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Biochemistry

Charakterisierung von Membrantransportern durch heterologen Ausdruck in E. coli und Herstellung von Membranvesikeln

Published: December 31, 2019 doi: 10.3791/60009
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Bowling Green State University

Summary

Wir beschreiben ein Verfahren zur Charakterisierung von protonengetriebenen Membrantransportern in Membranvesikelpräparaten, die durch heterologe Expression in E. coli und Lyse von Zellen mit einer französischen Presse hergestellt werden.

Abstract

Mehrere Methoden wurden entwickelt, um neuartige Membrantransporter funktionell zu charakterisieren. Polyamine sind in allen Organismen allgegenwärtig, aber Polyaminaustauscher in Pflanzen wurden nicht identifiziert. Hier skizzieren wir eine Methode zur Charakterisierung von Polyamin-Antiportern mit Membranvesiken, die aus der Lyse von Escherichia coli-Zellen erzeugt werden, die heterolog einen Pflanzenantiporter exemitzen. Zunächst haben wir AtBAT1 heterolog in einem E. coli-Stamm mangelhaft in Polyamin- und Argininaustauschtransportern exprimiert. Vesikel wurden mit einer französischen Presse hergestellt, die durch Ultrazentrifugation gereinigt und in einem Membranfiltrationstest von markierten Substraten verwendet wird, um die Substratspezifität des Transporters zu demonstrieren. Diese Assays zeigten, dass AtBAT1 ein Proton-vermittelter Transporter von Arginin, Aminobuttersäure (GABA), Putrescin und Spermidin ist. Der mutierte Stamm, der für den Test von AtBAT1 entwickelt wurde, kann für die funktionelle Analyse anderer Familien von Pflanzen- und Tierpolyaminaustauschern nützlich sein. Wir gehen auch davon aus, dass dieser Ansatz verwendet werden kann, um viele andere Arten von Antiportern zu charakterisieren, solange diese Proteine in der bakteriellen Zellmembran exprimiert werden können. E. coli ist ein gutes System für die Charakterisierung neuartiger Transporter, da es mehrere Methoden gibt, die eingesetzt werden können, um einheimische Transporter zu mutagenisieren.

Introduction

Proteine, die am Handel mit Metaboliten beteiligt sind, stellen ein wesentliches Maß an physiologischer Regulation dar, aber die überwiegende Mehrheit der Pflanzenmembrantransporter ist noch nicht funktionell charakterisiert. Mehrere Strategien wurden implementiert, um neuartige Transportproteine zu charakterisieren. Heterologe Expression in Modellorganismen wie E. coli und eukaryotischen Zellen wie Hefe, Xenopus Oozyten, Säugetierzellen, Insektenzellen und Pflanzenzellen wurden alle verwendet, um ihre Transportaktivität zu bestimmen1. Eukaryotische Zellen werden für die Expression von eukaryotischen Proteinen bevorzugt, da die grundlegende zelluläre Zusammensetzung, Signaltransducing-Pfade, Transkription und Übersetzungsmaschinen mit den nativen Bedingungen kompatibel sind.

Hefe war ein wichtiger Modellorganismus für die Charakterisierung neuartiger Transportproteine in Pflanzen. Das erste Pflanzentransportprotein, das erfolgreich in Hefe exprimiert wurde (Saccharomyces pombe) war der Hexose-Transporter HUP1 von Chlorella2. Seitdem wurden viele Pflanzentransportproteine funktionell mit einem Hefeexpressionssystem charakterisiert. Dazu gehören Pflanzenzuckertransporter (SUC1 und SUC23, VfSUT1 und VfSTP14) und die Auxin-Transporter (AUX1 und PIN5). Nachteile der Verwendung von Hefe, um pflanzliche Proteine auszudrücken, können eine beeinträchtigte Aktivität von plastid-lokalisierten Proteinen umfassen, da Hefe diese Organelle fehlt, Fehlausrichtung6, und Bildung von falsch gefalteten Aggregaten und Aktivierung von Stressreaktionen in Hefe aufgrund der Überexpression von Membranproteinen7,8,9.

Heterologe Expression von Transportproteinen in Xenopus Oozyten wurde häufig für die elektrophysiologische Charakterisierung von Transportern10verwendet. Die ersten pflanzentransportinochig charakterisierten Pflanzentransportproteine, die mit heterologer Expression in Xenopus oocyten charakterisiert wurden, waren der Arabidopsis Kaliumkanal KAT110 und der Arabidopsis Hexose Transporter STP111. Seitdem wurden Xenopus Oozyten eingesetzt, um viele Pflanzentransportproteine wie Plasmamembrantransporter12, Vacuolar-Saccharosetransporter SUT413 und Vacuolar-Malattransporter ALMT914zu charakterisieren. Eine wichtige Einschränkung von Xenopus Oozyten für Transporttests ist, dass die Konzentration von intrazellulären Metaboliten nicht manipuliert werden kann1. Darüber hinaus sind professionelle Kenntnisse erforderlich, um Xenopus Oozyten vorzubereiten, und die Variabilität der Eizellenchargen ist schwer zu kontrollieren.

Heterologe Expression im Modellorganismus E. coli ist ein ideales System in Bezug auf die Charakterisierung neuartiger Pflanzentransportproteine. Mit einem vollständig sequenzierten Genom15sind die molekularen und physiologischen Eigenschaften von E. coli bekannt. Molekulare Werkzeuge und Techniken sind gut etabliert16. Darüber hinaus stehen verschiedene Expressionsvektoren, nichtpathogene Stämme und Mutanten zur Verfügung17,18,19. Darüber hinaus hat E. coli eine hohe Wachstumsrate und kann leicht unter Laborbedingungen angebaut werden. Viele Proteine können leicht in hohen Mengen in E. coli9exprimiert und gereinigt werden. Wenn Proteine nicht direkt in zellulären Systemen untersucht werden können, war die Rekonstitution von Proteinen zu Liposomen auch eine erfolgreiche, wenn auch herausfordernde Innovation für die Charakterisierung gereinigter Membranproteine. Die funktionelle Charakterisierung der mitochondrialen Transportproteine der Pflanze einschließlich gelöster Transporter wie Phosphattransporter in Sojabohnen, Mais, Reis und Arabidopsis, Dicarboxylat-Tricarboxylatträger in Arabidopsis wurde mit diesem Modellsystem20,21erreicht. Jedoch, rekombinante Proteine des Tomatenproteins SICAT9 wurden festgestellt, dass nicht funktional in Rekonstitutionsexperimente, und andere Mitglieder der CAT-Transporter-Familie wurden gefunden, um nicht funktional in Xenopus Oozyten-Assays22. Daher werden zusätzliche molekulare Werkzeuge für die Charakterisierung von Membrantransportern benötigt.

