Summary
Aquí, presentamos protocolos de procesamiento detallados para la toma de imágenes de muestras de tejido delicadas utilizando microscopía electrónica de barrido (SEM). Tres métodos de procesamiento diferentes, a saber, el secado químico de hexametil disilazana (HMDS), el secado simple al aire y el secado de puntocrítico se describen para preparar cáscaras de huevo rígidas, embriones en etapas tempranas del desarrollo y cultivos de hongos, respectivamente.
Abstract
Aunque la microscopía electrónica de barrido (SEM) está siendo ampliamente utilizada para el análisis ultraestructural de diversas muestras biológicas y no biológicas, los métodos involucrados en el procesamiento de diferentes muestras biológicas implican prácticas únicas. Todas las prácticas convencionales descritas en la literatura para el procesamiento de muestras todavía encuentran aplicaciones útiles, pero los cambios sutiles en la preparación de la muestra pueden alterar la calidad de la imagen, así como, introducir artefactos. Por lo tanto, se requiere el uso de una técnica única de preparación de muestras específica para el tipo de tejido analizado para obtener una imagen de buena calidad con resolución ultraestructural. El enfoque de este estudio es proporcionar los protocolos óptimos de preparación de muestras para la toma de imágenes embriones, cáscaras de huevo rígidas y cultivos de hongos utilizando SEM. Se recomendaron las siguientes optimizaciones para obtener buenos resultados para las tres muestras biológicas delicadas diferentes estudiadas. El uso de fijadores más suaves como 4% paraformaldehído o 3% glutaraldehído seguido de deshidratación con series de etanol es obligatorio. El micelio fúngico en bloques de agar obtenidos por cultivos de diapositivas produce una mejor integridad ultraestructural en comparación con los cultivos tomados directamente de placas de agar. El secado químico de embriones con HMDS proporciona secado sin introducir artefactos de tensión superficial en comparación con el secado de punto crítico. HMDS previene el agrietamiento causado por la contracción, ya que las muestras son menos frágiles durante el secado. Sin embargo, para el cultivo de hongos, el secado de puntocrítico proporciona una calidad de imagen aceptable en comparación con el secado químico. Las cáscaras de huevo se pueden crear imágenes sin pasos de preparación especiales, excepto para el lavado a fondo y el secado al aire antes del montaje. Las metodologías de preparación se estandarizaron en función de la calidad de imagen aceptable obtenida con cada ensayo.
Introduction
El análisis ultraestructural del microscopio electrónico de barrido (SEM) y la imagen intracelular complementan la microscopía de luz para el perfilado tridimensional de prokaryotes, plantas y animales. La alta resolución espacial de un SEM lo convierte en una de las técnicas más versátiles y potentes disponibles para el examen de las características microestructurales de las muestras a escala de nanómetro a micrómetro. Los especímenes desecados se resuelven en estructuras compositivas y topográficas con detalles intensos, lo que proporciona la base para el desarrollo de conclusiones válidas sobre las relaciones funcionales1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. Al interpretar imágenes SEM de especímenes biológicos, es un gran desafío distinguir entre las estructuras nativas y los artefactos que se crean durante el procesamiento. El SEM generalmente se opera a vacíos muy altos para evitar cualquier interferencia de moléculas de gas que afecte a los haces de electrones primarios, secundarios o retrodispersos emitidos por la muestra10,11. Además, los materiales biológicos son susceptibles a daños por radiación debido a sus propiedades deficientes o no conductoras. Es esencial que los especímenes cargados en el SEM estén completamente secos y libres de contaminantes orgánicos para eliminar cualquier posible desgasificación en un entorno de alto vacío10,11. Dado que los especímenes biológicos se componen principalmente de agua, se requieren técnicas preparativas adicionales para garantizar que las estructuras nativas se mantengan.
La resolución obtenida se basa en la optimización de métodos de preparación específicos para los tipos de muestras y parámetros instrumentales utilizados. Por lo tanto, es necesario evitar el uso de pasos de procesamiento generalizado para todos los tipos de tejido. Algunos especímenes biológicos requerirán un procesamiento menos estricto para preservar su estructura, mientras que podría ser necesario más tiempo y cuidado para los tipos delicados de muestras para evitar la introducción de artefactos de secado, como la contracción y el colapso. La preparación de muestras es un paso crítico en la toma de imágenes SEM; los resultados de los estudios morfométricos están notablemente influenciados por los procedimientos de preparación de muestras12,13. Los pasos de preparación comunes para muchas muestras biológicas son la fijación, deshidratación y recubrimiento con un metal como oro, platino o paladio para convertir sus superficies en conductoras para el análisis SEM. La naturaleza y la combinación de pasos utilizados variarán dependiendo del tipo de tejido, y los objetivos específicos del estudio. La acumulación de carga, la sensibilidad al vacío y el daño del haz de electrones plantean problemas al procesar muestras biológicas delicadas y blandas, lo que requiere pasos de procesamiento adicionales para conservar la estructura nativa del objeto. El uso de métodos convencionales como la fijación de tetróxido de osmio, y la deshidratación causan contracción y el colapso de los tejidos delicados14,15,16,17. El objetivo del estudio es establecer metodologías elegantes derivadas de la combinación de ideas de estudios anteriores con modificaciones para preparar e imaginar tejidos delicados blandos (por ejemplo, embriones de reptiles, cáscara de huevo de tortugas pintadas y cultivos de hongos).
