27. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Localisation SG dans les cellules vivantes lors de l’étiquetage à différentes concentrations. HeLa cells were incubated for 30 min with a mixture of 0.25 μM Mitotracker CMXRos Red and the indicated SG dilution. La solution a été remplacée par DMEM, et les images ont été acquises sur un microscope LSM880 Airyscan, objectif 63x 1.4 huile, avec une acquisition séquentielle de canaux de couleur. Des tranches optiques simples sont montrées Barre d’échelle à 10 m. Ce chiffre a été modifié à partir de Jevtic et al.27. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Cellules HeLa pendant l’étiquetage avec SYBR Gold (SG). Tout d’abord, les cellules HeLa vivantes ont été étiquetées avec Mitotracker CMXRos Red et lavées. SG (dilution finale 1:10,000 dans DMEM) a été ajouté aux cellules et une série de time lapse a été acquise. LSM880 microscope, 63x 1.4 Objectif huile, acquisition séquentielle. Z-stacks ont été acquis à chaque point de temps. Les projections d’intensité maximale sont affichées. (A) Intensités moyennes de fluorescence SG au fil du temps dans plusieurs régions d’intérêt. (B) Champs de vision représentatifs montrant les régions d’intérêt où la fluorescence SG a été mesurée (rectangles colorés). (C) Un champ de vision à plusieurs moments lors de l’incubation avec SG. Une région carrée marquée de ligne blanche est montrée à un grossissement plus élevé dans la colonne droite. Ce chiffre a été modifié à partir de Jevtic et al.27. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Effet de fixation et de perméabilisation sur la localisation de SG dans les cellules. Les cellules HeLa ont été tachées de SG (stock dilué 1:10,000) et Mitotracker CMXRos Red (0,25 m) pendant 30 min. Des tranches optiques simples ont été acquises sur un microscope à disque tournant; acquisition séquentielle; barre d’échelle de 10 m. (A) Cellules HeLa vivantes tachées de SG. (B) Live HeLa cellules tachées avec SG, puis fixés avec 2% PFA dans PBS pour 30 min. (C) Live HeLa cellules tachées avec SG, puis fixé avec 2% PFA dans PBS pour 30 min et perméabilisé avec 0,1% Triton X100 pour 15 min. Sur le panneau inférieur, la même image est affichée, mais la luminosité dans le canal vert est placée plus haut. (D) HeLa cellules fixées avec 2% PFA, perméabilisé avec 0,1% Triton X100 pour 15 min, puis taché avec SG et Mitotracker CMXRos Red. Pour acquérir les images montrées en (D), le gain EMCCD de la caméra pour le canal vert a été réduit d’un facteur de 12 par rapport à A-C pour éviter la surexposition. Ce chiffre a été modifié à partir de Jevtic et al.27. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Suivi nucléoïde sur les images SIM en direct. Images représentatives d’un champ de vision des cellules tachées de SG. En bas : l’image SIM bicolore prise avant l’acquisition de la série time lapse. Canal vert et SG; magenta - canal mitotracker. Top: pistes nucléoïdes d’une série de 50 épisodes SIM dans la chaîne SG (Film 1); temps d’une-temps de 1,8 s; suivi par le logiciel Imaris 8.4.1. Les pistes sont codées en couleur par une vitesse maximale de la voie (m/s); Elyra PS.1, mode SIM, objectif 100x/1.46 Huile; Barre d’échelle à 10 m. Ce chiffre a été modifié à partir de Jevtic et al.27. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Movie 1
Film 1 : Série DE time lapse SIM montrant les cellules représentantes tachées de SG. Barre d’échelle de 5 m. Les nucléoïdes mitochondriaux détectés sont marqués comme des sphères blanches. Les pistes sont visualisées sous le nom de « queues de dragon » (longueur de 8 cadres) et codées en couleur selon leurs vitesses instantanées maximales (barre de couleur en bas à droite montre des vitesses en m/s). Les nucléoïdes mitochondriaux suivi et visualisation par le logiciel Imaris 8.4.1. Cette vidéo a été publiée dans Jevtic et al.27. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo (Cliquez à droite pour télécharger).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Il y a plusieurs composantes critiques au protocole : pour obtenir l’étiquetage préférentiel de l’ADN mitochondrial, la concentration du colorant de liaison d’ADN pendant l’incubation devrait être maintenue très basse (p. ex., une dilution de 1:10 000 d’un stock commercial typique), et le temps d’incubation devrait être de 30 min. Le temps d’incubation ne doit jamais dépasser 1 h. Le colorant SYBR Gold doit être utilisé; d’autres colorants liant l’ADN ne sont pas assez brillants pour générer un signal fort lors de l’étiquetage à faible concentration.