Fünf Polyamin-Transportsysteme sind in E. coli23zu finden. Dazu gehören zwei ABC-Transporter, die die Aufnahme von Spermidin und Putrescin vermitteln, einen Putrescine/Ornithin-Austauscher, einen Kadaverin/Lysinaustauscher, einen Spermidinexporteur und einen Putrescine-Importeur. Der Putrescine-Austauscher PotE wurde ursprünglich mit einem Vesikel-Assay charakterisiert, bei dem von innen nach außen Vesikel durch Lysingzellen mit einer französischen Presse hergestellt und die Aufnahme von radioaktiv markiertem Putrescin in die Vesikel im Austausch gegen Ornithin24gemessen wurden. Vesikel-Assays wurden auch verwendet, um einen Kalziumtransporter zu charakterisieren, der den Transport von Kalzium als Reaktion auf einen Protonengradientenvermittelte 25. Diese Experimente veranlassten uns, eine Strategie für die Charakterisierung anderer Polyaminaustauscher zu entwickeln. Wir haben zuerst einen Stamm von E. coli-Mangel an PotE- und CadB-Austauschern entwickelt. Hier zeigen wir die funktionelle Charakterisierung eines Pflanzenpolyamin-Antiporters durch heterlogen Ausdruck im modifizierten E. coli-Stamm, die Erzeugung von Membranbläschen mit einer französischen Presse und radioaktiv markierte Assays.

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Protocol

1. Erzeugung des E. coli Double Knock Out Mutant mit P1-Transduktion

  1. Beziehen Sie die E. coli Single-Knockout-Mutantenstämme "PotE" und "CadB" vom E. coli Genetic Stock Center (http://cgsc.biology.yale.edu).
    HINWEIS: Die Sorte "PotE" ist kanamycinbeständig26 und die Sorte "CadB" tetracyclinbeständig27.
  2. Konstruieren Sie die PotE/CadB Double Knockout (DKO) Dehnung mit dem P1-Transduktionsprotokoll28.
    1. Lysat-Vorbereitung
      1. Verdünnen Sie eine Übernachtkultur von "PotE" in frischem LB (1:100), ergänzt mit 10-25 mM MgCl2, 5 mM CaCl2und 0,1-0,2% Glukose.
      2. Bei 37 °C für 1-2 h wachsen.
      3. Fügen Sie der Kultur 40 l P1-Phagenlysat hinzu und wachsen Sie bei 37 °C weiter. Monitor für 1-3 h, bis die Kultur lysiert hat
        HINWEIS: Wenn die Kultur lysiert wird, werden zelluläre Trümmer in der Röhre sichtbar und die Kultur wird einen signifikanten Verlust an Trübung haben.
      4. Fügen Sie dem Lysat und dem Wirbel mehrere Tropfen Chloroform (50-100 l) hinzu. Zentrifuge bei 12.000 x g für 2 min, um Zellablagerungen zu entfernen und den Überstand in ein frisches Rohr zu übertragen.
    2. Transduktion
      1. Wachsen Sie die CadB-Sorte über Nacht in LB-Medium.
      2. Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 4.000 x g für 2 min und resuspendieren in 1/5-1/3 das geerntete Kulturvolumen in frischem LB ergänzt mit 100 mM MgSO4 und 5 mM CaCl2.
      3. Fügen Sie die Zellenaufhängung von CadB mit Phagen ab Schritt 1.2.1.4 in das Rohr ein und mischen Sie sie schnell.
      4. Fügen Sie 200 l von 1 M Na-Citrat (pH5.5) hinzu, dann fügen Sie 1 ml LB hinzu. Bei 37 °C für 1 h inkubieren, um die Expression des antibiotikaresistenten Markers zu ermöglichen.
      5. Spin-Zellen bei 4000 x g für 5 min.
      6. Resuspend in 100 L LB mit 100 mM Na-Citrat (pH 5.5) und Wirbel gut, um Zellen zu dispergieren.
      7. Wählen Sie die rekombinanten Dehnungen auf LB-Agarplatten mit 50 g/ml Kanamycin und 10 g/ml Tetracyclin aus und bestätigen Sie dann durch Polymerase Chain Reaction (PCR) mit geeigneten Primern26,27.
      8. Überprüfen Sie die PCR-Fragmente durch Sequenzierung.