La selección de un método de fijación adecuado es el primer paso más importante para el análisis microscópico de muestras biológicas. La fijación de los tejidos inmediatamente después del aisleo de un organismo es esencial para evitar alteraciones en su morfología debido a la descomposición. Un fijador eficaz debe terminar los procesos celulares permeando las células rápidamente y manteniendo el efecto irreversiblemente para estabilizar la estructura de la muestra para soportar tanto los pasos de procesamiento subsiguientes como el examen bajo el SEM17 , 18. Aunque se conocen varios métodos de fijación química y física, la fijación química se utiliza más comúnmente para especímenes biológicos para evitar cualquier cambio celular debido a la autolisis, putrefacción, y efectos de secado. Hay numerosas formulaciones químicas fijativas discutidas en la literatura17,19,20,21,22,23, fijadores que funcionan por desnaturalización y coagulando macromoléculas biológicas, y las que se fijan mediante macromoléculas reticulantes covalentemente. Los alcoholes se utilizan como fijadores desnaturalizantes que preservan muy mal la ultraestructura y se utilizan principalmente para la microscopía de luz y no se recomiendan para el análisis microscópico electrónico. Los fijativos reticulantes como el formaldehído, el glutaraldehído y el tetróxido de osmio crean reticulación intermolecular e intramolecular entre macromoléculas dentro de los tejidos, proporcionando una excelente preservación de las ultraestructuras11 ,24,25,26. Las muestras biológicas son sensibles a la temperatura. Se recomienda que la temperatura al comienzo de la fijación sea de 4oC para reducir la movilidad lateral de las proteínas de membrana, ralentizar la difusión de moléculas intercelulares y ralentizar la velocidad de fijación11. El tiempo necesario para la fijación de los tejidos depende en gran medida del tamaño de la muestra y de la velocidad a la que el fijador difunde y reacciona con los componentes de la muestra. Una fijación durante la noche en 4% paraformaldehído o 3% de glutaraldehído en PBS a 4oC es el método preferido para el análisis SEM de los especímenes utilizados en este estudio por sus propiedades penetrantes secuenciales, que permiten procesar muestras delicadas más pequeñas17 , 18 , 19 , 20 , 27. Se elimina un paso posterior a la fijación con tetróxido de osmio no sólo debido a su naturaleza tóxica, sino que también se ha encontrado que no implementa ninguna ventaja adicional para mejorar la calidad de imagen de las muestras analizadas en este estudio.
Las muestras biológicas contienen fluidos que interfieren con el funcionamiento de la SEM; por lo tanto, las muestras deben secarse antes de insertarlas en la cámara de muestras SEM. Una vez asegurada la deshidratación, el disolvente debe retirarse del tejido sin crear artefactos en las muestras debido a la tensión/secado superficial. Tres métodos de secado diferentes se utilizaron comúnmente durante el procesamiento de tejidos para imágenes SEM: secado por aire, secado de punto crítico, y muestras de secado por congelación28,29,30,31. Pocos estudios informan de los tres métodos de secado que producen resultados idénticos con muestras de tejido animal28,29,30,31. Una práctica general utilizada para especímenes más pequeños es la deshidratación química por una serie de concentración ascendente de alcohol y hexametildisilazane (HMDS), pero los especímenes más grandes se secan utilizando un instrumento de secado de punto crítico (CPD)32. Durante el proceso de secado, fuerzas considerables formadas en pequeñas cavidades que pasan a través de la muestra por una interfaz líquido/gas; esto puede incluso conducir a un colapso completo de las estructuras huecas33. Cualquier deformación que se produzca debido al tratamiento podría confundirse como una característica estructural nativa de la muestra. Por lo tanto, se debe eliminar el fenómeno generalizado para el procesamiento y se debe estandarizar un proceso de secado único para cada tipo de tejido, especialmente cuando se analizan muestras de tejido delicadas.
En varios ensayos realizados utilizando varias combinaciones de todos los procesos mencionados, estandarizamos los métodos que se pueden utilizar para el análisis SEM de tres tejidos delicados: embriones de reptiles, cáscaras de huevo de tortugas pintadas y cultivos de hongos. Los biólogos y morfologíadels del desarrollo describen la morfogénesis normal y anormal durante el desarrollo embrionario en animales vertebrados representativos. Las investigaciones sobre las vías de señalización génica dependen de la descripción morfológica de las estructuras novedosas. Para evitar cualquier cambio abrupto en la estructura del embrión vertebrado durante el análisis sem, recomendamos el secado químico después de la deshidratación. El secado químico con HMDS es el método de secado relativamente más reciente y las ventajas incluyenrapidez relativa, facilidad de uso, pérdida de costos y la limitada experiencia y equipo necesarios 9. La CPD es una técnica de secado comúnmente utilizada utilizando CO2 de paso a través de las muestras a una temperatura y presión específicas. Identificamos que HMDS es adecuado para secar tejidos blandos delicados y permite procesar muestras más grandes en comparación con el secado de puntocrítico, lo que causó una deformación extensa a los tejidos embrionarios. Se han utilizado varios métodos para preparar muestras para imágenes SEM para estudiar las características morfológicas de los hongos34. Los especímenes fúngicos se fijan comúnmente en tetróxido de osmio seguido de deshidratación de etanol y secado de puntocrítico, lo que puede proporcionar resultados satisfactorios, aunque los efectos tóxicos del tetróxido de osmio6,7,35 y la pérdida de materiales fúngicos mientras se cambian las soluciones durante el procesamiento son desventajas pronunciadas. La técnica de preparación de muestras utilizando secado al aire sin fijación también se ha practicado36, pero resulta en estructuras encogidas y colapsadas, y la observación de tales especímenes puede ser fácilmente malinterpretada mientras se caracteriza la especie. La hifa fúngica pierde su integridad en contacto con líquidos y es posible que no se logre un secado uniforme para restaurar la estructura. Debido a este efecto, secar por congelación se utiliza comúnmente para secar tejidos blandos como el micelio fúngico. El secado por congelación funciona bien para materiales limpios, pero la presencia de cualquier sales o secreción oscurecerá los detalles de la superficie que se identificarán solo en la etapa de visualización del SEM. Acoplamos el método de cultivo de diapositivas con la fijación de glutaraldehído y el secado de punto crítico para producir detalles estructurales de hifas y esporas fúngicas intactas. Aunque el secado por CPD causó contracción en embriones, resultó en estructuras miceliales bien conservadas cuando se combina con la fijación de glutaraldehído. La cáscara de huevo es de importancia primordial para el embrión de animales ovíparos, no sólo actuando como una cubierta protectora, sino también proporcionando estabilidad mecánica, permeabilidad al gas y al agua, y una reserva de calcio para el embrión en desarrollo. Las cáscaras de huevo de tortuga de agua dulce se clasifican como "rígidas" en función de su estructura, y debido a su disponibilidad han recibido una atención significativa de los biólogos1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 37 , 38.
