Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Karakterisering af membran transportører ved heterologe udtryk i E. coli og fremstilling af membran vesikler

Published: December 31, 2019 doi: 10.3791/60009
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Bowling Green State University

Summary

Vi beskriver en metode til karakterisering af Proton-drevne membran transportører i membran vesikle præparater fremstillet ved heterologe udtryk i E. coli og lysis af celler ved hjælp af en fransk presse.

Abstract

Flere metoder er udviklet til funktionelt at karakterisere nye membran transportører. Polyaminer er allestedsnærværende i alle organismer, men polyamin vekslere i planter er ikke blevet identificeret. Her skitserer vi en metode til at karakterisere polyamin antibærere ved hjælp af membran vesikler genereret fra lysis af Escherichia coli celler heterologously udtrykker en plante antiporter. For det første, vi heterologously udtrykte AtBAT1 i en E. coli stamme mangelfuld i polyamin og arginin udveksling transportører. Vesikler blev fremstillet ved hjælp af en fransk presse, renset af ultracentrifugering og anvendes i en membranfiltrering assay af mærkede substrater til at demonstrere substratspecificitet af transportøren. Disse assays viste, at AtBAT1 er en proton-medieret transportør af arginin, γ-aminosmørsyre (GABA), putrescine og spermidine. Den mutante stamme, der blev udviklet til assay af AtBAT1 , kan være nyttig til den funktionelle analyse af andre familier af plante-og dyre polyamin vekslere. Vi også hypotese, at denne fremgangsmåde kan bruges til at karakterisere mange andre typer af antibærere, så længe disse proteiner kan udtrykkes i bakteriecelle membranen. E. coli er et godt system til karakterisering af nye transportører, da der er flere metoder, der kan anvendes til mutagenize indfødte transportører.

Introduction

Proteiner, der er involveret i handel med metabolitter, udgør et væsentligt niveau for fysiologisk regulering, men langt størstedelen af plantens membran transportører er endnu ikke funktionelt karakteriseret. Flere strategier er blevet gennemført for at karakterisere nye transportproteiner. Heterologe udtryk i modelorganismer såsom E. coli og eukaryotiske celler såsom gær, xenopus oocytter, pattedyrsceller, insekt celler og planteceller er alle blevet brugt til at bestemme deres transportaktivitet1. Eukaryote celler er begunstiget for ekspression af eukaryote proteiner, fordi den grundlæggende cellulære sammensætning, signal transducere veje, transskription og oversættelse machineries er forenelige med de indfødte forhold.

Gær har været en vigtig model organisme til karakterisering af nye transport proteiner i planter. Den første vegetabilske transport protein, der blev udtrykt med succes i gær (Saccharomyces pombe) var hexoseenheder transporter HUP1 fra chlorella2. Siden da er mange vegetabilske transportproteiner blevet funktionelt karakteriseret ved hjælp af et gærudtryks system. Disse omfatter vegetabilske sukker transportører (SUC1 og SUC23, VfSUT1 og VfSTP14) og auxin-transportører (AUX1 og PIN5). Ulemper ved at udnytte gær til at udtrykke vegetabilske proteiner kan omfatte nedsat aktivitet af plastid-lokaliserede proteiner, fordi gær mangler denne organelle, mistargeting6, og dannelse af misfoldede aggregater og aktivering af stress respons i gær på grund af over ekspression af membran proteiner7,8,9.

Heterologe udtryk af transportproteiner i Xenopus oocytter har været meget anvendt til elektrofysiologisk karakterisering af transportører10. De første vegetabilske transport proteiner karakteriseret ved hjælp af heterologe udtryk i Xenopus oocytter var Arabidopsis kalium kanalen KAT110 og Arabidopsis hexoseenheder transporter STP111. Siden da har Xenopus oocytter været ansat til at karakterisere mange vegetabilske transport proteiner såsom plasma membran transportører12, VAKUOLAR saccharose transporter SUT413 og vakuolar Malate transportør ALMT914. En vigtig begrænsning af Xenopus oocytter til transport assays er, at koncentrationen af intracellulære metabolitter ikke kan manipuleres1. Desuden er det nødvendigt med faglig viden for at forberede Xenopus oocytter, og variabiliteten af oocyt-batcher er svær at kontrollere.

Heterologt udtryk i den model organisme E. coli er et ideelt system med hensyn til karakterisering af nye vegetabilske transport proteiner. Med et fuldt sekvenserede genom15er de molekylære og fysiologiske karakteristika ved E. coli velkendte. Molekylære værktøjer og teknikker er veletablerede16. Desuden er forskellige udtryks vektorer, ikke-sygdomsfremkaldende stammer og mutanter tilgængelige17,18,19. Desuden, E. coli har en høj vækstrate og kan let dyrkes under laboratorieforhold. Mange proteiner kan let udtrykkes og renses ved høje mængder i E. coli9. Når proteiner ikke kan blive analyseret direkte i cellulære systemer, har rekonstitution af proteiner i Liposomer også været en vellykket, omend udfordrende nyskabelse for karakterisering af rensede membran proteiner. Funktionel karakterisering af planten mitokondrie transport proteiner, herunder opløst stof transportører såsom fosfat transportører i sojabønner, majs, ris og Arabidopsis, dicarboxylat-tricarboxylat bærer i Arabidopsis er opnået ved hjælp af denne model system20,21. Imidlertid fandtes rekombinante proteiner af tomat protein SICAT9 at være nonfunktionelle i rekonstitutionseksperimenter, og andre medlemmer af Cat transporter familien fandtes at være nonfunktionelle i xenopus oocyt assays22. Således er der behov for yderligere molekylære værktøjer til karakterisering af membran transportører.

Fem polyamin transportsystemer findes i E. coli23. De omfatter to ABC-transportører, der formidler optagelsen af spermidin og putrescine, en putrescine/ornithine-veksler, en cadaverin/lysin-veksler, en spermidineksportør og en putrescine-importør. Den putrescine veksler pote var oprindeligt karakteriseret ved hjælp af en vesikelprotein assay, hvor indersiden ud vesikler blev fremstillet ved at lyserende celler med en fransk presse og måling optagelsen af radioaktivt mærket putrescine i vesikler i bytte for ornithin24. Vesicle assays blev også brugt til at karakterisere en calcium transportør, som medierede transport af calcium som reaktion på en protongradient25. Disse eksperimenter fik os til at udvikle en strategi for karakterisering af andre polyamin vekslere. Vi har først skabt en stamme af E. coli mangelfuld i pote og cadb vekslere. Her viser vi den funktionelle karakterisering af en plante polyamin antiporter ved heterlogt udtryk i den modificerede E. coli stamme, generation af membran vesikler ved hjælp af en fransk presse, og radioaktivt mærkede assays.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. generation af E. coli dobbelt knock out mutant med P1 transduktion

  1. Få e. coli single-knockout mutant-stammerne δpote og δcadb fra e. coli Genetic Stock Center (http://cgsc.Biology.Yale.edu).
    Bemærk: Δpote -stammen er kanamycin-resistent26 , og δcadb -stammen er tetracyclin-resistent27.
  2. Byg pote/CadB Double knockout (dko)-stammen ved hjælp af P1-transduktionsprotokol28.
    1. Klargøring af lysat
      1. En overnight kultur af Δpote fortyndes i frisk LB (1:100) suppleret med 10-25 mm Mgcl2,5mm CaCl2og 0,1-0,2% glucose.
      2. Vokse ved 37 °C for 1-2 h.
      3. Tilsæt 40 μl P1 fagtypning lysat til kulturen, og Fortsæt med at vokse ved 37 °c. Monitor til 1-3 h, indtil kulturen har lyseres
        Bemærk: når kulturen er lysed, vil cellerester være synlige i røret, og kulturen vil have et betydeligt tab af turbiditet.
      4. Tilsæt flere dråber chloroform (50-100 μL) til lysatet og vortex. Centrifugeres ved 12.000 x g i 2 minutter for at fjerne cellulære rester og overføre supernatanten til et friskt rør.
    2. Transduktion
      1. Grow Δcadb stamme natten over i lb medium.
      2. Høst cellerne ved centrifugering ved 4.000 x g i 2 min og resuspension i 1/5-1/3 den høstede kultur volumen i frisk lb suppleret med 100 mm mgso4 og 5 mm CaCl2.
      3. Tilsæt δcadb -cellesuspensionen til røret med fagtypning fra trin 1.2.1.4 og bland hurtigt.
      4. Tilsæt 200 μL 1 M na-citrat (pH 5.5), og tilsæt derefter 1 mL LB. Inkuber ved 37 °C i 1 time for at tillade ekspression af den antibiotikaresistente markør.
      5. Spin celler ved 4000 x g i 5 min.
      6. Resuspension i 100 μL LB supplemeted med 100 mM na-citrat (pH 5,5) og vortex godt at dispersere celler.
      7. Vælg de rekombinante stammer på lb agar plader med 50 μg/ml kanamycin og 10 μg/ml tetracyclin og bekræft derefter med polymerasekædereaktion (PCR) med passende primere26,27.
      8. Kontrollér PCR-fragmenterne ved sekvensering.

2. ekspression af Målgenet (AtBAT1) i E. coli mutant

  1. Amplificere den fulde længde sekvens af målgenet ved PCR og indsætte i Gateway Entry vektor pENTR/D-TOPO29.
    Bemærk: I dette tilfælde blev atbat 1.1 forstærket ved hjælp af Forward primer 5 ' cggcgatcaatcctttgtt og reverse primer 5 ' gctaagaatgttggagatgg, en Initial denaturering ved 98 °c i 2 min og derefter 30 cyklusser af denaturering ved 98 °c i 0,1 min, udglødning ved 59 °c for 0,3 min, udvidelse ved 72 °c for 0,40 min og endelig udvidelse ved 72 °c i 10 min. PCR-produktet blev renset ved hjælp af et PCR-oprydnings kit, der blev kvantificeret ved hjælp af et spektrometer. Indsættelse af PCR-produktet i Gateway-vektoren blev udført efter fremstillingsanvisningerne.
    1. Transformér indgangs vektoren til kompetente top10 E. coli -celler ved hjælp af heatshock, og vælg for vellykkede rekombinanter på lb-medier med 50 μg/ml kanamycin efter standard molekyl klonings protokoller30.
    2. Ekstrakt plasmid DNA ved hjælp af et plasmid ekstraktions kit, efter producentens anvisninger, og sekvens for at bekræfte den korrekte indsættelse.
  2. Overfør målgenet til E. coli -destinations vektoren, pbad-DEST49 ved gateway LR-kloning for at oprette et udtryk Vector29.
    1. Forvandl udtryks vektoren til kompetente top10 E. coli -celler ved hjælp af heatshock i 30 s, og vælg vellykkede rekombinanter på lb-medier med 100 μg/ml ampicillin30.
    2. Ekstrakt plasmid DNA30 og sekvens for at bekræfte den korrekte indsættelse.
  3. Transformér udtryks vektor til E. coli δpote740 (del):: kan, ΔcadB2231:: Tn10 og vælg på lb-plader med ampicillin, kanamycin og tetracyclin30.
  4. For at bestemme den optimale koncentration af Arabinose til induktion, udtrykker målgenet under AraBAD-promotoren i lb-medier med gradient koncentrationer af Arabinose som beskrevet29.
  5. Saml celle pellets og vurdere protein ekspression af SDS-side og visualisering af protein bands som beskrevet i produktmanualen29.
    Bemærk: E. coli δpote740 (del):: kan, ΔcadB2231:: Tn10 blev brugt som kontrolprøve uden BAT1 udtryk. E. coli dobbelt knock out mutant celler med den tomme PBAD-DEST49 vektor blev ikke brugt som et kontrolelement på grund af tilstedeværelsen af ccdb genet i vektoren.

3. generering af indvendige membran vesikler

  1. Kultur E. coli -mutant cellerne, der udtrykker målproteinet ved at dyrke en enkelt koloni natten over i 5 ml polyamin frie medier (2% glycerol, 6 g af K2HPO4, 3 g KH2po4, 0,5 g NaCl, NH4CL, 50 mg thiamin, 0,79 g gær komplet syntetisk medie adenin Hemisulfat (10 mg/L), l-arginin (50 mg/L), L-aspartinsyre (80 mg/l), L-Histidinhydrochlorid monohydrat (20 mg/l), l-leucin (100 mg/L), L-lysinhydrochlorid (50 mg/L), l-methionin (20 mg/l), L-phenylalanin (50 mg/L), L-Threonin (100 mg/L), L-tryptophan (50 mg/L), L-tyrosin (50 mg/L), L-valin (140 mg/L), uracil (20 mg/L)). Overfør denne kultur til 500 mL polyamin frie medier suppleret med 0,0002% Arabinose og vokse, indtil cellekulturen når en OD600 af 0,6-0,8 (normalt ~ 5 h).
  2. Celle pellet opsamles ved centrifugering ved 2.000 x g i 15 minutter ved 4 °c. Resuspension af pellet og vask tre gange med 0,1 M kaliumphosphat buffer, pH 6,6, indeholdende 10 mM EDTA (buffer 1). Den endelige volumen af celler i buffer 1 efter den tredje spin bør være 10 mL.
  3. Generer indefra-ud membran vesikler ved fransk presse behandling (10.000 p.s.i.) af de intakte celler ved hjælp af en 35 mL fransk tryk celle.
  4. Før prøven indlæses i den franske standard tryk celle, skal du smøre stemplet og O-ringene for at gøre det lettere at indsætte i cellen.
    Bemærk:Disse anvisninger er specifikke for brug af standard tryk cellen31.
    1. Skru forsigtigt lukke proppen ind i den nedre ende af cellen. Sørg for, at cellen er højre side opad baseret på bogstaver på siden af cellen. Indsæt stemplet i cellen og Flyt det ind i cellen, indtil Max fill line på stemplet når toppen af stemplet. Vend enheden om og Placer den på den medfølgende stander mellem de tre stolper.
    2. Hæld cellesuspensionen i cellens krop.
      Bemærk: Vi har brugt kun 10 mL, så der vil være masser af plads tilbage i det franske tryk celle kammer, som har en kapacitet på 35 mL.
    3. Monter standard tryk cellen på den franske tryk celle enhed.
      1. Kontroller først, at strømmen er slukket. I venstre side af panelet er forholdet vælger kontakten. Det har tre positioner: ned i slutningen af kørslen, lav for at bruge en mindre tryk celle, og høj til brug med standard fransk tryk celle. Hvis den franske presse tidligere blev brugt med den mindre celle, kan stemplet ikke trækkes helt tilbage. Indstil denne knap til ned.
    4. Tænd maskinen med kontakten på RHS bag på enheden, og drej pause-Run- kontakten til kørsels positionen. Dette vil resultere i, at stemplet trækkes helt tilbage. Flyt kontakten tilbage til pause, og luk maskinen af.
    5. Løsn tommelskruerne, og bevæg sikkerheds klemmen, der strækker sig til to søjler i rustfrit stål til siden. Det vil svinge ud til højre. Med den ene hånd holder bunden af lukningen stikket på plads, skal du vælge den franske tryk celle op med begge hænder, og rotere det 180 °, så stemplet er nu i oprejst position. Sæt den på platformen, og Flyt sikkerheds klemmen tilbage på plads, så denne klemme holder den franske tryk celle i position.
    6. Bemærk at flow ventil samlingen på lukke proppen skal være tilgængelig for opereret og placeret således, at ventilen kan drejes frit. Åbn flow ventil samlingen med et par Counter med uret sving. Placer armene på stemplet, så de er orienteret i en to o'clock og klokken otte position. Stram tommelskruerne, så standard tryk cellen holdes på plads.
    7. Indsæt prøve udtagningsrøret i lukke proppen, og Tilslut et kort stykke fleksibelt rør, så den ødelagte celle snavs kan opsamles i en Falcon tube. Vi bruger normalt en 300 mL isfyldt bæger til at holde Falcon røret oprejst, og for at holde celle resterne kølet.
    8. Sørg for, at kontakten pause-Run er indstillet til pause, og at ventil samlingen er i åben position. Drej maskinen tilbage til on, adust forholdet vælgeren til høj, og drej tryk stignings ventilen på frontpanelet til højre omkring en halv drejning.
    9. Stemplet vil begynde at stige fra bunden for at fortrænge luften i kammeret. Direkte den luft, der kommer ud af Tygon slangen, der er fastgjort til prøve udløbsrøret, til røret i bægerglasset.
    10. Når de første dråber væske kommer ud, skal du lukke flow ventil samlingen ved at dreje den med uret. Dette skaber en metal til metal tætning, med tryk cellen, så stram ikke.
    11. Forsiden af den franske presse har et diagram på frontpanelet for at generere det korrekte tryk på de biologiske celler inde i tryk cellen. I dette tilfælde øges trykket ved at dreje tryk stignings ventilen med uret, indtil måleren når 640 PSI. Dette vil skabe et internt Tryk på 10.000 PSI.
    12. Når cellen har nået måltrykket, skal du åbne flow ventil samlingen lidt ved at dreje den mod uret. Juster åbningen af ventilen for at tillade en strømningshastighed på kun omkring 10 dråber pr. min.
    13. Når stop linjen på stempel legemet når toppen af flowcellen. Skift pause-Run-kontakten til pause. Dette er afgørende, fordi det at have stemplet indsat længere ind i cellen vil beskadige enheden. Åbn flow ventil samlingen og Saml de resterende dråber.
    14. Drej ratio Selector -kontakten til down, og indstil derefter pause Run -kontakten til at køre. Når bundpladen er fuldt tilbagetrukket, skal du indstille Kør -kontakten for at afbrydeog slukke for maskinen.
    15. Fjern den franske tryk celle fra den franske presse, og demontere til rengøring. Opbevar alle dele tørre med en lys belægning af glycerol. Fjern og Udskift pakninger eller tætninger med tegn på slid.
  5. Fjern ubrudte celler og cellerester fra den franske presse elueringsvæske ved centrifugering ved 10.000 x g i 15 minutter ved 4 °c. Kassér pellet, og overføre supernatanten til ultracentrifuge rør.
  6. Blærer fra den resulterende supernatanten med ultracentrifugationat 150.000 g i 1 time ved 4 °C.
  7. Membranens vesikler vaskes én gang, uden resuspension, i 1 mM Tris-malat, pH 5,2 indeholdende 0,14 M KCl, 2 mM 2-mercaptoethanol og 10% glycerol og resuspension i samme buffer (buffer 2)23 ved hjælp af en dounce vævs sliber. Typisk vil membranen fraktion fra 500 mL kultur blive suspenderet i 5 mL buffer, og en koncentration på 5-10 mg membran protein/mL ved hjælp af Biochininsyre assay32.
  8. Opbevar 100 μL aliquoter af membran præparater ved-80 °C i 1,5 mL mikrocentrifuge glas.

4. Western blot og orientering af transportør analyse

  1. Vask og resuspension af vesikler fra trin 3,7 i 30 mM Tris pH 7,8 + 0,1 mM CoCl2.
  2. Til 100 μL prøver tilsættes 1 μL 2 mg/mL carboxypeptidase A i 0,1 M NaCl, 30 mM Tris, 0,2 mM CoCl2 pH 7,8.
  3. Inkube i 20 minutter ved 20 °C. Stop fordøjelsen ved tilsætning af 5 μL 0,5 M NaEDTA, 0,5 M 2-mercaptoethanol pH 7,5.
  4. For helt at inaktivere enzymet, inkubatér opløsningen i 1 time ved stuetemperatur.
    Bemærk: Vesikler uden catboxypeptidase blev en behandling anvendt som kontrol.
  5. Analyser prøver ved elektroforese i nærværelse af lithium dodecyl sulfat. Tilsæt 5-10 μl af 150 mg/ml lithiumdodecylsulfat, 450 mg/ml glycerol, 0,1 mg/ml bromphenolblåt blå, 0,4 M Tris pH 7,5 til 100 μl af prøven.
  6. Udføre blot ved at lægge et nitrocellulose filter fugtet med 25 mm natrium-hydrogenphosphat pH 7,5 på polyacrylamid gel. Placer disse mellem to fugtet cellulose filtre og endelig mellem to fugtes plastik skure puder. Denne samling placeres mellem elektroderne i et kammer, der indeholder 25 mM natrium-hydrogenphosphat pH 7,5 ved 2-4 °C.
  7. Tillad elektro overførsel af proteiner til at fortsætte i 3 h ved 20 V og 2-3 A.
  8. Nitrocellulose membranen overnatter ved 2 °C i en blokerende buffer på 0,15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5 og 0,5 mg/mL Tween 2033.
  9. Nitrocellulose filteret inkubates i 2 timer med en 1:5000 fortynding af anti-His (C-terminalen)-HRP-antistof i blokerings bufferen (20 mL) og vaskes to gange med 50 mL buffer i alt 60 min.
  10. For at visualisere immunoblot, opløses 6 mg 4-chloro-1-naphthol i 20 mL denatureret alkohol og tilsættes 80 mL af 15 mM Tris pH 7,5 og 50 μL af 30% H2O2. Bade filtrerpapiret i substratopløsningen i 20 min. Reagenset vil reagere med antistoffet for at danne et blåt bundfald på nitrocellulose membranen. Når tilstrækkelig farve har udviklet, skyl membranen med vand, og lad det tørre.

5. transport-analyse

  1. Inkubator 100 μL aliquoter af membran vesikler ved 12 °C i 5 min.
  2. Initiering af transport ved tilsætning af radioaktivt mærkede polyaminer til membranens vesikler ved en endelig koncentration på 50 μM (medmindre andet er angivet). Lav 3H-substrat (spermidine eller putrescine) opløsninger i en analyse buffer bestående af 10 mm Tris-HCl, 10 mm Kaliumphosphat, pH 8,0 og 0,14 M KCl23 (buffer 3) med modifikationer afhængigt af analysen.
  3. Udfør transport assays i 1 min ved 12 °C i 1,5 mL mikrofuge rør.
  4. Efter 1 min. overføres reaktions blandingerne til filtrerings manifold og filtreres gennem et 0,45 μm nitrocellulose membranfilter.
    1. Der tilsættes 3 mL iskold-analyse buffer med en 10 gange højere koncentration af ikke-mærkede polyaminer efterfulgt af 3 mL analyse buffer uden polyaminer for at reducere den uspecifikke binding.
    2. Overfør de vaskede filtre til 20 mL engangs-scintillationshætte glas indeholdende 10 mL scintillationsvæske, og bestem radioaktivitet ved hjælp af en flydende scintillationstæller. Scintillationstælleren måler radioaktiviteten i prøven og rapporterer den som disintegrationer pr. minut (DPM).
  5. Netto optagelsen af polyamin beregnes som forskellen mellem optagelsen ved 1 min. af vesikler inkuberet ved 12 °C og optagelsen ved 0 min ved vesikler inkuberet på is.
    Bemærk: Massen af substrat, der importeres til vesikler, beregnes på følgende måde. Hvis prøvevolumenet i mikrofuge røret er 0,2 μL, og udgangs koncentrationen af substrat er 100 μM, er den totale masse af substrat i mikrofuge røret 20 x 10-12 M. På grund af den meget høje specifikke aktivitet af kommercielt mærkede substrater (ofte 2,22 x 109 DPM/mm) kan massen af den tilføjede isotop ignoreres i beregningen. Så hvis den samlede mængde isotop, der blev tilsat til mikrofuge røret var 100 x 106 DPM og vesikler havde en netto optagelse af 1.000 DPM, så den samlede masse af substrat taget op af vesikler var 1% af det samlede antal mol af substrat eller 2 x 10-13 M.
    1. Bestem Km for substratet ved at måle optagelsen af 10, 25, 50, 250 og 500 μM radioaktivt mærket substrat i vesikler, som udtrykker målproteinet. Beregn Michaelis-Menten kinetik ved hjælp af en ikke-lineær regressionsmetode ved hjælp af Michaelis Menton-modellen i den statistiske softwarepakke34.
  6. For konkurrence forsøgene tilsættes 100 μM, 500 μM, 1 mM, 1,5 mM eller 2 mM ikke-mærket konkurrence substrat, som er fremstillet i analyse bufferen, til det 1,5 mL mikrocentrifuge glas, der indeholder 100 μL vesikler ved 12 °C.
    1. Tilsæt radioaktivt mærket polyamin (50 μM) til mikrocentrifuge glasset samtidigt.
    2. Mål radioaktivitet fanget i vesikler som nævnt ovenfor ved at gentage trin 5 til 5.4.2.
    3. Bestem tilsyneladende km (km, app) for de konkurrencemæssige substrater ved at måle optagelsen af 10, 25, 50, 250 og 500 μM radioaktivt mærkede polyaminer i nærværelse af 100 μM eller højere ikke-mærket substrat og ved hjælp af en ikke-lineær regressionsmetode til at afbilde kurven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De vigtigste skridt i denne protokol er opsummeret visuelt i figur 1. Kort, E. coli celler mangelfuld i alle polyamin vekslere og udtrykker AtBAT1 dyrkes, centrifugeret, vaskes med en buffer og underkastes celle lysis ved hjælp af en fransk presse. Lysis tendens til at producere vesikler, der er for det meste indefra-ud og fælde bufferen uden for cellerne. Cellerester fjernes ved centrifugering, og et andet ultracentifugationstrin bruges til at indsamle en membran pellet. Membran pellet opslæmmede i Tris-Maleate buffer pH 5,2 og opbevares ved-80 °C. Transport assays er udført ved 12 °C, hvilket viste sig at være optimalt til opretholdelse af membran stabiliteten. Assays initieres ved tilsætning af radioaktivt mærket substrat og et skift i pH-værdien af buffer suspensionen af vesikler til pH 8,0. Efter 1 min. tilsættes iskold-analyse buffer med ikke-mærkede substrater for at standse optagelsen af radioaktivt mærket i vesikler. Radioaktivt mærkede vesikler fanges ved filtrering gennem nitrocellulose membraner. Membraner overføres til scintillationshætte glas, og radioaktiv på membranerne bestemmes af flydende scintillationstælling.

En Western blot bruges til at kontrollere, at AtBAT1 er omplaceret til vesikler (figur 2). Probing den skamplet med en anti-hans C-Terminal antistof afslørede en fusion konstruere protein på ca. 72,3 kDa (figur 2, Lane 2). Fordøjelsen af vesikler forud for SDS-side resulterede i en dimunition, men ikke et fuldstændigt tab af sonde signalet (figur 2, Lane 3). Faldet i sonde signalet som følge af carboxypeptidase A antyder, at de fleste af C-terminalerne er på yderside af vesikler.

I dette analyse system suspenderes vesikler i en buffer ved pH 5,2, således at pH-værdien inde i vesikler er i ligevægt med bufferen. Transport af det radioaktivt mærkede substrat i vesikler ved pH 5,2 initieres ved suspension af vesikler i en pH 8,0-buffer, hvorved der skabes en pH-gradient på pH 2,8 på tværs af membranen. Ved 12 °C var optagelsen af radioaktivt mærket spermidin ved vesikler højest i 1 min. og forblev lineær over 3 min (figur 3A). Inkubationstiden for transport analysen blev derfor fastsat til 1 min. For ikke-specifik binding af radioaktiv blev vesikler inkuberet ved 0 °C i tilstedeværelse af radioaktivt mærket substrat i et minut, og disse tal blev trukket fra optagelsen af ladiolabel ved højere temperaturer.

Figur 3B viser optagelsen af radioaktivt mærket spermidin i vesikler efter et minut. Der var ingen netto optagelse af isotop ved membran vesikler, der blev forberedt og opbevaret ved pH 8,0, da der ikke var nogen protongradient over vesikle membranen. For at påvise virkningen af spredning af den kunstige protongradient blev membranerne vesikler inkuberet i pH 8,0 buffer i 10 min før tilsætning af mærket substrat25. Under disse omstændigheder blev der vist en minimal optagelse af radioaktivt mærket substrat. Optagelsen af radioaktivt mærket spermidin var også minimal i vesikler tilberedt med E. coli -celler, som var mangelfulde i polyaminudvekslere CAdB og pote. Tilsammen viser disse resultater, at den proton drevne optagelse af spermidin skyldtes BAT1-proteinet (figur 3A, B).

For at bestemme proteinets substratspecificitet blev Km værdier beregnet ved at måle optagelsen af radioaktivt mærket substrat ved 10, 25, 50, 100, 250 og 500 μM koncentrationer. Km for spermidin, putrescine og arginin var 55 ± 12 μm, 85 ± 20 μM og 1,4 ± 0,5 mm, hvilket indikerer, at dette protein er en høj affinitet polyamin og arginin veksler (figur 4).

Transportørens affinitet for et bestemt substrat kan også bestemmes indirekte ved hjælp af konkurrenceanalyser. Her har vi brugt to metoder til at evaluere konkurrencen mellem to substrater. Ved den første metode blev optagelsen af 50 μM radioaktivt mærket spermidin målt i tilstedeværelse af stigende koncentrationer af det ikke-mærkede konkurrerende substrat (figur 5A). I den anden metode blev den tilsyneladende Km for spermidin beregnet ved at måle optagelsen af stigende koncentrationer af radioaktivt mærket spermidin i nærværelse af 100 μM ikke-mærket konkurrerende substrat (figur 5B). Konkurrence assays afslørede, at GABA er en konkurrencedygtig hæmmer af spermidine med en Km, app på 164 ± 15 μM (figur 5a, B). Desuden afslørede optagelsen af 50 μM radioaktivt mærket spermidin i nærværelse af varierende koncentrationer af forskellige aminosyrer, at AtBAT1 også er i stand til at transportere glutamat og alanin ved mM koncentrationer (figur 6).

Figure 1
Figur 1: skematisk gengivelse af metoden. A) skematisk gengivelse, der skitserer de vigtigste trin i forberedelsen og oprensningen af membran vesikler fra E. coli. B) skematisk gengivelse, som skitserer de vigtigste trin i transport analysen af membran vesikle præparater med radioaktivt mærkede substrater. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Western blot viser udtryk for AtBAt1 i rensede vesikler. Bands blev visualiseret ved hjælp af peberrod peroxidase konjugeret anti-His (C-term)-HRP antistof. Lane 1, prestained protein stigen. Lane 2, renset vesikler, der udtrykker atbat 1.1 viser et bånd af den forventede størrelse af fusions proteinet. Lane 3, renset vesikler, der udtrykker atbat 1.1, blev forbehandlet med carboxypeptidase A før SDS elektroforese og Western blotting. Der blev føjet tilsvarende mængder vesikler (protein) til hver vognbane. Nedsat farvning indikerer, at C-terminalen af proteinet i de fleste vesikler nedbrydes ved proteasefordøjelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: vesikles transport aktivitet, der viser virkningen af BAT1 protein ekspression og betydningen af en pH-gradient. (A) tidsafhængig optagelse af 3H mærket spermidin i vesikler, der udtrykker BAT1 med en intern pH-værdi på 5,2 og introduceret til en buffer ved pH 8,0. I kontrol analysen blev vesikler føjet til analyse bufferen ved pH 8,0, 10 min før tilsætning af 3H mærket spermidin for at muliggøre afledning af Proton gradienten. Derefter blev optagelsen af radioaktiv i vesikler vurderet over et interval på 1 min. B) optagelse af 3H mærket spermidin i nærværelse af en protongradient (intern pH på 5,2), i mangel af en protongradient (intern pH på 8), i vesikler føjet til analyseopløsningen 10 min før tilsætning af radioaktivt mærket spermidin og i vesikler fremstillet af E. coli mutant celler, der ikke udtrykker BAT1. Optagelse i vesikler blev overvåget i 1 min. Alle værdier præsenteres som Mean ± SE af fem replikater. Data analysen blev udført ved hjælp af en elevs t-test og * indikerer en signifikant forskel fra kontrolelementet (p -værdi < 0,05). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: in vitro-assays af polyamin og arginin transport aktivitet af BAT1. A) Km -værdierne for spermidin-og putrescin-optagelsen er henholdsvis 55 ± 12 μm og 85 ± 32 μm. (B) Km for arginin optagelse er 1,4 ± 0,5 mm. Alle værdier præsenteres som Mean ± SE af fem replikater. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: GABA er en konkurrencedygtig hæmmer af Spermidine transport af BAT1. (A) optagelsen af 3H mærket spermidin af vesikler, der udtrykker atbat 1.1, blev signifikant reduceret i nærværelse af 100 ΜM eller 500 μM GABA. (B) tilsyneladende Km for spermidinoptagelse af bat 1.1 blev forhøjet til 164 ± 20 μM ved tilstedeværelse af 100 μM GABA. Alle værdier præsenteres som Mean ± SE af fem replikater. Data analysen blev udført ved hjælp af en elevs t-test og * indikerer en signifikant forskel fra kontrolelementet (p -værdi < 0,05). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: glutamat og alanin er konkurrencedygtige hæmmere af spermidine vejtransporten BAT1. Spermidinoptagelsen var signifikant reduceret i nærværelse af 1 mM ikke-mærket glutamat og 1,5 mM ikke-mærket alanin. Alle værdier præsenteres som Mean ± SE af fem replikater. Data analysen blev udført ved hjælp af en elevs t-test og * indikerer en signifikant forskel fra kontrolelementet (p -værdi < 0,05). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I nærværende undersøgelse skitserer vi en metode til karakterisering af en antiporter ved først at udtrykke proteinet i E. coli og derefter generere membran vesikler, således at det heterologously udtrykte protein kan blive analyseret i et celle frit system. Ud over udstyr, der findes i de fleste molekylære biologi laboratorier, denne strategi kræver brug af en fransk presse, en ultracentrifuge, og adgang til en facilitet til at udføre radioisotop assays.

Et grundlæggende krav i denne teknik er, at det heterologe protein er korrekt målrettet til plasma membranen af E. coli. Denne strategi kan også være nyttig til funktionel analyse af organellar transportører, da plastid ADP glucose transporter blev med succes lokaliseret til E. coli cellemembranen og funktionelt karakteriseret35. Vektoren (pBAD-DEST49), der anvendes i disse eksperimenter indeholder en N-terminal thioredoxin protein til at øge opløseligheden af det oversatte produkt. N-terminal fusioner af en lille B. subtilus protein Mystic, har været fundet for at muliggøre mere effektiv målretning af membran transportører til cytoplasmiske membran36. Men, fejl foldning begivenheder, og svigt af proteiner til at være ordentligt integreret i cytoplasmatiske membran er potentielle problemer, der udelukker brugen af bakterielle udtryks systemer for mange typer af transportører1.

Der er også anvendt membran vesikler til at karakterisere plante transportører37,38. Da vesikler mangler de essentielle energikilder som ATP og enzymer, er interferensen fra aktive transportører og anden metabolisk aktivitet minimal. Dette system er således ideelt til analyse af passive omplaceringer såsom metabolit-vekslere. De krænget membran vesikler, især, kan anvendes til karakterisering af eksportører og antibærere, da sammensætningen af den interne løsning kan manipuleres ved at ændre sammensætningen af buffer 1. Desuden, ved hjælp af fransk presse eller ultralyd sonikering er temmelig effektiv i generering indefra-ud membran vesikler fra intakt E. coli celler. 95% af vesikler genereret ved ultralydsonikering eller fransk presse har krænget membraner39,40. PotE, E. coli antiporter af putrescine og ornithine, var den første polyamin antiporter, der var karakteriseret ved hjælp af indvendige membran vesikler23. Vi brugte P1 transduktion til at skabe en specifik mutant stamme til karakterisering af en polyamin antiporter, og denne stamme kan være nyttig til karakterisering af andre dyr, svampe eller plante polyamin vekslere. Vi forestiller også, at andre E. coli -stammer med to eller flere gensletninger kan være nyttige til karakterisering af andre plante-og dyre udvekslings transportører ved hjælp af membran vesikler.

Det mest kritiske trin i denne protokol er ekspression af proteinet i E. coli -mutant systemet. En E. coli ekspressions vektor med en inducerbar promotor udnyttes til at fremme stram, dosisafhængig regulering af det heterologe genekspression. Tilstedeværelsen af N terminal og C Terminal Tags såsom hans-patch thioredoxin, V5 epitop eller 6xhis i vektoren er nyttig til påvisning og rensning af proteinet. Desuden kan tilstedeværelsen af et thioredoxin-fusionsprotein, som er en bestanddel af pBAD49-vektoren, øge oversættelses effektiviteten og i nogle tilfælde Opløselighed af eukaryotiske proteiner udtrykt i E. coli41. De forskellige codon valg i Arabidopsis og e. coli kunne udfordre protein ekspression i e. coli. Det er kendt, at codon optimering kan imponerende øge heterozygot proteiner udtryk i E. coli42. I vesikelprotein-Analysen viste codon optimeret atbat 1.2 en højere udvekslings aktivitet end ikke-codon optimeret atbat 1.1 i E. coli -celler (data ikke vist), hvilket viser, at codon optimering var nyttigt at forbedre ekspression og funktion af heterologously udtrykte proteiner i bakterieceller. Fremstilling af membran vesikler ved omhyggelig justering af ventilen for at opretholde en langsom selv drop af lysede celler er også et vigtigt skridt i proceduren. Efter ultracentrifugering har vi konstateret, at opblanding af membran vesikler i en dounce homogenisator minimerer prøven for at prøve variation mellem aliquoter af membran vesikler, der forberedes og efterfølgende opbevares ved-80 °c.

En begrænsning af E. coli ekspressionssystemer er, at de ikke er i stand til post-translationelle modifikationer såsom N-glykosylering eller acetylering. Fravær af disse protein modifikationer kan påvirke protein aktivitet1. Men, mutanter i stand til at udføre disse modifikationer er blevet identificeret og kan bruges som et redskab til at udtrykke proteiner, der kræver sådanne modifikationer43. Genereringen af tilstrækkelige mængder af det udtrykte protein kunne være en udfordring på grund af udfolder sig og aggregering som inklusions organer, svigt af proteinet til at være ordentligt integreret i den cytoplasmiske membran, mistargeting og mis-regulering på grund af manglende post translationelle modifikationer.

En mindre begrænsning af denne teknik er, at det ikke giver bevis for den naturlige orientering af transportøren. Dette kan opnås ved at drage fordel af N eller C Terminal Tags og immunologiske metoder. Tilgængeligheden af en bestemt endestation af proteinet i vesikler kan opnås ved fordøjelsen af alle tilgængelige, og derfor formentlig eksterne Termini af bæreren, elektroforese af proteinet i nærværelse af natriumdodecyl sulfat, overførsel til nitrocellulose filtre og påvisning af de resterende, indre Termini med antistoffer40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Støtte til dette projekt kom fra BGSU Graduate College, og BGSU Office af sponsorerede programmer og forskning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
3H-putrescine PerkinElmer NET185001MC
3H-spermidine PerkinElmer NET522001MC
4-chloro-1-naphthol Sigma-Aldrich C8890
14C arginine Moravek Inc. MC137
Arginine Sigma-Aldrich A-5006
Anti-His (C-term)-HRP antibody ThermoFisher R931-25 Detects the C-terminal polyhistidine (6xHis) tag, requires the free carboxyl
group for detection
Arabinose Sigma-Aldrich A3256
BCA protein assay kit ThermoFisher 23227 Pierce BCA protein asay kit.
Bromophenol blue Bio-Rad 161-0404
Carboxypeptidase B Sigma-Aldrich C9584-1mg
Centrifuge Sorvall SS-34 fixed angle rotor and GA-6 fixed angle rotor
Dounce tissue grinder LabGenome 7777-7 Corning 7777-7 pyrex homogenizer with pour spout.
Ecoscint-H National Diagnostics LS275 scintillation cocktail
EDTA Sigma-Aldrich
Filtration manifold Hoefer FH225V
French Pressure Cell Glen Mills FA-080A120
GABA Sigma-Aldrich A2129
Glutamate Sigma-Aldrich G6904
Glycerol
GraphPad Prism software http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm
Hydrogen peroxide KROGER
Potassium Chloride J.T. Baker 3040-01
Liquid scintillation counter Beckman LS-6500
Maleate Sigma-Aldrich M0375
Nanodrop ThermoFisher
Nitrocellulose membrane filters Merck Millipore hawp02500 0.45 µM
PCR clean up kit Genscript QuickClean II
Potassium Phosphate dibasic ThermoFisher P290-500
putrescine fluka 32810
Potassium Phosphate monobasic J.T.Baker 4008
Spermidine Sigma-aldrich S2501
Strains :E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10 This manuscript Available upon request. Strain is deficient in the PotE and CadB polyamine exchangers.
Tris-base Research Products T60040-1000
Ultracentrifuge Sorvall MTX 150 46960 Thermo Fisher S150-AT fixed angle rotor
Ultracentrifuge tubes ThermoFisher 45237 Centrifuge tubes for S150-AT rotor
Vector: pBAD-DEST49 ThermoFisher Gateway expression vector for E. coli