La limitation de notre protocole est que le colorant est lavé des nucléoïdes mitochondriaux pendant une étape de perméabilisation. Par conséquent, la procédure décrite n’est pas appropriée pour les protocoles conventionnels d’immunofluorescence. Dans ce cas, les nucléoïdes dans les cellules fixes peuvent être étiquetés efficacement avec d’autres techniques, telles que les anticorps contre l’ADN ou les facteurs de transcription mitochondrial (TFAM).

L’étiquetage direct des nucléoïdes mitochondriaux avec le colorant organique liant l’ADN présente des avantages par rapport à l’étiquetage des protéines fluorescentes : tout type de cellule peut être étiqueté dans le cadre de lt;1 h, sans contraintes temporelles ou autres d’expression transitoire ou stable de constructions fluorescentes marquées par des protéines. En outre, dans les protocoles actuels, le marquage des protéines fluorescentes conventionnelles de TFAM a été rapporté pour causer des artefacts. En outre, SG tache efficacement les nucléoïdes que si le potentiel de membrane mitochondriale est intact. Cela empêche l’acquisition d’images de cellules biologiquement non pertinentes « malades » et mortes, qui ne peut pas être évitée avec la coloration basée sur LE FP. Enfin, les protocoles précédemment publiés basés sur les colorants de liaison d’ADN n’ont pas réalisé la coloration préférentielle de l’ADN mitochondrial.

Le protocole proposé est rapide et simple, donc nous supposons qu’il sera largement utilisé pour l’imagerie en direct des nucléoïdes mitochondriaux par diverses techniques de fluorescence, à la fois de la diffraction limitée (par exemple, confocal de balayage laser, TIRF, etc)) ainsi que super-résolution SIM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs reconnaissent Asifa Akhtar et Angelika Rambold (à la fois Max Planck Institute for Immunobiology and Epigenetics) pour la fourniture de cellules HeLa.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Elyra PS1 Carl Zeiss multi-modal super-resolution microscope containing module for super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM)
High glucose DMEM GIBCO/ThermoFisher 31966021
ibidi 35 mm dish, glass bottom Ibidi Gmbh 81158
ibidi 8-well microSlide, glass bottom Ibidi Gmbh 80827
Imaris 8.4.1 Bitplane/Oxford Instruments image porcessing and visualisation software package
iXon 885 Andor Technologies EMCCD camera with back-illuminated sensor
LSM880 Airyscan Carl Zeiss laser scanning confocal microscope with array detector
Mitotracker CMXRos Red ThermoFischer M7512 red live cell mitochondrial stain
Mitotracker Deep Red FM ThermoFischer M22426 far red live cell mitochondrial stain
picoGreen ThermoFischer P7581 cell permeant DNA stain
Plan Apochromat 100x/1.46 Oil objective Carl Zeiss
SYBR Gold ThermoFischer S11494 cell permeant DNA stain
Zen Black 2012 software Carl Zeiss image acquisition and processing software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaufman, B. A., et al. The mitochondrial transcription factor TFAM coordinates the assembly of multiple DNA molecules into nucleoid-like structures. Molecular Biology of the Cell. 18, (9), 3225-3236 (2007).
  2. Farge, G., et al. Protein sliding and DNA denaturation are essential for DNA organization by human mitochondrial transcription factor A. Nature Communications. 3, 1013 (2012).
  3. Bogenhagen, D. F. Mitochondrial DNA nucleoid structure. Biochimica et Biophysica Acta. 1819, (9-10), 914-920 (2012).
  4. Kang, D., Kim, S. H., Hamasaki, N. Mitochondrial transcription factor A (TFAM): roles in maintenance of mtDNA and cellular functions. Mitochondrion. 7, (1-2), 39-44 (2007).
  5. Tauber, J., et al. Distribution of mitochondrial nucleoids upon mitochondrial network fragmentation and network reintegration in HEPG2 cells. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45, (3), 593-603 (2013).
  6. Garrido, N., et al. Composition and dynamics of human mitochondrial nucleoids. Molecular Biology of the Cell. 14, (4), 1583-1596 (2003).
  7. Pernas, L., Scorrano, L. Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function. Annual Review of Physiology. 78, 505-531 (2016).
  8. Caielli, S., et al. Oxidized mitochondrial nucleoids released by neutrophils drive type I interferon production in human lupus. Journal of Experimental Medicine. 213, (5), 697-713 (2016).
  9. Okayama, S., Ohta, K., Higashi, R., Nakamura, K. Correlative light and electron microscopic observation of mitochondrial DNA in mammalian cells by using focused-ion beam scanning electron microscopy. Microscopy (Oxf). 63, (Suppl 1), i35 (2014).
  10. Alan, L., Spacek, T., Jezek, P. Delaunay algorithm and principal component analysis for 3D visualization of mitochondrial DNA nucleoids by Biplane FPALM/dSTORM. European Biophysics Journal. 45, (5), 443-461 (2016).
  11. Kukat, C., et al. Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (33), 13534-13539 (2011).
  12. Kukat, C., Larsson, N. G. mtDNA makes a U-turn for the mitochondrial nucleoid. Trends in Cell Biology. 23, (9), 457-463 (2013).
  13. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, (5793), 1642-1645 (2006).
  14. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3, (10), 793-795 (2006).
  15. Benke, A., Manley, S. Live-cell dSTORM of cellular DNA based on direct DNA labeling. ChemBioChem. 13, (2), 298-301 (2012).
  16. Ishigaki, M., et al. STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells. Mitochondrion. 28, 79-87 (2016).
  17. Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
  18. Gustafsson, M. G., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94, (12), 4957-4970 (2008).
  19. Hirano, Y., Matsuda, A., Hiraoka, Y. Recent advancements in structured-illumination microscopy toward live-cell imaging. Microscopy (Oxf). 64, (4), 237-249 (2015).
  20. Brown, T. A., et al. Superresolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Molecular and Cellular Biology. 31, (24), 4994-5010 (2011).
  21. Lewis, S. C., Uchiyama, L. F., Nunnari, J. ER-mitochondria contacts couple mtDNA synthesis with mitochondrial division in human cells. Science. 353, (6296), aaf5549 (2016).
  22. Dellinger, M., Geze, M. Detection of mitochondrial DNA in living animal cells with fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 204, (Pt 3), 196-202 (2001).
  23. Ban-Ishihara, R., Ishihara, T., Sasaki, N., Mihara, K., Ishihara, N. Dynamics of nucleoid structure regulated by mitochondrial fission contributes to cristae reformation and release of cytochrome c. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, (29), 11863-11868 (2013).
  24. Zurek-Biesiada, D., et al. Localization microscopy of DNA in situ using Vybrant((R)) DyeCycle Violet fluorescent probe: A new approach to study nuclear nanostructure at single molecule resolution. Experimental Cell Research. 343, (2), 97-106 (2016).
  25. He, J. Y., et al. The AAA(+) protein ATAD3 has displacement loop binding properties and is involved in mitochondrial nucleoid organization. Journal of Cell Biology. 176, (2), 141-146 (2007).
  26. Ashley, N., Harris, D., Poulton, J. Detection of mitochondrial DNA depletion in living human cells using PicoGreen staining. Experimental Cell Research. 303, (2), 432-446 (2005).
  27. Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S. V. SYBR Gold dye enables preferential labeling of mitochondrial nucleoids and their time-lapse imaging by structured illumination microscopy. PLoS One. 13, (9), e0203956 (2018).
Étiquetage spécifique des nucléoïdes mitochondriaux pour la microscopie d’illumination structurée time-lapse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S. V. Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy. J. Vis. Exp. (160), e60003, doi:10.3791/60003 (2020).More

Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S. V. Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy. J. Vis. Exp. (160), e60003, doi:10.3791/60003 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter