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Biochemistry

ई. कोलाई में हेटेरोलोगस अभिव्यक्ति और झिल्ली वेसिकल्स के उत्पादन द्वारा झिल्ली ट्रांसपोर्टरों का लक्षण वर्णन

Published: December 31, 2019 doi: 10.3791/60009
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Bowling Green State University

Summary

हम ई. कोलाई में विषमलोगोस अभिव्यक्ति और फ्रांसीसी प्रेस का उपयोग करकोशिकाओं के लिसिस द्वारा उत्पादित झिल्ली वेसिकल तैयारी में प्रोटोन-चालित झिल्ली ट्रांसपोर्टरों के लक्षण वर्णन के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं।

Abstract

उपन्यास झिल्ली ट्रांसपोर्टरों की कार्यात्मक रूप से विशेषता के लिए कई विधियां विकसित की गई हैं। पॉलीएमाइंस सभी जीवों में सर्वव्यापी हैं, लेकिन पौधों में पॉलीमाइन एक्सचेंजर्स की पहचान नहीं की गई है। यहां, हम एस्चेरिचिया कोलाई कोशिकाओं के लिसिस से उत्पन्न झिल्ली वेसिकल्स का उपयोग करके पॉलीएमाइन एंटीकुलर की विशेषता के लिए एक विधि रेखांकित करते हैं। सबसे पहले, हमने पॉलीएमाइन और आर्जिनिन एक्सचेंज ट्रांसपोर्टरों में ई. कोलाई तनाव की कमी में AtBAT1 को विषमता पूर्वक व्यक्त किया। वेसिकल्स को एक फ्रांसीसी प्रेस का उपयोग करके उत्पादित किया गया था, जो अल्ट्रासेंट्र्युजन द्वारा शुद्ध किया गया था और ट्रांसपोर्टर की सब्सट्रेट विशिष्टता प्रदर्शित करने के लिए लेबल वाले सब्सट्रेट्स की झिल्ली निस्पंदन परख में उपयोग किया जाता था। इन परखों से पता चला कि AtBAT1 आर्जिनिन, एमिनोबुटिरिक एसिड (गाबा), पुत्रस्सिन और शुक्राणुकीं का प्रोटॉन मध्यस्थता करने वाला ट्रांसपोर्टर है । AtBAT1 की परख के लिए विकसित किया गया उत्परिवर्ती तनाव संयंत्र और पशु पॉलीएमाइन एक्सचेंजर्स के अन्य परिवारों के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए उपयोगी हो सकता है। हम यह भी परिकल्पना करते हैं कि इस दृष्टिकोण का उपयोग कई अन्य प्रकार के एंटीपोर्टरों की विशेषता के लिए किया जा सकता है, जब तक कि इन प्रोटीनों को बैक्टीरियल सेल झिल्ली में व्यक्त किया जा सकता है। ई. कोलाई उपन्यास ट्रांसपोर्टरों के लक्षण वर्णन के लिए एक अच्छी प्रणाली है, क्योंकि देशी ट्रांसपोर्टरों को म्यूटकरने के लिए कई तरीके नियोजित किए जा सकते हैं।

Introduction

मेटाबोलाइट्स की तस्करी में शामिल प्रोटीन शारीरिक विनियमन का एक आवश्यक स्तर का गठन करते हैं, लेकिन पौधों की झिल्ली ट्रांसपोर्टरों के विशाल बहुमत को अभी तक कार्यात्मक रूप से चित्रित नहीं किया गया है। उपन्यास परिवहन प्रोटीन की विशेषता के लिए कई रणनीतियों को लागू किया गया है। ई. कोलाई और यूकैरियोटिक कोशिकाओं जैसे खमीर, ज़ेनोपस ओसाइट्स, स्तनधारी कोशिकाओं, कीट कोशिकाओं और पौधों की कोशिकाओं जैसे मॉडल जीवों में विषमलॉगस अभिव्यक्ति का उपयोग उनकी परिवहन गतिविधि1निर्धारित करने के लिए किया गया है। यूकेरियोटिक कोशिकाओं को यूकेरियोटिक प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए इष्ट किया जाता है, क्योंकि बुनियादी सेलुलर संरचना, सिग्नल ट्रांसड्यूइंग रास्ते, प्रतिलेखन और अनुवाद मशीनरी मूल परिस्थितियों के अनुकूल हैं।

खमीर पौधों में उपन्यास परिवहन प्रोटीन के लक्षण वर्णन के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल जीव रहा है। पहले पौधे के परिवहन प्रोटीन को खमीरमेंसफलतापूर्वक व्यक्त किया गया था , जो क्लोरेला2से हेक्सोस ट्रांसपोर्टर HUP1 था । तब से, कई संयंत्र परिवहन प्रोटीन कार्यात्मक रूप से खमीर अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करके विशेषता है। इनमें प्लांट शुगर ट्रांसपोर्टर्स (एसयूसी1 और एसयूसी23,वीएफएसयूटी1 और वीएफएसटीपी14)और ऑक्सिन ट्रांसपोर्टर्स (AUX1 और पिन5)शामिल हैं । पौधे प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए खमीर का उपयोग करने के नुकसान में प्लास्टिड-स्थानीयकृत प्रोटीन की बिगड़ा गतिविधि शामिल हो सकती है क्योंकि खमीर में इस ऑर्गेनेल की कमी है,6को गलत टार्गेट करना और झिल्ली प्रोटीन की अतिअभिव्यक्ति के कारण खमीर में तनाव प्रतिक्रियाओं का गठन और सक्रियता7,8,9।

ज़ेनोपस ओसाइट्स में परिवहन प्रोटीन की हेटेरोलोगस अभिव्यक्ति का व्यापक रूप से ट्रांसपोर्टरोंकेइलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल लक्षण वर्णन के लिए उपयोग किया गया है । ज़ेनोपस ओसाइट्स में हेटेरोलोगस अभिव्यक्ति का उपयोग करने वाले पहले पौधे परिवहन प्रोटीन अरबीडोपस पोटेशियम चैनल KAT110 और अरबीडोप्सिस हेक्सोज़ ट्रांसपोर्टर एसटीपी 111थे। तब से, ज़ेनोपस ओसाइट्स को प्लाज्मा झिल्लीट्रांसपोर्टर12,वाकुओलर सुक्रोज ट्रांसपोर्टर सुत413 और वाकुओलर मैलेट ट्रांसपोर्टर एएलएमटी914जैसे कई संयंत्र परिवहन प्रोटीन की विशेषता के लिए नियोजित किया गया है। परिवहन परखों के लिए ज़ेनोपस ओसाइट्स की एक महत्वपूर्ण सीमा यह है कि इंट्रासेलर मेटाबोलाइट्स की एकाग्रता को हेरफेर नहीं किया जा सकता1. इसके अलावा, Xenopus oocytes तैयार करने के लिए पेशेवर ज्ञान की आवश्यकता होती है और ओसाइट बैचों की परिवर्तनशीलता को नियंत्रित करना मुश्किल है।

आदर्श जीव ई कोलाई में विषमलॉगस अभिव्यक्ति उपन्यास संयंत्र परिवहन प्रोटीन के लक्षण वर्णन के मामले में एक आदर्श प्रणाली है। एक पूरी तरह से अनुक्रमित जीनोम15के साथ, ई. कोलाई की आणविक और शारीरिक विशेषताओं को अच्छी तरह से जाना जाता है। आणविक उपकरण और तकनीक अच्छी तरह से स्थापित कर रहे हैं16. इसके अलावा, विभिन्न अभिव्यक्ति वैक्टर, गैर-रोगजनक उपभेद और म्यूटेंट17,18,19उपलब्ध हैं। इसके अलावा, ई. कोलाई एक उच्च विकास दर है और आसानी से प्रयोगशाला की स्थिति के तहत उगाया जा सकता है । ई. कोलाई9में उच्च मात्रा में कई प्रोटीन को आसानी से व्यक्त और शुद्ध किया जा सकता है। जब प्रोटीन सीधे सेलुलर सिस्टम में नहीं कहा जा सकता है, liposomes में प्रोटीन का पुनर्गठन भी एक सफल रहा है, हालांकि शुद्ध झिल्ली प्रोटीन के लक्षण वर्णन के लिए चुनौतीपूर्ण नवाचार । सोयाबीन, मक्का, चावल और अरबीडोप्सिस में फॉस्फेट ट्रांसपोर्टरों जैसे सोल्यूट ट्रांसपोर्टरों सहित पौधे माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन प्रोटीन का कार्यात्मक लक्षण वर्णन, अरबीडोप्सिस में डाइकार्बोक्लेट-ट्राइकार्बॉक्सिलेट वाहक20,21का उपयोग करके पूरा किया गया है। हालांकि, टमाटर प्रोटीन SICAT9 के पुनर्संयोजन प्रोटीन पुनर्गठन प्रयोगों में nonfunctional पाया गया, और कैट ट्रांसपोर्टर परिवार के अंय सदस्यों को Xenopus oocyte परख22में nonfunctional पाया गया । इस प्रकार, झिल्ली ट्रांसपोर्टरों के लक्षण वर्णन के लिए अतिरिक्त आणविक उपकरणों की आवश्यकता होती है।

ई. कोलाई23में पांच पॉलीएमाइन परिवहन प्रणालियां पाई जाती हैं । इनमें दो एबीसी ट्रांसपोर्टर शुक्राणुऔर पुत्रस्सिन के तेज, एक पुटरेसिन/ऑर्निथिन एक्सचेंजर, एक शवासीन/लाइसिन एक्सचेंजर, एक शुक्राणुनिर्यातक और एक पुत्रस्सिन आयातक शामिल हैं । putrescine एक्सचेंजर PotE मूल रूप से एक वेसिकल परख का उपयोग कर विशेषता थी, जहां अंदर बाहर vesicles एक फ्रांसीसी प्रेस के साथ lysing कोशिकाओं द्वारा तैयार किया गया था और ऑरलैंडाइल24के बदले में वेसिकल्स में रेडियोलेबल putrescine के तेज मापने । वेसिकल परखों का उपयोग कैल्शियम ट्रांसपोर्टर की विशेषता के लिए भी किया जाता था, जिसने प्रोटोन ढाल25के जवाब में कैल्शियम के परिवहन में मध्यस्थता की। इन प्रयोगों ने हमें अन्य पॉलीएमाइन एक्सचेंजर्स के लक्षण वर्णन के लिए एक रणनीति विकसित करने के लिए प्रेरित किया। हमने सबसे पहले पोटे और कैडबी एक्सचेंजर्स में ई कोलाई की कमी का तनाव पैदा किया । यहां, हम संशोधित ई. कोलाई तनाव में विषमता अभिव्यक्ति द्वारा एक पौधे पॉलीमाइन एंटीपोर्टर के कार्यात्मक लक्षण वर्णन, एक फ्रांसीसी प्रेस का उपयोग कर झिल्ली वेसिकल्स की पीढ़ी, और रेडियोलेबल assays प्रदर्शित करते हैं।

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Protocol

1. ई. कोलाई डबल नॉक आउट उत्परिवर्ती के साथ P1 ट्रांसड्यूक्शन की पीढ़ी

  1. ई. कोलाई जेनेटिक स्टॉक सेंटर(http://cgsc.biology.yale.edu)से ई कोलाई सिंगल-नॉकआउट उत्परिवर्ती उपभेदों और ई. कोलाई एथिकल बी प्राप्त करें।
    नोट: पोटे स्ट्रेन26 और कैडबी स्ट्रेन टेट्रासाइक्लिन प्रतिरोधी27है।
  2. P1 ट्रांसड्यूक्शन प्रोटोकॉल28का उपयोग करपोट/कैडबी डबल नॉकआउट (DKO) तनाव का निर्माण करें ।
    1. Lysate तैयारी
      1. ताजा पौंड (1:100) में 10-25 mM MgCl2,5 mM CaCl2,और 0.1-0.2% ग्लूकोज के साथ पूरक में एक रात की संस्कृति को पतला करें।
      2. 1-2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस से बढ़ें।
      3. संस्कृति के लिए P1 phage lysate के 40 μL जोड़ें, और 37 डिग्री सेल्सियस से बढ़ रहा जारी है। 1-3 घंटे के लिए मॉनिटर जब तक संस्कृति lysed है
        नोट: जब संस्कृति का पालन किया जाता है, तो सेलुलर मलबा ट्यूब में दिखाई देगा और संस्कृति को टर्बिडिटी का एक महत्वपूर्ण नुकसान होगा।
      4. लिसिस और भंवर में क्लोरोफॉर्म (50-100 माइक्रोन) की कई बूंदें डालें। सेलुलर मलबे को हटाने और एक ताजा ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण करने के लिए 2 मिन के लिए 12,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    2. ट्रांसड्यूक्शन
      1. पौंड माध्यम में रातोंरात बढ़ो।
      2. 2 मिन के लिए 4,000 x ग्राम पर केंद्रीकरण द्वारा कोशिकाओं को काटें और 1/5-1/3 में पुनर्निलंबित करें 100 एमएम एमजीएसओ4 और 5 एम एम सीएसीएल2के साथ पूरक ताजा पौंड में काटी गई संस्कृति की मात्रा।
      3. चरण 1.2.1.4 से फेज के साथ ट्यूब पर कैडबी सेल निलंबन जोड़ें और तेजी से मिलाएं।
      4. 1 एम ना-सिट्रेट (पीएच5.5) के 200 माइक्रोन जोड़ें, फिर एंटीबायोटिक प्रतिरोधी मार्कर की अभिव्यक्ति की अनुमति देने के लिए 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एलबी इनक्यूबेट का 1 एल जोड़ें।
      5. 5 मिन के लिए 4000 x ग्राम पर स्पिन कोशिकाओं।
      6. कोशिकाओं को तितर-बितर करने के लिए 100 एम एम एनए-सिट्रेट (पीएच 5.5) और भंवर के साथ 100 माइक्रोन एलबी में फिर से निलंबित करें।
      7. एलबी एगर प्लेटों पर 50 μg/mL kanamycin और 10 μg/mL tetracycline के साथ recombinant उपभेदों का चयन करें और फिर उचित प्राइमर26,27के साथ पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) द्वारा पुष्टि करें ।
      8. पीसीआर के टुकड़ों को सीक्वेंस करके सत्यापित करें।

2. ई. कोलाई उत्परिवर्ती में लक्ष्य जीन (AtBAT1) की अभिव्यक्ति

  1. पीसीआर द्वारा लक्ष्य जीन के पूर्ण लंबाई अनुक्रम को बढ़ाना और गेटवे प्रवेश वेक्टर पीएनटीआर/डी-टोप्पो29में डालें ।
    नोट: इस मामले में ATBAT1.1 को फॉरवर्ड प्राइमर 5'CGGCGATCAATCCTTTTTTtt t और रिवर्स प्राइमर 5'GCTAAGAATGTTGGAGATGG का उपयोग करके परिलक्षित किया गया था, 2 मिन के लिए 98 डिग्री सेल्सियस और फिर 01 मिन के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर डेन्टुरेशन के 30 चक्र, 0.3 मिन के लिए 59 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग, 0.40 मिन के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार और 10 मिन के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम विस्तार। पीसीआर उत्पाद को पीसीआर क्लीनअप किट का उपयोग करके शुद्ध किया गया था, जो स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। गेटवे वेक्टर में पीसीआर उत्पाद का सम्मिलन मनुफैट्रर निर्देशों के बाद किया गया था।
    1. प्रवेश वेक्टर को हीटशॉक द्वारा सक्षम Top10 ई. कोलाई कोशिकाओं में बदलें और मानक आणविक क्लोनिंग प्रोटोकॉल30के बाद 50 μg/mL kanamycin के साथ एलबी मीडिया पर सफल पुनर्संयोजनके लिए चयन करें।
    2. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए, प्लाज्मिड निष्कर्षण किट का उपयोग करके प्लाज्मिड डीएनए निकालें, और सही प्रविष्टि की पुष्टि करने के लिए अनुक्रम।
  2. एक अभिव्यक्ति वेक्टर29बनाने के लिए गेटवे एलआर क्लोनिंग द्वारा ई. कोलाई गंतव्य वेक्टर, pBAD-DEST49 में लक्ष्य जीन स्थानांतरित करें ।
    1. अभिव्यक्ति वेक्टर को सक्षम Top10 ई. कोलाई कोशिकाओं में 30 एस के लिए हीटशॉक द्वारा बदलें और १०० μg/mL ampicillin30के साथ पौंड मीडिया पर सफल recombinants का चयन करें ।
    2. सही प्रविष्टि की पुष्टि करने के लिए प्लाज्मिड डीएनए30 और अनुक्रम निकालें।
  3. अभिव्यक्ति वेक्टर को ई. कोलाई में बदलें::कान, एकैडबी2231::Tn10 और एम्पिसिलिन, कानामाइसिन और टेट्रासाइक्लिन30के साथ एलबी प्लेटों पर चुनें।
  4. शामिल करने के लिए अरबीनोज़ की इष्टतम एकाग्रता निर्धारित करने के लिए,29वर्णित अरबीनोज की ढाल सांद्रता के साथ एलबी मीडिया में अराबाद प्रमोटर के नियंत्रण में लक्ष्य जीन व्यक्त करें।
  5. सेल छर्रों को इकट्ठा करें और एसडीएस-पेज द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति का आकलन करें और उत्पाद मैनुअल29में वर्णित प्रोटीन बैंड के दृश्य।
    नोट: ई. कोलाई 100 (डेल):: कान, 100 10 BAT1 अभिव्यक्ति के बिना नियंत्रण नमूने के रूप में इस्तेमाल किया गया था। ई. कोलाई डबल खाली pBAD-DEST49 वेक्टर के साथ उत्परिवर्ती कोशिकाओं को वेक्टर में सीसीडीबी जीन की उपस्थिति के कारण नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल नहीं किया गया था ।

3. अंदर से बाहर झिल्ली Vesicles की पीढ़ी

  1. संस्कृति ई. कोलाई उत्परिवर्ती कोशिकाओं पॉलीएमाइन मुक्त मीडिया के 5 mL में रात भर एक ही कॉलोनी बढ़ रही द्वारा लक्ष्य प्रोटीन व्यक्त (2% ग्लाइसेरोल, कश्मीरके 6ग्राम 2 HPO4,KH2PO4के 3 ग्राम, NaCl के ०.५ ग्राम, एनएच4सीएल, 50 मिलीग्राम थियामीन, 0.79 ग्राम खमीर पूरा सिंथेटिक मीडिया एडेनिन हेमिसुलफेट (10 मिलीग्राम/एल), एल-आर्गिनिन (50 मिलीग्राम/एल), एल-एस्पार्टिक एसिड (80 मिलीग्राम/एल), एल-हिस्टिडीन हाइड्रोक्लो मोनोहाइड्रेट (20 मिली/एल), एल-ल्यूसिन (100 मिलीग्राम/एल), एल-लाइसिन हाइड्रोक्लोराइड (50 मिलीग्राम/एल), एल-मेथिओनीन (20 मिलीग्राम/एल), एल-फेनीलालाइन (५० मिलीग्राम/एल), एल-थ्रेओन (१०० मिलीग्राम/एल), एल-ट्रिप्टोफान (५० मिलीग्राम/एल), एल-टायरोसिन (५० मिलीग्राम/एल), एल-वेलिन (१४० मिलीग्राम/एल), उरसिल (20 मिली/एल)। इस संस्कृति को पॉलीमाइन-मुक्त मीडिया के 500 मिलीएल में स्थानांतरित करें 0.0002% अरबीनोज़ के साथ पूरक और तब तक बढ़ें जब तक कि सेल संस्कृति 0.6-0.8 (आमतौर पर ~ 5 घंटे) के ओडी600 तक न पहुंच जाए।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिन के लिए 2,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज्ड द्वारा सेल पैलेट को इकट्ठा करें। गोली को फिर से निलंबित करें और 0.1 एम पोटेशियम फॉस्फेट बफर, पीएच 6.6 के साथ तीन बार धोएं, जिसमें 10 मीटर ईटीए (बफर 1)। तीसरे स्पिन के बाद बफर 1 में कोशिकाओं की अंतिम मात्रा 10 मीटर होनी चाहिए।
  3. 35 mL फ्रेंच प्रेशर सेल का उपयोग करके बरकरार कोशिकाओं के फ्रेंच प्रेस उपचार (10,000 बजे) द्वारा अंदर-बाहर झिल्ली वेसिकल्स उत्पन्न करें।
  4. नमूना को मानक फ्रांसीसी दबाव सेल में लोड करने से पहले, पिस्टन और ओ-रिंग्स को चिकनाई करें ताकि सेल में डालने में आसानी हो सके।
    नोट:ये निर्देश मानक दबाव सेल के उपयोग के लिए विशिष्ट हैं31.
    1. सावधानी से सेल के निचले छोर में बंद प्लग पेंच। सुनिश्चित करें कि सेल के पक्ष में अक्षरों के आधार पर सेल राइट-साइड अप है। पिस्टन को सेल में डालें और इसे सेल में ले जाएं, जब तक कि पिस्टन पर मैक्स फिल लाइन पिस्टन के शीर्ष तक न पहुंच जाए। तीन पदों के बीच प्रदान किए गए स्टैंड पर यूनिट को फ्लिप करें और रखें।
    2. सेल निलंबन को कोशिका के शरीर में डालें।
      नोट: हम केवल 10 मिलीएल का उपयोग कर रहे हैं, इसलिए फ्रांसीसी दबाव सेल चैंबर में बहुत सारे कमरे बचे होंगे, जिनकी क्षमता 35 मिलीएल है।
    3. फ्रेंच प्रेशर सेल यूनिट पर स्टैंडर्ड प्रेशर सेल माउंट करें।
      1. सबसे पहले जांच करें कि बिजली बंद है। पैनल के बाईं ओर अनुपात चयनकर्ता स्विच है। इसमें तीन स्थितियां हैं: रन के अंत में नीचे, एक छोटे दबाव सेल का उपयोग करने के लिए कम, और मानक फ्रांसीसी दबाव सेल के साथ उपयोग के लिए उच्च। यदि फ्रांसीसी प्रेस पहले छोटे सेल पिस्टन पूरी तरह से मुकर नहीं जा सकता है के साथ इस्तेमाल किया गया था । इस स्विच को नीचेसेट करें।
    4. यूनिट के पीछे आरएचएस पर स्विच के साथ मशीन को चालू करें और पॉज-रन स्विच को रन पोजीशन पर बदल दें। इसके चलते पिस्टन पूरी तरह मुकर जाएगा। स्विच को थामनेके लिए वापस ले जाएं, और मशीन को बंद कर दें।
    5. अंगूठे के शिकंजा को ढीला करें और सुरक्षा क्लैंप को स्थानांतरित करें जो दो स्टेनलेस स्टील कॉलम को साइड में फैला ताहै। यह सही करने के लिए बाहर स्विंग होगा । एक हाथ के साथ जगह में बंद प्लग के आधार पकड़, दोनों हाथों से फ्रांसीसी दबाव सेल उठाओ, और यह 180 ° घुमाएगी, इसलिए पिस्टन अब ईमानदार स्थिति में है। इसे मंच पर सेट करें, और सुरक्षा क्लैंप को वापस जगह में ले जाएं ताकि यह क्लैंप फ्रांसीसी दबाव सेल को स्थिति में रख सके।
    6. नोट क्लोजर प्लग पर फ्लो वाल्व असेंबली को ऑपरेटर और तैनात करने के लिए सुलभ होने की आवश्यकता है ताकि वाल्व को स्वतंत्र रूप से बदल दिया जा सके। कुछ काउंटर दक्षिणावर्त बदल जाता है के साथ प्रवाह वाल्व विधानसभा खोलें। पिस्टन की भुजाओं को रखें ताकि वे दो बजे और आठ बजे की स्थिति में उन्मुख हों। अंगूठे शिकंजा कस ें ताकि मानक दबाव सेल जगह में आयोजित हो।
    7. क्लोजर प्लग में नमूना आउटलेट ट्यूब डालें, और लचीला ट्यूबिंग का एक छोटा टुकड़ा कनेक्ट करें ताकि टूटे हुए सेल मलबे को फाल्कन ट्यूब में एकत्र किया जा सके। हम आमतौर पर एक ३०० mL बर्फ से भरे बीकर का उपयोग करने के लिए फाल्कन ट्यूब सीधा पकड़, और सेल मलबे ठंडा रखने के लिए ।
    8. सुनिश्चित करें कि ठहराव-भागस्विच को थामनेके लिए सेट है, और वाल्व असेंबली खुली स्थितिमें है। मशीन को वापस चालू करें, अनुपात चयनकर्ता उच्चपर स्विच करें, और फ्रंट पैनल पर दबाव वृद्धि वाल्व को आधे मोड़ के बारे में दाईं ओर मोड़ दें।
    9. पिस्टन चैंबर में हवा को विस्थापित करने के लिए आधार से उठना शुरू हो जाएगा । बीकर में ट्यूब के लिए नमूना आउटलेट ट्यूब से जुड़ी टायगन ट्यूबिंग से बाहर आने वाली हवा को निर्देशित करें।
    10. जब तरल की पहली बूंदें बाहर आती हैं, तो प्रवाह वाल्व असेंबली को दक्षिणावर्त मोड़कर बंद कर दें। यह दबाव सेल के साथ धातु की सील के लिए एक धातु बनाता है, इसलिए अधिक मजबूत न करें।
    11. फ्रांसीसी प्रेस के सामने दबाव सेल के अंदर जैविक कोशिकाओं पर उचित दबाव उत्पन्न करने के लिए सामने पैनल पर एक चार्ट है । इस मामले में, दबाव वृद्धि वाल्व दक्षिणावर्त मोड़ द्वारा दबाव बढ़ाएं, जब तक कि गेज 640 साई तक न पहुंच जाए। इससे 10 हजार साई का इंटरनल प्रेशर पैदा होगा।
    12. एक बार सेल लक्ष्य दबाव तक पहुंच गया है यह काउंटर दक्षिणावर्त मोड़ द्वारा प्रवाह वाल्व विधानसभा थोड़ा खुला । वाल्व के उद्घाटन को समायोजित करें ताकि प्रति मिन केवल लगभग 10 बूंदों की प्रवाह दर की अनुमति दी जा सके।
    13. जब पिस्टन शरीर पर स्टॉप लाइन प्रवाह कोशिका के शीर्ष पर पहुंच जाती है। ठहराव-रन स्विच को थामनेके लिए स्विच करें। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि पिस्टन को सेल में आगे डाला जाने से इकाई को नुकसान होगा। प्रवाह वाल्व विधानसभा खोलें और शेष बूंदों को इकट्ठा करें।
    14. टर्न रेशियो चयनकर्ता स्विच को नीचेकरें और फिर पॉज रन स्विच को रनपर सेट करें । जब नीचे की प्लेट पूरी तरह से वापस आ जाती है तो रन स्विच को थामनेके लिए सेट करें, और मशीन को बंद कर दें।
    15. फ्रांसीसी प्रेस से फ्रांसीसी दबाव सेल निकालें, और सफाई के लिए जुदा। ग्लिसरोल के हल्के कवर के साथ सभी भागों को सूखा स्टोर करें। किसी भी गैसकेट या जवानों को पहनने के संकेतों के साथ निकालें और बदलें।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिन के लिए 10,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज्ड द्वारा फ्रांसीसी प्रेस एलुएंट की अटूट कोशिकाओं और सेल मलबे को हटा दें। गोली को त्यागें, और अल्ट्रासेंट्रोफ्यूज ट्यूबों के लिए सुपरनेटेंट स्थानांतरित करें।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 150,000 ग्राम पर अल्ट्रासेंटरिफुगेशन द्वारा परिणामी सुपरनेट से पैलेट झिल्ली वेसिकल्स।
  7. झिल्ली वेसिकल्स को एक बार धोएं, बिना निलंबन के, 1 एमएम ट्रिस-मालेट में, पीएच 5.2 जिसमें 0.14 एम केसीएल, 2 एमएम 2-मर्काप्टोथेनॉल और 10% ग्लाइरोल और एक ही बफर (बफर 2)23 में एक डल्̈स टिश्यू ग्राइंडर का उपयोग करके फिर से सस्पेंड करें। आमतौर पर संस्कृति के ५०० मिलीग्राम से झिल्ली अंश बफर के 5 mL में निलंबित कर दिया जाएगा, और 5-10 मिलीग्राम झिल्ली प्रोटीन की एकाग्रता/
  8. 1.5 एम माइक्रोसेंट्रिकफ्यूज ट्यूब में -80 डिग्री सेल्सियस पर झिल्ली तैयारी के 100 माइक्रोनल एलिकोट्स स्टोर करें।

4. वेस्टर्न ब्लॉट और ट्रांसपोर्टर परख का ओरिएंटेशन

  1. 30 एमएम ट्रिस पीएच 7.8 + 0.1 mM CoCl2में चरण 3.7 से वेसिकल्स को धोएं और फिर से निलंबित करें।
  2. 100 माइक्रोन नमूनों के लिए, 0.1 एम एनसीएल, 30 एम ट्राई, 0.2 एम सीओसीएल2 पीएच 7.8 में 2 मिलीग्राम/एमएल कार्बोसिपेप्टिडेस ए के 1 माइक्रोन जोड़ें।
  3. 20 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिन के लिए टीका। 0.5 एम नाएट्टा, 0.5 एम 2-मर्काप्टोथेनॉल पीएच 7.5 के 5 माइक्रोन जोड़कर पाचन बंद करें।
  4. एंजाइम को पूरी तरह निष्क्रिय करने के लिए, कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए समाधान को इनक्यूबेट करें।
    नोट: कैटबॉक्सिपेप्टिडेस ए ट्रीटमेंट के बिना वेसिकल्स का उपयोग नियंत्रण के रूप में किया जाता था।
  5. लिथियम डोडेकिल सल्फेट की उपस्थिति में इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा नमूनों का विश्लेषण करें। 150 मिलीग्राम/एमएल लिथियम डोडेकिल सल्फेट, 450 मिलीग्राम/एमएल ग्लाइसेरोल, 0.1 मिलीग्राम/एमएल ब्रोमोफेनॉल ब्लू, 0.4 एम ट्रिस पीएच 7.5 से 100 माइक्रोनल के 5-10 माइक्रोन जोड़ें।
  6. पॉलीएक्रिलैमाइड जेल पर 25 एमएम सोडियम-हाइड्रोजन फॉस्फेट पीएच 7.5 के साथ गीला एक नाइट्रोसेल्यूलोज फिल्टर बिछाकर इम्यूनोलोटिंग करें। इन्हें दो गीले सेल्यूलोज फिल्टर के बीच रखें और अंत में दो गीले प्लास्टिक दस्त पैड के बीच। इस संयोजन को 2-4 डिग्री सेल्सियस पर 25 मीटर सोडियम-हाइड्रोजन फॉस्फेट पीएच 7.5 वाले कक्ष के इलेक्ट्रोड के बीच रखें।
  7. प्रोटीन के इलेक्ट्रोट्रांसफर को 20 वी और 2-3 ए पर 3 घंटे के लिए आगे बढ़ने की अनुमति दें ।
  8. 0.15 एम NaCl, 10 m Tris, पीएच 7.5 और 0.5 मिलीग्राम/mL ट्वीन 2033के एक अवरुद्ध बफर में 2 डिग्री सेल्सियस पर रात भर नाइट्ट्रोसेल्यूलोज झिल्ली को ब्लॉक करें।
  9. एंटी-ए-उस (सी टर्मिनल) के 1:5000 कमजोर पड़ने के साथ 2 घंटे के लिए नाइट्रोसेल्यूलोज फिल्टर को इनक्यूबेट करें - अवरुद्ध बफर (20 मीटर) में एचआरपी एंटीबॉडी और कुल 60 मीटर के लिए बफर के 50 मीटर के साथ दो बार धोएं।
  10. इम्यूनोब्लॉट की कल्पना करने के लिए, विकृत शराब के 20 मिलीग्राम में 4-क्लोरो-1-नैपथथोल के 6 मिलीग्राम को भंग करें और 15 मीटर ट्रिस पीएच 7.5 और 30% एच2ओ2के 50 माइक्रोन के 80 मिलीग्राम जोड़ें। फिल्टर पेपर को सब्सट्रेट सॉल्यूशन में 20 मिन के लिए नब करें। रिएजेंट एंटीबॉडी के साथ प्रतिक्रिया देगा कि वह नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर नीली वर्षा करे। जब पर्याप्त रंग विकसित हो गया है, तो झिल्ली को पानी से कुल्लाकरें, और सूखने की अनुमति दें।

5. परिवहन परख

  1. 5 मिन के लिए 12 डिग्री सेल्सियस पर झिल्ली वेसिकल्स के इनक्यूबेट 100 माइक्रोन एलिकोट्स।
  2. 50 माइक्रोन (जब तक अन्यथा नहीं कहा जाता है) की अंतिम एकाग्रता पर झिल्ली वेसिकल्स में रेडियोलेबल पॉलीएमाइंस जोड़कर परिवहन शुरू करें। परख बफर में 3एच-सब्सट्रेट (स्पर्मिडीन या पुटरेससिन) समाधान करें जिसमें 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल, 10 मीटर पोटेशियम फॉस्फेट, पीएच 8.0 और 0.14 एम केसीएल23 (बफर 3) को परख के आधार पर संशोधनों के साथ शामिल किया गया है।
  3. 1.5 मीटर माइक्रोफ्यूज ट्यूब में 12 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिन के लिए परिवहन परख ों का संचालन करें।
  4. 1 मिन के बाद, प्रतिक्रिया मिश्रण को छानने के लिए कई गुना स्थानांतरित करें और 0.45 माइक्रोन नाइट्रोसेल्यूलोस झिल्ली फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें।
    1. बर्फ के 3 मिलीएल-ठंडा परख बफर जोड़ें जिसमें अवेलेबल पॉलीएमाइंस की 10 गुना अधिक एकाग्रता होती है, जिसके बाद गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को कम करने के लिए पॉलीअमाइंस के बिना परख बफर के 3 मिलील होते हैं।
    2. धोए गए फिल्टर को 20 मीटर डिस्पोजेबल प्रस्फुटन शीशियों में स्थानांतरित करें जिसमें प्रस्फुटन तरल का 10 मीटर हो और तरल प्रस्फुटन काउंटर का उपयोग करके रेडियोधर्मिता निर्धारित करें। प्रस्फुटन काउंटर नमूने में रेडियोधर्मिता को मापता है और इसे प्रति मिन (डीपीएम) विघटन के रूप में रिपोर्ट करता है।
  5. 12 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटल द्वारा 1 मिन पर तेज के बीच के अंतर के रूप में शुद्ध पॉलीमाइन तेज की गणना करें और बर्फ पर इनक्यूबेटल द्वारा 0 मिन पर तेज करें।
    नोट: वेसिकल्स में आयातित सब्सट्रेट के द्रव्यमान की गणना इस प्रकार की जाती है। यदि माइक्रोफ्यूज ट्यूब में नमूना मात्रा 0.2 माइक्रोन है और सब्सट्रेट की शुरुआती एकाग्रता 100 माइक्रोन है, तो माइक्रोफ्यूज ट्यूब में सब्सट्रेट का कुल द्रव्यमान 20 x 10-12 एम है। वाणिज्यिक रूप से लेबल किए गए सब्सट्रेट्स (अक्सर 2.22 x 109 डीपीएम/एमएम) की बहुत उच्च विशिष्ट गतिविधि के कारण आइसोटोप जोड़े गए द्रव्यमान को गणना में नजरअंदाज किया जा सकता है। इसलिए यदि माइक्रोफ्यूज ट्यूब में जोड़े गए आइसोटोप की कुल मात्रा 100 x 106 डीपीएम थी और वेसिकल्स में 1,000 डीपीएम का शुद्ध तेज था, तो वेसिकल्स द्वारा उठाए गए सब्सट्रेट का कुल द्रव्यमान सब्सट्रेट या 2 x10-13 एम के मॉल की कुल संख्या का 1% था।
    1. लक्ष्य प्रोटीन व्यक्त वेसिकल्स में 10, 25, 50, 250 और 500 माइक्रोएम रेडियोलेबल सब्सट्रेट के तेज को मापकर सब्सट्रेट के लिए केएम निर्धारित करें। सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर पैकेज34के माइकलिस मेंटन मॉडल का उपयोग करके एक nonlinear प्रतिगमन विधि का उपयोग करके माइकलिस-मेनटेन काइनेटिक्स की गणना करें।
  6. प्रतियोगिता प्रयोगों के लिए, 100 माइक्रोन, 500 माइक्रोएम, 1 एमएम, 1.5 एमएम या 2 एमएम नॉनलेबल प्रतिस्पर्धी सब्सट्रेट को परख बफर में 1.5 मिलीएम माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में 12 डिग्री सेल्सियस पर 100 माइक्रोसेन्ट्रल युक्त जोड़ें।
    1. माइक्रोसेंटिफ्यूज ट्यूब में रेडियोलेबल पॉलीएमाइन (50 माइक्रोएम) एक साथ जोड़ें।
    2. 5.4.2 के माध्यम से चरण 5 दोहराकर ऊपर उल्लिखित वेसिकल्स के अंदर फंसे रेडियोधर्मिता को मापें।
    3. 100 माइक्रोन या उच्च लेबल वाले सब्सट्रेट की उपस्थिति में 10, 25, 50, 250 और 500 माइक्रोन रेडियोलेबल पॉलीएमाइंस के तेज को मापकर और वक्र को प्लॉट करने के लिए एक nonlinear प्रतिगमन विधि का उपयोग करके प्रतिस्पर्धी सब्सट्रेट्स के लिए स्पष्ट केएम (केएम, ऐप)निर्धारित करें।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल में प्रमुख कदम चित्र 1में सचित्र रूप से संक्षेप में हैं । संक्षेप में, ई. कोलाई कोशिकाओं सभी पॉलीएमाइन एक्सचेंजर्स में कमी और AtBAT1 व्यक्त सुसंस्कृत, केंद्रीकृत, एक बफर के साथ धोया और एक फ्रांसीसी प्रेस का उपयोग कर सेल lysis के अधीन हैं । लिसिस वेसिकल्स का उत्पादन करता है जो ज्यादातर अंदर-बाहर होते हैं और कोशिकाओं के बाहर बफर को जाल में फंसाते हैं। सेल मलबे को केंद्रीकरण द्वारा हटा दिया जाता है, और झिल्ली गोली एकत्र करने के लिए एक दूसरा अल्ट्रासेंटिफुगेशन कदम का उपयोग किया जाता है। झिल्ली गोली Tris-Maleate बफर पीएच 5.2 में फिर से निलंबित कर दिया है और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है। परिवहन परख 12 डिग्री सेल्सियस पर किया जाता है, जो झिल्ली स्थिरता बनाए रखने के लिए इष्टतम पाया गया था। रेडियोलेबल सब्सट्रेट के अलावा और वेसिकल्स के बफर सस्पेंशन के पीएच में बदलाव से पीएच 8.0 तक के लिए परख शुरू की जाती है। 1 मिन के बाद, अवेलेबल सब्सट्रेट्स के साथ बर्फ-ठंडपर बफर को वेसिकल्स में रेडियोलेबल के तेज को रोकने के लिए जोड़ा जाता है। रेडियोलेबल वाले वेसिकल्स नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली के माध्यम से निस्पंदन से फंस जाते हैं। झिल्ली को प्रस्फुटन शीशियों में स्थानांतरित किया जाता है और झिल्ली पर रेडियोलेबल तरल प्रस्फुटन गिनती द्वारा निर्धारित किया जाता है।

एक पश्चिमी दाग का उपयोग यह सत्यापित करने के लिए किया जाता है कि AtBAT1 वेसिकल्स(चित्रा 2)में स्थानांतरित हो जाता है। एक विरोधी अपने सी टर्मिनल एंटीबॉडी के साथ दाग की जांच लगभग ७२.३ केडीए(चित्रा 2,लेन 2) के एक संलयन निर्माण प्रोटीन से पता चला । एसडी-पेज से पहले वेसिकल्स के पाचन के परिणामस्वरूप एक डिम्यूशन हुआ, लेकिन जांच संकेत(चित्रा 2,लेन 3) का पूर्ण नुकसान नहीं हुआ। carboxypeptidase ए के परिणामस्वरूप जांच संकेत में कमी से पता चलता है कि सी-टर्मिनल अवशेषों के अधिकांश vesicles के बाहर पर हैं ।

इस परख प्रणाली में, वेसिकल्स पीएच 5.2 पर एक बफर में निलंबित कर दिया जाता है ताकि वेसिकल्स के अंदर पीएच बफर के साथ समान हो। पीएच 5.2 में वेसिकल्स में रेडियोलेबल सब्सट्रेट का परिवहन पीएच 8.0 बफर में वेसिकल्स को निलंबित करके शुरू किया जाता है, इस प्रकार झिल्ली में पीएच 2.8 का पीएच ग्रेडिएंट बनाता है। 12 डिग्री सेल्सियस पर, वेसिकल्स द्वारा रेडियोलेबल शुक्राणुओं का तेज 1 मिन पर सबसे अधिक था, और 3 मिन(चित्रा 3ए)से अधिक रैखिक बना रहा। इसलिए परिवहन परख के लिए ऊष्मायन का समय 1 मिन तय किया गया था। रेडियोलेबल के गैर-विशिष्ट बाध्यकारी के लिए खाते में, वेसिकल्स को एक मिनट के लिए रेडियोलेबल सब्सट्रेट की उपस्थिति में 0 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया था, और इन मामलों को उच्च तापमान पर लाडियोलेबल के तेज से घटाया गया था।

चित्रा 3बी एक मिनट के बाद वेसिकल्स में रेडियोलेबल शुक्राणुओं के तेज को दिखाता है। पीएच 8.0 पर तैयार और संग्रहीत झिल्ली वेसिकल्स द्वारा आइसोटोप का कोई शुद्ध तेज नहीं था, क्योंकि वेसिकल झिल्ली में कोई प्रोटोन ग्रेडिएंट नहीं था। कृत्रिम प्रोटोन ढाल के अपव्यय के प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए, लेबल सब्सट्रेट25के अलावा 10 मिन के लिए पीएच 8.0 बफर में झिल्ली वेसिकल्स को इनक्यूबेट किया गया था। इन शर्तों के तहत रेडियोलेबल सब्सट्रेट का न्यूनतम तेज दिखाया गया । पॉलीएमाइन एक्सचेंजर्स सीएडबी और पोटेमें ई. कोलाई कोशिकाओं की कमी के साथ तैयार किए गए वेसिकल्स में रेडियोलेबल शुक्राणुओं का तेज भी कम था। एक साथ लिया, इन परिणामों से संकेत मिलता है कि शुक्राणुओं का प्रोटोन संचालित तेज BAT1 प्रोटीन(चित्रा 3ए, बी)के कारण था ।

प्रोटीन की सब्सट्रेट विशिष्टता निर्धारित करने के लिए, केएम मूल्यों की गणना रेडियोलेबल सब्सट्रेट के तेज को मापने के द्वारा 10, 25, 50, 100, 250 और 500 माइक्रोएम सांद्रता पर की गई थी। शुक्राणु, putrescine और arginine के लिए कश्मीरएम क्रमशः 55 ± 12 μM, 85 ± 20 μM और 1.4 ± 0.5 mM थे, यह दर्शाता है कि यह प्रोटीन एक उच्च आत्मीयता पॉलीएमाइन और आर्जिनिन एक्सचेंजर(चित्र4)है।

एक विशेष सब्सट्रेट के लिए ट्रांसपोर्टर की आत्मीयता भी अप्रत्यक्ष रूप से प्रतिस्पर्धा परखों का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है। यहां, हमने दो सब्सट्रेट्स के बीच प्रतिस्पर्धा का मूल्यांकन करने के लिए दो तरीकों का उपयोग किया है । पहली विधि में, 50 माइक्रोएम रेडियोलेबल शुक्राणुओं के तेज को गैर-लेबल प्रतिस्पर्धी सब्सट्रेट(चित्रा 5ए)की बढ़ती सांद्रता की उपस्थिति में मापा गया था। दूसरी विधि में, शुक्राणुओं के लिए स्पष्ट केएम की गणना 100 माइक्रोन नॉनलेबल प्रतिस्पर्धी सब्सट्रेट(चित्र 5बी)की उपस्थिति में रेडियोलेबल शुक्राणुओं की बढ़ती सांद्रता के तेज को मापने के द्वारा की गई थी। प्रतियोगिता के परखों से पता चला है कि गाबा एक कश्मीरएम, १६४ ± 15 μM(चित्रा 5ए, बी)के app के साथ शुक्राणुओं का एक प्रतिस्पर्धी अवरोधक है । इसके अलावा, विभिन्न अमीनो एसिड की अलग-अलग सांद्रता की उपस्थिति में 50 माइक्रोएम रेडियोलेबल शुक्राणुओं के तेज को मापने से पता चला कि AtBAT1 एमएम सांद्रता(चित्रा 6)पर ग्लूटामेट और एलेन के परिवहन में भी सक्षम है।

Figure 1
चित्रा 1: विधि का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (A)योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व ई कोलाईसे झिल्ली वेसिकल्स की तैयारी और शुद्धिकरण में महत्वपूर्ण कदमों को रेखांकित करता है । (ख)योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व रेडियोलेबल सब्सट्रेट्स का उपयोग करके झिल्ली वेसिकल तैयारियों के परिवहन परख में महत्वपूर्ण कदमों की रूपरेखा तैयार करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: शुद्ध vesicles में AtBAt1 की अभिव्यक्ति दिखा पश्चिमी दाग । बैंड सहिजन पेरोक्सिड्स का उपयोग कर कल्पना विरोधी अपने (सी-टर्म)-एचआरपी एंटीबॉडी थे । लेन 1,प्रीदाग्ड प्रोटीन सीढ़ी। लेन 2,शुद्ध वेसिकल्स AtBAT1.1 व्यक्त संलयन प्रोटीन के अपेक्षित आकार का एक बैंड दिखा । लेन 3,AtBAT1.1 व्यक्त शुद्ध वेसिकल्स को एसडीएस इलेक्ट्रोफोरेसिस और वेस्टर्न ब्लॉटिंग से पहले कार्बोसिपेप्टिडेस के साथ प्रीमिलेट किया गया था। प्रत्येक लेन में वेसिकल्स (प्रोटीन) की बराबर मात्रा जोड़ी गई थी। धुंधला संकेत है कि सबसे vesicles में प्रोटीन के सी टर्मिनल प्रोटीज पाचन द्वारा अपमानित किया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: बैट1 प्रोटीन अभिव्यक्ति का प्रभाव और पीएच ढाल के महत्व को दिखाने वाले वेसिकल्स की परिवहन गतिविधि। (A) 3एच के समय निर्भर तेज 5.2 के आंतरिक पीएच के साथ BAT1 व्यक्त वेसिकल्स में शुक्राणुओं लेबल और पीएच 8.0 पर एक बफर के लिए पेश किया। नियंत्रण परख में, वेसिकल्स को पीएच 8.0 पर परख बफर में जोड़ा गया था, 3एच लेबल शुक्राणुओं के अलावा से पहले 10 मिन्हास को प्रोटोन ग्रेडिएंट के अपव्यय को सक्षम करने के लिए जोड़ा गया था। फिर वेसिकल्स में रेडियोलेबल के तेज का आकलन 1 मिन अंतराल पर किया गया था। (ख) 3एच का तेज एक प्रोटोन ढाल (5.2 के आंतरिक पीएच) की उपस्थिति में शुक्राणुओं का लेबल, प्रोटॉन ढाल (8 के आंतरिक पीएच) की अनुपस्थिति में, वेसिकल्स में रेडियोलेबल शुक्राणुओं के अलावा से पहले परख समाधान 10 में जोड़ा गया और ई कोलाई उत्परिवर्ती कोशिकाओं से बने वेसिकल्स में BAT1 व्यक्त नहीं किया। 1 मिन के लिए वेसिकल्स में तेज की निगरानी की गई थी। सभी मूल्यों को पांच प्रतिकृतियों के मतलब ± एसई के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। डेटा विश्लेषण एक छात्र के टी परीक्षण का उपयोग कर किया गया था और * नियंत्रण(पी मूल्य और एलटी; ०.०५) से एक महत्वपूर्ण अंतर इंगित करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: बैट1 की पॉलीएमाइन और आर्जिनिन परिवहन गतिविधि के इन विट्रो परख। (A)शुक्राणुऔर पुत्रस्सिन तेज के लिए केएम मूल्य क्रमशः 55 ± 12 माइक्रोन और 85 ± 32 माइक्रोन हैं। (ख) आर्जिनिन तेज के लिए कश्मीरएम 1.4 ± 0.5 मीटर है। सभी मूल्यों को पांच प्रतिकृतियों के मतलब ± एसई के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: गाबा BAT1 द्वारा शुक्राणुओं के परिवहन का एक प्रतिस्पर्धी अवरोधक है । (A)एबट1.1 व्यक्त करने वाले वेसिकल्स द्वारा 3एच लेबल वाले शुक्राणुओं का तेज 100 माइक्रोन या 500 माइक्रोएम गाबा की उपस्थिति में काफी कम हो गया था। (ख)बैट11.1 द्वारा शुक्राणुओं के तेज के लिए स्पष्ट केएम को 100 माइक्रोन गाबा की उपस्थिति में बढ़ाकर 164 ± 20 माइक्रोन कर दिया गया था। सभी मूल्यों को पांच प्रतिकृतियों के मतलब ± एसई के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। डेटा विश्लेषण एक छात्र के टी परीक्षण का उपयोग कर किया गया था और * नियंत्रण(पी मूल्य और एलटी; ०.०५) से एक महत्वपूर्ण अंतर इंगित करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: ग्लूटामेट और एलेन बैट1 द्वारा शुक्राणुओं के परिवहन के प्रतिस्पर्धी अवरोधक हैं। 1 एमएम गैर लेबल ग्लूटामेट और 1.5 m गैर लेबल alanine की उपस्थिति में शुक्राणुओं का तेज काफी कम हो गया था। सभी मूल्यों को पांच प्रतिकृतियों के मतलब ± एसई के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। डेटा विश्लेषण एक छात्र के टी परीक्षण का उपयोग कर किया गया था और * नियंत्रण(पी मूल्य और एलटी; ०.०५) से एक महत्वपूर्ण अंतर इंगित करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

वर्तमान अध्ययन में, हम पहले ई कोलाई में प्रोटीन व्यक्त करके और फिर झिल्ली वेसिकल पैदा करके एंटीपोर्टर के लक्षण वर्णन के लिए एक विधि की रूपरेखा तैयार करते हैं, ताकि विषमता-व्यक्त प्रोटीन को सेल-मुक्त प्रणाली में परायोजित किया जा सके। सबसे आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में पाए जाने वाले उपकरणों के अलावा, इस रणनीति के लिए फ्रांसीसी प्रेस, एक अल्ट्रासेंट्रोफ्यूज और रेडियोआइसोटोप परख ों का संचालन करने की सुविधा तक पहुंच के उपयोग की आवश्यकता होती है।

इस तकनीक की एक बुनियादी आवश्यकता यह है कि हेटेरोलोगस प्रोटीन को ई कोलाईकी प्लाज्मा झिल्ली के लिए सही ढंग से लक्षित किया जाता है। यह रणनीति ऑर्गेनेलर ट्रांसपोर्टरों के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए भी उपयोगी हो सकती है क्योंकि प्लास्टिड एडीपी ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर को सफलतापूर्वक ई कोलाई सेल झिल्ली में स्थानीयकृत किया गया था और कार्यात्मक रूप से35की विशेषता थी। इन प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले वेक्टर (pBAD-DEST49) में अनुवादित उत्पाद की घुलनशीलता बढ़ाने के लिए एन-टर्मिनल थिओरेडॉक्सिन प्रोटीन होता है। एक छोटे बी सबटिलस प्रोटीन रहस्यवादी के एन-टर्मिनल फ्यूजन, झिल्ली ट्रांसपोर्टरों को साइटोप्लाज्मिक झिल्ली36में अधिक कुशल लक्ष्यीकरण करने में सक्षम करने के लिए पाए गए हैं। हालांकि, गलत घटनाओं, और प्रोटीन की विफलता को साइटोप्लाज्मिक झिल्ली में ठीक से एकीकृत किया जाना संभावित समस्याएं हैं जो कई प्रकार के ट्रांसपोर्टरों के लिए बैक्टीरियल अभिव्यक्ति प्रणालियों के उपयोग को बाधित करती हैं1।

पौधों के ट्रांसपोर्टरों की विशेषता के लिए झिल्ली वेसिकल्स का भी उपयोग किया गया है37,38. चूंकि वेसिकल्स में एटीपी और एंजाइम जैसे आवश्यक ऊर्जा स्रोतों की कमी है, इसलिए सक्रिय ट्रांसपोर्टरों और अन्य मेटाबोलिक गतिविधि से हस्तक्षेप कम है। इस प्रकार, यह प्रणाली मेटाबोलाइट एक्सचेंजर्स जैसे निष्क्रिय ट्रांसलोकेशन के विश्लेषण के लिए आदर्श है। विशेष रूप से, एवरेटेड झिल्ली वेसिकल्स को निर्यातकों और एंटीपोर्टरके लक्षण वर्णन पर लागू किया जा सकता है क्योंकि आंतरिक समाधान की संरचना को बफर 1 की संरचना को बदलकर हेरफेर किया जा सकता है। इसके अलावा, फ्रेंच प्रेस या अल्ट्रासाउंड सोनिकेशन का उपयोग बरकरार ई. कोलाई कोशिकाओं से अंदर-बाहर झिल्ली वेसिकल्स पैदा करने में काफी कुशल है। अल्ट्रासाउंड सोनिकेशन या फ्रेंच प्रेस द्वारा उत्पन्न वेसिकल्स का 95% ने झिल्ली39,40को एवरीटेड किया है . पोटे, पुटेस्सिन और ऑर्निथिन का ई कोलाई एंटीपोर्टर, पहला पॉलीएमाइन एंटीपोर्टर था जिसे अंदर-बाहर झिल्ली वेसिकल्स23का उपयोग करके विशेषता थी। हमने पॉलीएमाइन एंटीपोर्टर के लक्षण वर्णन के लिए एक विशिष्ट उत्परिवर्ती तनाव बनाने के लिए P1 ट्रांसड्यूक्शन का उपयोग किया, और यह तनाव अन्य पशु, फंगल या पौधे पॉलीमाइन एक्सचेंजर्स के लक्षण वर्णन के लिए उपयोगी हो सकता है। हम यह भी कल्पना करते हैं कि झिल्ली वेसिकल्स का उपयोग करके अन्य संयंत्र और पशु विनिमय ट्रांसपोर्टरों के लक्षण वर्णन के लिए दो या अधिक जीन विलोपन के साथ अन्य ई. कोलाई उपभेद उपयोगी हो सकते हैं।

इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम ई कोलाई उत्परिवर्ती प्रणाली में प्रोटीन की अभिव्यक्ति है। एक प्रेरक प्रमोटर के साथ एक ई. कोलाई अभिव्यक्ति वेक्टर का उपयोग विषमलोगस जीन अभिव्यक्ति के तंग, खुराक निर्भर विनियमन को बढ़ावा देने के लिए किया जाता है। एन टर्मिनल और सी टर्मिनल टैग जैसे कि उनके पैच थिओरेडॉक्सिन, V5 एपिटोप या वेक्टर में 6xHis की उपस्थिति प्रोटीन का पता लगाने और शुद्धिकरण के लिए उपयोगी है। इसके अलावा, एक थिओरेडॉक्सिन फ्यूजन प्रोटीन की उपस्थिति जो pBAD49 वेक्टर का एक घटक है, अनुवाद दक्षता को बढ़ा सकती है और कुछ मामलों में, ई कोलाई41में व्यक्त यूकेरियोटिक प्रोटीन की घुलनशीलता। अरबीडोप्सिस और ई कोलाई में विभिन्न कोडन विकल्प ई. कोलाई में प्रोटीन अभिव्यक्ति को चुनौती दे सकते हैं। यह ज्ञात है कि कोडन अनुकूलन ई. कोलाई42में हेटेरोजिगौस प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रभावशाली रूप से बढ़ा सकता है। वेसिकल परख में, कोडन अनुकूलित AtBAT1.2 ई. कोलाई कोशिकाओं में गैर-कोडन अनुकूलित AtBAT1.1 की तुलना में एक उच्च विनिमय गतिविधि दिखाई गई (डेटा नहीं दिखाया गया है), यह प्रदर्शित करता है कि कोडन अनुकूलन बैक्टीरियल कोशिकाओं में विषमज्ञान के व्यक्त प्रोटीन की अभिव्यक्ति और कार्य को बढ़ाने के लिए मददगार था। वाल्व के सावधानीपूर्वक समायोजन द्वारा झिल्ली वेसिकल्स का उत्पादन lysed कोशिकाओं की धीमी गति से भी ड्रिप बनाए रखने के लिए भी प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम है। अल्ट्रासेंट्रोइफ्यूजेशन के बाद, हमने पाया है कि एक ड्ल समरूपमें झिल्ली वेसिकल्स का पुनर्निलंबन नमूने को कम करता है जो झिल्ली वेसिकल्स के एलिकोट्स के बीच नमूना भिन्नता को कम करता है जो तैयार किए जाते हैं और बाद में -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होते हैं।

ई. कोलाई अभिव्यक्ति प्रणालियों की एक सीमा यह है कि वे एन-ग्लाइकोसिलेशन या एसीटिलेशन जैसे ट्रांसलेशनल संशोधनों में असमर्थ हैं। इन प्रोटीन संशोधनों के अभाव में प्रोटीन गतिविधि1प्रभावित हो सकती है । हालांकि, इन संशोधनों को करने में सक्षम म्यूटेंट की पहचान की गई है और प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है जिसके लिए इस तरह के संशोधनोंकीआवश्यकता होती है। व्यक्त प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा की पीढ़ी शामिल निकायों के रूप में खुलासा और एकत्रीकरण के कारण एक चुनौती हो सकती है, प्रोटीन की विफलता को ठीक से साइटोप्लाज्मिक झिल्ली में एकीकृत किया जा सकता है, गलत लक्ष्यीकरण और गलत विनियमन पोस्ट ट्रांसलेशनल संशोधनों की कमी के कारण ।

इस तकनीक की एक छोटी सी सीमा यह है कि यह ट्रांसपोर्टर के प्राकृतिक अभिविन्यास के लिए सबूत प्रदान नहीं करता है। इसे एन या सी टर्मिनल टैग और इम्यूनोलॉजिकल तरीकों का फायदा उठाकर पूरा किया जा सकता है। वेसिकल्स में प्रोटीन के एक विशेष टर्मिनस की पहुंच सभी सुलभ के पाचन द्वारा प्राप्त की जा सकती है, और इसलिए, संभवतः वाहक की बाहरी टर्मिनी, सोडियम डोडेसिल सल्फेट की उपस्थिति में प्रोटीन का इलेक्ट्रोफोरेसिस, नाइट्रोसेल्यूलोज फिल्टर में स्थानांतरित करना और शेष, आंतरिक टर्मिनी का पता लगाना एंटीबॉडी40के साथ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस परियोजना के लिए समर्थन BGSU ग्रेजुएट कॉलेज, और प्रायोजित कार्यक्रमों और अनुसंधान के BGSU कार्यालय से आया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
3H-putrescine PerkinElmer NET185001MC
3H-spermidine PerkinElmer NET522001MC
4-chloro-1-naphthol Sigma-Aldrich C8890
14C arginine Moravek Inc. MC137
Arginine Sigma-Aldrich A-5006
Anti-His (C-term)-HRP antibody ThermoFisher R931-25 Detects the C-terminal polyhistidine (6xHis) tag, requires the free carboxyl
group for detection
Arabinose Sigma-Aldrich A3256
BCA protein assay kit ThermoFisher 23227 Pierce BCA protein asay kit.
Bromophenol blue Bio-Rad 161-0404
Carboxypeptidase B Sigma-Aldrich C9584-1mg
Centrifuge Sorvall SS-34 fixed angle rotor and GA-6 fixed angle rotor
Dounce tissue grinder LabGenome 7777-7 Corning 7777-7 pyrex homogenizer with pour spout.
Ecoscint-H National Diagnostics LS275 scintillation cocktail
EDTA Sigma-Aldrich
Filtration manifold Hoefer FH225V
French Pressure Cell Glen Mills FA-080A120
GABA Sigma-Aldrich A2129
Glutamate Sigma-Aldrich G6904
Glycerol
GraphPad Prism software http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm
Hydrogen peroxide KROGER
Potassium Chloride J.T. Baker 3040-01
Liquid scintillation counter Beckman LS-6500
Maleate Sigma-Aldrich M0375
Nanodrop ThermoFisher
Nitrocellulose membrane filters Merck Millipore hawp02500 0.45 µM
PCR clean up kit Genscript QuickClean II
Potassium Phosphate dibasic ThermoFisher P290-500
putrescine fluka 32810
Potassium Phosphate monobasic J.T.Baker 4008
Spermidine Sigma-aldrich S2501
Strains :E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10 This manuscript Available upon request. Strain is deficient in the PotE and CadB polyamine exchangers.
Tris-base Research Products T60040-1000
Ultracentrifuge Sorvall MTX 150 46960 Thermo Fisher S150-AT fixed angle rotor
Ultracentrifuge tubes ThermoFisher 45237 Centrifuge tubes for S150-AT rotor
Vector: pBAD-DEST49 ThermoFisher Gateway expression vector for E. coli

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References

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Ariyaratne, M., Ge, L., Morris, P.… More

Ariyaratne, M., Ge, L., Morris, P. F. Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles. J. Vis. Exp. (154), e60009, doi:10.3791/60009 (2019).

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