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Haferkamp, I., Linka, N. Functional expression and characterisation of membrane transport proteins. Plant Biology (Stuttgart). 14 (5), 675-690 (2012).
  2. Sauer, N., Caspari, T., Klebl, F., Tanner, W. Functional expression of the Chlorella hexose transporter in Schizosaccharomyces pombe. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (20), 7949-7952 (1990).
  3. Sauer, N., Stolz, J. SUC1 and SUC2: two sucrose transporters from Arabidopsis thaliana; expression and characterization in baker's yeast and identification of the histidine-tagged protein. The Plant Journal. 6 (1), 67-77 (1994).
  4. Weber, H., Borisjuk, L., Heim, U., Sauer, N., Wobus, U. A role for sugar transporters during seed development: molecular characterization of a hexose and a sucrose carrier in fava bean seeds. Plant Cell. 9 (6), 895-908 (1997).
  5. Huang, J. G., et al. GhDREB1 enhances abiotic stress tolerance, delays GA-mediated development and represses cytokinin signalling in transgenic Arabidopsis. Plant, Cell & Environment. 32 (8), 1132-1145 (2009).
  6. Bassham, D. C., Raikhel, N. V. Plant cells are not just green yeast. Plant Physiology. 122 (4), 999-1001 (2000).
  7. Garcia-Mata, R., Bebok, Z., Sorscher, E. J., Sztul, E. S. Characterization and dynamics of aggresome formation by a cytosolic GFP-chimera. Journal of Cell Biology. 146 (6), 1239-1254 (1999).
  8. Liu, J., Sitaram, A., Burd, C. G. Regulation of copper-dependent endocytosis and vacuolar degradation of the yeast copper transporter, Ctr1p, by the Rsp5 ubiquitin ligase. Traffic. 8 (10), 1375-1384 (2007).
  9. Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).
  10. Schachtman, D. P., Schroeder, J. I., Lucas, W. J., Anderson, J. A., Gaber, R. F. Expression of an inward-rectifying potassium channel by the Arabidopsis KAT1 cDNA. Science. 258 (5088), 1654-1658 (1992).
  11. Boorer, K. J., Forde, B. G., Leigh, R. A., Miller, A. J. Functional expression of a plant plasma membrane transporter in Xenopus oocytes. FEBS Letters. 302 (2), 166-168 (1992).
  12. Miller, A. J., Zhou, J. J. Xenopus oocytes as an expression system for plant transporters. Biochimica et Biophysica Acta. 1465 (1-2), 343-358 (2000).
  13. Reinders, A., Sivitz, A. B., Starker, C. G., Gantt, J. S., Ward, J. M. Functional analysis of LjSUT4, a vacuolar sucrose transporter from Lotus japonicus. Plant Molecular Biology. 68 (3), 289-299 (2008).
  14. Kovermann, P., et al. The Arabidopsis vacuolar malate channel is a member of the ALMT family. The Plant Journal. 52 (6), 1169-1180 (2007).
  15. Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  16. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 72 (2), 211-222 (2006).
  17. Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. Journal of Molecular Biology. 260 (3), 289-298 (1996).
  18. Wagner, S., et al. Consequences of membrane protein overexpression in Escherichia coli. Molecular & Cellular Proteomics. 6 (9), 1527-1550 (2007).
  19. Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), e29191 (2011).
  20. Takabatake, R., et al. Isolation and characterization of cDNAs encoding mitochondrial phosphate transporters in soybean, maize, rice, and Arabidopis. Plant Molecular Biology. 40 (3), 479-486 (1999).
  21. Picault, N., Palmieri, L., Pisano, I., Hodges, M., Palmieri, F. Identification of a novel transporter for dicarboxylates and tricarboxylates in plant mitochondria. Bacterial expression, reconstitution, functional characterization, and tissue distribution. Journal of Biological Chemistry. 277 (27), 24204-24211 (2002).
  22. Snowden, C. J., Thomas, B., Baxter, C. J., Smith, J. A., Sweetlove, L. J. A tonoplast Glu/Asp/GABA exchanger that affects tomato fruit amino acid composition. The Plant Journal. 81 (5), (2015).
  23. Kashiwagi, K., Igarashi, K. Identification and assays of polyamine transport systems in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 720, 295-308 (2011).
  24. Kashiwagi, K., Miyamoto, S., Suzuki, F., Kobayashi, H., Igarashi, K. Excretion of putrescine by the putrescine-ornithine antiporter encoded by the potE gene of Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (10), 4529-4533 (1992).
  25. Tsuchiya, T., Rosen, B. P. Calcium transport driven by a proton gradient and inverted membrane vesicles of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 251 (4), 962-967 (1976).
  26. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, (2006).
  27. Nichols, B. P., Shafiq, O., Meiners, V. Sequence analysis of Tn10 insertion sites in a collection of Escherichia coli strains used for genetic mapping and strain construction. Journal of Bacteriology. 180 (23), 6408-6411 (1998).
  28. Sauer, B. P1vir phage transduction. , https://openwetware.org/wiki/Sauer:P1vir_phage_transduction (2011).
  29. Invitrogen. pBAD-DEST49 Gateway Destination Vector. , https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12283016 (2010).
  30. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: a laboratory Manual. , 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  31. GlennMills. Thermo Electron French Press Operation Manual. , http://www.glenmills.com/wp-content/uploads/2011/06/GLEN-MILLS-INC.-FRENCH-PRESS-Operating-Manual-Feb-2007-Rev-11.pdf (2007).
  32. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using biochinic acid. Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).
  33. Wright, J. K., Overath, P. Purification of the lactose: H+ carrier of Escherichia coli and characterization of galactoside binding and transport. European Journal of Biochemistry. 138 (3), 497-508 (1984).
  34. PRISM. GaphPad Software. , https://www.graphpad.com/data-analysis-resource-center/ (2019).
  35. Kirchberger, S., et al. Molecular and biochemical analysis of the plastidic ADP-glucose transporter (ZmBT1) from Zea mays. Journal of Biological Chemistry. 282 (31), 22481-22491 (2007).
  36. Deniaud, A., et al. Expression of a chloroplast ATP/ADP transporter in E. coli membranes: behind the Mistic strategy. Biochimica et Biophysica Acta. 1808 (8), 2059-2066 (2011).
  37. Sze, H. H+-Translocating ATPases: Advances Using Membrane Vesicles. Annual Review of Plant Physiology. 36, 175-208 (1985).
  38. Bush, D. R. Proton-coupled sugar and amino acid transporters in plants. Annual Review of Plant Physiology Plant Molecular Biology. 44, 513-542 (1993).
  39. Futai, M. Orientation of membrane vesicle from Escherichea coli prepared by different procedures. Journal of Membrane Biology. 115, 15-28 (1974).
  40. Seckler, R., Wright, J. K. Sideness of native membrane vesicles of Escherichea coli and orientation of the reconstituted lactose: H+ carrier. European Journal of Biochemistry. 142 (2), 269-279 (1984).
  41. LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli. Methods in Enzymology. 326, 322-340 (2000).
  42. Goodman, D. B., Church, G. M., Kosuri, S. Causes and effects of N-terminal codon bias in bacterial genes. Science. 342 (6157), 475-479 (2013).
  43. Wacker, M., et al. N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli. Science. 298 (5599), 1790-1793 (2002).

Tags

Biokemi membran transportør anti Porter polyamin transport polyamin veksler membran vesikler fransk presse kinetisk analyse radioisotop transport assays GABA
Karakterisering af membran transportører ved heterologe udtryk i <em>E. coli</em> og fremstilling af membran vesikler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ariyaratne, M., Ge, L., Morris, P.… More

Ariyaratne, M., Ge, L., Morris, P. F. Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles. J. Vis. Exp. (154), e60009, doi:10.3791/60009 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter