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Neuroscience

Imagerie avancée de diffusion dans l'hippocampe des rats avec la blessure cérébrale traumatique douce

Published: August 14, 2019 doi: 10.3791/60012
Automatic Translation
1, 1, 1
1Infinity lab, Medical Imaging and Signal Processing Group, Ghent University

Summary

L'objectif global de cette procédure est d'obtenir des informations microstructurales quantitatives de l'hippocampe chez un rat avec des lésions cérébrales traumatiques légères. Ceci est fait utilisant un protocole avancé de formation image de résonance magnétique de diffusion-weighted et l'analyse basée sur la région d'intérêt des cartes paramétriques de diffusion.

Abstract

Les lésions cérébrales traumatiques légères (ITM) sont le type de lésions cérébrales acquises le plus courant. Étant donné que les patients atteints de lésions cérébrales traumatiques présentent une variabilité et une hétérogénéité considérables (âge, sexe, type de traumatisme, autres pathologies possibles, etc.), les modèles animaux jouent un rôle clé dans le démêlage des facteurs qui sont des limitations dans la recherche clinique. Ils fournissent un cadre normalisé et contrôlé pour étudier les mécanismes biologiques des blessures et des réparations après TBI. Cependant, tous les modèles animaux n'imitent pas efficacement la nature diffuse et subtile de l'ITM. Par exemple, les modèles couramment utilisés d'impact cortical contrôlé (ICC) et de lésion latérale des percussions de fluide (LFPI) utilisent une craniotomie pour exposer le cerveau et induire un traumatisme focal généralisé, qui ne sont pas couramment observés dans l'ITMT. Par conséquent, ces modèles expérimentaux ne sont pas valables pour imiter mTBI. Ainsi, un modèle approprié devrait être utilisé pour étudier mTBI. Le modèle de chute de poids de Marmarou pour des rats induit des altérations microstructurales semblables et des affaiblissements cognitifs comme vu dans les patients qui soutiennent le trauma doux ; par conséquent, ce modèle a été choisi pour ce protocole. La tomographie calculée conventionnelle et les balayages de formation image de résonance magnétique (MRI) ne montrent généralement aucun dommage suivant une blessure douce, parce que mTBI induit souvent seulement des dommages subtils et diffus. Avec l'IRM pondérée par diffusion, il est possible d'étudier les propriétés microstructurales du tissu cérébral, ce qui peut fournir plus de perspicacité dans les altérations microscopiques suivant le trauma doux. Par conséquent, l'objectif de cette étude est d'obtenir des informations quantitatives d'une région sélectionnée d'intérêt (c.-à-d., hippocampe) pour suivre la progression de la maladie après avoir obtenu une lésion cérébrale légère et diffuse.

Introduction

Les lésions cérébrales traumatiques (ITC) ont gagné plus d'attention ces dernières années, car il est devenu clair que ces lésions cérébrales peuvent entraîner des conséquences cognitives, physiques, émotionnelles et sociales à vie1. Malgré cette prise de conscience croissante, le TBI doux (MTBI, ou commotion) est encore souvent sous-déclaré et non diagnostiqué. MTBI a été appelé une épidémie silencieuse, et les personnes ayant des antécédents de mTBI montrent des taux plus élevés de toxicomanie ou de problèmes psychiatriques2. Plusieurs patients présentant mTBI vont undiagnosed chaque année dû à la nature diffuse et subtile des dommages, qui sont souvent pas visibles sur la tomographie calculée conventionnelle (CT) ou la formation image de résonance magnétique (MRI) balayages. Ce manque de preuves radiologiques de lésions cérébrales a conduit au développement de techniques d'imagerie plus avancées telles que l'IRM de diffusion, qui sont plus sensibles aux changements microstructuraux3.

L'IRM de diffusion permet la cartographie in vivo de la microstructure, et cette technique d'IRM a été largement utilisée dans les études TBI4,5,6. À partir du tenseur de diffusion, l'anisotropie fractionnaire (FA) et la diffusion moyenne (MD) sont calculeres pour quantifier l'altération dans l'organisation microstructurale après des dommages. Les examens récents dans les patients de mTBI rapportent des augmentations dans FA etdiminutions dans MD suivant des dommages, qui peuvent être indicatifs de gonflement axonal 7. Contrairement, des augmentations de MD et des diminutions dans FA sont également trouvées et ont été suggérées pour sous-tendre des perturbations dans la structure parenchymale suivant la formation d'oème, la dégénérescence axonale, ou le désalignement/perturbationdefibre 8. Ces résultats mitigés peuvent s'expliquer en partie par l'hétérogénéité clinique significative de l'ITM causée par différents types d'impact et de gravité (p. ex. accélération de rotation, traumatisme par force émoussée, blessures par explosion ou combinaison de l'ancien). Cependant, il n'y a actuellement aucun consensus clair au sujet de la pathologie fondamentale et de la base biologique/cellulaire soutenant des changements dans l'organisation microstructurale.

Les modèles animaux offrent un cadre normalisé et contrôlé pour étudier plus en détail les mécanismes biologiques de blessures et de réparations après l'ITC. Plusieurs modèles expérimentaux pour le TBI ont été développés et représentent différents aspects de l'ITC humain (p. ex., traumatisme focal par rapport à traumatisme diffus ou traumatisme causé par les forces de rotation)9,10. Les modèles animaux couramment utilisés comprennent l'impact cortical contrôlé (ICC) et les lésions latérales des percussions fluides (LFPI)11,12. Bien que les paramètres expérimentaux puissent être bien contrôlés, ces modèles utilisent une craniotomie pour exposer le cerveau. Craniotomies ou fractures du crâne ne sont pas couramment vus dans mTBI; par conséquent, ces modèles expérimentaux ne sont pas valables pour imiter mTBI. Le modèle d'accélération d'impact développé par Marmarou et coll.13 utilise un poids qui est tombé d'une certaine hauteur sur la tête du rat, qui est protégé par un casque. Ce modèle animal induit des altérations microstructurales semblables et des affaiblissements cognitifs comme vu dans les patients qui soutiennent le trauma doux. Par conséquent, ce modèle de chute de poids Marmarou est approprié pour étudier les biomarqueurs d'imagerie pour le mTBI diffus14,15.

Ce rapport démontre l'application de l'IRM avancée de diffusion dans un modèle de rat de mTBI utilisant le modèle de chute de poids de Marmarou. La première fois est montrée comment induire un trauma doux et diffus, et l'analyse utilisant le modèle d'imagerie de tenseur de diffusion (DTI) est alors fournie. Des informations biologiques spécifiques sont obtenues à l'aide de modèles de diffusion plus avancés [c.-à-d. imagerie par kurtose de diffusion (DKI) et modèle d'intégrité des voies de la matière blanche (WMTI)]. Plus précisément, des traumatismes légers sont infligés et des changements microstructuraux sont ensuite évalués dans l'hippocampe à l'aide d'IRM conventionnelle serréfique par T2 et d'un protocole avancé de imagerie par diffusion.

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Protocol

Le protocole a été approuvé par le Comité d'éthique animale de l'Université de Gand (ECD 15/44Aanv), et toutes les expériences ont été menées conformément aux directives de la Commission européenne (Directive 2010/63/UE).

1. Préparation des animaux et fixation du casque

  1. Peser un rat Femelle Wistar H (250 g ou 12 semaines d'âge) et anesthésier dans une petite chambre à induction remplie d'un mélange d'isoflurane (5%) et O2 pendant au moins 1 min.
  2. Injecter le rat avec 0,05 mg/kg de buprénorphine sous-cutané dans le cou, le retourner à la cage d'accueil, et permettre à l'analgésie préventive pendant au moins 30 min de prendre un effet.
    REMARQUE : Pendant l'attente de 30 min, le site chirurgical peut être préparé.
  3. Placer un coussin chauffant maintenu à 37 oC sous le champ chirurgical. Placez les instruments chirurgicaux stérilisés sur le champ chirurgical qui a été désinfecté avec 70% d'éthanol.
  4. Placer le rat dans la chambre d'induction et anesthésier le rat jusqu'à ce qu'il ne soit pas sensible à une pince à pattes ou à queue.
  5. Placez le rat sur le champ chirurgical et insérez un cathéter dans la veine latérale de la queue. Ensuite, raser la tête du rat, enlever l'excès de fourrure et désinfecter le cuir chevelu et le reste de la zone chirurgicale avec de la chlorohexidine.
  6. Injecter localement 100 lidocaïnes de 2 % dans le cuir chevelu.
  7. Faire une incision de ligne médiane à l'aide d'un scalpel taille 11 pour exposer le crâne, en enlevant les membranes excédentaires avec de petits ciseaux. Retirez la peau à l'aide d'un spéculum oculaire avec une propagation maximale de 1 cm.  En outre, enlever le périosteume en frottant doucement un bourgeon de coton stérile sur le crâne jusqu'à ce que le périoste n'est plus présent.
  8. Placez une goutte de colle de tissu sur le crâne et une sur le disque métallique stérilisé (diamètre de 10 mm et 3 mm d'épaisseur), qui agit comme le casque. Coller le disque environ un tiers avant et deux tiers derrière le bregma. Laisser sécher la colle pendant 1 min.

2. Induction de lésions cérébrales traumatiques (ITT)

  1. Placez le rat sur le lit sur mesure avec un matelas en mousse de certaines constantes printanières (voir Tableau des matériaux). Placez le rat directement sous un tube en plastique transparent avec un poids en laiton de 450 g avec le casque aussi horizontal que possible. Détachez le rat de l'anesthésie.
  2. Tirez le poids jusqu'à 1 m et relâchez-le lorsqu'il est prêt. Assurez-vous qu'un deuxième expérimentateur est présent pour éloigner le rat du tube en plastique immédiatement après l'impact afin d'éviter un deuxième impact.
    REMARQUE : Les rats blessés de faux reçoivent la même procédure expérimentale (étapes 1.1-2.7), excepté l'étape 2.2.
  3. Re-attachez le rat à l'anesthésie et injectez 1 ml de solution physiologique (0,9% NaCl) via le cathéter pour réduire le choc hémodynamique.
    REMARQUE : Il est possible que le rat cesse brièvement de respirer à cause de l'impact. Comprimez doucement le thorax si le rat ne respire pas spontanément après 2 s pour encourager le réflexe respiratoire.
  4. Retirez le casque en le tirant doucement du crâne. Enlever toute colle restante du crâne et de la peau et fermer l'incision avec une suture chirurgicale. Appliquer le gel d'analgésie local à l'aide d'une pointe d'applicateur stérile.
  5. Placez le rat sur le lit du scanner. Confirmez la position correcte à l'aide d'un balayage scout. Ajuster le champ de vision pour permettre l'imagerie de toute la tête dans une position de lit. Administrer un but général, tomodensitome à faible dose pour exclure les fractures du crâne.
    REMARQUE : La fracture du crâne est un critérium pour l'euthanasie.
  6. Placer le rat dans une cage propre sur un coussin chauffant (37 oC). Surveillez le temps de reprendre conscience. Une fois que le rat est capable de s'asseoir debout, le rat peut être retourné à la cage à la maison.
  7. Administrer une deuxième dose de 0,05 mg/kg de buprénorphine un jour après l'induction de l'ITC.

3. Imagerie par résonance magnétique de diffusion (IRM)

REMARQUE : La formation image pondérée par diffusion est exécutée avant et 1 jour après induction de trauma.

  1. Anesthésier le rat dans une petite chambre à induction remplie d'isoflurane (5%) et O2. Lorsque le rat n'est pas sensible à une pince de patte ou de queue, réduisez l'anesthésie à 2 % avec un débit de 500 ml/min. Transférer l'animal au lit du scanner en position couchée la tête la première.
  2. Placez le rat dans le support de tête avec la barre de dents et le cône de nez, livrant l'anesthésie, et faites glisser la tête vers l'avant jusqu'à ce que le centre du cerveau soit au niveau du centre de la bobine d'IRM de volume de quadrature. Appliquer une pommade lubrifiante sur les yeux en petites quantités pour éviter tout dommage à la cornée. Fixer la tête avec un petit morceau de ruban adhésif pour éviter le mouvement pendant la numérisation.
  3. Placez un coussin de pression sous le thorax du rat pour surveiller la respiration et recouvrir le rat d'une couverture de chauffage à l'eau chaude en circulation et d'un enveloppement à bulles pour garder le rat au chaud. Avant la numérisation, vérifiez le moniteur respiratoire pour vous assurer que le signal est clair sans bruit et que le cycle respiratoire est constant. Déplacez le bloc de pression, si nécessaire.
    REMARQUE : Le taux respiratoire doit être maintenu entre 1 respiration pour 1 200 à 1 700 ms en ajustant le niveau d'anesthésie entre 1 % et 2 %.
  4. Faites glisser la bobine de volume de quadrature sur la tête. Ajustez les condensateurs et les condensateurs assortis de la bobine à la fréquence appropriée et empéniez selon les instructions fournies par le vendeur de bobines. Avancez le lit du scanner dans le scanner pour commencer à scanner.
  5. Obtenir un balayage par défaut de l'éclaireur à trois avions (« tripilote ») pour assurer un positionnement correct.
    1. Chargez la séquence tripilote dans le contrôle de l'analyse en cliquant sur New Scan et en sélectionnant la séquence tripilote de la liste de protocole. Ensuite, cliquez sur le bouton de feux de circulation pour démarrer l'analyse.
    2. Lorsque l'analyse est terminée, chargez l'analyse dans l'écran d'image et assurez-vous que 1) la tête est couchée droite et 2) le cerveau est placé au centre de l'aimant et de la bobine. Ajuster la position de la tête et/ou du lit du scanner, si nécessaire, et acquérir un nouveau balayage tripilote.
  6. Ajustez le champ magnétique local à l'aide d'un protocole de jeu automatisé de deuxième ordre : chargez le protocole de deuxième ordre dans le contrôle de balayage tel que décrit à l'étape 3.5.1. Ensuite, cliquez sur l'onglet Acq . Ajustements actuels Ajustement spécifique à la méthode pour l'homogénéité de champ local dans la fenêtre de l'outil de contrôle du spectromètre pour commencer le calage automatisé.
  7. Chargez une nouvelle séquence d'imagerie rapide T2 avec des échos recentrés (RARE) dans le contrôle de l'analyse tel que décrit à l'étape 3.5.1.
    1. Acquérir des images pondérées T2 en utilisant les paramètres par défaut, à l'exception des paramètres suivants :
    2. Ouvrez l'onglet Edit Scan et ajustez le temps de répétition (TR) et le temps d'écho (TE) à 5 500 ms et 37 ms, respectivement. En outre, modifiez le champ de vision et la taille de la matrice pour permettre une résolution plus élevée dans l'avion de 109 m x 109 m (résolution par défaut de 156 m x 156 m). Assurez-vous que l'épaisseur de la tranche est de 600 m, le nombre de tranches est réglé à 45, et le facteur RARE est réglé à 8.
    3. Ouvrez l'éditeur de géométrie et placez le paquet de tranche dans la bonne position comprenant le bulbus du cerveau et le cervelet.
  8. Chargez trois nouvelles séquences spin-écho pondérées par diffusion écho-planaire (DtiEpi) du dossier B-DIFFUSION dans le protocole de contrôle de balayage tel que décrit à l'étape 3.5.1.
    REMARQUE : À l'aide de trois « coquilles » de diffusion différentes, on peut estimer lemodèle4,16, l'imagerie par kurtose de diffusion (DKI) et le modèle18 de l'intégrité des tracts de matière blanche (WMTI). Il est recommandé d'utiliser au moins trois valeurs b différentes, la valeur b la plus élevée ayant un maximum de 3000 s/mm2 avec au moins 15 directions uniformément espacées par obus d'imagerie17.
    1. Acquérir des images pondérées en fonction de la diffusion (DWIs) en utilisant les paramètres par défaut, en dehors des paramètres suivants :
    2. Ouvrez l'onglet Edit Scan et ajustez les paramètres géométriques sous l'onglet Géométrie. Ajustez le champ de vision et la taille de la matrice à 105 x 105 pour assurer une résolution de 333 m x 333 m.
    3. Définir l'orientation de la tranche à axial et le nombre de tranches à 25, résultant en une épaisseur de tranche de 500 m et une distance intertranchedement de 600 m. Modifier la direction de lecture en gauche-droite.
    4. Cliquez sur l'onglet Contraste pour ajuster le temps d'écho à 24 ms et le temps de répétition à 6 250 ms.
    5. Fixez la bande passante à 250 000 Hz et activez la suppression des graisses. Ajustez le nombre de moyennes à un.
    6. Cliquez sur l'onglet Recherche et modifiez le nombre de moyennes (segments EPI) à 4.
    7. Cliquez sur l'onglet Diffusion dans l'onglet recherche. Effectuez cette étape séparément pour chacune des trois coquilles de diffusion.
      1. Ajuster le nombre de directions de diffusion à 32 pour la première coquille, 46 pour la deuxième coquille, et 64 pour la troisième coquille.
      2. Ajustez les directions de gradient avec des fichiers de directions de gradient personnalisés.
      3. Changer le nombre d'images B0 à 5 pour la première coquille, 5 pour la deuxième coquille, et 7 pour la troisième coquille.
      4. Ajuster la valeur b par direction à 800 s/mm2 pour la première coquille, 1500 s/mm2 pour la deuxième coquille et 2000 s/mm2 pour la troisième coquille.
        REMARQUE : L'ajustement des directions de gradient avec un fichier de directions de gradient personnalisé peut être effectué manuellement en définissant les instructions de diffusion d'entrée à oui ou automatiquement en utilisant la macro DTI-SET-DIRECTIONS.
    8. Ouvrez l'éditeur de géométrie et placez le champ de vision entre le bulbus et le cervelet contenant seulement le cerveau pour réduire l'artefact et le temps de balayage. Placez six bandes de saturation de 5 mm à l'extérieur du cerveau pour réduire les artefacts en cliquant sur Saturation et en faisant glisser les bandes dans la position préférée à l'aide des barres de défilement.
      REMARQUE : Le bulbus et le cervelet peuvent être identifiés en fonction des repères anatomiques et des trois images du balayage tripilote.
  9. Acquérir les séquences importées en cliquant sur le symbole du feu de circulation. En utilisant les paramètres décrits ci-dessus, le temps d'acquisition de l'analyse T2-RARE est de 12 min, de la première coquille DWI 15 min, de la deuxième coquille DWI 21 min et de la troisième coquille 30 min. Le temps d'acquisition total est d'environ 80 min (sur un seul système de canal récepteur).
  10. À la fin du protocole de balayage, retirez l'animal du lit du scanner et placez l'animal dans une cage propre avec un coussin chauffant à 37 oC. Retournez l'animal dans la cage de la maison lorsqu'il reprend conscience.

4. Traitement d'image

REMARQUE : Dans les sections suivantes, le traitement des images de diffusion est décrit dans les logiciels MRtrix3, ExploreDTI19 et Amide20 qui sont des boîtes à outils en libre accès. Toutefois, les étapes de prétraitement peuvent être effectuées dans d'autres boîtes à outils (par exemple, FSL, MedInria, DTIStudio).

  1. Transférer les données acquises de la console d'acquisition en exportant le fichier 2dseq.
  2. Convertissez les fichiers 2dseq (fichiers DWI bruts) dans le format .mif, qui est le formatage standard de MRtrix3, pour permettre d'autres étapes de prétraitement dans MRtrix3. De plus, concatenate les trois obus de diffusion en utilisant les commandes suivantes dans la coquille :
    pdata de convert-bruker/1/2dseq ratID-T2.mih (pour les images pondérées par T2)
    pdata convert-bruker/1/2dseq ratID-dwi1.mih (pour la première coquille de diffusion)
    pdata convert-bruker/1/2dseq ratID-dwi2.mih (pour la deuxième coquille de diffusion)
    pdata convert-bruker/1/2dseq ratID-dwi3.mih (pour la troisième coquille de diffusion)
    mrcat ratID-dwi1.mif ratID-dwi2.mif ratID-dwi3.mif ratID-dwi.mif
  3. Effectuer la correction du bruit et La correction de sonnerie Gibbs sur les DWIs dans MRtrix321,22. De plus, convertissez les images DWI corrigées et l'image T2 au format NIFTI à l'aide des commandes suivantes :
    dwidenoise ratID-dwi.mif ratID-dwi-denoised.mif
    mrdegibbs ratID-dwi-denoised.mif ratID-dwi-denoised-gr.mif
    mrconvert ratID-dwi-denoised-gr.mif ratID.nii
    mrconvert ratID-T2.mif ratID-T2.nii
  4. Effectuer la correction pour les distorsions actuelles de l'EPI, du mouvement et de l'Eddy dans ExploreDTI :
    1. Convertissez les images NIFTI en un fichier .mat en cliquant sur Calculer le fichier DTIMD.mat . Convertir les données brutes en fichier DTIMD.mat. Modifier l'estimation du tenseur de diffusion en linéaire et la valeur b à NaN. Ajustez la taille du voxel à 0,333 0,333 0,6, le nombre d'images non-DWI à 17, le nombre d'images DWI à 142, et la taille de la matrice à 105 105 25.
      REMARQUE : En définissant la valeur B à NaN, ExploreDTI considérera le jeu de données comme un ensemble de données de kurtose.
    2. Cliquez sur l'onglet Paramètres pour ajuster les paramètres de correction EPI (il est désactivé par défaut). Sélectionnez la correction SM/EC/EPI, enregistrez-vous également à d'autres données ? et cliquez sur Oui, pour effectuer la correction EPI (non rigide). Spécifiez le suffixe de l'image anatomique T2 correspondant à l'ensemble de données de diffusion.
      REMARQUE : ExploreDTI corrige les distorsions EPI à l'aide de l'enregistrement d'images entre l'image anatomique non déformée et l'image de diffusion.
    3. Cliquez sur l'onglet Plugins et sélectionnez Correction pour les mouvements du sujet et les distorsions EC/EPI et sélectionnez le fichier de données de diffusion prétraité à partir de l'étape 2.3. Assurez-vous que l'image T2 est dans le même dossier et a la même base que le nom de fichier de données de diffusion (par exemple, rat1.nii pour le DWI et rat1-T2.nii pour l'image anatomique). Cette étape générera un fichier « natif » (native.mat) et « transformé » (trafo.mat).
  5. Calculez les mesures DTI pour chaque rat en cliquant sur Plugins et Export stuff à '.nii et en sélectionnant les cartes paramétriques du modèle DTI: anisotropie fractionnaire (FA), la diffusion moyenne (MD), la diffusion radiale (RD), et la diffusion axiale (AD; « plus grande valeur eigenvalue L1 »).
  6. En outre, exportez les cartes paramétriques pour le modèle kurtosis (MK, AK et RK) et le modèle WMTI (AWF, AxEAD, RadEAD et TORT). Le traitement des images de diffusion donnera lieu à 12 cartes paramétriques (figure1, figure 2, figure 3) qui pourront être utilisées pour une analyse microstructurale plus poussée.
  7. Créez un fichier de masque pour l'hippocampe de chaque rat à l'aide de MRtrix3.
    1. Chargez l'image FA du rat dans le visualiseur MRtrix en cliquant sur outil et éditeur de retour sur investissement.
    2. Créez un nouveau retour sur investissement en cliquant sur le bouton «ô » et appuyez sur Modifier pour dessiner le retour sur investissement sur chaque tranche qui inclut l'hippocampe (Figure 4). Pour effacer les zones indésirables du retour sur investissement tiré, appuyez sur le bouton de la souris droite.
    3. Lorsque le dessin du ROI est terminé, enregistrez l'image du masque en cliquant sur le bouton Enregistrer.
      REMARQUE: Ce fichier de masque sera un fichier d'image binaire NIFTI avec des voxels de valeur 1 contenant le tissu hippocampal, et les voxels restants auront des valeurs de 0. Pour normaliser la région de l'hippocampe chez les rats, les cartes paramétriques peuvent être co-enregistrées avec un modèle spécifique à l'étude avec des régions prédéfinies d'intérêt délimitées23 ou un atlas du cerveau des rats.
  8. Pour extraire les mesures de diffusion de l'hippocampe du rat, utilisez le fichier masque créé de l'étape 4.6 et ouvrez le logiciel Amide.
    1. Ouvrez les cartes paramétriques et masquez l'image du rat.
    2. Pour ajouter le retour sur investissement du fichier masque dans Amide, sélectionnez l'image de fichier masque, cliquez sur Modifier Ajouter le ROI 3D Isocontour et cliquez sur le retour sur investissement affiché dans l'image du masque. Donnez au roi-roi un nom significatif et confirmez que ce volume ne doit contenir que des voxels ayant une valeur d'un.
    3. Pour calculer les valeurs moyennes des mesures de diffusion dans l'hippocampe, cliquez sur Outils Calculez les statistiques du retour sur investissement et indiquez les images et le retour sur investissement qui doivent être inclus. Après avoir cliqué sur Execute, un autre écran apparaîtra avec des valeurs calculées qui peuvent être utilisées pour une analyse statistique plus approfondie. Ce fichier peut être enregistré ou copié dans un format de données préféré (p. ex., fichier .xlsx ou .csv).

5. Analyse statistique

REMARQUE : Dans les sections suivantes, nous décrivons le traitement des images de diffusion dans SPSS Statistics 24; cependant, l'analyse statistique peut être effectuée dans d'autres boîtes à outils statistiques.

  1. Chargez les données dans le grand format dans un fichier SPSS.sav.
  2. Pour vérifier les différences statistiques entre les deux groupes pour chaque point de temps (c.-à-d. la ligne de base ou un jour après la blessure), cliquez sur Analyser Tests non paramétriques Dialogs de l'héritage (en anglais) 2 Tests d'échantillons indépendants. Chargez les variables qui doivent être testées et spécifiez les groupes (c.-à-d. les groupes TBI et faux). Indiquez le Mann-Whitney U comme type de test.
  3. Pour vérifier les différences statistiques entre les 2 points de temps de chaque groupe, le fichier de données doit être divisé. Aller à Aller à des données, diviser le fichier et indiquer les groupes Comparer. Ensuite, cliquez sur Analyze, Tests nonparamétriques, Dialogs Hérités, 2 Tests d'ÉchantillonsConnexes, chargez les variables qui doivent être comparées et indiquez Wilcoxon comme type de test.
    REMARQUE : Pour corriger les comparaisons multiples, les p-values sont ajustées pour chaque modèle de diffusion à l'aide de la correction Bonferroni [c.-à-d., valeur p divisée par le nombre de paramètres comparés (DTI 4, DKI 3 et WMTI 4)]. Plus précisément, p 'lt; 0.0125 est considéré comme significatif pour les modèles DTI et WMTI, et p 'lt; 0.016 est considéré comme important pour le modèle DKI.

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Representative Results

Dans l'étude, tous les rats TBI (n - 10) ont survécu à l'impact et ont pu se remettre de l'impact et de l'anesthésie dans les 15 minutes suivant le détachement de l'anesthésie23. Sur les images CT, il n'y avait aucune preuve de fractures du crâne et les images T2 ne montraient aucune anomalie comme des saignements, des ventricules agrandis ou la formation d'œdèmes au site de contusion 1 jour après le traumatisme (figure 5). Ainsi, sur la base de ces inspections visuelles des images anatomiques, de grandes lésions focales n'ont pas été détectées, confirmant la nature diffuse et douce de la blessure.

La qualité de l'étape de coenregistrement (non rigide) entre l'ensemble de données d'image T2 et de diffusion (étape 4.4) a été examinée en ajoutant une pari de l'image T2 à la carte FA codée par couleur (figure 6). Ensuite, les cartes paramétriques FA, MD, AD et RD ont été calculées (figure 1) et chargées dans le logiciel Amide. Sur la base de la carte FA, un retour sur investissement comprenant la structure hippocampique a été dessiné (Figure 4). Les valeurs statistiques des mesures de diffusion ont été calculées en moyenne sur tous les voxels dans la région d'intérêt et les valeurs moyennes de chaque mesure DTI ont été exportées pour une analyse plus approfondie. Une autre vérification de la qualité des données de diffusion peut être effectuée en inspectant les valeurs aberrantes dans les mesures DTI. Par exemple, les valeurs FA dans l'hippocampe devraient être autour de 0,15; par conséquent, les valeurs de 'lt;0.10 (dénotant la diffusion isotropique) ou 'gt;0.30 (les valeurs sont vues dans la matière blanche) peuvent être considérées comme des valeurs biologiquement invraisemblables. Ces points de données devraient être rejetés par suite d'une analyse. En outre, les valeurs moyennes pour AK, RK et MK du modèle de kurtose de diffusion ainsi que les AWF, AxEAD, RadEAD et TORT du modèle WMTI ont été calculées (Figure 2, Figure 3).

Dans notre étude, l'analyse des mesures de l'ITD a révélé une augmentation significative des valeurs FA (p - 0,007) et une diminution des valeurs de diffusion (MD et RD) (p - 0,007 et p - 0,007, respectivement) à la suite de l'impact dans le groupe mTBI (figure 7). Ces diminutions de la RD et de la MD étaient significativement différentes de celles du groupe fictif (p - 0,005 et p - 0,004, respectivement). Les mesures de la kurtose de diffusion ont montré une diminution significative de la RK (p - 0,005) à la suite de l'impact, mais aucun changement dans l'AK ou le MK (figure 8). À l'aide du modèle WMTI, RadEAD (p - 0,007) et TORT (p - 0,007) ont affiché une diminution et une augmentation significatives, respectivement, dans le groupe mTBI 1 jour après l'impact (Figure 9C,D). Les valeurs du groupe fictif n'ont montré aucun changement significatif.

Figure 1
Figure 1 : Cartes paramétriques représentatives pour l'anisotropie fractionnaire (FA), la diffusion moyenne (MD), la diffusion axiale (AD) et la diffusion radiale (RD). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Cartes paramétriques représentatives pour la kurtose moyenne (MK), la kurtose axiale (AK) et la kurtose radiale (RK). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Cartes paramétriques représentatives pour la fraction axonale de l'eau (AWF), la diffusion axonale extra axonale axiale et radiale (AxEAD, RadEAD) et la tortuosité (TORT). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Création d'un masque dans MRtrix3. Un retour sur investissement est dessiné autour de l'hippocampe sur toutes les tranches contenant le volume de l'hippocampe, et le volume est enregistré comme un fichier de masque. Cela peut être fait pour chaque rat individuellement ou en utilisant un fichier de masque modèle spécifique à l'étude à laquelle chacune des cartes paramétriques peuvent être co-enregistrées. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Images pondérées par CT et T2 d'un animal représentatif mTBI 1 jour après l'impact. Les images CT (rangée supérieure) ne montrent aucune fracture du crâne. Sur les images T2-weighted (rangée inférieure) aucun saignement, ventricules agrandis, ou formation d'oème n'ont été démontrés. Il convient de noter que la formation d'oedème est clairement visible comme zone hyperintense autour de la zone de la plaie de l'intervention chirurgicale. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Carte FA codée en couleur des données de diffusion superposées à l'image anatomique après correction pourl'EPI, le mouvement et la correction actuelle d'Eddy dans ExploreDTI . Montré est une mauvaise correction et la co-enregistrement sur la gauche et de bons exemples sur la droite. Il faut s'assurer que l'encodage des couleurs est correct : direction gauche-droite en rouge (p. ex. corpus callosum), direction antérieure-postérieure en vert et direction inférieure supérieure en bleu (p. ex., cingulum). En outre, la couleur encodée FA image doit être parfaitement aligné avec l'image anatomique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7
Figure 7 : Changements dans les mesures des tenseurs de diffusion de l'hippocampe pour les animaux fictifs (n - 10) et mTBI (n - 10). Après l'impact, il y a eu une augmentation significative de FA (A) et des diminutions significatives de la diffusion moyenne (B) et de la diffusion radiale (D) chez les animaux mTBI (B,D). Aucune différence significative n'a été observée pour la diffusion axiale (C) chez les rats mTBI. Les animaux fictifs n'ont pas montré de changements significatifs de dTI (p 'lt; 0.0125). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 8
Figure 8 : Changements dans les mesures de la kurtose de diffusion de l'hippocampe pour les animaux fictifs (n - 10) et mTBI (n - 10). Après l'impact, il y a eu une diminution significative de RK (C) des animaux mTBI mais aucun changement dans AK (B) ou MK (A). Les animaux fictifs n'ont montré aucun changement (p 'lt; 0.0166). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 9
Figure 9 : Changements dans les mesures d'intégrité des voies de la matière blanche de l'hippocampe pour les animaux fictifs (n - 10) et mTBI (n - 10). Après l'impact, il y a eu une diminution significative du RadEAD (C) et une augmentation significative de tortli (D) des animaux mTBI, mais aucun changement dans aWF ou AxEAD (A,B). Les animaux fictifs n'ont montré aucun changement (p 'lt; 0.0125). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Puisque mTBI est souvent le résultat d'une blessure diffuse et subtile qui ne montre aucune anomalie sur CT et balayages conventionnels de MRI, l'évaluation des dommages microstructuralaprès un trauma doux demeure un défi. Par conséquent, des techniques d'imagerie plus avancées sont nécessaires pour visualiser toute l'étendue du traumatisme. L'application de l'imagerie par résonance magnétique de diffusion dans la recherche sur l'ITC a gagné plus d'intérêt au cours de la dernière décennie, où l'imagerie par tenseur de diffusion est le plus fréquemment utilisée5. Une limitation du modèle DTI est l'hypothèse d'un processus de diffusion gaussien qui n'est pas une hypothèse précise pour la microstructure du cerveau (composé d'un réseau complexe d'axones et de cellules avec des membranes agissant comme des barrières), résultant en des mesures DTI non spécifiques à la microstructure biologique sous-jacente24. L'imagerie par kurtose de diffusion est une extension du modèle DTI et tente de caractériser le degré de diffusion non-gaussienne17. Cela peut fournir des informations supplémentaires sur l'hétérogénéité ou la complexité des tissus.

Bien que, un inconvénient des modèles DTI et DKI est qu'ils ne sont qu'une représentation du signal de diffusion, qui caractérise le profil probabiliste de déplacement de l'eau, mais n'est pas spécifique à la microstructure6. D'autre part, le modèle d'intégrité des voies de la matière blanche basé sur le tenseur de kurtose est une technique de cartographie microstructurale qui intègre des informations biologiques a priori (hypothèses) dans le modèle18. Il attribue le signal de diffusion aux compartiments tissulaires et peut évaluer plus directement les attributs biologiques. Ces modèles biophysiques peuvent donc offrir de nouvelles informations pour décrire les anomalies après mTBI et surmonter cette question de non-spécificité6. À l'aide de ces trois modèles différents, les altérations microstructurales et les processus biologiques ont pu être visualisés plus en détail en suivant l'ITMT, notamment en utilisant le modèle de baisse de poids de Marmarou.

Le modèle de chute de poids Marmarou est facile à utiliser et ne nécessite qu'une intervention mineure; cependant, un deuxième expérimentateur est recommandé de déplacer le rat loin du tube de verre immédiatement après le premier impact pour éviter un deuxième. En outre, il est parfois nécessaire d'aider le rat à retrouver son réflexe respiratoire après l'impact. Le protocole d'IRM assez long, avec un temps d'acquisition total d'environ 80 min, est bien toléré par les rats fictifs et mTBI. Bien que, pendant la numérisation, il est important de surveiller le cycle respiratoire et d'ajuster l'anesthésie si l'animal dort trop profondément ou légèrement. Il est également important de garder l'animal au chaud pendant et après l'acquisition jusqu'à ce que le rat soit complètement éveillé pour éviter l'hypothermie.

Dans l'IRM de diffusion avancée, les artefacts de mouvement doivent être évités autant que possible. Une solution simple pour réduire le mouvement pendant la numérisation est de faire usage d'une barre de dents et de fixer la tête avec un petit morceau de ruban adhésif ou deux barres d'oreille, si disponible. Cela garantit que la tête ne se déplacera pas de haut en bas chaque fois que le rat prend une respiration.

À l'aide de protocoles d'IRM de diffusion avancée, les images acquises doivent passer par plusieurs étapes de traitement (pré-), principalement à l'aide de différents outils logiciels, avant de pouvoir être utilisées pour une analyse plus approfondie. Un inconvénient de l'utilisation de différents outils logiciels pour traiter les images pondérées en fonction de la diffusion est que (souvent) chaque outil utilise son propre format de données pour encoder le tableau des directions de gradient. MRtrix3 stocke les informations de gradient avec l'image pondérée en fonction de la diffusion dans un fichier .mif, tandis que ExploreDTI utilise un fichier séparé (matrice B) pour stocker les directions de gradient. Par conséquent, il est important de vérifier que les directions de gradient sont correctement transférées de MRtrix3 à ExploreDTI. Cela peut être fait en vérifiant que l'encodage des couleurs est correct sur les images FA codées par couleur [c.-à-d., direction gauche-droite en rouge (p. ex. corpus callosum), direction antérieure-postérieure en vert, et direction inférieure supérieure en bleu (p. ex., cingulum)]. Les images FA codées en couleur peuvent également être utilisées pour vérifier la qualité du processus de co-enregistrement non rigide entre les images pondérées en fonction de la diffusion et les images structurelles pondérées par Le T2.

À l'aide de ExploreDTI, des cartes paramétriques ont été extraites à l'aide des modèles DTI, DKI et WMTI. Le modèle DTI a fourni des cartes paramétriques pour MD, AD, RD et FA, tandis que le modèle DKI fournit des cartes paramétriques pour MK, AK et RK. Bien que quatre mesures du modèle WMTI aient été calculées (c.-à-d. AWF, AxEAD, RadEAD, TORT), il n'a pas été possible d'extraire la diffusion intra-axonale (DIA) au sein de ExploreDTI. La SAI peut être obtenue à l'aide d'un outil MATLAB fourni par les développeurs du modèle WMTI25. Pour ce faire, les images pondérées en fonction de la diffusion et les informations de gradient doivent être transférées à nouveau de ExploreDTI à Matlab. Cette étape est à nouveau sujette à des erreurs concernant l'encodage des informations de gradient. En outre, le tenseur de kurtose et les paramètres WMTI doivent être estimés et calculés à nouveau.

Le prétraitement des images acquises, l'estimation des tenseurs et le calcul des cartes paramétriques nécessitent une longue période de calcul. Corrections pour EPI, le mouvement, et le courant de remous requis 40 min par jeu de données sur un serveur avec huit cœurs et 16 Go de RAM. À l'aide d'une analyse du retour sur investissement, les valeurs moyennes dans l'hippocampe ont été calculées avant et 1 jour après l'impact. Les changements dans les mesures DTI, DKI et WMTI ont ensuite été quantifiés dans le groupe mTBI. Cependant, dans les mesures DKI et AWF du modèle WMTI, une grande variabilité inter-sujets a été observée, ce qui a entraîné une différence inattendue dans les valeurs de base entre les groupes fictifs et mTBI. C'est probablement le résultat de voxels contenant des valeurs biologiquement invraisemblables (aberrantes) dans la région étudiée et peuvent être filtrés dans des études futures avant le calcul des valeurs moyennes dans Amide.

En conclusion, ce protocole démontre la faisabilité de l'IRM de diffusion avancée pour étudier et quantifier des altérations microstructurales dans l'hippocampe dans un modèle de rat de mTBI. À l'aide de trois modèles de diffusion différents, des informations complémentaires peuvent être obtenues sur les processus biologiques sous-jacents qui contribuent aux conditions après l'ITM. Il s'agit d'un pas en avant dans le développement de biomarqueurs pour l'ITMT qui peuvent être suffisamment sensibles pour identifier des changements microstructuraux spécifiques dans la phase initiale après un impact doux.

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Disclosures

Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs souhaitent remercier la Fondation de la Recherche - Flandre (FWO) pour son soutien à ce travail (numéro de subvention: G027815N).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Induction of trauma
0.9% NaCl physiologic solution B Braun 394496
brass weight 450g custom made custom made diamter 18mm and 210 mm height
catheter Terumo Versatus-W 26G
ethilon II Ethicon EH7824 FS-3, 4-0, 3/8, 16mm
Matrass Foam to Size Type E
Plexiglas tube ISPA Plastics 416564 M1 PMMA XT GOO tube 25x19 mm (inner diamter 19 mm, minimal length of 1.50 m)
Preclinical CT scanner Molecubes X-cube
Steel helmet custom made custom made diameter 10 mm and 3 mm thickness
Vetbond Tissue Adhesive 3M 1469SB
Vetergesic (buprenorphin) EcuPhar VETERG20 0.05 mk/kg
Xylocaine 2% gel AstraZeneca Xylocaine 2% gel
Xylocaine (lidocain 2%) Aspen/AstraZeneca Xylocaine 2% gel 100 μl injection
Diffusion MRI
Preclinical MRI acquisition software Bruker Biospin MRI GmbH Z400_PV51_CENTOS55 ParaVision 5.1 MRI software
Preclinical MRI scanner Bruker Biospin MRI GmbH PharmaScan 70/16 7T MRI scanner
Quadrature volume coil Bruker Biospin MRI GmbH RF RES 300 1H 075/040 QSN TR Model No: 1P T13161C3
Small animal physiological monitoring unit Rapid Biomedical EKGHR02-0571-043C01 Unit for respiratory monitoring
Water-based heating unit Thermo Fisher Scientific Haake S 5P Model No: 1523051
Anaesthesia
Anaesthesia movable unit Veterenary technics BDO - Medipass, Ijmuiden
isoflurane: Isoflo Zoetis B506
Oxygen generator Veterenary technics 7F-3 BDO - Medipass, Ijmuiden
Diffusion image processing
Amide http://amide.sourceforge.net Version 1.0.5. Medical Imaging Data Examiner Toolbox (Loening AM, Gambhir SS, " AMIDE: A Free Software Tool for Multimodality Medical Image Analysis", Molecular Imaging, 2(3):131-137, 2003)
ExploreDTI http://www.exploredti.com Version 4.8.6 Toolbox for (pre-)processing and analysis of diffusion weighted MR images (Leemans A, Jeurissen B, Sijbers J, and Jones DK. ExploreDTI: a graphical toolbox for processing, analyzing, and visualizing diffusion MR data. In: 17th Annual Meeting of Intl Soc Mag Reson Med, p. 3537, Hawaii, USA, 2009)
MRtrix3 http://www.mrtrix.org Version 3.0_RC3-86-g4b523b41 Toolbox for (pre-)processing and analysis of diffusion weighted MR images

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References

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Neurosciences Numéro 150 lésions cérébrales traumatiques imagerie par résonance agnetique imagerie par tenseur de diffusion préclinique rat hippocampe
Imagerie avancée de diffusion dans l'hippocampe des rats avec la blessure cérébrale traumatique douce
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Braeckman, K., Descamps, B., Vanhove, C. Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (150), e60012, doi:10.3791/60012 (2019).

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