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Biochemistry

Caracterización de transportadores de membranas por expresión heteróloga en E. coli y producción de vesículas de membrana

Published: December 31, 2019 doi: 10.3791/60009
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Bowling Green State University

Summary

Describimos un método para la caracterización de transportadores de membrana impulsados por protones en preparaciones de vesículas de membrana producidas por la expresión heteróloga en E. coli y lisis de células utilizando una prensa francesa.

Abstract

Se han desarrollado varios métodos para caracterizar funcionalmente a los nuevos transportadores de membranas. Las poliaminas son omnipresentes en todos los organismos, pero no se han identificado intercambiadores de poliamina en las plantas. Aquí, delineamos un método para caracterizar los antiportadores de poliamina utilizando vesículas de membrana generadas a partir de la lisis de Escherichia coli cells hetrólogamente expresando un antiportador vegetal. En primer lugar, expresamos heterologousamente AtBAT1 en una cepa de E. coli deficiente en transportadores de intercambio de poliamina y arginina. Las vesículas se produjeron utilizando una prensa francesa, purificadas por ultracentrifugación y utilizadas en un ensayo de filtración por membrana de sustratos etiquetados para demostrar la especificidad del sustrato del transportador. Estos ensayos demostraron que AtBAT1 es un transportador mediado por protones de arginina, ácido aminobutírico (GABA), putrescina y espermidina. La cepa mutante que se desarrolló para el ensayo de AtBAT1 puede ser útil para el análisis funcional de otras familias de intercambiadores de poliaminas vegetales y animales. También hipotetizamos que este enfoque se puede utilizar para caracterizar muchos otros tipos de antiportadores, siempre y cuando estas proteínas se puedan expresar en la membrana celular bacteriana. E. coli es un buen sistema para la caracterización de nuevos transportadores, ya que hay múltiples métodos que se pueden emplear para mutagenizar a los transportadores nativos.

Introduction

Las proteínas implicadas en el tráfico de metabolitos constituyen un nivel esencial de regulación fisiológica, pero la gran mayoría de los transportadores de membranas vegetales aún no se han caracterizado funcionalmente. Se han implementado varias estrategias para caracterizar las nuevas proteínas de transporte. La expresión hetróloga en organismos modelo como E. coli y células eucariotas como levaduras, ovocitos de Xenopus, células de mamíferos, células de insectos y células vegetales se han utilizado para determinar su actividad de transporte1. Las células eucariotas son favorecidas por la expresión de proteínas eucariotas, ya que la composición celular básica, las vías de transducción de señales, la transcripción y las máquinas de traducción son compatibles con las condiciones nativas.

La levadura ha sido un organismo modelo importante para la caracterización de nuevas proteínas de transporte en las plantas. La primera proteína de transporte vegetal que se expresó con éxito en levadura (Saccharomyces pombe) fue el transportador de hexosa HUP1 de Chlorella2. Desde entonces, muchas proteínas de transporte de plantas se han caracterizado funcionalmente utilizando un sistema de expresión de levadura. Estos incluyen, los transportadores de azúcar vegetal (SUC1 y SUC23, VfSUT1 y VfSTP14) y los transportadores de auxin (AUX1 y PIN5). Las desventajas de utilizar levadura para expresar proteínas vegetales pueden incluir deterioro de la actividad de las proteínas localizadas por plastid porque la levadura carece de este orgánulo, el objetivo erróneo6, y la formación de agregados mal plegados y la activación de respuestas de estrés en la levadura debido a la sobreexpresión de proteínas de membrana7,8,9.

La expresión heteróloga de proteínas de transporte en los ovocitos Xenopus ha sido ampliamente utilizada para la caracterización electrofisiológica de los transportadores10. Las primeras proteínas de transporte vegetal caracterizadas por expresión hetróloga en los ovocitos de Xenopus fueron el canal de potasio Arabidopsis KAT110 y el transportador de hexosa Deabidopsis STP111. Desde entonces, los ovocitos de Xenopus se han empleado para caracterizar muchas proteínas de transporte vegetal como los transportadores de membrana plasmática12, transportador de sacarosa vacuola raquídor SUT413 y transportador de malatovacuo ALMT914. Una limitación importante de los ovocitos de Xenopus para los ensayos de transporte es que la concentración de metabolitos intracelulares no puede ser manipulada1. Además, se requieren conocimientos profesionales para preparar los ovocitos de Xenopus y la variabilidad de los lotes de ovocitos es difícil de controlar.

La expresión heteróloga en el organismo modelo E. coli es un sistema ideal en términos de caracterización de nuevas proteínas de transporte vegetal. Con un genoma15completamente secuenciado, las características moleculares y fisiológicas de E. coli son bien conocidas. Las herramientas y técnicas moleculares están bien establecidas16. Además, diferentes vectores de expresión, cepas no patógenas y mutantes están disponibles17,18,19. Además, E. coli tiene una alta tasa de crecimiento y se puede cultivar fácilmente en condiciones de laboratorio. Muchas proteínas se pueden expresar y purificar fácilmente en grandes cantidades en E. coli9. Cuando las proteínas no se pueden ensayo directamente en los sistemas celulares, la reconstitución de proteínas en liposomas también ha sido una innovación exitosa, aunque desafiante para la caracterización de proteínas de membrana purificadas. La caracterización funcional de las proteínas de transporte mitocondrial vegetal, incluidos los transportadores de solutos como los transportadores de fosfato en soja, maíz, arroz y Arabidopsis, portadorde de dicarboxilato-tricarboxilato en Arabidopsis, se han logrado utilizando este sistema modelo20,21. Sin embargo, se encontró que las proteínas recombinantes de la proteína de tomate SICAT9 no eran funcionales en experimentos de reconstitución, y se encontró que otros miembros de la familia de transportadores CAT no eran funcionales en los ensayos de ovocitos del xenopus 22. Por lo tanto, se necesitan herramientas moleculares adicionales para la caracterización de los transportadores de membranas.

Cinco sistemas de transporte de poliamina se encuentran en E. coli23. Incluyen dos transportadores ABC que median la toma de espermidina y putrescina, un intercambiador de putrescina/ornitina, un intercambiador de cadaverina/lisina, un exportador de espermadina y un importador de putrescina. El intercambiador de putrescina PotE se caracterizó originalmente utilizando un ensayo de vesícula, donde de adentro hacia afuera se preparaban vesículas cortando células con una prensa francesa y midiendo la toma de putrescina radioetiquetada en las vesículas a cambio de ornitina24. Los ensayos de vesículas también se utilizaron para caracterizar a un transportador de calcio, que mediaba en el transporte de calcio en respuesta a un gradiente de protones25. Estos experimentos nos llevaron a desarrollar una estrategia para la caracterización de otros intercambiadores de poliamina. Primero creamos una cepa de E. coli deficiente en intercambiadores PotE y CadB. Aquí, demostramos la caracterización funcional de una planta antiportadora de poliamina por expresión heterlomea en la cepa modificada de E. coli, generación de vesículas de membrana utilizando una prensa francesa y ensayos radiomarcados.

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Protocol

1. Generación del Mutante Doble Knock Out de E. coli con Transducción P1

  1. Obtenga las cepas mutantes de un solo knockout de E. coli, el Centro de Valores Genéticos de E. coli (http://cgsc.biology.yale.edu).
    NOTA: La cepa de la variedad de la variedad de la sr. Es resistente a la kanamicina26 y la cepa de CadB es resistente a la tetraciclina27.
  2. Construir la cepa PotE/CadB de doble knockout (DKO) utilizando el protocolo de transducción P128.
    1. Preparación de lisado
      1. Diluir un cultivo nocturno de la olla en LB fresco (1:100) complementado con 10-25 mM MgCl2, 5 mM CaCl2y 0.1-0.2% glucosa.
      2. Crecer a 37oC durante 1-2 h.
      3. Añadir 40 s de lisato de fago P1 al cultivo, y seguir creciendo a 37 oC. Monitor durante 1-3 h hasta que la cultura se haya lisado
        NOTA: Cuando el cultivo es lysed, los desechos celulares serán visibles en el tubo y el cultivo tendrá una pérdida significativa de turbidez.
      4. Añadir varias gotas de cloroformo (50-100 l) al lisado y al vórtice. Centrifugar a 12.000 x g durante 2 min para eliminar los residuos celulares y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.
    2. Transducción
      1. Cultivar la cepa de CadB durante la noche en medio LB.
      2. Cosecha las células por centrifugación a 4.000 x g durante 2 min y resuspende en 1/5-1/3 el volumen de cultivo cosechado en LB fresco complementado con 100 mM MgSO4 y 5 mM CaCl2.
      3. Agregue la suspensión de la célula cadB al tubo con fago del paso 1.2.1.4 y mezcle rápidamente.
      4. Añadir 200 éL de 1 M de na-citrato (pH5.5), luego añadir 1 mL de LB. Incubar a 37 oC durante 1 h para permitir la expresión del marcador resistente a los antibióticos.
      5. Espíe las células a 4000 x g durante 5 min.
      6. Resuspender en 100 l LB suplémido con 100 mM de na-citrato (pH 5.5) y vórtice bien para dispersar las células.
      7. Seleccione las cepas recombinantes en las placas de agar LB con kanamicina de 50 g/ml y tetraciclina de 10 g/ml y, a continuación, confirme por Radimera reacción en cadena (PCR) con las imprimaciones apropiadas26,27.
      8. Verifique los fragmentos PCR secuenciando.

2. Expresión del gen objetivo (AtBAT1) en E. coli Mutant

  1. Amplifique la secuencia de longitud completa del gen de destino por PCR e insértelo en el vector de entrada de gateway pENTR/D-TOPO29.
    NOTA: En este caso ATBAT1.1 se amplificó utilizando la imprimación directa 5'CGGCGATCAATCCTTTGTT y la imprimación inversa 5'GCTAAGAATGTTGGAGATGG, una desnaturalización inicial a 98oC durante 2 min y luego 30 ciclos de desnaturalización a 98oC durante 0,1 min, recocido a 59oC durante 0,3 min, extensión a 72oC para 0,40 min y extensión final a 72oC durante 10 min. El producto PCR fue purificado utilizando un kit de limpieza de PCR, cuantificado mediante un espectrómetro. La inserción del producto PCR en el vector Gateway se realizó siguiendo las instrucciones de los fabricantes.
    1. Transforme el vector de entrada en células competentes Top10 E. coli por shock térmico y seleccione para recombinantes exitosos en medios LB con kanamicina de 50 g/ml siguiendo los protocolos de clonación molecular estándar30.
    2. Extraiga el ADN plásmido utilizando un kit de extracción de plásmido, siguiendo las instrucciones del fabricante, y secuencia para confirmar la correcta inserción.
  2. Transfiera el gen de destino al vector de destino E. coli, pBAD-DEST49 por clonación de Gateway LR para crear un vector de expresión29.
    1. Transforme el vector de expresión en células competentes top10 E. coli por choque de calor durante 30 s y seleccione recombinantes exitosos en medios LB con 100 g/ml de ampicilina30.
    2. Extraiga el ADN plásmido30 y la secuencia para confirmar la correcta inserción.
  3. Transforme el vector de expresión en E. coli-potE740(del):kan, ácadB2231::Tn10 y seleccione en placas LB con ampicilina, kanamicina y tetraciclina30.
  4. Con el fin de determinar la concentración óptima de arabinosa para la inducción, expresar el gen diana bajo el control del promotor araBAD en medios LB con concentraciones de gradiente de arabinosa como se describe29.
  5. Recoger los pellets celulares y evaluar la expresión de proteínas por SDS-PAGE y la visualización de bandas proteicas como se describe en el manual del producto29.
    NOTA: El E. colipotE740(del)::kan, el cadB2231::Tn10 se utilizó como muestra de control sin expresión BAT1. Las células mutantes noqueadas dobles de E.coli con el vector pBAD-DEST49 vacío no se utilizaron como control debido a la presencia del gen ccdB en el vector.

3. Generación de vesículas de membrana de interior-salida

  1. Cultivo de las células mutantes de E. coli que expresan la proteína diana mediante el cultivo de una sola colonia durante la noche en 5 ml de medios libres de poliamina (2% glicerol, 6 g de K2HPO4, 3 g de KH2PO4, 0,5 g de NaCl, NH4Cl, 50 mg de tiamina, 0.79 g de levadura completa medios sintéticos adenine hemisulfate (10 mg/L), L-arginina (50 mg/L), ácido L-aspártico (80 mg/L), clorhidrato de L-histidina monohidrato (20 mg/L), L-leucina (100 mg/L), clorhidrato de L-lisina (50 mg/L), L-metionina (20 mg/L), L-fenilalanina (50 mg/L), L-threonina (100 mg/L), L-triptófano (50 mg/L), L-tirosina (50 mg/L), L-valina (140 mg/L), Uracil (20 mg/L)). Transfiera este cultivo a 500 ml de medios libres de poliamina complementados con 0.0002% arabinose y crezca hasta que el cultivo celular alcance una DoS600 de 0.6-0.8 (generalmente 5 h).
  2. Recoger el pellet celular por centrifugación a 2.000 x g durante 15 min a 4 oC. Resuspenda el pellet y lávelo tres veces con un tampón de fosfato potásico de 0,1 M, pH 6,6, que contiene 10 mM de EDTA (Buffer 1). El volumen final de celdas en el búfer 1 después del tercer giro debe ser de 10 ml.
  3. Generar vesículas de membrana de adentro hacia afuera mediante el tratamiento de prensa francesa (10.000 p.s.i.) de las células intactas utilizando una célula de presión francesa de 35 ml.
  4. Antes de cargar la muestra en la celda de presión francesa estándar, lubrique el pistón y las juntas tóricas para que sea más fácil de insertar en la celda.
    Nota:Estas instrucciones son específicas para el uso de la célula de presión estándar31.
    1. Atornille cuidadosamente el tapón de cierre en el extremo inferior de la celda. Asegúrese de que la celda esté del lado derecho hacia arriba en función de las letras en el lado de la celda. Inserte el pistón en la celda y muévalo a la celda, hasta que la línea de llenado máxima en el pistón alcance la parte superior del pistón. Voltee la unidad y colóquela en el soporte proporcionado entre los tres postes.
    2. Vierta la suspensión celular en el cuerpo de la célula.
      NOTA: Hemos estado usando sólo 10 mL, por lo que quedará mucho espacio en la cámara de la célula de presión francesa, que tiene una capacidad de 35 ml.
    3. Monte la celda de presión estándar en la unidad de celda de presión francesa.
      1. Primero compruebe que la alimentación está apagada. En el lado izquierdo del panel se encuentra el interruptor Selector de relación. Tiene tres posiciones: Abajo al final de la carrera, Bajo para usar una celda de presión más pequeña, y Alto para su uso con la celda de presión francesa estándar. Si la prensa francesa se utilizó anteriormente con la celda más pequeña, es posible que el pistón no se retraiga por completo. Establezca este interruptor en Abajo.
    4. Encienda la máquina con el interruptor del RHS en la parte posterior de la unidad y gire el interruptor Pause-Run a la posición Ejecutar. Esto dará lugar a que el pistón se retraiga por completo. Mueva el interruptor de nuevo a Pausay apague la máquina.
    5. Afloje los tornillos del pulgar y mueva la abrazadera de seguridad que se extiende a dos columnas de acero inoxidable hacia un lado. Se balanceará a la derecha. Con una mano sosteniendo la base del tapón de cierre en su lugar, recoja la celda de presión francesa con ambas manos y gírela 180o, por lo que el pistón está ahora en posición vertical. Colóquelo en la plataforma y vuelva a colocar la abrazadera de seguridad en su lugar para que esta abrazadera mantenga la celda de presión francesa en su posición.
    6. Tenga en cuenta que el conjunto de la válvula de flujo en el enchufe de cierre debe ser accesible para el operador y colocado para que la válvula se pueda girar libremente. Abra el conjunto de la válvula de flujo con unos giros en sentido contrario a las agujas del reloj. Coloque los brazos del pistón de modo que estén orientados en una posición de dos y ocho. Apriete los tornillos de los pulgares de modo que la celda de presión estándar se mantenga en su lugar.
    7. Inserte el tubo de salida de muestra en el tapón de cierre y conecte una pieza corta de tubo flexible para que los restos de celda rotos puedan recogerse en un tubo de halcón. Usualmente usamos un vaso de 300 ml lleno de hielo para mantener el tubo del halcón en posición vertical, y para mantener los restos de la célula refrigerados.
    8. Asegúrese de que el interruptor Pausar-Ejecutar esté establecido en Pausay que el conjunto de válvulas esté en la posición abierta. Vuelva a encender la máquina, apolvo el selector de relación interruptor a alta, y gire la válvula de aumento de presión en el panel frontal a la derecha alrededor de media vuelta.
    9. El pistón comenzará a levantarse de la base para desplazar el aire en la cámara. Dirija el aire que sale del tubo Tygon unido al tubo de salida de la muestra al tubo del vaso de precipitados.
    10. Cuando salgan las primeras gotas de líquido, cierre el conjunto de la válvula de flujo girándolo en el sentido de las agujas del reloj. Esto crea un sello de metal a metal, con la celda de presión, por lo que no apriete demasiado.
    11. La parte frontal de la Prensa Francesa tiene un gráfico en el panel frontal para generar la presión adecuada sobre las células biológicas dentro de la célula de presión. En este caso, aumente la presión girando la válvula de aumento de presión en el sentido de las agujas del reloj, hasta que el medidor alcance 640 psi. Esto creará una presión interna de 10.000 psi.
    12. Una vez que la célula ha alcanzado la presión objetivo, abra ligeramente el conjunto de la válvula de flujo girándolo en sentido contrario a las agujas del reloj. Ajuste la abertura de la válvula para permitir un caudal de sólo unas 10 gotas por minuto.
    13. Cuando la línea de parada en el cuerpo del pistón alcanza la parte superior de la celda de flujo. Cambie el interruptor Pausar-Ejecutar a Pausa. Esto es fundamental porque tener el pistón insertado más lejos en la célula dañará la unidad. Abra el conjunto de la válvula de flujo y recoja las gotas restantes.
    14. Gire el selector de relación en Abajoy, a continuación, establezca el modificador Pausar ejecución en Ejecutar. Cuando la placa inferior esté completamente retraída, ajuste el interruptor Ejecutar a Pausay apague la máquina.
    15. Retire la celda de presión francesa de la prensa francesa y desmonte para su limpieza. Conservar todas las piezas secas con una cubierta ligera de glicerol. Retire y reemplace las juntas o sellos con signos de desgaste.
  5. Retire las células ininterrumpidas y los restos celulares de la prensa francesa eluyente por centrifugación a 10.000 x g durante 15 min a 4 oC. Deseche el pellet y transfiera el sobrenadante a tubos ultracentrífugos.
  6. Vesículas de membrana de pellets del sobrenadante resultante por ultracentrifugationat 150.000 g durante 1 h a 4oC.
  7. Lavar las vesículas de membrana una vez, sin resuspensión, en 1 mM Tris-maleato, pH 5.2 que contiene 0.14 M KCl, 2 mM 2-mercaptoetanol y 10% glicerol y resuspender en el mismo tampón (Buffer 2)23 usando una amoladora de tejido Dounce. Típicamente la fracción de membrana de 500 ml de cultivo se suspendería en 5 ml de tampón, y una concentración de 5-10 mg de proteína de membrana/ml utilizando el ensayo de ácido biocílico32.
  8. Almacene alícuotas de 100 ml de preparados de membranas a -80 oC en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.

4. Western Blot y orientación del ensayo transportador

  1. Lavar y resuspender vesículas del paso 3.7 en 30 mM Tris pH 7.8 + 0.1 mM CoCl2.
  2. A muestras de 100 l, añadir 1 ml de carboxipeptidasa de 2 mg/ml en 0,1 M NaCl, Tris de 30 mM, 0,2 mM de CoCl2 pH 7,8.
  3. Inculque durante 20 min a 20oC. Detenga la digestión añadiendo 5 sL de NaEDTA de 0,5 M, 0,5 M 2-mercaptoetanol pH 7,5.
  4. Para inactivar completamente la enzima, incubar la solución durante 1 h a temperatura ambiente.
    NOTA: Las vesículas sin el tratamiento catboxypeptidase A se utilizaron como control.
  5. Analizar muestras por electroforesis en presencia de sulfato de dodecílico de litio. Añadir 5-10 l de 150 mg/ml de sulfato de dodecilo de litio de 150 mg/ml, 450 mg/ml de glicerol, 0,1 mg/ml de bromofenol azul, 0,4 M Tris pH 7,5 a 100 ml de la muestra.
  6. Realice la inmunoblotación colocando un filtro de nitrocelulosa humedecido con 25 mM de pH de fosfato sódico-hidrógeno 7.5 sobre el gel de poliacrilamida. Colóquelos entre dos filtros de celulosa humedecido y, finalmente, entre dos almohadillas de plástico humedecido. Coloque este conjunto entre los electrodos de una cámara que contenga 25 mM de fosfato sódico-hidrógeno pH 7,5 a 2-4 oC.
  7. Permita que la electrotransferencia de proteínas continúe durante 3 h a 20 V y 2-3 A.
  8. Bloquear la membrana de nitrocelulosa durante la noche a 2 oC en un tampón de bloqueo de 0,15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5 y 0,5 mg/mL Tween 2033.
  9. Incubar el filtro de nitrocelulosa durante 2 h con una dilución de 1:5000 de anticuerpo anti-His (terminal C)-HRP en el tampón de bloqueo (20 ml) y lavar dos veces con 50 ml de tampón durante un total de 60 min.
  10. Para visualizar el inmunoblot, disolver 6 mg de 4-cloro-1-naftol en 20 ml de alcohol desnaturalizado y añadir 80 mL de 15 mM Tris pH 7,5 y 50 ml de 30% H2O2. Bañe el papel filtrante en la solución de sustrato durante 20 min. El reactivo reaccionará con el anticuerpo para formar un precipitado azul en la membrana de la nitrocelulosa. Cuando se haya desarrollado suficiente color, enjuague la membrana con agua y deje secar.

5. Ensayo de transporte

  1. Incubar 100 alícuotas de vesículas de membrana a 12 oC durante 5 min.
  2. Inicie el transporte añadiendo poliaminas radioetiquetadas a las vesículas de membrana a una concentración final de 50 m (a menos que se indique lo contrario). Hacer 3soluciones de sustrato H (espermidina o putrescina) en un tampón de ensayo que consta de 10 mM Tris-HCl, 10 mM de fosfato de potasio, pH 8.0 y 0.14 M KCl23 (Buffer 3) con modificaciones dependiendo del ensayo.
  3. Llevar a cabo ensayos de transporte durante 1 min a 12 oC en tubos de microfúgeo de 1,5 ml.
  4. Después de 1 min, transfiera las mezclas de reacción al colector de filtración y filtre a través de un filtro de membrana de nitrocelulosa de 0,45 m.
    1. Añadir 3 ml de tampón de ensayo frío en hielo que contenga una concentración 10 veces mayor de poliaminas sin etiquetar seguida de 3 ml de tampón de ensayo sin las poliaminas para reducir la unión inespecífica.
    2. Transfiera los filtros lavados a viales de centelleo desechables de 20 ml que contengan 10 ml de líquido centelleo y determine la radiactividad utilizando un contador de centelleo líquido. El contador de centelleo mide la radiactividad en la muestra y la notifica como desintegraciones por minuto (dpm).
  5. Calcular la ingesta neta de poliamina como la diferencia entre la toma a 1 min por vesículas incubadas a 12 oC y la toma a 0 min por vesículas incubadas sobre hielo.
    NOTA: La masa de sustrato importada en las vesículas se calcula de la siguiente manera. Si el volumen de la muestra en el tubo de microfúctelo es de 0,2 l y la concentración inicial del sustrato es de 100 m, la masa total de sustrato en el tubo de microfúctil es de 20 x 10-12 M. Debido a la muy alta actividad específica de sustratos etiquetados comercialmente (a menudo 2,22 x 109 dpm/mM) la masa del isótopo añadido puede ser ignorada en el cálculo. Así que si la cantidad total de isótopo que se añadió al tubo de microfúcteo fue 100 x 106 dpm y las vesículas tenían una toma neta de 1.000 dpm, entonces la masa total de sustrato tomada por las vesículas fue del 1% del número total de moles de sustrato o 2 x 10-13 M.
    1. Determinar Km para el sustrato midiendo la absorbación de 10, 25, 50, 250 y 500 m de sustrato radiomarcado en vesículas que expresan la proteína diana. Calcule la cinética de Michaelis-Menten utilizando un método de regresión no lineal utilizando el modelo Michaelis Menton del paquete de software estadístico34.
  6. Para los experimentos de la competencia, añada un sustrato competitivo no etiquetado de 100 m, 500 m, 1 mM o 2 mM de mM fabricado en el tampón de ensayo al tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene 100 ml de vesículas a 12 oC.
    1. Añadir poliamina radioetiquetada (50 m) al tubo de microcentrífuga simultáneamente.
    2. Mida la radiactividad atrapada dentro de las vesículas como se mencionó anteriormente repitiendo los pasos 5 a 5.4.2.
    3. Determinar km aparente(Km,app) para los sustratos competitivos midiendo la ingesta de 10, 25, 50, 250 y 500 m poliaminas radioetiquetadas en presencia de sustrato no etiquetado de 100 m o superior y utilizando un método de regresión no lineal para trazar la curva.

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Representative Results

Los pasos principales de este protocolo se resumen pictóricamente en la Figura 1. Brevemente, las células de E. coli deficientes en todos los intercambiadores de poliamina y la expresión de AtBAT1 son cultivadas, centrifugadas, lavadas con un tampón y sometidas a lisis celular utilizando una prensa francesa. La lisis tiende a producir vesículas que son en su mayoría de adentro hacia afuera y atrapan el tampón fuera de las células. Los desechos celulares se eliminan por centrifugación, y se utiliza un segundo paso de ultracentrifugación para recoger un pellet de membrana. El pellet de membrana se resuspende en tampón Tris-Maleato pH 5.2 y se almacena a -80 oC. Los ensayos de transporte se realizan a 12oC, lo que se encontró que era óptimo para mantener la estabilidad de la membrana. Los ensayos se inician mediante la adición de sustrato radiomarcado y un cambio en el pH de la suspensión tampón de vesículas a pH 8.0. Después de 1 min, se añade un tampón de ensayo frío con sustratos sin etiquetar para detener la toma de la radioetiqueta en las vesículas. Las vesículas radioetiquetadas están atrapadas por filtración a través de membranas de nitrocelulosa. Las membranas se transfieren a viales de centelleo y la radioetiqueta en las membranas se determina mediante recuento de centelleo líquido.

Una mancha occidental se utiliza para verificar que AtBAT1 se transloca a vesículas(Figura 2). Sondear la mancha con un anticuerpo Anti-His C-terminal reveló una proteína de construcción de fusión de aproximadamente 72,3 kDa(Figura 2,Carril 2). La digestión de las vesículas antes de SDS-PAGE dio lugar a una dimunición, pero no una pérdida completa de la señal de la sonda(Figura 2,carril 3). La disminución de la señal de la sonda como consecuencia de la carboxipeptidasa A sugiere que la mayoría de los residuos C-terminal están en el exterior de las vesículas.

En este sistema de ensayo, las vesículas se suspenden en un tampón a pH 5.2 de modo que el pH dentro de las vesículas se equilibra con el tampón. El transporte del sustrato radiomarcado a las vesículas a pH 5.2 se inicia suspendiendo las vesículas en un tampón de pH 8.0, creando así un gradiente de pH de pH 2.8 a través de la membrana. A 12oC, la toma de esperdinano radiomarcado por las vesículas fue más alta a 1 min, y se mantuvo lineal durante 3 min(Figura 3A). Por lo tanto, el tiempo de incubación para el ensayo de transporte se fijó en 1 min. Para tener en cuenta la unión no específica de la radioetiqueta, las vesículas se incubaron a 0 oC en presencia de sustrato radiomarcado durante un minuto, y estos recuentos se restaron de la aceptación de ladiolabel a temperaturas más altas.

La Figura 3B muestra la aceptación de espermatozoides radiomarcados en las vesículas después de un minuto. No hubo la toma neta de isótopo por vesículas de membrana que se prepararon y almacenaron en pH 8.0, ya que no había ningún gradiente de protones a través de la membrana vesícula. Para demostrar el efecto de la disipación del gradiente de protones artificial, las vesículas de membrana se incubaron en tampón pH 8.0 durante 10 minutos antes de la adición del sustrato etiquetado25. En estas condiciones, se mostró una mínima toma de sustrato radiomarcado. La aceptación de espermatozoides radiomarcados también fue mínima en vesículas preparadas con células de E. coli deficientes en los intercambiadores de poliamina CadB y PotE. En conjunto, estos resultados indican que la absorbesta impulsada por protones de la espermadina se debió a la proteína BAT1(Figura 3A,B).

Para determinar la especificidad del sustrato de la proteína, los valores de Km se calcularon midiendo la absorbación del sustrato radiomarcado a concentraciones de 10, 25, 50, 100, 250 y 500 m. Los Km para espermidina, putrescina y arginina fueron de 55 a 12 M, 85 a 20 m y 1,4 a 0,5 mM, respectivamente, lo que indica que esta proteína es un intercambiador de poliamina y arginina de alta afinidad ( Figura4).

La afinidad del transportador para un sustrato en particular también se puede determinar indirectamente mediante el uso de ensayos de competencia. Aquí, hemos utilizado dos métodos para evaluar la competencia entre dos sustratos. En el primer método, se midió la ingesta de 50 m de esperdina radioradioteado en presencia de concentraciones crecientes del sustrato competidor no etiquetado(Figura 5A). En el segundo método, el Km aparente para la espermidina se calculó midiendo la ingesta de concentraciones crecientes de espermidina radioetiquetada en presencia de 100 m de sustrato competidor no etiquetado(Figura 5B). Ensayos de la competencia revelaron que GABA es un inhibidor competitivo de la espermidina con un Km,app de 164 á 15 m(Figura 5A, B). Además, la medición de la ingesta de 50 m de esperdina radioetiquetada en presencia de concentraciones variables de diferentes aminoácidos reveló que AtBAT1 también es capaz de transportar glutamato y alanina a concentraciones de mM(Figura 6).

Figure 1
Figura 1: Representación esquemática del método. (A) Representación esquemática que esboza pasos clave en la preparación y purificación de vesículas de membrana de E. coli. (B) Representación esquemática que esboza los pasos clave en el ensayo de transporte de preparaciones de vesículas de membrana utilizando sustratos radiomarcados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Mancha occidental que muestra la expresión de AtBAt1 en vesículas purificadas. Las bandas fueron visualizadas usando anticuerpos anti-His (C-term)-HRP conjugados por peroxidasa de rábano picante. Carril 1, Escalera de proteína prestada. Carril 2, Vesículas purificadas que expresan AtBAT1.1 mostrando una banda del tamaño esperado de la proteína de fusión. Carril 3, las vesículas purificadas que expresan AtBAT1.1 fueron pretratadas con carboxipeptidasa A antes de la electroforesis SDS y la hincha occidental. Se añadieron cantidades equivalentes de vesículas (proteínas) a cada carril. La disminución de la tinción indica que el Terminal C de la proteína en la mayoría de las vesículas se degrada por la digestión de la proteasa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Actividad de transporte de vesículas que muestra el efecto de la expresión de proteína BAT1 y la importancia de un gradiente de pH. (A) La ingesta dependiente del tiempo de 3H etiqueta espermidina en vesículas que expresa BAT1 con un pH interno de 5.2 e introducido en un tampón a pH 8.0. En el ensayo de control, las vesículas se añadieron al tampón de ensayo a pH 8.0, 10 min antes de la adición de 3H etiquetadas esperidina para permitir la disipación del gradiente de protones. A continuación, se evaluó la aceptación de la etiqueta radioeléctrica en las vesículas durante un intervalo de 1 minuto. (B) La ingesta de 3H con la etiqueta spermidina en presencia de un gradiente de protones (pH interno de 5.2), en ausencia de un gradiente de protones (pH interno de 8), en vesículas añadidas a la solución de ensayo 10 minutos antes de la adición de esperdinano radiomarcado y en vesículas hechas de células mutantes de E. coli que no expresan BAT1. La toma en vesículas fue monitoreada durante 1 min. Todos los valores se presentan como media s SE de cinco réplicas. El análisis de datos se realizó utilizando la prueba t de un alumno y * indica una diferencia significativa con respecto al control (valorp < 0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Ensayos in vitro de la actividad de transporte de poliamina y arginina de BAT1. (A) Los valores de Km para la toma de espermatozoides y putrescina son de 55 a 12 m y de 85 a 32 m respectivamente. (B) La Km para la acumulación de arginina es de 1,4 x 0,5 mM. Todos los valores se presentan como media s SE de cinco réplicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: GABA es un inhibidor competitivo del transporte de espermidina por BAT1. (A) La toma de 3H etiquetada esperidina por vesículas que expresaN AtBAT1.1 se redujo significativamente en presencia de 100 M o 500 OM GABA. (B) Aparente Km para la toma de espermatozoides por BAT1.1 se incrementó a 164 á 20 M en presencia de GABA de 100 M. Todos los valores se presentan como media s SE de cinco réplicas. El análisis de datos se realizó utilizando la prueba t de un alumno y * indica una diferencia significativa con respecto al control (valorp < 0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: El glutamato y la alanina son inhibidores competitivos del transporte de espermidina por BAT1. La acumulación de espermidina se redujo significativamente en presencia de 1 mM de glutamato no etiquetado y 1,5 mM de alanina no etiquetada. Todos los valores se presentan como media s SE de cinco réplicas. El análisis de datos se realizó utilizando la prueba t de un alumno y * indica una diferencia significativa con respecto al control (valorp < 0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En el presente estudio, delineamos un método para la caracterización de un antiportador expresando primero la proteína en E. coli y luego generando vesículas de membrana, de modo que la proteína expresada heterólogamente puede ser ensayada en un sistema libre de células. Además de los equipos que se encuentran en la mayoría de los laboratorios de biología molecular, esta estrategia requiere el uso de una prensa francesa, una ultracentrífuga y el acceso a una instalación para llevar a cabo ensayos de radioisótopos.

Un requisito básico de esta técnica es que la proteína hetóloga está correctamente dirigida a la membrana plasmática de E. coli. Esta estrategia también puede ser útil para el análisis funcional de transportadores organelares ya que el transportador de glucosa Plastid ADP fue localizado con éxito a la membrana celular De coli y se caracterizó funcionalmente35. El vector (pBAD-DEST49) utilizado en estos experimentos contiene una proteína de tioredoxina N-terminal para aumentar la solubilidad del producto traducido. Se han encontrado fusiones N-terminal de una pequeña proteína B. subtilus mística para permitir una focalización más eficiente de los transportadores de membrana a la membrana citoplasmática36. Sin embargo, los eventos de desdoblamiento, y el fracaso de las proteínas para ser correctamente integrado en la membrana citoplasmática son problemas potenciales que impiden el uso de sistemas de expresión bacteriana para muchos tipos de transportadores1.

Las vesículas de membrana también se han utilizado para caracterizar a los transportadores de plantas37,38. Como las vesículas carecen de las fuentes de energía esenciales como ATP y enzimas, la interferencia de los transportadores activos y otra actividad metabólica es mínima. Por lo tanto, este sistema es ideal para el análisis de translocaciones pasivas como intercambiadores de metabolitos. Las vesículas de membrana en constante estado, en particular, se pueden aplicar a la caracterización de exportadores y antiportadores, ya que la composición de la solución interna se puede manipular cambiando la composición del tampón 1. Además, el uso de la sonicación de prensa o ultrasonido francés es bastante eficiente en la generación de vesículas de membrana de a partir de fuera de células intactas de E. coli. El 95% de las vesículas generadas por ultrasonido sonicación o prensa francesa han everted membranas39,40. PotE, el antiportador E. coli de putrescina y ornitina, fue el primer antiportador de poliamina que se caracterizó utilizando vesículas de membrana interna23. Usamos la transducción P1 para crear una cepa mutante específica para la caracterización de un antiportador de poliamina, y esta cepa puede ser útil para la caracterización de otros intercambiadores de poliamina animal, fúngico o vegetal. También prevemos que otras cepas de E. coli con dos o más deleciones genéticas podrían ser útiles para la caracterización de otros transportadores de intercambio de plantas y animales que utilizan vesículas de membrana.

El paso más crítico en este protocolo es la expresión de la proteína en el sistema mutante E. coli. Un vector de expresión de E. coli con un promotor inducible se utiliza para promover una regulación estricta y dependiente de la dosis de la expresión génica hetróloga. La presencia de N etiquetas terminales y terminales C como Thioredoxin su parche, epítopo V5 o 6xHis en el vector es útil para la detección y purificación de la proteína. Además, la presencia de una proteína de fusión de tioredoxina que es un componente del vector pBAD49, puede aumentar la eficiencia de la traducción y, en algunos casos, la solubilidad de las proteínas eucariotas expresadas en E. coli41. Las diferentes opciones de codón en Arabidopsis y E. coli podrían desafiar la expresión de proteínas en E. coli. Se sabe que la optimización del codón puede aumentar impresionantemente la expresión de proteínas heterocigotas en E. coli42. En el ensayo de vesículas, el AtBAT1.2 optimizado para codón mostró una mayor actividad de intercambio que el AtBAT1.1 optimizado para no codón en células De E. coli (datos no mostrados), lo que demuestra que la optimización del codón fue útil para mejorar la expresión y la función de las proteínas expresadas henocimosamente en las células bacterianas. La producción de vesículas de membrana mediante un ajuste cuidadoso de la válvula para mantener un goteo lento y uniforme de células lysed es también un paso clave en el procedimiento. Después de la ultracentrifugación, hemos encontrado que la resuspensión de vesículas de membrana en un homogeneizador Dounce minimiza la muestra a la variación de la muestra entre las alícuotas de las vesículas de membrana que se preparan y posteriormente se almacenan a -80 oC.

Una limitación de los sistemas de expresión de E. coli es que son incapaces de modificaciones post-traduccionales como La glicosilación N o la acetilación. La ausencia de estas modificaciones proteicas podría afectar la actividad proteica1. Sin embargo, los mutantes capaces de realizar estas modificaciones han sido identificados y pueden ser utilizados como una herramienta para expresar proteínas que requieren tales modificaciones43. La generación de cantidades suficientes de la proteína expresada podría ser un desafío debido al desarrollo y la agregación como cuerpos de inclusión, la falta de integración de la proteína en la membrana citoplasmática, la segmentación incorrecta y la regulación incorrecta debido a la falta de modificaciones post traslacionales.

Una pequeña limitación de esta técnica es que no proporciona evidencia de la orientación natural del transportador. Esto se puede lograr aprovechando las etiquetas terminales N o C y los métodos inmunológicos. La accesibilidad de una determinada terminus de la proteína en las vesículas se puede lograr mediante la digestión de todos los accesibles, y por lo tanto, presumiblemente termini externo del portador, electroforesis de la proteína en presencia de sulfato de dodecilo sódico, transferencia a filtros de nitrocelulosa y detección del resto, termini interno con anticuerpos40.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

El apoyo a este proyecto vino de la BGSU Graduate College, y la Oficina de Programas Patrocinados e Investigación de BGSU.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
3H-putrescine PerkinElmer NET185001MC
3H-spermidine PerkinElmer NET522001MC
4-chloro-1-naphthol Sigma-Aldrich C8890
14C arginine Moravek Inc. MC137
Arginine Sigma-Aldrich A-5006
Anti-His (C-term)-HRP antibody ThermoFisher R931-25 Detects the C-terminal polyhistidine (6xHis) tag, requires the free carboxyl
group for detection
Arabinose Sigma-Aldrich A3256
BCA protein assay kit ThermoFisher 23227 Pierce BCA protein asay kit.
Bromophenol blue Bio-Rad 161-0404
Carboxypeptidase B Sigma-Aldrich C9584-1mg
Centrifuge Sorvall SS-34 fixed angle rotor and GA-6 fixed angle rotor
Dounce tissue grinder LabGenome 7777-7 Corning 7777-7 pyrex homogenizer with pour spout.
Ecoscint-H National Diagnostics LS275 scintillation cocktail
EDTA Sigma-Aldrich
Filtration manifold Hoefer FH225V
French Pressure Cell Glen Mills FA-080A120
GABA Sigma-Aldrich A2129
Glutamate Sigma-Aldrich G6904
Glycerol
GraphPad Prism software http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm
Hydrogen peroxide KROGER
Potassium Chloride J.T. Baker 3040-01
Liquid scintillation counter Beckman LS-6500
Maleate Sigma-Aldrich M0375
Nanodrop ThermoFisher
Nitrocellulose membrane filters Merck Millipore hawp02500 0.45 µM
PCR clean up kit Genscript QuickClean II
Potassium Phosphate dibasic ThermoFisher P290-500
putrescine fluka 32810
Potassium Phosphate monobasic J.T.Baker 4008
Spermidine Sigma-aldrich S2501
Strains :E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10 This manuscript Available upon request. Strain is deficient in the PotE and CadB polyamine exchangers.
Tris-base Research Products T60040-1000
Ultracentrifuge Sorvall MTX 150 46960 Thermo Fisher S150-AT fixed angle rotor
Ultracentrifuge tubes ThermoFisher 45237 Centrifuge tubes for S150-AT rotor
Vector: pBAD-DEST49 ThermoFisher Gateway expression vector for E. coli

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Bioquímica Número 154 Transportador de membrana antiportador transporte de poliamina intercambiador de poliamina vesículas de membrana prensa francesa análisis cinético ensayos de transporte de radioisótopos GABA
Caracterización de transportadores de membranas por expresión heteróloga en <em>E. coli</em> y producción de vesículas de membrana
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