Detallamos métodos simples para un fácil examen de las membranas de cáscara de huevo y concha de tortuga pintada que se pueden aplicar a cualquier especie rígida de cáscara de huevo. Las metodologías de preparación se evaluaron en función de la calidad de imagen resultante y la reducción de los artefactos potenciales.
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Protocol
NOTA: Los huevos de tortuga pintada (Chrysemys picta) utilizados en este estudio fueron recogidos durante la temporada de anidación de mayo a junio de 2015-16 de Rice Creek Field Station, Oswego New York con permiso obtenido del Departamento de Medio Ambiente del Estado de Nueva York Conservación (DEC).
1. Método de secado químico para procesar embriones para SEM
- Recoger huevos de tortuga de sitios de campo durante la temporada de anidación. Preparar las cámaras de incubación con antelación, hechas de cajas de plástico con tapas (L x An x H) 6,7 cm x 25,4 cm x 10,2 cm llenas de medio de cama preparado con una mezcla húmeda de vermiculita y musgo de turba (1:1 relación). Hacer 4-6 agujeros de aproximadamente 0,25 cm a lo largo de los lados de las cajas y en la tapa para permitir la aireación.
- Retire suavemente el suelo del nido para descubrir los huevos. Limpie la superficie de los huevos de tortuga con tintura de yodo diluido (1:25.000) para controlar la contaminación microbiana durante la incubación. Coloque las garras separadas entre sí, el tamaño del embrague de la tortuga pintada puede variar de 5-9 huevos y colocar un máximo de 8-9 huevos por caja.
NOTA: Manipule cuidadosamente los huevos durante la recolección, limpiando, etiquetando y colocando dentro de las cajas. La posición y la alineación de los óvulos deben ser las mismas que se establecieron, cualquier movimiento inhibirá el desarrollo embrionario. - Entierra manualmente los huevos la mitad en la ropa de cama, cubre y coloca la caja dentro de la incubadora a 30oC. Incubar los óvulos durante 10-17 días para obtener las etapas embrionarias 12, 13 y 18 utilizadas respectivamente en este estudio. Añadir agua destilada para humedecer parcialmente el medio de cama cada dos días para evitar la deshidratación y mantener el nivel de humedad para el desarrollo normal de los embriones.
NOTA: Los embriones de incubación y puesta en escena se realizan de acuerdo con una tabla de desarrollo completa publicada anteriormente39. - Fijar los embriones haciendo el primer corte en un lado de la cáscara de huevo dorsal y la membrana de la yema juntos, vertical al eje largo utilizando tijeras puntiagudas. Inserte las tijeras en la yema cuidadosamente para evitar cortar el disco embrionario. Ahora corte el lado lateral del huevo a lo largo del eje largo y luego corte el otro lado del huevo a lo largo del eje corto.
- Abra la pieza extirpada con el lado del embrión hacia arriba usando fórceps. Corte el otro lado lateral de la cáscara de huevo y coloque la pieza extirpada en solución salina tamponada de fosfato (PBS a un pH de 7,4).
NOTA: El huevo de tortuga está lleno de yema de huevo altamente viscosa y el lado dorsal del embrión se adhiere a la membrana de la cáscara de huevo. La membrana de cáscara de huevo cerca del embrión cambia con la incubación de blanco translúcido a un blanco opaco y calcáreo. Esto permite ubicar el embrión en el centro del eje largo y ser visto como un punto calcificado oscuro desde el exterior40,41. - Utilice un estereomicroscopio para aislar los embriones junto con la membrana de la yema pelándolos de la cáscara de huevo usando fórceps. Retire las membranas extraembrionarias utilizando fórceps y microtijeras. Transfiera el embrión usando una cuchara de embrión a PBS fresco en un plato de Petri para lavar cualquier sangre o yema.
- Utilice placas claras de 12 pocillos para fijar los embriones durante la noche en un 4% de paraformaldehído en PBS a 4oC o en 2-3% de glutaraldehído en PBS. Coloque de uno a tres embriones en cada pozo dependiendo del tamaño de los embriones. Asegurar una infiltración completa (las muestras aparecerán blancas) para embriones más viejos extendiendo el tiempo de fijación durante 2-3 días. Enjuague los embriones 3veces con PBS fresco durante 5 min cada enjuague.
NOTA: Evite dañar la superficie del embrión utilizando inserciones de poliestireno con fondos de malla de poliéster para placas de 12 pocillos para transferir muestras de un disolvente a otro. - Deshidratar muestras utilizando una serie de concentraciones de etanol en agua destilada: 30%, 50%, 70%, 80%, 95% y 100% y tratar muestras durante 1 h en cada solución de deshidratación. Repita el paso con 100% de etanol dos veces para asegurar una deshidratación completa. Si no se utiliza inmediatamente, almacene las muestras en etanol al 70% a -20 oC durante un período más largo.
- Embriones secos utilizando una serie de hexametildisilazana (HMDS) a 100% concentración de etanol: 1:2, 2:1 y 100%. Deje las muestras en cada solución durante 20 minutos y mantenga la placa Petri parcialmente cubierta durante el proceso.
NOTA: Lleve a cabo todos los pasos que impliquen HMDS en la campana de humos con el equipo de protección personal necesario, ya que HMDS es altamente tóxico. - Deje los embriones en la solución final 100% HMDS cubierta total o parcialmente en una campana de humo durante la noche ayudando en evaporación de HMDS, dejando las muestras listas para el montaje y el recubrimiento de esputo. Cubra el plato para eliminar el desasover el polvo sobre las muestras.
NOTA: El tejido aparecerá blanco después de un secado completo y las muestras parcialmente secas se verán de color amarillo, dejar estos tejidos en la campana de humos durante más tiempo. - Elija el tamaño de los talones de aluminio y la cinta adhesiva de carbono por tamaño de la muestra analizada. Monte las muestras secas cuidadosamente en un talón de pasador de aluminio estándar (12,7 mm x 8 mm) utilizando cinta conductora de carbono de doble palo (12 mm).
- Introducir muestras montadas en la cámara de la recubridora de esputo para recubrir la muestra con una película muy delgada de oro para eliminar el efecto de carga. Placa de oro de los especímenes para 60-120 s en un sputter de 35 mA.
- Monte los talones en las placas de poro correspondientes fijando firmemente los tornillos. Transfiera el portamuestras dentro o fuera de la cámara de muestras de SEM utilizando la herramienta de intercambio de muestras. Imagen de las muestras en modo de vacío alto con una tensión de haz de aceleración de 10 kV y corriente de emisión de 10 oA.
NOTA: Use siempre guantes mientras manipula muestras, portamuestras, talones de montaje y herramientas de transferencia para evitar la contaminación por grasa de las manos al sistema SEM. - Pruebe las técnicas alternativas enumeradas a continuación para comparar la resolución de las muestras obtenidas del procedimiento anterior.
- Incluya una post-fijación con 1% de tetróxido de osmio durante 1 h a temperatura ambiente después del paso 1.7.
- Retire parcial o completamente el HMDS en el paso 1.10 para una rápida evaporación rápida de HMDS.
- Procesar embriones después del paso 1.8 utilizando el secado de punto crítico (CPD) siguiendo los pasos 3.3-3.4.
2. Preparación de la cáscara de huevo para SEM utilizando un método de secado al aire
- Recoger e incubar los huevos de tortuga pintada (Chrysemys picta) para fijar los embriones como se especifica en los pasos 1.1-1.7.
- Ahorre cáscaras de huevo en agua destilada después de la fijación embrionaria en el paso 2.1. Limpie bien las cáscaras de huevo remojándolas en agua destilada durante al menos 1 h para eliminar la contaminación por yema y albúmina.
- Cáscaras de huevo secas al aire después de lavarse delicadas toallitas antiestáticas en la campana de humos durante la noche. Almacene las cáscaras de huevo secas en botellas de muestras limpias etiquetadas por número y etapa.
- Monte, cubra e iimagene los especímenes siguiendo los pasos especificados en los pasos 1.11-1.13.
3. Método de secado de puntocrítico crítico para preparar cultivos de hongos para SEM
- Establecer cultivos de diapositivas
- Preparar medios de agar dextrosa de patata (PDA) para cultivos de hongos: Añadir 39 g de potencia PDA en 1 L de agua destilada en un matraz Erlenmeyer. Mezcle bien girando el matraz y el autoclave el medio a 121 oC durante 30 minutos. Permita que la solución de medios se enfríe y luego agregue el antibiótico cloramphenicol (25 g/ml) utilizando una micropipette estéril.
NOTA: Después de la esterilización, la solución de agar debe estar caliente y no se solidifique pronto. Enfríe lo suficiente para que no inactive los antibióticos. - Mezclar arremolinando y verter las placas (aproximadamente 10-12 ml de medios para cada plato Petri de 10 cm), apilar cuidadosamente y dejar solidificar.
- Utilice una cuchilla de bisturí estéril para cortar pequeños bloques de agar alrededor de 1/2 a 3/4 de una pulgada. Retire y coloque un bloque de agar en un portaobjetos de microscopio de vidrio limpio.
- Coloque el portaobjetos en un plato Petri limpio para evitar la contaminación y preservar la humedad durante la incubación.
- Levante el portaobjetos de la parte inferior de la placa Petri usando un palillo estéril para crear tensión superficial entre la placa y la corredera para quitar el portaobjetos de vidrio sin interrumpir el delicado crecimiento después de la incubación.
- Utilice un lazo estéril o una aguja para transferir algunos de los hongos del inóculo de la muestra a cada uno de los cuatro lados del bloque de agar en la diapositiva.
- Coloque un cubreobjetos limpio en la superficie del bloque de agar después de la inoculación. Agregue unas gotas de agua destilada estéril a la placa Petri alrededor del portaobjetos para asegurar la humedad de los hongos en crecimiento.
- Sellar parcialmente la placa con película de parafina e incubar la placa a 30 oC durante un período de tiempo adecuado (para la incubación de especies de Fusarium durante 36 a 48 h).
- Retire el portaobjetos de la placa Petri y separe el cubreobjetos herméticamente del bloque de agar utilizando fórceps estériles. Fijar los bloques de agar en 3% glutaraldehído en PBS durante la noche a 4 oC.
- Preparar medios de agar dextrosa de patata (PDA) para cultivos de hongos: Añadir 39 g de potencia PDA en 1 L de agua destilada en un matraz Erlenmeyer. Mezcle bien girando el matraz y el autoclave el medio a 121 oC durante 30 minutos. Permita que la solución de medios se enfríe y luego agregue el antibiótico cloramphenicol (25 g/ml) utilizando una micropipette estéril.
- Deshidratar las muestras pasando por una serie de etanol: 10%, 25%, 50%, 75% y 90% con 15 min por cambio. Procesar las muestras para la deshidratación final con dos cambios en 100% etanol que duran 30 minutos cada uno para asegurar la saturación completa.
- Secado de punto crítico: Colocar muestras deshidratadas en la cámara del aparato CPD. Selle y enfríe la cámara abriendo las válvulas para permitir la entrada de CO2 líquido y el etanol de ventilación, hasta que el CO2 líquido llene completamente la cámara.
- Sellar y calentar la cámara lentamente para lograr un punto crítico cuando la presión de la cámara supere los 1000 psi y la temperatura supere los 31 oC, la fase de líquido y gas de CO2 está en equilibrio. Drenar lentamente el CO2 de la cámara y la muestra como gas para evitar efectos de tensión superficial.
- Realice el montaje, el chapado en oro y la toma de imágenes de las muestras siguiendo los pasos especificados en los pasos 1.11-1.13.
- Realice análisis comparativos secando químicamente las muestras del paso 3.2 utilizando HMDS siguiendo los pasos 1.9-1.13.
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Representative Results
La Figura 1 muestra el análisis micrográfico de electrones de barrido de embriones de tortuga pintada (Chrysemys picta). Se utilizaron huevos de tortuga pintados recogidos e incubados en un medio de cama, montados en talones de aluminio después del secado químico para imágenes SEM (Figura1A-E). Una vista lateral de un embrión en la etapa 12 muestra las estructuras craneofaciales; prominencia maxilar se extiende más allá de la mandibular y limita un foso nasal bien marcado medially; también se observaron cinco arcos faríngeos (Figura1F). Las somitas recién formadas en la región posterior de la cola del embrión son fácilmente contables en comparación con las somitas corporales segmentadas. Los cogollos de las extremidades anteriores parecen más largos en comparación con los cogollos de las extremidades posteriores y apuntan más caudalmente que ventralmente. Un crecimiento bien definido de una cresta de caparazón se ve a lo largo de toda la región del flanco entre extremidades del embrión de la etapa 15 (Figura1G. En la etapa 18, las tortugas pintadas poseen un hocivo corto y débil. El pico inferior descansa dentro de la mandíbula superior y está ligeramente hacia arriba con un gancho de terminal que cabe en la muesca central del pico superior (Figura1H). La mandíbula superior de las tortugas pintadas muestra una apariencia con muescas formando una punta distal medial en forma de U-V con una pequeña cúspide en cada lado, un pequeño diente de huevo comienza a formarse en la punta de la mandíbula superior. Los cogollos de las extremidades que aparecieron más tiempo durante las etapas anteriores forman una estructura similar a una paleta durante las etapas 13-14 con placa digital vagamente indicada. Limb mesenchyme demarcado por la cresta ectodérmica apical se ve a lo largo de los márgenes anterior-posterior (Figura1I-J).
La Figura 2 muestra el análisis ultraestructural de la cáscara de huevo y la membrana de la cáscara de la crisema de Chrysemys utilizando imágenes SEM. Las cáscaras de huevo de tortuga pintadas se obtuvieron como se describió anteriormente y fueron sometidas a secado al aire después del lavado con agua destilada doble (Figura2A,B). Las cáscaras de huevo montadas en talones de aluminio con cinta de carbono de doble cara (Figura2C)se crearon en imágenes utilizando SEM. Una vista lateral de la cáscara mostraba una capa exterior de cáscara de huevo calcárea firmemente pegada a la membrana de la cáscara filamentosa interna (Figura2D). La superficie exterior de la cáscara de huevo consiste en unidades de concha mineralizadas bien distinguidas, hechas de nódulos globulares/esféricos dispuestos en grupos y entre unidades de concha adyacentes una concentración de pequeñas depresiones redondeadas o poros de varios tamaños fueron (Figura2E). Los nódulos de cada grupo de unidades de vaciado se encuentran en un cruce de conexión, el punto central (Figura 2F). La superficie exterior se peló manualmente utilizando fórceps para observar la superficie de la membrana de la cáscara. Se vieron filas de placas centrales que proporcionan el punto de unión entre las unidades de concha y la membrana fibrosa multicapa subyacente (Figura2G).
La Figura 3 muestra la caracterización morfológica del aislado de hongos ascomicetos de cultivos de diapositivas observados mediante imágenes SEM. Esquema de configuración de cultivo de diapositivas establecido (Figura3A) que muestra el crecimiento de hongos en el bloque de agar dentro de los dos días de la inoculación. Colonias que crecen rápidamente con micelio aéreo de color blanco a crema (Figura3B). Las imágenes SEM después del secado de punto crítico y el recubrimiento de esputo de rodajas de agar revelaron hifas fúngicas, conidia curvada y arroz como esporas. Se vieron conidioforos que surgieron lateralmente de las hifas aéreas del septato (Figura3C). Las macroconidias producidas en conidioforos más cortos y ramificados son moderadamente curvados, con células apicales cortas, contundentes e indistintamente pediceladas en su mayoría septato (Figura3D).
La Figura 4 muestra los resultados comparativos para el procesamiento de muestras similares utilizando técnicas alternativas. Los cabezales de inmersión de la etapa 15 embriones en HMDS y el secado por evaporación gradual muestran estructuras craneofaciales bien conservadas, casi no se ve contracción o distorsión con tiempos prolongados de evaporación lenta de HMDS (Figura4A). Los embriones post-fijados con tetróxido de osmio no mostraron ninguna diferencia distinguible en la calidad de la imagen, excepto por una ligera contracción del tejido en comparación con el procesamiento lento de HMDS (Figura4B). El secado de embriones mediante la eliminación parcial o completa de HMDS permite una rápida evaporación da como resultado una distorsión estructural y contracción (Figura4C),mientras que la evaporación lenta resolvió excelentes estructuras superficiales de un embrión con una etapa similar ( Figura 4 A). Los artefactos de secado se vieron en los embriones tratados con la técnica de CPD causando una amplia contracción y destrucción de tejido (Figura4D,E). Las rodajas de agar de cultivos de diapositivas muestran un secado incompleto del aislado de hongos con tratamiento HMDS en comparación con el CPD (FiguraF). El secado completo se logra con el tratamiento de CPD de rodajas de agar con un espécimen blanco bien seco que muestra características estructurales intactas de alta resolución de hifas y esporas fúngicas (Figura4G-G'). Los bloques de agar con cultivos de hongos parecen encogidos y de color amarillo, por lo que no son adecuados para imágenes SEM (Figura4H-H').
Figura 1 : Escaneo de micrografías electrónicas de Chrysemys picta embriones preparados por secado químico. (A) Chrysemys picta, anidación durante la temporada de cría en Rice Creek Field Station, Oswego, NY. (B) Nido bien construido desde el exterior. (C) Superficie removido con cuidado a la exposición de los huevos puestos. (D) Huevos colocados en la cámara de incubación con medio de cama. (E) Montaje de embriones en talones de aluminio después del secado químico, E4 mostrando el embrión recubierto de esputo. (F) Vista lateral del embrión de la etapa 12 que muestra estructuras faciales, cogollos de las extremidades y somitas. (G) La cresta del caparazón bien definida y los cogollos de las extremidades en forma de paleta se ven en la etapa 15. (H) Estructuras craneofaciales de la etapa 18 embrión que muestra la mandíbula superior e inferior, nota un pequeño diente de huevo formado en la punta del pico superior. (I) Vista dorsal de la extremidad delantera derecha en la etapa 13-14 y una vista de primer plano de AER (J) en el límite dorsal-ventral. Barras de escala: F-H, 500 m; I, 100 m, y J, 10 m. Claves: mb, midbrain; np, fosa nasal; mxp, prominencia maxilar; pa, arcos faríngeos; h, corazón; fl, extremidad delantera; s, somita; hl, extremidad posterior; t, punta de la cola; cr, cresta carapacial; et, diente de huevo; oc, cavidad oral; e, ojo; uj; , mandíbula inferior; m, mesenchyme, AER, cresta ectodérmica apical. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Análisis ultraestructurales de la cáscara de huevo seca al aire y la membrana de la cáscara de los huevos de tortuga pintados. ( A ) Despuésdefijar los embriones, las cáscaras de huevo se lavaron a fondo en agua destilada para eliminar la yema y la albúmina. (B) Las cáscaras de huevo limpias se secaron al aire al menos durante la noche. (C) Montaje de una cáscara de huevo en talones de aluminio. (D) Vista radial del fragmento de vaciado que muestra la capa calcárea externa y la membrana interna de la cáscara. (E) La capa calcárea exterior muestra unidades de vaciado globular (su) dispuestas en grupos y poros vistos entre estas unidades (asteriscos). (F) Vista ampliada de un nódulo que muestra el punto central (c) entre las unidades de vaciado. (G) La eliminación de la capa calcárea muestra la superficie exterior de la membrana de la cáscara con depresiones descompuestas de las unidades de vaciado. Barras de escala: E, 100 m; F, 10 m, y G, 20 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Preparación del cultivo de hongos para imágenes SEM. (A) Diagrama esquemático para mostrar la configuración de la referencia cultural de diapositivas. (B) Colonias de hongos de color blanco que se ven en el bloque de agar después de dos días de incubación a 30oC. (C) imagen SEM que muestra una sección de micelio de Fusarium solani, asteriscos negros que marcan la macroconidia en esporodoquia, una flecha que apunta a phialide, y puntas de flecha dirigidas hacia la microconidia, barra de escala, 10 m. (D) Imagen magnificada de las clamididosporas septadas, barra de escala 5 m. Llaves: ab, bloque de agar; cs, coverslip; f, cultivo de hongos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Análisis comparativo de técnicas alternativas para procesar muestras similares. (A) Vista frontal de la cabeza de tortuga pintada seca con lenta evaporación de HMDS (A), después de la fijación con tetróxido de osmio (B ), la evaporación rápida y rápida de HMDS (C) y CPD (D-E). La inclusión de un paso posterior a la fijación con tetróxido de osmio no muestra ninguna diferencia visible en la calidad de la imagen en comparación con el tratamiento HMDS sin post-fijación. Las deformaciones se ven después de una rápida evaporación de HMDS, mientras que el secado gradual con evaporación lenta proporciona una mejor estructura superficial. Diferentes grados de contracción y estructuras colapsadas se ven en las regiones del cerebro, los ojos y las prominencias faciales en embriones tratados con CPD. (F) Montaje de cultivos de diapositivas procesados con HMDS (1), CPD (2) y espécimen tratado con CPD recubierto de esputo (3) talones de aluminio. (G-G') Secado completo visto como rodaja de agar de color blanco intacto con inoculación de hongos logrado por CPD preservando estructuras de micelio fúngico y esporas de Fusarium solani. (H-H') Secado inadecuado del cultivo de la corredera, contracción e integridad estructural dañada visto con la técnica de conservación de HMDS. Barras de escala: A-E, 500 m; G-H, 2 mm, y G'-H', 20 m. Llaves: et, diente de huevo; oc, cavidad oral; e, ojo; uj, mandíbula superior; lj, mandíbula inferior; asteriscos negros, macroconidios en esporodochia; flecha, phialide; y puntas de flecha, microconidia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En nuestro estudio, se probaron diferentes agentes de fijación, métodos de deshidratación y secado para preparar tres muestras biológicas delicadas diferentes para la toma de imágenes SEM: embriones, cáscaras de huevo y cultivos de hongos. El SEM se utiliza comúnmente para el análisis de superficie, por lo que la penetración fijativa es menos preocupante, pero debe entenderse que las estructuras internas mal fijas causarán una contracción interna o/y estructuras superficiales colapsadas. También se debe considerar un tiempo de fijación prolongado para muestras de tejido más grandes, reemplazando la solución fijativa unas cuantas veces dependiendo de la duración de la fijación. Debido a la interacción activa entre el fijador y el tejido, las propiedades osmóticas de las células cambiarían considerablemente. Los fluidos tisulares diluirían el fixativo y, por lo tanto, un efecto de aldehído que contribuye a la osmolalidad general puede descuidarse en lo que respecta a los efectos sobre el volumen celular. Además, el formaldehído penetraría más rápido en los tejidos y es más eficaz que el retitulador en comparación con el glutaraldehído. También se informó de una mezcla de formaldehído-glutaraldehído tamponada para la fijación de una amplia variedad de tejidos, aunque para monocapas y suspensiones celulares las soluciones diluidas eran más adecuadas para la fijaciónde 15,16. Sin embargo, las soluciones diluidas también son hipertónicas, por lo que los aldehídos no son osmotically activos. Para muestras delicadas utilizadas en este estudio, PBS a pH 7.4 se utilizó como vehículo para los agentes de fijación, ya que se cree que los amortiguadores de fosfato son más similares a los ambientes citoplasma de la mayoría de las muestras biológicas. Además, se identifica que la osmolaridad está dentro del rango fisiológico requerido para la muestra, mientras que PBS actúa como un vehículo para el agente de fijación. Después de la fijación con tetróxido de osmio se recomienda a menudo para varias muestras biológicas16,22,42, pero se ha eliminado para todas las muestras biológicas utilizadas en este estudio. Las muestras sin tetróxido de osmio produjeron imágenes nítidas y muestras fijadas con tetróxido de osmio produjeron resultados indistinguibles (Figura4A). El osmio tetróxido causa distorsión de las estructuras del tejido de las hojas y produce una peor preservación de la muestra en comparación con la mezcla de glutaraldehído y formaldehído43,y se ha sugerido que una acumulación de moléculas de osmio podría inhibir la infiltración de agentes deshidratantes y agentes de transición utilizados en la CPD, y los disolventes como HMDS utilizados para el secado químico. El efecto es específico del tejido y excluir el tetróxido de osmio no tendrá ningún efecto en la calidad de imagen para el tipo de muestras delicadas analizadas en este estudio. Para otros tipos de tejidos el uso de tetróxido de osmio puede eliminarse con una fijación primaria prolongada.
Los especímenes de embriones de tortuga seca HMDS mostraron superficies bien conservadas y menos distorsión o contracción en comparación con cpD (Figura4). CpD minimiza la posibilidad de distorsión en la morfología celular y la producción de artefactos debido a la tensión superficial cero o mínima creada durante el proceso. Sin embargo, la CPD puede causar un peligro físico potencial para muestras frágiles delicadas. En línea con nuestra observación, HMDS produjo imágenes similares o de mayor calidad al minimizar la tensión superficial causada por el secado basado en estudios previos publicados44,45,46,47. En comparación con el tratamiento con CPD, HMDS conservó los detalles estructurales de la malla orgánica excelentemente en bivalvos grabados y conchas de percebe48 y proporcionó una alta resolución de las características estructurales de la compleja organización interna de mermithid nematodos49 y tejidos internos de insectos28. Los artefactos de la placa de secado se vieron en grandes cantidades en las muestras preparadas por la técnica CPD en comparación con la técnica HMDS. Los blebs de membrana y los artefactos de pellets se incrementaron en las células cervicales preparadas mediante la técnica de CPD50. HMDS reacciona con agua para producir hexametildisiloxano y amoníaco, los cuales se evaporan del objeto. HMDS se utiliza comúnmente en la cromatografía de gases para crear éteres de silículo de compuestos como azúcares, aminoácidos, alcoholes, y muchos otros compuestos. Se desconoce si HMDS reacciona con algunos de estos compuestos en los tejidos. HMDS podría retificar proteínas y endurecer el tejido durante el proceso de secado28, aunque la razón exacta por la que HMDS proporciona una mejor preservación de los embriones no podría explicarse excepto por la especificidad del tejido. Según los resultados de nuestra investigación, la CPD causó una amplia contracción en comparación con el HMDS, y es mucho más adecuada para procesar tejidos embrionarios, especialmente para analizar la estructura superficial de embriones de etapa temprana. El mecanismo por el cual HMDS trabaja en el secado tisular no ha sido aclarado, aunque el secado lento con evaporación gradual en un entorno anhidro absoluto podría ser una razón para obtener una excelente estructura superficial de los animales.
En este estudio se utilizaron pequeños trozos de bloques de agar con colonias de hongos de cultivos de diapositivas previamente establecidos para evitar problemas con el mantenimiento de la fluffiness original de la estera micelial. El secado por CPD de trozos de agar con colonias de hongos dio lugar a un efecto de lavado, mientras que los cambios en los fijadores, tampones y etanol se encontró que era una mejor opción superando las dificultades con el secado por congelación. HmDS que funciona bien para embriones de todas las etapas fue incapaz de resolver cultivos de hongos, mientras que el secado por aire con HMDS plantea un problema significativo: acurrucarse y perder la rigidez estructural. Mientras que la CPD funciona bien para cultivos de hongos, indujo daño instantáneo a los embriones especialmente en las primeras etapas del desarrollo, causando contracción en la superficie. No se observaron artefactos de carga o secado cuando se utilizaron HMDS y CPD para embriones y cultivos de hongos, respectivamente. Para el tejido rígido como la cáscara de huevo de las tortugas, no se requiere ningún procesamiento especial, excepto para el lavado y secado al aire a temperatura ambiente antes del montaje para la toma de imágenes.
Independientemente del método de preparación, se deben utilizar pasos graduales de gradiente de etanol para reducir el potencial de secar artefactos. Inicialmente, se encontró que las muestras de HMDS y CPD tenían artefactos superficiales con contracción siguiendo los protocolos de deshidratación y secado disponibles en la literatura. Después de una serie de estandarizaciones, determinamos que los artefactos eran el resultado de la deshidratación del alcohol. Es fundamental utilizar un proceso de deshidratación lenta utilizando aumentos de etanol más graduales durante la deshidratación. Además, la duración de cada iteración debe ser más larga para los embriones en comparación con los cultivos de hongos. Además, un paso adicional al 100% de etanol aseguró una saturación uniforme completa. El HMDS se puede eliminar total o parcialmente para permitir el secado por aire de las muestras, pero se encontró que la exposición prolongada al HMDS y el secado gradual del aire por evaporación eran eficaces para que los embriones evitaran la interrupción (Figura4A,C)causada por una gran superficie tensión observada para la fijación de células microbianas51. La inmersión de especímenes en HMDS y el secado lento durante la noche revelaron una excelente estructura superficial en la especie Daphnia52, lo que sugiere que los tejidos suaves y delicados podrían beneficiarse del proceso de secado lento. La calidad de imagen aceptable para embriones se puede obtener con un secado químico lento aumentando gradualmente la concentración de HMDS al etanol después de la deshidratación.
Todas las muestras se montaron en talones de aluminio utilizando una cinta de carbono de doble cara para proporcionar una superficie conductora, una fina capa de esmalte de uñas incoloro también podría utilizarse si la misma muestra necesita ser imagen da una imagen en una orientación diferente. Las muestras se pueden quitar fácilmente de los talones cuando se utiliza esmalte de uñas en la superficie del talón y es posible colocar las muestras en planos alternativos en comparación con el uso de cinta de carbono de doble cara. Como las muestras no son conductoras, es necesario espuelar una fina capa de metal en las muestras para aumentar la conductancia. Un objetivo de oro se utilizó en este estudio durante el recubrimiento de sputter, y el oro-paladio también produce resultados similares evitando efectos de carga. La tensión de haz correcta depende de la muestra, para muestras ligeramente recubiertas, la imagen con una emisión de campo SEM a 2-5 kV proporcionará una buena definición de las estructuras de superficie. Para los tejidos con recubrimiento adecuado, 5 kV generalmente proporciona una mejor señal sin más penetración de haz. Para los especímenes que carecen de profundidad y están recubiertos de oro solo, la toma de imágenes a una tensión más alta (10 kV) permitió una mejor visualización de la topografía superficial.
La preparación de tejidos delicados para SEM plantea desafíos distintivos, y se puede utilizar una serie de técnicas de preparación de muestras para superar y minimizar los artefactos de imagen. Proporcionamos métodos integrales para procesar tres muestras de tejido biológico delicada diferentes, para imágenes SEM: embriones, cáscaras de huevo rígidas y cultivos de hongos. En nuestra investigación, se realizaron alteraciones sutiles a los métodos populares disponibles en estudios publicados anteriormente, e identificamos los métodos de deshidratación y secado más apropiados específicos para cada tipo de tejido delicado. Estos protocolos podrían adaptarse para obtener una calidad de imagen SEM aceptable a partir de muestras biológicas similares.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar
Acknowledgments
Los autores quieren agradecer al Dr. Daniel Baldassarre, SUNY Oswego por sus útiles discusiones y comentarios sobre el manuscrito. Este estudio fue apoyado por Rice Creek Associate Grants, Oswego; Challenge Concede a SUNY Oswego y a la National Science Foundation (NSF) pequeñas subvenciones a PGL y JG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Fischer Scientific | S25127A | for slide cultures |
| Aluminum pin stub | Tedpella | 16111 | 12.7 mm x 8 mm |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar | BD 213400 | DF0013-17-6 | Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds |
| Chloramphenicol | Fischer BioReagents | BP904-100 | Antibiotic for media |
| Coarse Vermiculite | Greenhouse Megastore | SO-VER-12 | bedding medium |
| Clear 12- well plate | Corning | 07-201-589 | for fixing embryo |
| Coverslips | Fischer Scientific | S17525B | for slide culture |
| Critical Point Dryer | Quorum CPD | EMS850 | critical point drying |
| Culture dishes | Fischer Scientific | 08 747B | DISH PETRI 100X10MM 12/PK |
| Ethanol | Fischer Scientific | A406P 4 | dehydration agent |
| Forceps- Aquarius Tweezers | Tedpella | 5804 | style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm |
| Glutaraldehyde | Fischer Scientific | G151-1 | fixative |
| Gold target for sputter coater | DENTON VACUUM | TAR001-0158 | Gold Target, 2.375″ D X .002″ |
| Hexamethyldisilazana | Fischer Scientific | C19479-5000 | chemical drying agent |
| Kim wipes | Kimtech | S-8115 | cleaning |
| Microscope slides | Thermo Scientific | 67-762-16 | for slide culture |
| Microscopy Scissors | Tedpella | 1327 | Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8"). |
| Micro-scissors | Tedpella | 1346 | Vannas-type, straight, 80mm L |
| Moria Perforated Embryo Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm |
| Netwell Inserts | Corning | 0330B09 | 15 mm Inserts with 74 µm Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents |
| Paraformaldehyde | Fischer Scientific | T353 500 | fixative |
| Peat moss | Walmart- Miracle Gro | 551705263 | bedding medium |
| PELCO tabs double stick carbon conductive tape | Tedpella | 5000 | 12 mm OD |
| Sputter coater | DENTON VACUUM | DESK V | thin metal coating |
| SEM | JEOL USA | JEOL JSM 6610LV scanning electron scope | electron microscopy |
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