Summary
Det overordnede målet med denne prosedyren er å få kvantitativ mikrostrukturelle informasjon av hippocampus i en rotte med mild traumatisk hjerneskade. Dette gjøres ved hjelp av en avansert diffusjon vektet magnetisk resonans imaging protokoll og region-av-interesse basert analyse av parametrisk diffusjon kart.
Abstract
Mild traumatisk hjerneskade (mTBI) er den vanligste typen ervervet hjerneskade. Siden pasienter med traumatisk hjerneskade viser en enorm variasjon og heterogenitet (alder, kjønn, type traumer, andre mulige patologi, etc.), dyremodeller spille en nøkkelrolle i unraveling faktorer som er begrensninger i klinisk forskning. De gir en standardisert og kontrollert innstilling for å undersøke de biologiske mekanismene for skade og reparasjon etter TBI. Imidlertid, ikke alle dyr modeller etterligne det diffus og subtil art av mTBI effektivt. For eksempel, det vanligvis anvendt kontrollert kortikale innvirkningen (CCI) og sidelengs Fluid rytme skaden (LFPI) modeller gjøre bruk av en kraniotomi å avsløre hjernen og indusere alminnelig fokal Trauma, hvilke er ikke vanligvis sett inne mTBI. Derfor er disse eksperimentelle modeller er ikke gyldige å etterligne mTBI. Således bør en passende modell brukes til å undersøke mTBI. Marmarou vekt dråpe modell for rotter induserer liknende mikrostrukturelle forandringer og kognitive hemninger som sett hos pasienter som oppholder milde traumer; Derfor ble denne modellen valgt for denne protokollen. Konvensjonelle beregnede tomografi og magnetisk resonans imaging (MRI) skanner vanligvis viser ingen skade etter en mild skade, fordi mTBI induserer ofte bare subtile og diffuse skader. Med diffusjon vektet Mr, er det mulig å undersøke mikrostrukturelle egenskaper av hjernevev, som kan gi mer innsikt i mikroskopiske endringer etter milde traumer. Målet med denne studien er derfor å få kvantitativ informasjon om en utvalgt region av interesse (dvs. hippocampus) for å følge opp sykdomsprogresjon etter å ha oppnådd en mild og diffus hjerneskade.
Introduction
Traumatisk hjerneskade (TBI) har fått mer oppmerksomhet de siste årene, da det har blitt klart at disse hjerne skader kan føre til livslang kognitive, fysiske, følelsesmessige og sosiale konsekvenser1. Til tross for denne økende bevisstheten, milde TBI (mTBI, eller hjernerystelse) er fortsatt ofte underrapportert og udiagnostisert. MTBI har blitt referert til som en stille epidemi, og individer med en historie med mTBI viser høyere forekomst av rusmisbruk eller psykiatriske problemer2. Flere pasienter med mTBI gå udiagnostisert hvert år på grunn av diffus og subtil karakter av skadene, som ofte ikke er synlige på konvensjonelle beregnede tomografi (CT) eller magnetisk resonans imaging (MRI) skanner. Denne mangelen på radiologiske bevis på hjerneskade har ført til utvikling av mer avanserte Imaging teknikker som diffusjon Mr, som er mer følsomme for mikrostrukturelle endringer3.
Diffusion MRI tillater in vivo kartlegging av mikrostruktur, og denne MRI teknikken har blitt brukt mye i TBI studier4,5,6. Fra diffusjon tensor, brøk anisotropien (FA) og Mean diffusivity (MD) er beregnet å kvantifisere endring i mikrostrukturelle organisasjonen etter skade. Nylige anmeldelser i mTBI pasienter rapporterer økning i FA og nedgang i MD etter skade, som kan være en indikasjon på axonal hevelse7. I motsetning, øker i MD og avtar i FA er også funnet og har blitt foreslått å ligger til grunn forstyrrelser i parenkymatøs struktur etter ødem dannelse, axonal degenerasjon, eller fiber forskyvning/avbrudd8. Disse blandede funnene kan delvis forklares av den betydelige kliniske heterogenitet av mTBI forårsaket av ulike typer av effekt og alvorlighetsgrad (f. eks, rotasjon-akselerasjon, stump kraft traumer, blast skade eller kombinasjon av den tidligere). Men for tiden er det ingen klar enighet om underliggende patologi og biologisk/Cellular basis underbygger endringer i mikrostrukturelle organisasjonen.
Dyremodeller gir en standardisert og kontrollert innstilling for å undersøke biologiske mekanismer for skade og reparasjon etter TBI i større detalj. Flere eksperimentelle modeller for TBI har blitt utviklet og representerer ulike aspekter av menneskelig TBI (f. eks, fokal g. diffuse traumer eller traumer forårsaket av rotasjons krefter)9,10. Brukte dyremodeller inkluderer kontrollerte kortikale Impact (CCI) og lateral flytende perkusjon skade (LFPI) modeller11,12. Selv om de eksperimentelle parametrene kan være godt kontrollert, disse modellene gjøre bruk av en kraniotomi å utsette hjernen. Craniotomies eller hodeskallen er ikke allment sett i mTBI; Derfor er disse eksperimentelle modellene ikke er gyldige å etterligne mTBI. Virkningen akselerasjon modell utviklet av Marmarou et al.13 gjør bruk av en vekt som er droppet fra en viss høyde på rotte hode, som er beskyttet av en hjelm. Denne dyre modellen induserer lignende mikrostrukturelle forandringer og kognitive hemninger som sett hos pasienter som oppholder milde traumer. Derfor er denne Marmarou vekt slipp modellen hensiktsmessig for å undersøke Imaging biomarkører for diffus mTBI14,15.
Denne rapporten demonstrerer anvendelsen av avansert diffusjon MRI i en mTBI rotte modell ved hjelp av Marmarou vekt slipp modell. Først vist er hvordan man skal indusere en mild og diffus traumer, og analyse ved hjelp av diffusjon tensor Imaging (DTI) modellen er så gitt. Spesifikk biologisk informasjon er innhentet med bruk av mer avanserte diffusjon modeller [dvs. diffusjon kurtosis Imaging (DKI) og hvit materie tarmkanalen integritet (WMTI) modell]. Nærmere bestemt er milde traumer påført og mikrostrukturelle endringer blir deretter evaluert i hippocampus bruke konvensjonelle T2-vektet MRI og en avansert diffusjon Imaging protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen er godkjent av dyreetikk komitéen ved Universitetet i Gent (ECD 15/44Aanv), og alle eksperimenter ble utført i samsvar med retningslinjene i Europakommisjonen (direktiv 2010/63/EU).
1. Animal forberedelse og hjelm vedlegg
- Veie en kvinnelig Wistar H rotte (± 250 g eller 12 ukers alder) og bedøve i en liten induksjon kammer fylt med en blanding av isoflurane (5%) og O2 i minst 1 min.
- Injiser rotte med 0,05 mg/kg buprenorfin subkutant i nakken, returner den til hjem buret, og la forkjøps analgesi i minst 30 minutter for å ta en effekt.
Merk: under 30 min vent, kan operasjonsstedet være forberedt. - Plasser en varmepute holdt på 37 ° c under operasjonsfeltet. Plasser de sterilisert kirurgiske instrumentene på det kirurgiske feltet som ble desinfiseres med 70% etanol.
- Sted rotta rygg inne det induksjon kammeret og bedøve rotta til det er en ingen-forståelsesfull å en pote eller hale hugge.
- Plasser rotte på operasjonsfeltet og sette inn et kateter i lateral hale vene. Neste, barbere rotta ' leder, fjerne overmål fur og desinfisere hodebunnen og hvilepausen av det inngrep område med chlorohexidine.
- Injiser 100 μL av 2% lidokain lokalt i hodebunnen.
- Lag en midtlinjen snitt ved hjelp av en skalpell størrelse 11 for å utsette skallen, fjerne eventuelle overflødig membraner med liten saks. Trekk tilbake huden med et øye med en maksimal spredning på 1 cm. I tillegg fjerner du periosteum ved forsiktig å gni en steril bomulls knopp over skallen til periosteum ikke lenger er til stede.
- Sett en dråpe vev lim på skallen og en på sterilisert metallisk plate (diameter på 10 mm og 3 mm tykkelse), som fungerer som hjelmen. Limplaten omtrent en tredjedel før og to tredjedeler bak bregma. La limet tørke i 1 min.
2. induksjon av traumatisk hjerneskade (TBI)
- Plasser rotta på den skreddersydde sengen med en skum mattress av visse våren konstant (se tabell over materialer). Plasser rotta direkte under et gjennomsiktig plastrør med en 450 g messing vekt med hjelmen så horisontal som mulig. Løsne rotte fra anestesi.
- Trekk vekten opp til 1 m og slipp når den er klar. Sikre det en andre eksperimentator er gave å bevege rotta fjerne fra plasten rør like etter innvirkningen å forhindre en andre innvirkningen.
Merk: humbug skadde rotter får samme eksperimentelle prosedyre (trinn 1.1-2.7), med unntak av trinn 2,2. - Re-feste rotte til anestesi og injisere 1 mL fysiologisk oppløsning (0,9% NaCl) via kateteret for å redusere hemodynamisk sjokk.
Merk: det er mulig at rotte kort slutter å puste på grunn av virkningen. Forsiktig omslag thorax hvis rotta er ikke spontan puste etter 2 s å oppmuntre det åndedrag refleks. - Ta av hjelmen ved å trekke den forsiktig ut av skallen. Fjern eventuelle gjenværende lim fra skallen og huden og Lukk snittet med kirurgiske Sutur. Påfør lokal analgesi gel ved hjelp av en steril applikator tupp.
- Plasser rotte på sengen av CT skanneren. Bekreft riktig posisjon ved hjelp av en speider skanning. Juster synsfeltet for å muliggjøre bildebehandling av hele hodet i en seng posisjon. Administrere en generell hensikt, lav dose CT Skann å utelukke skallen frakturer.
Merk: Skull brudd er en criterium for døds aktiv. - Plasser rotta i et rent bur på en varmepute (37 ° c). Overvåk tiden for å gjenvinne bevisstheten. En gang rotta er kjøpedyktig sitte oppreist, rotta kan kommet tilbake å hjemmet bur.
- Administrer en ny dose på 0,05 mg/kg buprenorfin en dag etter TBI induksjon.
3. Diffusion magnetisk resonans imaging (MRI)
Merk: diffusjon-vektet bildebehandling er utført før og 1 dag etter traume induksjon.
- Bedøve rotta i en liten induksjon kammer fylt med en blanding av isoflurane (5%) og O2. Når rotta er ingen-forståelsesfull å en pote eller hale hugge nedskrive anestesi å 2% med en flyte rate av 500 mL/min. Overfør dyret til skanner sengen i første liggende posisjon.
- Plasser rotte i hodet holderen med tennene bar og nese kjegle, levere anestesi, og skyv hodet forover til midten av hjernen er på nivå med midten av Quadrature volum Mr coil. Påfør smøre salve på øynene i små mengder for å forhindre skade på hornhinnen. Fixate hodet med et lite stykke tape for å unngå bevegelse under skanning.
- Sted en trykk pute under det thorax av rotta å dataskjerm åndedrett og dekket rotta med en circulating hjertelig vann oppvarming teppe og boble vikle å oppbevare rotta hjertelig. Før skanningen må du kontrollere respirasjons skjermen for å sikre at signalet er klart uten støy, og at respirasjons syklusen er konsistent. Flytt om nødvendig på trykk puten.
Merk: respirasjonsfrekvensen bør holdes mellom 1 pust per 1200 – 1700 MS ved å justere nivået av anestesi mellom 1% – 2%. - Skyv den Quadrature volum spolen over hodet. Juster tuning og matchende kondensatorer av spolen til riktig frekvens og impedans i henhold til instruksjonene fra coil leverandøren. Før skanneren sengen inn i skanneren bore for å starte skanning.
- Skaff en standard tre-Plane speider skanning ("tripilot") for å sikre riktig posisjonering.
- Last tripilot sekvensen inn i Scan Control ved å klikke på ny skanning og velge tripilot sekvensen fra protokoll listen. Deretter klikker du på trafikklys knappen for å starte skanningen.
- Når skanningen er ferdig, Last skanningen i bildet displayet og sørge for at 1) hodet er liggende rett og 2) hjernen er plassert i midten av magnet og coil. Juster posisjonen til hodet og/eller skannerens seng, om nødvendig, og Skaff deg en ny tripilot skanning.
- Juster det lokale magnetfeltet ved hjelp av en automatisert shimming protokoll for andre ordre: Last inn protokollen for andre ordre SHIM i skannings kontrollen som beskrevet i trinn 3.5.1. Deretter klikker du på Acq kategorien | Gjeldende justeringer | Metode spesifikk justering for den lokale felt homogenitet i vinduet spektrometer Control Tool for å starte automatiserte shimming.
- Last inn en ny T2 Rapid Imaging med refocused ekko (RARE) sekvens i Scan-kontrollen som beskrevet i trinn 3.5.1.
- Skaff T2 vektet bilder ved hjelp av standardinnstillingene, bortsett fra følgende parametere:
- Åpne kategorien Rediger skanning og Juster repetisjons tiden (TR) og ekko tiden (te) til henholdsvis 5 500 ms og 37 MS. Også endre synsfeltet og matrise størrelse for å muliggjøre en høyere in-plane oppløsning på 109 μm x 109 μm (standard oppløsning = 156 μm x 156 μm). Kontroller at Slice tykkelse er 600 μm, antall skiver er satt til 45, og sjelden faktor er satt til 8.
- Åpne geometri editoren og plasser Slice-pakken i riktig posisjon, inkludert bulbus av hjernen og lillehjernen.
- Load tre nye ekko-Planar diffusjon-vektet spin-Echo sekvens (DtiEpi) fra B_DIFFUSION mappen i Scan Control protokollen som beskrevet i trinn 3.5.1.
Merk: ved hjelp av tre ulike diffusjon "shells", den Diffusion tensor Imaging (DTI) modell4,16, diffusjon kurtosis Imaging (DKI) modell17, og hvit materie tarmkanal integritet (WMTI) modell18 kan alle anslås. Det anbefales å bruke minst tre forskjellige b-verdier, med den høyeste b-verdien har maksimalt 3000 s/mm2 med minst 15 jevnt fordelte retninger per bilde skall17.- Skaff deg diffusjon vektet bilder (DWIs) ved hjelp av standardinnstillinger, bortsett fra følgende innstillinger:
- Åpne fanen Rediger skanning og juster de geometriske parametrene under geometri -fanen. Juster synsfeltet og matrise størrelsen til 105 x 105 for å sikre en oppløsning på 333 μm x 333 μm.
- Sett Slice orientering til aksial og antall skiver til 25, noe som resulterer i en skive tykkelse på 500 μm og interslice avstand på 600 μm. Endre avlesning retning i venstre-høyre.
- Klikk kategorien kontrast for å justere ekko tiden til 24 MS og repetisjon tid til 6 250 MS.
- Sett båndbredde til 250 000 Hz og slå fettet undertrykkelse på. Juster antall gjennomsnitt til en.
- Klikk på kategorien forskning og endre antall gjennomsnitt (Epi segmenter) til 4.
- Klikk på Diffusion kategorien i forskningen kategorien. Utfør dette trinnet separat for hver av de tre diffusjon skjell.
- Juster antall diffusjon retninger til 32 for første skallet, 46 for det andre skallet, og 64 for den tredje skallet.
- Juster gradient retninger med tilpassede gradient retninger filer.
- Endre antallet av B0 profilen å 5 for det for det første skall, 5 for sekundet skall, og 7 for det tredje skall.
- Juster b-verdien per retning til 800 s/mm2 for det første skallet, 1500 s/mm2 for det andre skallet, og 2000 s/mm2 for det tredje skallet.
Merk: justering av gradient retninger med en egendefinert gradient retninger fil kan gjøres manuelt ved å sette Angi Diffusion veibeskrivelse til Ja eller automatisk ved hjelp av DTI_SET_DIRECTIONS makro.
- Åpne geometri-editoren og plasser synsfeltet mellom bulbus og lillehjernen som bare inneholder cerebrum for å redusere artefakter og skannetid. Plasser seks metnings bånd på 5 mm utenfor hjernen for å redusere artefakter ved å klikke på metning og skyve båndene i foretrukket posisjon ved hjelp av rullefeltene.
Merk: bulbus og lillehjernen kan identifiseres basert på anatomiske landemerker og de tre bildene av tripilot skanningen.
- Skaff de importerte sekvensene ved å klikke på symbolet for trafikklys . Ved hjelp av innstillingene for parametrene som er beskrevet ovenfor, er oppkjøpet tiden av T2-SJELDNE Scan 12 min, av den første DWI skallet 15 min, av den andre DWI skallet 21 min og av det tredje skallet 30 min. Den totale anskaffelses tiden er ca. 80 min (på et enkelt mottaker kanalsystem).
- For avslutningen av skanningen protokollen, fjerne det dyr fra det skanner seng, og sted dyret inne en feilfri bur med en varmer pute for 37 ° c. Returner dyret til hjemmet buret når det gjenvinner bevisstheten.
4. bildebehandling
Merk: i de følgende avsnittene er behandlingen av diffusjon bildene beskrevet i MRtrix3, ExploreDTI19 og amid programvare20 som er Open Access verktøykasser. Imidlertid kan forbehandling trinnene utføres i andre verktøykasser (f. eks, FSL, MedInria, DTIStudio).
- Overfør de hentede dataene fra anskaffelses konsollen ved å eksportere 2dseq-filen.
- Konverter 2dseq filer (rå DWI filer) inn i. MIF format, som er standard formatering av MRtrix3, for å muliggjøre ytterligere forbehandling trinn i MRtrix3. Videre sammenkoble de tre diffusjon skjell ved hjelp av følgende kommandoer i skallet:
convert_bruker pData/1/2dseq ratID_T2. Mih (for T2-vektet bilder)
convert_bruker pData/1/2dseq ratID_dwi1. Mih (for første diffusjon skallet)
convert_bruker pData/1/2dseq ratID_dwi2. Mih (for andre diffusjon skallet)
convert_bruker pData/1/2dseq ratID_dwi3. Mih (for tredje diffusjon skallet)
mrcat for ratID_dwi1. MIF ratID_dwi2. MIF ratID_dwi3. MIF ratID_dwi. MIF - Utføre støy korreksjon og Gibbs ringing korreksjon på DWIs i MRtrix321,22. Også konvertere korrigert DWI bilder og T2 bildet til NIFTI format ved hjelp av følgende kommandoer:
dwidenoise for ratID_dwi. MIF ratID_dwi_denoised. MIF
mrdegibbs for ratID_dwi_denoised. MIF ratID_dwi_denoised_gr. MIF
mrconvert for ratID_dwi_denoised_gr. MIF ratID. NII
mrconvert for ratID_T2. MIF ratID_T2. NII - Utfør korreksjon for EPI, bevegelse og Eddy gjeldende forvrengninger i ExploreDTI:
- Konverter NIFTI-bildene til en. mat-fil ved å klikke BEREGN DTI*. mat-fil | Konverter rådata til DTI*. mat-fil. Endre diffusjon tensor estimering til veide lineær og b-verdi til NaN. Juster Voxel størrelse til 0,333 0,333 0,6, antall ikke-DWI bilder til 17, antall DWI bilder til 142, og matrise størrelse til 105 105 25.
Merk: ved å sette b-verdien til NaN, vil ExploreDTI betrakte datasettet som et kurtosis datasett. - Klikk på Innstillinger kategorien for å justere innstillingene for Epi korreksjon (dette er slått av som standard). Velg SM/EC/Epi korreksjon, også registrere deg til andre data? og klikk på Ja, for å gjøre Epi korreksjon (ikke-rigid). Angi suffikset for det anatomiske T2-bildet som tilsvarer sprednings datasettet.
Merk: ExploreDTI korrigerer for EPI forvrengninger ved hjelp av bilde registrering mellom jevne anatomiske bildet og diffusjon bildet. - Klikk på plugins kategorien og velg korreksjon for FAGET bevegelse & EC/Epi forvrengninger og velg preprocessed diffusjon datafilen fra trinn 2,3. Kontroller at T2-bildet er i samme mappe og har samme base som diffusjon datafilnavnet (for eksempel rat1. NII for DWI og rat1_T2. NII for det anatomiske bildet). Dette trinnet vil generere en "native" (* Native. mat) og "transformert" fil (* trafo. mat).
- Konverter NIFTI-bildene til en. mat-fil ved å klikke BEREGN DTI*. mat-fil | Konverter rådata til DTI*. mat-fil. Endre diffusjon tensor estimering til veide lineær og b-verdi til NaN. Juster Voxel størrelse til 0,333 0,333 0,6, antall ikke-DWI bilder til 17, antall DWI bilder til 142, og matrise størrelse til 105 105 25.
- Beregn det DTI metrisk for hver rotten av klikker plugg og eksport ting å *. NII og velge de parametriske kartene av DTI modell: brøk anisotropien (FA), mener diffusivity (MD), radial diffusivity (RD), og aksial diffusivity (ad; betegnet som "største eigenvalue L1").
- I tillegg eksportere de parametriske kartene for kurtosis-modellen (MK, AK, og RK) og WMTI-modellen (AWF, AxEAD, RadEAD og TORT). Behandling av Diffusion bilder vil resultere i 12 parametriske kart (figur 1, figur 2, Figur 3) som kan brukes for videre mikrostrukturelle analyse.
- Opprette en maske Arkiv for hippocampus av hver rotten benytter MRtrix3.
- Belaste det FA image av rotta inne det MRtrix seer av klikker verktøyet og ROI Editor.
- Opprett en ny ROI ved å klikke på "+" -knappen og trykk EDIT for å trekke avkastningen på hver skive som inkluderer hippocampus (Figur 4). Hvis du vil slette uønskede områder fra AVKASTNINGEN, trykker du høyre museknapp.
- Når tegningen av AVKASTNINGEN er fullført, lagrer du maske bildet ved å klikke på Lagre -knappen.
Merk: denne masken filen vil være en binær NIFTI bildefil med voxels av verdi 1 som inneholder hippocampus vev, og resterende voxels vil ha verdier på 0. For å standardisere regionen av hippocampus på tvers av rotter, kan de parametriske kartene være co-registrert med en studie bestemt mal med forhåndsdefinerte områder av interesse avgrenset23 eller en rotte hjernen Atlas.
- For å trekke ut diffusjon beregningene av hippocampus på rotte, bruk opprettet masken filen i trinn 4,6 og åpne amid programvare.
- Åpne de parametriske kartene og maske bildet av rotta.
- Hvis du vil legge til AVKASTNINGEN for maske filen i amid, velger du maske fil bildet og klikker Rediger | Legg til ROI | 3D-Isocontour og klikk på avkastningen som vises i maske bildet. Gi AVKASTNINGEN et meningsfullt navn, og Bekreft at dette volumet bare skal inneholde voxels som har en verdi på ett.
- For å beregne gjennomsnittet verdier av diffusjon beregningene i hippocampus, klikk verktøy | Beregn AVKASTNINGEN statistikk og angi bilder og avkastningen som skal inkluderes. Etter å ha klikket Execute, en annen skjerm vil dukke opp med beregnede verdier som kan brukes for videre statistisk analyse. Denne filen kan enten lagres eller kopieres til et foretrukket data format (for eksempel XLSX eller CSV-fil).
5. statistisk analyse
Merk: i de følgende avsnittene beskriver vi behandling av diffusjon bilder i SPSS statistikk 24; den statistiske analysen kan imidlertid utføres i andre statistiske verktøykasser.
- Last inn dataene i det brede formatet i en SPSS *. sav fil.
- Hvis du vil teste om det er statistiske forskjeller mellom de to gruppene for hver timepoint (dvs. baseline eller 1-dagers etter skade), klikker du analyser | Parametriske tester | Eldre dialoger | 2 uavhengige prøver tester. Belaste det variabler det nød å bli testet og angir nærmere gruppene (i.e., TBI og humbug holdene). Angi mann-Whitney U som test type.
- Hvis du vil teste om det finnes statistiske forskjeller mellom de to tids punktene i hver gruppe, må datafilen deles. Gå til gå til data, Split fil og angi Sammenlign grupper. Deretter klikker du på analyser, parametriske tester, Legacy dialoger, 2 relaterte samples tester, laste variablene som må sammenlignes og indikere Wilcoxon som test type.
Merk: for å korrigere for flere sammenligninger, p-verdier er justert for hver diffusjon modell ved hjelp av Bonferroni korreksjon [dvs., p-verdi delt på antall parametere sammenlignet (DTI 4, DKI 3, og WMTI 4)]. Mer spesifikt, er p < 0,0125 anses viktig for DTI og WMTI modeller, og p < 0,016 anses viktig for DKI modellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I studien, alle TBI rotter (n = 10) overlevde virkningen og var i stand til å gjenopprette fra virkningen og anestesi innen 15 min etter avløsning fra anestesi23. På CT-bildene, var det ingen bevis på skallen frakturer og T2 bildene ikke viser noen unormalt som blødning, forstørret ventriklene, eller ødem dannelse på kontusjon stedet 1 dag etter traumer (figur 5). Dermed, basert på disse visuelle inspeksjoner av anatomiske bilder, store fokal lesjoner ble ikke oppdaget, bekrefter diffus og mild natur skaden.
Kvaliteten på coregistration (ikke-rigid) trinn mellom T2-bildet og Diffusion datasettet (trinn 4,4) ble undersøkt ved å legge til en overlapping av T2-bildet til det farge kodede FA-kartet (figur 6). Deretter ble de parametriske kartene FA, MD, AD og RD beregnet (figur 1) og lastet inn i amid-programvaren. Basert på aktiva-kartet ble det trukket en ROI med hippocampus strukturen (Figur 4). Statistiske verdier av diffusjon beregningene ble beregnet gjennomsnitt over alle voxels innenfor regionen av interesse og gjennomsnittet verdier for hver DTI beregning ble eksportert for videre analyse. En annen kvalitetskontroll av diffusjon data kan utføres ved å inspisere outliers i DTI beregningene. For eksempel bør FA-verdier i hippocampus være rundt 0,15; Derfor, verdier av < 0.10 (betegner isotropic diffusjon) eller > 0.30 (verdier er sett i hvit materie) kan betraktes som biologisk usannsynlig verdier. Disse datapoints bør avvises fra videre analyse. Også gjennomsnittet verdier for AK, RK, og MK av diffusjon kurtosis modellen samt AWF, AxEAD, RadEAD og TORT av WMTI modellen ble beregnet (figur 2, Figur 3).
I vår studie, analyse av DTI beregninger avdekket betydelige økte FA verdier (p = 0,007), og redusert diffusivity verdier (MD og RD) (p = 0,007 og p = 0,007, henholdsvis) etter påvirkning i mTBI gruppen (figur 7). Disse reduksjoner i RD og MD var signifikant forskjellig fra humbug gruppen (p = 0,005 og p = 0,004, henholdsvis). Diffusion kurtosis beregninger viste en betydelig nedgang i RK (p = 0,005) etter påvirkning, men ingen endringer i AK eller MK (Figur 8). Bruk av WMTI-modellen, RadEAD (p = 0,007) og TORT (p = 0,007) viste en betydelig reduksjon og økning, henholdsvis i mTBI-gruppen 1 dag etter virkningen (figur 9C, D). Verdiene i humbug-gruppen viste ingen vesentlige endringer.
Figur 1: representative parametriske kart for brøk anisotropien (FA), gjennomsnittlig diffusivity (MD), aksial diffusivity (AD) og radial diffusivity (RD). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representative parametriske kart for gjennomsnittlig kurtosis (MK), aksial kurtosis (AK) og radial kurtosis (RK). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representative parametriske kart for axonal vann brøkdel (AWF), aksial-og radial ekstra axonal diffusivity (AxEAD, RadEAD) og tortuosity (tort). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: opprette en maske i MRtrix3. En ROI trekkes rundt hippocampus på alle skiver som inneholder volumet av hippocampus, og volumet er lagret som en maske fil. Dette kan enten gjøres for hver rotte enkeltvis eller ved hjelp av en studie bestemt mal maske fil som hver av de parametriske kartene kan være co-registrert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: CT og T2 vektet bilder av en representant mTBI dyr 1 dag etter påvirkning. CT-bilder (øverste rad) viser ikke noen skallen frakturer. På T2-vektet bilder (nederste rad) ingen blødning, forstørret ventriklene, eller ødem formasjon ble demonstrert. Av notatet, ødem formasjonen er godt synlig som et hyperintense område rundt såret området fra kirurgisk inngrep. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: farge kodet FA kart over diffusjon datasett kledde med anatomiske bildet etter korreksjon for Epi, bevegelse, og Eddy gjeldende korreksjon i ExploreDTI. Vist er en dårlig korreksjon og co-registrering på venstre og gode eksempler til høyre. Det bør sikres at fargekodingen er korrekt: venstre-høyre-retning i rødt (f. eks, corpus callosum), fremre bakre retning i grønt og dårligere-overlegen retning i blått (f.eks. cingulum). I tillegg bør farge-kodet FA bildet være perfekt på linje med den anatomiske bildet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: endringer i diffusjon tensor beregninger av hippocampus for humbug (n = 10) og mTBI dyr (n = 10). Etter påvirkning var det en betydelig økning i FA (a) og signifikant nedgang i gjennomsnittlig Diffusivity (b) og radial diffusivity (D) i mTBI dyr (b, D). Det ble ikke observert signifikante forskjeller for aksial diffusivity (C) i mTBI rotter. Den humbug dyrene ikke viser noen vesentlige DTI endringer (* p < 0,0125). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: endringer i diffusjon kurtosis beregninger av hippocampus for humbug (n = 10) og mTBI dyr (n = 10). Følgende innvirkning, var det en betydelig nedgang i RK (C) av mTBI dyr, men ingen endringer i AK (B) eller MK (a). Den humbug dyrene ikke viser noen endringer (* p < 0,0166). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9: endringer i hvit materie luftveiene integritet beregninger av hippocampus for humbug (n = 10) og mTBI dyr (n = 10). Etter påvirkning var det en signifikant reduksjon i RadEAD (C) og signifikant økning i tort (D) av mTBI-dyrene, men ingen endring i AWF eller AxEAD (a, B). Den humbug dyrene ikke viser noen endringer (* p < 0,0125). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Siden mTBI ofte er et resultat av en diffus og subtil skade som ikke viser unormalt på CT og konvensjonelle Mr-skanninger, er evalueringen av mikrostrukturelle Kader etter et mildt traume fortsatt en utfordring. Derfor er mer avansert Imaging teknikker som trengs for å visualisere den fulle omfanget av traumer. Anvendelsen av diffusjon magnetisk resonans imaging i TBI forskning har fått mer interesse i løpet av det siste tiåret, hvor diffusjon tensor Imaging er mest brukt5. En begrensning av DTI modellen er forutsetningen av en Gaussian diffusjon prosess som ikke er en presis forutsetning for hjernen mikrostruktur (bestående av et komplekst nettverk av axons og celler med membraner fungerer som barrierer), noe som resulterer i DTI beregninger ikke-spesifikke for den underliggende biologiske mikrostruktur24. Diffusion kurtosis Imaging er en forlengelse av DTI modellen og forsøker å karakterisere graden av ikke-Gaussian diffusjon17. Dette kan gi ytterligere informasjon om vev heterogenitet eller kompleksitet.
Skjønt, en ulempe med DTI og DKI modeller er at de er bare en representasjon av diffusjon signal, som karakteriserer den sannsynlighetsbasert vann forskyvning profil, men er ikke spesifikk for mikrostruktur6. På den annen side, den hvite materie luftveiene integritet modell basert på kurtosis tensor er en mikrostrukturelle kartlegging teknikk som inkorporerer a priori biologisk informasjon (forutsetninger) i modellen18. Det attributtene Diffusion signal til vev rom og kan vurdere biologiske attributter mer direkte. Disse Biofysiske modellene kan dermed tilby ny informasjon for å beskrive unormalt etter mTBI og overvinne denne ikke-spesifisitet problemet6. Ved hjelp av disse tre forskjellige modeller, mikrostrukturelle endringer og biologiske prosesser var i stand til å bli visualisere følgende mTBI i mer detalj, spesielt ved hjelp av Marmarou vekt slipp modell.
Den Marmarou vekt slipp modellen er enkel å bruke og krever bare mindre kirurgi; Imidlertid, en andre eksperimentator anbefales å bevege rotta fjerne fra glasset rør med det samme etter det for det første innvirkningen å unngå en andre ettall. I tillegg er det noen ganger nødvendig å hjelpe rotte gjenvinne sin puste refleks etter virkningen. Den ganske lange MRI-protokollen, med en total anskaffelsestid på rundt 80 min, er godt tolerert av både humbug og mTBI rotter. Skjønt, under skanning, er det viktig å overvåke puste syklus og justere anestesi hvis dyret sover for dypt eller lett. Det er en likeledes betydelig å oppbevare det dyr hjertelig begge to under og etter oppkjøpet til rotta er fullt ut våken å unngå nedkjøling.
I avansert diffusjon Mr, bør bevegelse artefakter unngås så mye som mulig. En enkel løsning for å redusere bevegelse under skanning er å gjøre bruk av en tenner bar og fixate hodet med et lite stykke tape eller to øre barer, hvis tilgjengelig. Denne forsikrer det hodet ville ikke bevege opp og ned hver gang rotta tar en pust.
Ved hjelp av avansert diffusjon MRI-protokoller, må ervervet bildene passere gjennom flere (pre-) behandlingstrinn, hovedsakelig ved hjelp av ulike programvareverktøy, før de kan brukes for videre analyse. En ulempe med å bruke ulike programvareverktøy for å behandle diffusjon-vektet bilder er at (ofte) hvert verktøy bruker sitt eget data format for å kode gradient retninger tabellen. MRtrix3 lagrer gradient informasjon sammen med diffusjon vektet bildet i en. MIF fil, mens ExploreDTI gjør bruk av en egen fil (B-Matrix) for å lagre gradient retninger. Derfor er det viktig å kontrollere at gradient retningene er riktig overført fra MRtrix3 til ExploreDTI. Dette kan gjøres ved å kontrollere at fargekoding er riktig på farge kodet FA bilder [dvs. venstre-høyre retning i rødt (f. eks, corpus callosum), fremre bakre retning i grønt, og dårligere-overlegen retning i blått (f. eks cingulum)]. Fargen kodede FA-bilder kan også brukes til å kontrollere kvaliteten på den ikke-stive co-Registration prosessen mellom diffusjon-vektet bilder og strukturelle T2-vektet bilder.
Bruke ExploreDTI, parametriske kartene ble ekstrahert ved hjelp av DTI, DKI, og WMTI modeller. Den DTI modellen gitt parametriske kart for MD, AD, RD, og FA, mens DKI modellen gir parametriske kart for MK, AK, og RK. Selv om fire beregninger av WMTI-modellen ble beregnet (dvs. AWF, AxEAD, RadEAD, TORT), var det ikke mulig å trekke ut intra-axonal diffusivity (IAD) innen ExploreDTI. IAD kan fås ved hjelp av en MATLAB verktøy levert av utviklerne av WMTI modell25. Hvis du vil gjøre dette, må diffusjon-vektet bilder og gradient informasjon overføres på nytt fra ExploreDTI til MATLAB. Dette trinnet er igjen utsatt for feil når det gjelder koding av gradert informasjon. I tillegg må kurtosis tensor og WMTI-parameterne anslås og beregnes på nytt.
Forbehandling av ervervet bilder, estimering av tensors, og beregning av parametriske kartene krever en lang periode med databehandling tid. Rettelser for EPI, bevegelse, og Eddy strøm kreves ~ 40 min per data satt på en server med åtte kjerner og 16 GB RAM. Ved hjelp av en ROI analyse, gjennomsnittlig verdier innen hippocampus ble beregnet før og 1 dag etter påvirkning. Endringer i DTI, DKI og WMTI beregningene ble deretter kvantifisert i mTBI gruppen. Men i DKI beregninger og AWF av WMTI modellen, store Inter-faget variasjon ble observert, noe som resulterte i en uventet forskjell i Baseline verdier mellom humbug og mTBI grupper. Dette er mest sannsynlig et resultat av voxels som inneholder biologisk usannsynlig verdier (outliers) innenfor det undersøkte området og kan filtreres ut i fremtidige studier før beregningen av middelverdiene i amid.
Som konklusjon, denne protokollen demonstrerer muligheten for avansert diffusjon Mr for å undersøke og kvantifisere mikrostrukturelle endringer i hippocampus i en rotte modell av mTBI. Ved hjelp av tre ulike diffusjon modeller, kan utfyllende informasjon fås om de underliggende biologiske prosesser som bidrar til forholdene etter mTBI. Dette representerer et skritt fremover i utviklingen av biomarkører for mTBI som kan være følsomme nok til å identifisere spesifikke mikrostrukturelle endringer i den tidlige fasen etter mild påvirkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Research Foundation-Flandern (FWO) for å støtte dette arbeidet (Grant nummer: G027815N).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Induction of trauma | |||
| 0.9% NaCl physiologic solution | B Braun | 394496 | |
| brass weight 450g | custom made | custom made | diamter 18mm and 210 mm height |
| catheter | Terumo | Versatus-W | 26G |
| ethilon II | Ethicon | EH7824 | FS-3, 4-0, 3/8, 16mm |
| Matrass | Foam to Size | Type E | |
| Plexiglas tube | ISPA Plastics | 416564 | M1 PMMA XT GOO tube 25x19 mm (inner diamter 19 mm, minimal length of 1.50 m) |
| Preclinical CT scanner | Molecubes | X-cube | |
| Steel helmet | custom made | custom made | diameter 10 mm and 3 mm thickness |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | |
| Vetergesic (buprenorphin) | EcuPhar | VETERG20 | 0.05 mk/kg |
| Xylocaine 2% gel | AstraZeneca | Xylocaine 2% | gel |
| Xylocaine (lidocain 2%) | Aspen/AstraZeneca | Xylocaine 2% gel | 100 μl injection |
| Diffusion MRI | |||
| Preclinical MRI acquisition software | Bruker Biospin MRI GmbH | Z400_PV51_CENTOS55 | ParaVision 5.1 MRI software |
| Preclinical MRI scanner | Bruker Biospin MRI GmbH | PharmaScan 70/16 | 7T MRI scanner |
| Quadrature volume coil | Bruker Biospin MRI GmbH | RF RES 300 1H 075/040 QSN TR | Model No: 1P T13161C3 |
| Small animal physiological monitoring unit | Rapid Biomedical | EKGHR02-0571-043C01 | Unit for respiratory monitoring |
| Water-based heating unit | Thermo Fisher Scientific | Haake S 5P | Model No: 1523051 |
| Anaesthesia | |||
| Anaesthesia movable unit | Veterenary technics | BDO - Medipass, Ijmuiden | |
| isoflurane: Isoflo | Zoetis | B506 | |
| Oxygen generator | Veterenary technics | 7F-3 | BDO - Medipass, Ijmuiden |
| Diffusion image processing | |||
| Amide | http://amide.sourceforge.net | Version 1.0.5. | Medical Imaging Data Examiner Toolbox (Loening AM, Gambhir SS, " AMIDE: A Free Software Tool for Multimodality Medical Image Analysis", Molecular Imaging, 2(3):131-137, 2003) |
| ExploreDTI | http://www.exploredti.com | Version 4.8.6 | Toolbox for (pre-)processing and analysis of diffusion weighted MR images (Leemans A, Jeurissen B, Sijbers J, and Jones DK. ExploreDTI: a graphical toolbox for processing, analyzing, and visualizing diffusion MR data. In: 17th Annual Meeting of Intl Soc Mag Reson Med, p. 3537, Hawaii, USA, 2009) |
| MRtrix3 | http://www.mrtrix.org | Version 3.0_RC3-86-g4b523b41 | Toolbox for (pre-)processing and analysis of diffusion weighted MR images |
References
- Carroll, L. J., et al. Systematic Review of the Prognosis After Mild Traumatic Brain Injury in Adults. Cognitive, Psychiatric, and Mortality Outcomes: Results of the International Collaboration on Mild Traumatic Brain Injury Prognosis. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 95 (3), S152-S173 (2014).
- Buck, P. W. Mild Traumatic Brain Injury: A Silent Epidemic in Our Practices. Health & Social Work. 36 (4), 299-302 (2011).
- Bodanapally, U. K., Sours, C., Zhuo, J., Shanmuganathan, K.
- Basser, P. J., Mattiello, J., LeBihan, D. MR diffusion tensor spectroscopy and imaging. Biophysical Journal. 66 (1), 259-267 (1994).
- Hulkower, M. B., Poliak, D. B., Rosenbaum, S. B., Zimmerman, M. E., Lipton, M. L. A Decade of DTI in Traumatic Brain Injury: 10 Years and 100 Articles Later. American Journal of Neuroradiology. 34 (11), 2064-2074 (2013).
- Hutchinson, E. B., Schwerin, S. C., Avram, A. V., Juliano, S. L., Pierpaoli, C. Diffusion MRI and the detection of alterations following traumatic brain injury. Journal of Neuroscience Research. 96 (4), 612-625 (2018).
- Wallace, E. J., Mathias, J. L., Ward, L. Diffusion tensor imaging changes following mild, moderate and severe adult traumatic brain injury: a meta-analysis. Brain Imaging and Behavior. , 1-15 (2018).
- Rutgers, D. R., et al. White Matter Abnormalities in Mild Traumatic Brain Injury: A Diffusion Tensor Imaging Study. American Journal of Neuroradiology. 29 (3), 514-519 (2008).
- Bondi, C. O., et al. Found in translation: Understanding the biology and behavior of experimental traumatic brain injury. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 58, 123-146 (2015).
- Shultz, S. R., et al. The potential for animal models to provide insight into mild traumatic brain injury: Translational challenges and strategies. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 76, 396-414 (2017).
- Osier, N. D., Dixon, C. E. The Controlled Cortical Impact Model: Applications, Considerations for Researchers, and Future Directions. Frontiers in Neurology. 7 (AUG), (2016).
- Lyeth, B. G. Historical Review of the Fluid-Percussion TBI Model. Frontiers in Neurology. 7 (DEC), 1-7 (2016).
- Marmarou, A., Foda, M. A. A. -E., van den Brink, W., Campbell, J., Kita, H., Demetriadou, K. A new model of diffuse brain injury in rats. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 291-300 (1994).
- Heim, L. R., et al. The Invisibility of Mild Traumatic Brain Injury: Impaired Cognitive Performance as a Silent Symptom. Journal of Neurotrauma. 34 (17), 2518-2528 (2017).
- Zohar, O., Rubovitch, V., Milman, A., Schreiber, S., Pick, C. G. Behavioral consequences of minimal traumatic brain injury in mice. Acta Neurobiol Exp (Wars. 71 (1), 36-45 (2011).
- Pierpaoli, C., Basser, P. J. Toward a quantitative assessment of diffusion anisotropy. Magnetic resonance in medicine : official journal of the Society of Magnetic Resonance in Medicine / Society of Magnetic Resonance in Medicine. 36 (6), 893-906 (1996).
- Jensen, J. H., Helpern, J. A. MRI quantification of non-Gaussian water diffusion by kurtosis analysis. NMR in Biomedicine. 23 (7), 698-710 (2010).
- Fieremans, E., Jens, H., Jensen, J. A. H. White matter characterization with diffusional kurtosis imaging. NeuroImage. 58, 177-188 (2011).
- Leemans, A. Explore DTI. , (2019).
- Loening, A. M., Gambhir, S. S. AMIDE: A Free Software Tool for Multimodality Medical Image Analysis. Molecular Imaging. 2 (3), 131-137 (2003).
- Veraart, J., et al. Denoising of diffusion MRI using random matrix theory. NeuroImage. 142, 394-406 (2016).
- Veraart, J., Fieremans, E., Novikov, D. S. Diffusion MRI noise mapping using random matrix theory. Magnetic Resonance in Medicine. 76 (5), 1582-1593 (2016).
- Braeckman, K., et al. Dynamic changes in hippocampal diffusion and kurtosis metrics following experimental mTBI correlate with glial reactivity. NeuroImage: Clinical. 21 (August 2018), 101669 (2019).
- Jones, D. K., Knösche, T. R., Turner, R. White matter integrity, fiber count, and other fallacies: The do's and don'ts of diffusion MRI. NeuroImage. 73, 239-254 (2013).
- Matlab code DKI and WMTI model. , Available from: https://github.com/NYU-DiffusionMRI/Diffusion-Kurtosis-Imaging (2019).