2. Expression des Zielgens (AtBAT1) in E. coli Mutant

  1. Verstärken Sie die Sequenz des Zielgens in voller Länge durch PCR und fügen Sie sie in den Gateway-Eintragsvektor pENTR/D-TOPO29ein.
    HINWEIS: In diesem Fall wurde ATBAT1.1 mit Vorwärtsgrundierung 5'CGGCGATCAATCCTTTGTT und Reverse Primer 5'GCTAAGAATGTTGGAGATGG verstärkt, eine anfängliche Denaturierung bei 98 °C für 2 min und dann 30 Denaturierungszyklen bei 98 °C für 0,1 min, Glühen bei 59 °C für 0,3 min, Verlängerung bei 72 °C für 0,40 min und Endverlängerung bei 72 °C für 10 min. Das PCR-Produkt wurde mit einem PCR-Reinigungskit gereinigt, quantifiziert mit einem Spektrometer. Das Einfügen des PCR-Produkts in den Gateway-Vektor erfolgte nach den Anweisungen der Manufakturierer.
    1. Verwandeln Sie den Einstiegsvektor durch Hitzeschock in kompetente Top10 E. coli-Zellen und wählen Sie erfolgreiche Rekombinanten auf LB-Medien mit 50 g/ml Kanamycin nach Standard-Molekularklonprotokollen30aus.
    2. Extrahieren Sie Plasmid-DNA mit einem Plasmid-Extraktionskit, nach den Anweisungen des Herstellers, und Sequenz, um die korrekte Einfügung zu bestätigen.
  2. Übertragen Sie das Zielgen in den E. coli-Zielvektor pBAD-DEST49 durch Gateway LR-Klonen, um einen Expressionsvektor29zu erstellen.
    1. Verwandeln Sie den Expressionsvektor in kompetente Top10 E. coli-Zellen durch Hitzeschock für 30 s und wählen Sie erfolgreiche Rekombinanten auf LB-Medien mit 100 g/ml Ampicillin30.
    2. Extrahieren Sie Plasmid DNA30 und Sequenz, um die korrekte Insertion zu bestätigen.
  3. Verwandeln Sie den Expressionsvektor in E. coli-PotE740(del)::kan, cadB2231::Tn10 und wählen Sie auf LB-Platten mit Ampicillin, Kanamycin und Tetracyclin30.
  4. Um die optimale Konzentration von Arabinose für die Induktion zu bestimmen, drücken Sie das Zielgen unter der Kontrolle des araBAD-Promotors in LB-Medien mit Gradientenkonzentrationen von Arabinose wiebeschrieben 29aus.
  5. Sammeln Sie die Zellpellets und bewerten Sie die Proteinexpression durch SDS-PAGE und die Visualisierung von Proteinbändern, wie im Produkthandbuch29beschrieben.
    HINWEIS: Als Kontrollbeispiel ohne BAT1-Expression wurde die E. coli-PotE740(del)::kan, cadB2231::Tn10 verwendet. E.coli Doppel-Knock-out-Mutationszellen mit dem leeren pBAD-DEST49-Vektor wurde aufgrund des Vorhandenseins des ccdB-Gens im Vektor nicht als Kontrolle verwendet.

3. Erzeugung von Inside-Out-Membranvesiken

  1. Kultur die E. coli-Mutantenzellen, die das Zielprotein exemiten, indem sie über Nacht eine einzige Kolonie in 5 ml Polyamin-freien Medien (2% Glycerin, 6 g K2HPO4, 3 g KH2PO4, 0,5 g NaCl, NH4Cl, 50 mg Thiamin, 0,79 g Hefe vollständig synthetische Medien Adenin Hemisulfat (10 mg/L), L-Arginin (50 mg/L), L-Assigsäure (80 mg/L), L-Histi Hydrochlorhydrat (20 mg/L), L-Leucin (100 mg/L), L-Lysinhydrochlorid (50 mg/L), L-Methionin (20 mg/L), L-Phenylalanin (50 mg/L), L-Threonin (100 mg/L), L-Tryptophan (50 mg/L), L-Tyrosin (50 mg/L), L-Valin (140 mg/L), Uracil (20 mg/L)). Übertragen Sie diese Kultur auf 500 ml Polyamin-freie Medien, ergänzt mit 0,0002% Arabinose, und wachsen Sie, bis die Zellkultur eine OD600 von 0,6-0,8 erreicht (in der Regel 5 h).
  2. Sammeln Sie das Zellpellet durch Zentrifugation bei 2.000 x g für 15 min bei 4 °C. Das Pellet wieder aufsetzen und dreimal mit 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 6,6, mit 10 mM EDTA (Puffer 1) waschen. Das endgültige Volumen der Zellen in Puffer 1 nach der dritten Drehung sollte 10 ml betragen.
  3. Generieren Sie inside-out Membranvesikdurch behandlung von French Press (10.000 p.s.i.) der intakten Zellen mit einer 35 ml französischen Druckzelle.
  4. Bevor Sie die Probe in die französische Standarddruckzelle laden, schmieren Sie Kolben und O-Ringe, um das Einlegen in die Zelle zu erleichtern.
    Hinweis:Diese Anweisungen sind spezifisch für die Verwendung der Standard-Druckzelle31.
    1. Schrauben Sie den Verschlussstecker vorsichtig in das untere Ende der Zelle. Stellen Sie sicher, dass die Zelle auf der Grundlage des Schriftzugs auf der Seite der Zelle rechts oben ist. Setzen Sie den Kolben in die Zelle ein und bewegen Sie ihn in die Zelle, bis die maximale Fülllinie auf dem Kolben die Oberseite des Kolbens erreicht. Drehen Sie das Gerät um und platzieren Sie es auf dem mitgelieferten Ständer zwischen den drei Pfosten.
    2. Gießen Sie die Zellsuspension in den Körper der Zelle.
      HINWEIS: Wir haben nur 10 ml verwendet, so dass in der französischen Druckzellenkammer, die eine Kapazität von 35 ml hat, noch viel Platz vorhanden sein wird.
    3. Montieren Sie die Standarddruckzelle auf der französischen Druckzelleneinheit.
      1. Überprüfen Sie zunächst, ob der Strom ausgeschaltet ist. Auf der linken Seite des Panels befindet sich der Ratio Selector Schalter. Es hat drei Positionen: unten am Ende des Laufs, Niedrig für die Verwendung einer kleineren Druckzelle und Hoch für die Verwendung mit der Standard-französischen Druckzelle. Wenn die französische Presse zuvor mit der kleineren Zelle verwendet wurde, kann der Kolben nicht vollständig eingefahren werden. Stellen Sie diesen Schalter auf Downein.
    4. Schalten Sie die Maschine mit dem Schalter am RHS auf der Rückseite des Geräts ein und schalten Sie den Pause-Run-Schalter in die Run-Position. Dies führt dazu, dass der Kolben vollständig zurückgezogen wird. Bewegen Sie den Schalter zurück zu Pause, und schalten Sie die Maschine aus.
    5. Lösen Sie die Daumenschrauben und bewegen Sie die Sicherheitsklemme, die sich auf zwei Edelstahlsäulen zur Seite spannt. Es wird nach rechts schwingen. Mit einer Hand, die die Basis des Verschlusssteckers an Ort und Stelle hält, nehmen Sie die französische Druckzelle mit beiden Händen auf und drehen Sie sie um 180°, so dass sich der Kolben nun in der aufrechten Position befindet. Stellen Sie sie auf die Plattform und bewegen Sie die Sicherheitsklemme wieder an Ort und Stelle, so dass diese Klemme die französische Druckzelle in Position hält.
    6. Beachten Sie, dass die Durchflussventil-Baugruppe am Verschlussstecker für den Bediener zugänglich und so positioniert sein muss, dass das Ventil frei gedreht werden kann. Öffnen Sie die Durchflussventilbaugruppe mit einigen Gegendrehungen im Uhrzeigersinn. Positionieren Sie die Arme des Kolbens so, dass sie in einer Zwei- und Achter-Position ausgerichtet sind. Ziehen Sie die Daumenschrauben so an, dass die Standarddruckzelle an Ort und Stelle gehalten wird.
    7. Setzen Sie das Probenauslaufrohr in den Verschlussstecker ein, und schließen Sie ein kurzes Stück flexibler Schläuche an, damit die gebrochenen Zellreste in einem Falkenrohr gesammelt werden können. Normalerweise verwenden wir einen 300 ml eisgefüllten Becher, um das Falkenrohr aufrecht zu halten und die Zellablagerungen gekühlt zu halten.
    8. Stellen Sie sicher, dass der Pause-Run-Schalter auf Pauseeingestellt ist und sich die Ventilbaugruppe in der offenen Position befindet. Drehen Sie die Maschine wieder auf, adust die Ratio Selector Schalter auf Hoch, und drehen Sie die Druckerhöhung Ventil auf der Frontplatte auf der Vorderseite nach rechts etwa eine halbe Runde.
    9. Der Kolben beginnt, von der Basis zu steigen, um die Luft in der Kammer zu verdrängen. Richten Sie die Luft, die aus dem Ambeispielauslassrohr befestigten Tygon-Schläuchen kommt, an das Rohr im Becher.
    10. Wenn die ersten Flüssigkeitstropfen herauskommen, schließen Sie die Durchflussventilbaugruppe, indem Sie sie im Uhrzeigersinn drehen. Dadurch entsteht eine Metall-Metall-Dichtung, mit der Druckzelle, also nicht zu verengen.
    11. Die Vorderseite der französischen Presse hat ein Diagramm auf der Vorderseite, um den richtigen Druck auf die biologischen Zellen innerhalb der Druckzelle zu erzeugen. Erhöhen Sie in diesem Fall den Druck, indem Sie das Druckerhöhungsventil im Uhrzeigersinn drehen, bis das Messgerät 640 psi erreicht. Dadurch entsteht ein interner Druck von 10.000 psi.
    12. Sobald die Zelle den Zieldruck erreicht hat, öffnen Sie die Durchflussventilbaugruppe leicht, indem Sie sie gegen den Uhrzeigersinn drehen. Stellen Sie die Öffnung des Ventils so ein, dass eine Durchflussrate von nur etwa 10 Tropfen pro min möglich ist.
    13. Wenn die Stopplinie am Kolbenkörper die Oberseite der Durchflusszelle erreicht. Wechseln Sie den Pause-Run-Schalter zu Pause. Dies ist von entscheidender Bedeutung, da der Kolben weiter in die Zelle eingeführt wird, um das Gerät zu beschädigen. Öffnen Sie die Durchflussventilbaugruppe und sammeln Sie die restlichen Tropfen.
    14. Drehen Sie den Schalter Ratio Selector auf Down, und legen Sie dann den Schalter Pause Run auf Ausführenfest. Wenn die untere Platte vollständig eingefahren ist, stellen Sie den Run-Schalter auf Pauseein, und schalten Sie das Gerät aus.
    15. Entfernen Sie die französische Druckzelle aus der französischen Presse und zerlegen Sie sie zur Reinigung. Alle Teile trocken mit einer leichten Abdeckung von Glycerin lagern. Entfernen und ersetzen Sie Dichtungen oder Dichtungen durch Verschleißerscheinungen.
  5. Ungebrochene Zellen und Zellablagerungen der französischen Presse durch Zentrifugation bei 10.000 x g für 15 min bei 4 °C entfernen. Entsorgen Sie das Pellet und übertragen Sie überlagert auf Ultrazentrifugenrohre.
  6. Pelletmembranbläschen aus dem resultierenden Überstand durch Ultrazentrifugation bei 150.000 g für 1 h bei 4 °C.
  7. Waschen Sie die Membranbläschen einmal, ohne Resuspension, in 1 mM Tris-Maleat, pH 5,2 mit 0,14 M KCl, 2 mM 2-Mercaptoethanol und 10% Glycerin und setzen Sie sich im gleichen Puffer (Puffer 2)23 mit einem Dounce-Gewebeschleifer aus. Typischerweise würde die Membranfraktion von 500 ml Kultur in 5 ml Puffer und einer Konzentration von 5-10 mg Membranprotein/ml mit dem Biochinic Acid Assay32aufgehängt.
  8. Lagern Sie 100 L Aliquots von Membranpräparaten bei -80 °C in 1,5 ml Mikrozentrifugenrohren.

4. Western Blot und Orientierung des Transporter-Assays

  1. Vesikel ab Schritt 3,7 in 30 mM Tris pH 7,8 + 0,1 mM CoCl2waschen und wieder aufhängen.
  2. Auf 100 L-Proben 1 l von 2 mg/ml Carboxypeptidase A in 0,1 M NaCl, 30 mM Tris, 0,2 mM CoCl2 pH 7,8 hinzufügen.
  3. 20 min bei 20 °C beule. Beenden Sie die Verdauung durch Zugabe von 5 l von 0,5 M NaEDTA, 0,5 M 2-Mercaptoethanol pH 7,5.
  4. Um das Enzym vollständig zu inaktivieren, inkubieren Sie die Lösung für 1 h bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Vesikel ohne catboxypeptidase A Behandlung wurden als Kontrolle verwendet.
  5. Analysieren Sie Proben durch Elektrophorese in Gegenwart von Lithium-Dodecylsulfat. Fügen Sie 5-10 l mit 150 mg/ml Lithium-Dodecylsulfat, 450 mg/ml Glycerin, 0,1 mg/ml Bromphenolblau, 0,4 M Tris pH-PH-Gehalt von 7,5 bis 100 l Probe hinzu.
  6. Durchführung der Immunoblotting durch Verlegung eines Nitrozellulosefilters, der mit 25 mM Natriumhydrogenphosphat pH 7.5 auf das Polyacrylamidgel befeuchtet ist. Platzieren Sie diese zwischen zwei befeuchteten Zellulosefiltern und schließlich zwischen zwei befeuchteten Kunststoff-Scheuerpads. Platzieren Sie diese Assemblage zwischen den Elektroden einer Kammer, die 25 mM Natrium-Wasserstoff-Phosphat-pH-PH 7,5 bei 2-4 °C enthält.
  7. Elektrotransfer von Proteinen für 3 h bei 20 V und 2-3 A ablaufen lassen.
  8. Blockieren Sie die Nitrocellulosemembran über Nacht bei 2 °C in einem Blockierpuffer von 0,15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5 und 0,5 mg/ml Tween 2033.
  9. Inkubieren Sie den Nitrozellulosefilter für 2 h mit einer 1:5000 Verdünnung des Anti-His (C-Klemmen)-HRP-Antikörpers im Sperrpuffer (20 ml) und waschen Sie zweimal mit 50 ml Puffer für insgesamt 60 min.
  10. Um den Immunoblot zu visualisieren, lösen Sie 6 mg 4-Chlor-1-Naphthol in 20 ml denaturiertem Alkohol auf und fügen Sie 80 ml 15 mM Tris pH 7,5 und 50 l von 30%H2O2hinzu. Das Filterpapier 20 min in der Substratlösung baden. Das Reagenz reagiert mit dem Antikörper, um einen blauen Niederschlag auf der Nitrocellulosemembran zu bilden. Wenn sich genügend Farbe entwickelt hat, spülen Sie die Membran mit Wasser ab und lassen Sie sie trocknen.

5. Transport Assay

  1. Inkubieren Sie 100 L Aliquots von Membranbläschen bei 12 °C für 5 min.
  2. Initiieren Sie den Transport, indem Sie den Membranvesikeln radioaktiv markierte Polyamine in einer Endkonzentration von 50 M (sofern nicht anders angegeben) hinzugefügt werden. Herstellung von 3H-Substrat-Lösungen (Spermidin oder Putresin) in einem Assaypuffer bestehend aus 10 mM Tris-HCl, 10 mM Kaliumphosphat, pH 8,0 und 0,14 M KCl23 (Puffer 3) mit Modifikationen je nach Assay.
  3. Transporttests für 1 min bei 12 °C in 1,5 ml Mikrofugenrohren durchführen.
  4. Nach 1 min die Reaktionsgemische auf Filtrationskrümmer übertragen und durch einen 0,45 m Nitrocellulose-Membranfilter filtern.
    1. Fügen Sie 3 ml eiskalten Assaypuffer hinzu, der eine 10-fach höhere Konzentration von nicht beschrifteten Polyaamen enthält, gefolgt von 3 ml Assaypuffer ohne die Polyame, um die unspezifische Bindung zu reduzieren.
    2. Übertragen Sie die gewaschenen Filter auf 20 ml Einweg-Szintillationsfläschchen mit 10 ml Szintillationsflüssigkeit und bestimmen Sie die Radioaktivität mit einem flüssigen Szintillationszähler. Der Szintillationszähler misst die Radioaktivität in der Probe und meldet sie als Disintegrationen pro min (dpm).
  5. Berechnen Sie die Netto-Polyaminaufnahme als Differenz zwischen der Aufnahme bei 1 min durch Vesikel, die bei 12 °C inkubiert werden, und der Aufnahme bei 0 min durch Vesikel, die auf Eis bebrütet werden.
    HINWEIS: Die Masse des substrats, das in die Vesikel importiert wird, wird wie folgt berechnet. Wenn das Probenvolumen im Mikrofuge-Rohr 0,2 l beträgt und die Anfangskonzentration des Substrats 100 m beträgt, beträgt die Gesamtmasse des Substrats im Mikrofugerohr 20 x 10-12 M. Aufgrund der sehr hohen spezifischen Aktivität von kommerziell gekennzeichneten Substraten (oft 2,22 x 109 dpm/mM) kann die Masse des zugesetzten Isotops bei der Berechnung ignoriert werden. Wenn also die Gesamtmenge des Isotopen, das dem Mikrofugenrohr zugesetzt wurde, 100 x 106 dpm betrug und die Vesikel eine Nettoaufnahme von 1.000 dpm hatten, dann betrug die Gesamtmasse des substrats, das von den Vesikeln aufgenommen wurde, 1% der Gesamtzahl der Maulwürfe des Substrats oder 2 x 10-13 M.
    1. Bestimmen Sie Km für das Substrat, indem Sie die Aufnahme von 10, 25, 50, 250 und 500 m Radioradioaktivsubstrat in Vesikel messen, die das Zielprotein exemitenken. Berechnen Sie die Michaelis-Menten-Kinetik mit einer nichtlinearen Regressionsmethode mit dem Michaelis Menton-Modell des statistischen Softwarepakets34.
  6. Für die Wettbewerbsexperimente fügen Sie dem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr, das 100 l Vesikel bei 12 °C enthält, 100 m, 1 mM, 1,5 mM oder 2 mM, nicht gekennzeichnetes Wettbewerbssubstrat, das im Assaypuffer hergestellt wird, 100 m, 50 m, 1,5 mM, 1,5 mM oder 2 mM.
    1. Radioaktiv-Polyamin (50 M) gleichzeitig in das Mikrozentrifugenrohr geben.
    2. Messen Sie die Radioaktivität, die in den Bläschen gefangen ist, wie oben erwähnt, indem Sie die Schritte 5 bis 5.4.2 wiederholen.
    3. Bestimmen Sie die sichtbare Km (Km,app) für die wettbewerbsfähigen Substrate, indem Sie die Aufnahme von 10, 25, 50, 250 und 500 m m radioaktiv markierten Polyaminen in Gegenwart von 100 m oder höher nicht gekennzeichnetem Substrat messen und eine nichtlineare Regressionsmethode zur Darstellung der Kurve verwenden.

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Representative Results

Die wichtigsten Schritte in diesem Protokoll sind bildlich in Abbildung 1zusammengefasst. Kurz gesagt, E. coli-Zellen, die in allen Polyaminaustauschern einen Mangel haben und AtBAT1 exprimieren, werden kultiviert, zentrifugiert, mit einem Puffer gewaschen und mit einer französischen Presse einer Zelllyse unterzogen. Lyse neigt dazu, Vesikel zu produzieren, die meist innen nach außen sind und den Puffer außerhalb der Zellen fangen. Zellablagerungen werden durch Zentrifugation entfernt, und ein zweiter Ultrazentrifugationsschritt wird verwendet, um ein Membranpellet zu sammeln. Das Membranpellet wird im Tris-Maleat-Puffer pH 5.2 resuspendiert und bei -80 °C gelagert. Transporttests werden bei 12 °C durchgeführt, was sich als optimal für die Aufrechterhaltung der Membranstabilität erwiesen hat. Die Assays werden durch Zugabe von radioaktiv markiertem Substrat und einer Verschiebung des pH-Werts der Puffersuspension von Vesikeln auf pH 8,0 eingeleitet. Nach 1 min wird ein eiskalter Assaypuffer mit unbeschrifteten Substraten hinzugefügt, um die Aufnahme des Radiolabels in die Vesikel zu stoppen. Radioaktivierte Vesikel werden durch Filtration durch Nitrocellulosemembranen eingeschlossen. Membranen werden auf Szintillationsfläschchen übertragen und Radiolabel auf den Membranen wird durch flüssige Szintillationszählung bestimmt.

Ein westlicher Fleck wird verwendet, um zu überprüfen, ob AtBAT1 in Vesikel transziert ist (Abbildung 2). Bei der Untersuchung des Blots mit einem Anti-His C-terminalen Antikörper ergab sich ein Fusionskonstruktprotein von ca. 72,3 kDa(Abbildung 2, Lane 2). Die Verdauung der Vesikel vor SDS-PAGE führte zu einer Dimunition, aber nicht zu einem vollständigen Verlust des Sondensignals(Abbildung 2,Spur 3). Die Abnahme des Sondensignals als Folge von Carboxypeptidase A deutet darauf hin, dass sich die meisten C-Terminal-Rückstände auf der Außenseite der Vesikel befinden.

In diesem Assay-System werden Vesikel in einem Puffer bei pH 5,2 aufgehängt, so dass der pH-Wert in den Vesikeln mit dem Puffer gleicht. Der Transport des radioaktiv markierten Substrats in die Vesikel bei pH 5,2 wird durch Aufhängen der Vesikel in einem pH 8,0-Puffer eingeleitet, wodurch ein pH-Gradient von pH 2,8 über die Membran erzeugt wird. Bei 12 °C war die Aufnahme von radioaktiv markiertem Spermidin durch die Vesikel mit 1 min am höchsten und blieb über 3 min linear(Abbildung 3A). Daher wurde die Inkubationszeit für den Transporttest auf 1 min festgelegt. Um die unspezifische Bindung des Radioetiketts zu berücksichtigen, wurden die Vesikel bei 0 °C in Gegenwart von radioaktiv markiertem Substrat für eine Minute inkubiert, und diese Zählungen wurden von der Aufnahme von Ladiolabel bei höheren Temperaturen subtrahiert.

Abbildung 3B zeigt die Aufnahme von radioaktiv markiertem Spermidin in die Vesikel nach einer Minute. Es gab keine Nettoaufnahme von Isotopen durch Membranbläschen, die bei pH 8,0 hergestellt und gelagert wurden, da es keinen Protonengradienten über der Vesikelmembran gab. Um die Wirkung der Ableitung des künstlichen Protonengradienten zu demonstrieren, wurden die Membranbläschen in 10 min pH 8,0 Puffer vor der Zugabe von markiertem Substrat25inkubiert. Unter diesen Bedingungen wurde eine minimale Aufnahme von radioaktiv markiertem Substrat gezeigt. Die Aufnahme von radioaktiv markiertem Spermidin war auch minimal in Vesikeln, die mit E. coli-Zellen hergestellt wurden, die an den Polyaminaustauschern CadB und PotEmangelhaft waren. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die protonengetriebene Aufnahme von Spermidin auf das BAT1-Protein zurückzuführen war (Abbildung 3A,B).

Um die Substratspezifität des Proteins zu bestimmen, wurden die Km-Werte berechnet, indem die Aufnahme von radioaktiv markiertem Substrat bei 10, 25, 50, 100, 250 und 500 M gemessen wurde. Die Km für Spermidin, Putresin und Arginin betrugen 55 x 12 m, 85 x 20 m bzw. 1,4 x 0,5 mM, was darauf hindeutet, dass es sich bei diesem Protein um einen Polyamin- und Argininaustauscher mit hoher Affinität handelt(Abbildung 4).

Die Affinität des Transporters für ein bestimmtes Substrat kann auch indirekt durch Wettbewerbstests bestimmt werden. Hier haben wir zwei Methoden eingesetzt, um den Wettbewerb zwischen zwei Substraten zu bewerten. Bei der ersten Methode wurde die Aufnahme von 50 M radioaktiv markiertem Spermidin in Gegenwart zunehmender Konzentrationen des nicht gekennzeichneten konkurrierenden Substrats gemessen (Abbildung 5A). In der zweiten Methode wurde das scheinbare Km für Spermidin berechnet, indem die Aufnahme zunehmender Konzentrationen von radioaktiv markiertem Spermidin in Gegenwart von 100 m m nicht-labeliertem konkurrierendem Substrat gemessen wurde ( Abbildung5B). Wettbewerbstests ergaben, dass GABA ein kompetitiver Inhibitor von Spermidin mit einem Km,ca von 164 x 15 m ist (Abbildung 5A,B). Darüber hinaus ergab die Messung der Aufnahme von radioaktiv markiertem Spermidin in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen verschiedener Aminosäuren, dass AtBAT1 auch glutamat und Alanin in mM-Konzentrationen transportieren kann (Abbildung 6).

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Methode. (A) Schematische Darstellung, die die wichtigsten Schritte bei der Herstellung und Reinigung von Membranbläschen von E. coliumreißt. (B) Schematische Darstellung, die die wichtigsten Schritte beim Transport-Assay von Membranvesikelpräparaten mit radioaktiv markierten Substraten umreißt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Westlicher Fleck mit Expression von AtBAt1 in gereinigten Vesikeln. Bands wurden mit Meerrettichperoxidase konjugierten Anti-His (C-Term)-HRP-Antikörper visualisiert. Lane 1, Vorbefleckte Proteinleiter. Lane 2, gereinigte Vesikel, die AtBAT1.1 ausdrücken und ein Band von der erwarteten Größe des Fusionsproteins zeigen. Lane 3, gereinigte Vesikel, die AtBAT1.1 exzessen, wurden vor der SDS-Elektrophorese und dem westlichen Blotting mit Carboxypeptidase A vorbehandelt. Jeder Spur wurden entsprechende Mengen an Vesikeln (Protein) zugesetzt. Verminderte Färbung zeigt an, dass das C-Terminal des Proteins in den meisten Vesikeln durch Proteaseverdauung abgebaut wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Transportaktivität von Vesikeln, die die Wirkung der BAT1-Proteinexpression und die Bedeutung eines pH-Gradienten zeigen. (A) Zeitabhängige Aufnahme von 3H markiertem Spermidin in Vesikeln, die BAT1 mit einem internen pH-Wert von 5,2 exdrücken und bei pH 8,0 in einen Puffer eingeführt werden. Im Kontrolltest wurden die Vesikel dem Assaypuffer bei pH 8,0, 10 min vor der Zugabe von 3H markiertem Spermidin zugesetzt, um eine Ableitung des Protonengradienten zu ermöglichen. Anschließend wurde die Aufnahme des Radioetiketts in die Vesikel über einen 1-min-Intervall bewertet. (B) Aufnahme von 3H beschrifteter Spermidin in Gegenwart eines Protonengradienten (interner pH-Wert von 5,2), in Ermangelung eines Protonengradienten (interner pH-Wert von 8), in Vesikeln, die der Assaylösung 10 min vor der Zugabe von radioaktiv markiertem Spermidin und in Vesikeln aus E. coli-Mutantenzellen hinzugefügt wurden, die BAT1 nicht exexziert. Die Aufnahme in Vesikel wurde 1 min überwacht. Alle Werte werden als Mittelwert von fünf Replikationen dargestellt. Die Datenanalyse wurde mit dem t-Test eines Schülers durchgeführt und * weist auf einen signifikanten Unterschied zum Steuerelement hin (p-Wert < 0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: In-vitro-Assays von Polyamin und Arginin-Transportaktivität von BAT1. (A) Die Km-Werte für die Spermidin- und Dieresinaufnahme liegen bei 55 x 12 m bzw. 85 x 32 m. (B) Die Km für arginin-Aufnahme beträgt 1,4 x 0,5 mM. Alle Werte werden als Mittelwert von fünf Replikationen dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: GABA ist ein wettbewerbsfähiger Inhibitor des Spermidin-Transports durch BAT1. (A) Die Aufnahme von 3H beschrifteter Spermidin durch Vesikel, die AtBAT1.1 exdrücken, wurde in Gegenwart von 100 m oder 500 M GABA signifikant reduziert. (B) Scheinbares Km für die Spermidinaufnahme durch BAT1.1 wurde in Gegenwart von 100 M GABA auf 164 x 20 m erhöht. Alle Werte werden als Mittelwert von fünf Replikationen dargestellt. Die Datenanalyse wurde mit dem t-Test eines Schülers durchgeführt und * weist auf einen signifikanten Unterschied zum Steuerelement hin (p-Wert < 0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Glutamat und Alanin sind kompetitive Inhibitoren des Spermidintransports durch BAT1. Die Spermidinaufnahme wurde in Gegenwart von 1 mM nicht-markiertem Glutamat und 1,5 mM nicht-markiertem Alanin signifikant reduziert. Alle Werte werden als Mittelwert von fünf Replikationen dargestellt. Die Datenanalyse wurde mit dem t-Test eines Schülers durchgeführt und * weist auf einen signifikanten Unterschied zum Steuerelement hin (p-Wert < 0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

In der vorliegenden Studie skizzieren wir eine Methode zur Charakterisierung eines Antiporters, indem wir zuerst das Protein in E. coli exprimieren und dann Membranbläschen erzeugen, so dass das heterologös exprimierte Protein in einem zellfreien System untersucht werden kann. Zusätzlich zu den Geräten, die in den meisten molekularbiologischen Labors zu finden sind, erfordert diese Strategie den Einsatz einer französischen Presse, einer Ultrazentrifuge und zugang zu einer Einrichtung zur Durchführung von Radioisotopen-Assays.

Eine Grundvoraussetzung dieser Technik ist, dass das heterologe Protein richtig auf die Plasmamembran von E. coliausgerichtet ist. Diese Strategie kann auch für die funktionelle Analyse von Organellar-Transportern nützlich sein, da der Plastid ADP Glukosetransporter erfolgreich auf die E. coli-Zellmembran lokalisiert und funktionell charakterisiert35. Der in diesen Experimenten verwendete Vektor (pBAD-DEST49) enthält ein N-terminales Thioredoxin-Protein, um die Löslichkeit des übersetzten Produkts zu erhöhen. N-terminale Fusionen eines kleinen B. subtilus Proteinmystik, wurden gefunden, um eine effizientere Ausrichtung von Membrantransportern auf die zytoplasmatische Membran zu ermöglichen36. Allerdings sind Fehlfaltungsereignisse und das Versagen der Proteine, ordnungsgemäß in die zytoplasmatische Membran integriert zu werden, potenzielle Probleme, die den Einsatz bakterieller Expressionssysteme für viele Arten von Transportern ausschließen1.

Membranbläschen wurden auch verwendet, um Pflanzentransporter37,38zu charakterisieren. Da den Vesikeln die wesentlichen Energiequellen wie ATP und Enzyme fehlen, ist die Interferenz durch aktive Transporter und andere stoffwechselmetabolische Aktivität minimal. Somit ist dieses System ideal für die Analyse passiver Translokationen wie Metabolitenaustauscher. Insbesondere die immerklässchen membranierten Vesikel können auf die Charakterisierung von Exporteuren und Antiportern angewendet werden, da die Zusammensetzung der inneren Lösung durch Änderung der Zusammensetzung des Puffers 1 manipuliert werden kann. Darüber hinaus ist die Verwendung der französischen Presse- oder Ultraschallbeschallung ziemlich effizient bei der Erzeugung von inneren Membranbläschen aus intakten E. coli-Zellen. 95% der vesikeln durch Ultraschall oder französische Presse erzeugt haben jeted Membranen39,40. PotE, der E. coli Antiporter von Putrescin und Ornithin, war der erste Polyamin-Antiporter, der mit Inside-Out-Membranvesikeln23charakterisiert wurde. Wir verwendeten P1-Transduktion, um einen spezifischen mutierten Stamm für die Charakterisierung eines Polyamin-Antiporters zu erstellen, und dieser Stamm kann für die Charakterisierung anderer tierischer, pilziger oder pflanzlicher Polyaminaustauscher nützlich sein. Wir stellen uns auch vor, dass andere E. coli-Stämme mit zwei oder mehr Genlöschungen für die Charakterisierung anderer Pflanzen- und Tieraustauschtransporter mit Membranbläschen nützlich sein könnten.

Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll ist die Expression des Proteins im E. coli-Mutantensystem. Ein E. coli-Expressionsvektor mit einem induzierbaren Promotor wird verwendet, um eine straffe, dosisabhängige Regulation der heterologen Genexpression zu fördern. Das Vorhandensein von N-Terminal- und C-Terminal-Tags wie His-Patch Thioredoxin, V5-Epitop oder 6xHis im Vektor ist nützlich für die Detektion und Reinigung des Proteins. Darüber hinaus kann das Vorhandensein eines Thioredoxin-Fusionsproteins, das Bestandteil des pBAD49-Vektors ist, die Translationseffizienz und in einigen Fällen die Löslichkeit von eukaryotischen Proteinen, ausgedrückt in E. coli41, erhöhen. Die verschiedenen Codon-Entscheidungen bei Arabidopsis und E. coli könnten die Proteinexpression in E. coli in Frage stellen. Es ist bekannt, dass die Codonoptimierung die heterozygote Proteinexpression in E. coli42eindrucksvoll erhöhen kann. Im Vesikel-Assay zeigte codonoptimierte AtBAT1.2 eine höhere Austauschaktivität als nicht-codonoptimierte AtBAT1.1 in E. coli-Zellen (Daten nicht gezeigt), was zeigt, dass die Codon-Optimierung hilfreich ist, um die Expression und Funktion heterologös exprimierter Proteine in Bakterienzellen zu verbessern. Die Herstellung von Membranbläschen durch sorgfältige Einstellung des Ventils, um einen langsamen gleichmäßigen Tropfen von lysierten Zellen aufrechtzuerhalten, ist ebenfalls ein wichtiger Schritt im Verfahren. Nach der Ultrazentrifugation haben wir herausgefunden, dass die Resuspension von Membranvesikeln in einem Dounce Homogenisator die Probenvariation auf Probenvariationen zwischen Aliquots von Membranbläschen minimiert, die bei -80 °C hergestellt und anschließend gelagert werden.

Eine Einschränkung der E. coli-Expressionssysteme besteht darin, dass sie nicht in der Lage sind, post-translationale Modifikationen wie N-Glykosylierung oder Acetylierung vorzunehmen. Das Fehlen dieser Proteinmodifikationen könnte sich auf die Proteinaktivitätauswirken 1. Mutanten, die diese Modifikationen durchführen können, wurden jedoch identifiziert und können als Werkzeug verwendet werden, um Proteine auszudrücken, die solche Modifikationen erfordern43. Die Erzeugung ausreichender Mengen des exprimierenden Proteins könnte eine Herausforderung sein, da sich die Entfaltung und Aggregation als Inklusionskörper, das Versagen des Proteins, das ordnungsgemäß in die zytoplasmatische Membran integriert werden kann, Fehlausrichtung und Fehlregulierung aufgrund fehlender posttranslationaler Modifikationen darstellt.

Eine geringfügige Einschränkung dieser Technik ist, dass sie keinen Nachweis für die natürliche Ausrichtung des Transporters liefert. Dies kann durch die Nutzung der N- oder C-Terminal-Tags und immunologischen Methoden erreicht werden. Die Zugänglichkeit eines bestimmten Endpunkts des Proteins in Vesikeln kann durch die Verdauung aller zugänglichen, und daher vermutlich externen Termini des Trägers, Elektrophorese des Proteins in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat, Übertragung auf Nitrozellulosefilter und Nachweis der verbleibenden, internen Termini mitAntikörpern 40erreicht werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Unterstützung für dieses Projekt kam vom BGSU Graduate College und dem BGSU Office of Sponsored Programs and Research.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
3H-putrescine PerkinElmer NET185001MC
3H-spermidine PerkinElmer NET522001MC
4-chloro-1-naphthol Sigma-Aldrich C8890
14C arginine Moravek Inc. MC137
Arginine Sigma-Aldrich A-5006
Anti-His (C-term)-HRP antibody ThermoFisher R931-25 Detects the C-terminal polyhistidine (6xHis) tag, requires the free carboxyl
group for detection
Arabinose Sigma-Aldrich A3256
BCA protein assay kit ThermoFisher 23227 Pierce BCA protein asay kit.
Bromophenol blue Bio-Rad 161-0404
Carboxypeptidase B Sigma-Aldrich C9584-1mg
Centrifuge Sorvall SS-34 fixed angle rotor and GA-6 fixed angle rotor
Dounce tissue grinder LabGenome 7777-7 Corning 7777-7 pyrex homogenizer with pour spout.
Ecoscint-H National Diagnostics LS275 scintillation cocktail
EDTA Sigma-Aldrich
Filtration manifold Hoefer FH225V
French Pressure Cell Glen Mills FA-080A120
GABA Sigma-Aldrich A2129
Glutamate Sigma-Aldrich G6904
Glycerol
GraphPad Prism software http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm
Hydrogen peroxide KROGER
Potassium Chloride J.T. Baker 3040-01
Liquid scintillation counter Beckman LS-6500
Maleate Sigma-Aldrich M0375
Nanodrop ThermoFisher
Nitrocellulose membrane filters Merck Millipore hawp02500 0.45 µM
PCR clean up kit Genscript QuickClean II
Potassium Phosphate dibasic ThermoFisher P290-500
putrescine fluka 32810
Potassium Phosphate monobasic J.T.Baker 4008
Spermidine Sigma-aldrich S2501
Strains :E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10 This manuscript Available upon request. Strain is deficient in the PotE and CadB polyamine exchangers.
Tris-base Research Products T60040-1000
Ultracentrifuge Sorvall MTX 150 46960 Thermo Fisher S150-AT fixed angle rotor
Ultracentrifuge tubes ThermoFisher 45237 Centrifuge tubes for S150-AT rotor
Vector: pBAD-DEST49 ThermoFisher Gateway expression vector for E. coli

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Charakterisierung von Membrantransportern durch heterologen Ausdruck in <em>E. coli</em> und Herstellung von Membranvesikeln
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